CN114032252A

CN114032252A - 一种重组状态人源mmp-7蛋白的表达方法及应用

Info

Publication number: CN114032252A
Application number: CN202111284788.XA
Authority: CN
Inventors: 余乐; 程威; 盛鑫龙; 刘佩佩
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-11-01
Also published as: CN114032252B

Abstract

本发明属于哺乳动物细胞重组蛋白表达技术领域，尤其涉及一种重组状态人源MMP‑7蛋白的表达方法及应用。本发明中对人源MMP‑7重组蛋白设计了3个信号肽和3种标签的组合搭配，最终在信号肽B和humanFc‑C‑6His标签、信号肽B和mouseFc‑C‑6His标签的共同存在的条件下实现了蛋白的分泌表达。其中信号肽B和humanFc‑C‑6His标签组合搭配蛋白表达量更佳，经过WB验证及亲和纯化成功获取了MMP‑7重组蛋白，表达量约为24.53mg/1000mL Cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。

Description

一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法及应用

技术领域

本发明属于哺乳动物细胞重组蛋白表达技术领域，尤其涉及一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法及应用。

背景技术

基质金属蛋白酶(MMPs)是主要分解细胞外基质成分的蛋白酶，其是一个大家族，各成员之间具有相似的结构及一定的底物特异性。基质溶解素(MMP-7)作为MMPs家族成员之一，不仅参与细胞外基质(ECM)、基底膜(BM)降解及细胞表面非基质蛋白分子外功能区脱落，而且还参与肿瘤血管形成及肿瘤细胞凋亡等过程。MMP-7与肺癌细胞的增殖、侵袭、转移、对抗癌化疗药物耐药性及不良预后有密切关系，有助于在肺癌预防、早期诊断及治疗等方面发挥重要作用。此外，基质溶解素(MMP-7)还被确定为肺纤维化的介质和潜在的治疗靶点。

现有技术缺点：

通常情况下，该蛋白的表达仍以原核表达为主。但是，原核表达容易产生包涵体或者表达的可溶蛋白没有活性。哺乳动物细胞表达也会存在表达在细胞内不分泌的问题，或者蛋白的表达量较少，无法满足后续实验需求。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒，包括能够依次编码信号肽和表达区域的DNA序列，所述信号肽和表达区域的氨基酸序列包括以下两种组合中的任一种：

a：如SEQ ID NO.3所示信号肽+SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中的第95-267aa；

b：如SEQ ID NO.4所示信号肽+SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中的第95-267aa；

所述DNA序列的C端添加humanFc-C-6His标签或mouseFc-C-6His标签；

所述mouseFc的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述humanFc的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。

进一步地，编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中的第95-267aa位的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地，所述表达质粒包括能够编码如SEQ ID NO.4所示信号肽+SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中的第95-267aa的DNA序列，所述DNA序列的C端添加humanFc-C-6His标签。

本发明还提供了一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法，包括：将如上述的重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒构建至哺乳动物表达载体中，利用哺乳动物细胞真核系统表达目标蛋白。

进一步地，所述哺乳动物细胞包括HEK293F细胞或EXPI293F细胞。

进一步地，目标蛋白表达后，利用Ni纯化柱对带有His-Tag标签的蛋白进行纯化。

进一步地，细胞转染时采用瞬时转染方式。

进一步地，转染过程中，细胞密度为2.6E6/mL。

本发明还提供了如述的重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒或表达方法在制备重组状态人源MMP-7蛋白中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明中对人源MMP-7重组蛋白设计了3个信号肽和3种标签的组合搭配，最终在信号肽B和humanFc-C-6His标签、信号肽B和mouseFc-C-6His标签的共同存在的条件下实现了蛋白的分泌表达。其中信号肽B和humanFc-C-6His标签组合搭配蛋白表达量更佳，经过WB验证及亲和纯化成功获取了MMP-7重组蛋白，表达量约为24.53mg/1000mL Cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。

附图说明

图1是跨膜结构域分析；

图2是翻译后修饰分析；

图3是三级结构预测；

图4是二级结构预测；

图5是PCR电泳图；

图6是细胞转染效果数据；

图7是WB电泳图；

图8是蛋白纯化效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法及应用。MMP-7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中对蛋白可表达性、翻译后修饰、三级结构和二级结构进行分析预测，分析预测结果如图1-4所示。

本发明同时提供多种蛋白和抗体的信号肽搭配不同的人源、鼠源和兔源免疫球蛋白FC区域，从而实现该蛋白的分泌表达。针对本发明实现的分泌蛋白的获取，从而在进行其他分泌蛋白的表达时提供了信号肽和标签使用的参考依据。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例

一、质粒构建

1、基因克隆构建

目标全长蛋白1-17为信号肽，18-94aa为前导肽活性形式，95-267aa为最终稳定形式。本发明本实施例中将其构建到哺乳动物表达载体中，使用293哺乳动物细胞真核系统表达蛋白。

本发明中构建多个不同组合形式的表达质粒如下，且都测序验证正确：

18-267aa的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，95-267aa的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

考虑到蛋白后期需要纯化，故在目的基因序列C端添加6his标签，使用Primer5进行引物设计，序列如下：

Primer name	Sequence5′-3′
		Plasmid 1-F	CttgtgactaactctCTGCCGCTGCCTCAGGAGGCGGGAGG
Plasmid 1-R	tcattactaaccggtctcgagTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCTTTCTTGAATTACTTCTCTTTC
		Plasmid 2-F	AtccagcctccggactctagaATGCGACTCACCGTGCTGTGTGCTGTG
Plasmid 2-R	tcattactaaccggtctcgagTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCTTTCTTGAATTACTTCTCTTTC
		Plasmid 3-F	CttgtgactaactctgaattcTACTCACTATTTCCAAATAGCCCAA
Plasmid 3-R	tcattactaaccggtctcgagTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTCTTTCTTGAATTACTTCTCTTTC
		Plasmid 4-F	CttgtgactaactctgaattcTACTCACTATTTCCAAATAGCCCAA
Plasmid 4-R	gGaaGtaCagattCtcCTCGAGTTTCTTTCTTGAATTACT
		Plasmid 5-F	TGCCAGGCTCTACCGGCTACTCACTATTTCCAAATAGCCCAA
Plasmid 5-R	gGaaGtaCagattCtcCTCGAGTTTCTTTCTTGAATTACT
		Plasmid 6-F	TGCCAGGCTCTACCGGCTACTCACTATTTCCAAATAGCCCAA
Plasmid 6-R	TTATCATCGTCGTCGGCTTTCTTTCTTGAATTACT

2、目的片段的扩增

(1)PCR体系(50ul)(武汉爱博泰克生物科技有限公司官网货号：RK20705):

(2)PCR扩增反应程序：

(3)PCR产物电泳结果如图5所示。利用市场购买的DNA回收试剂盒进行PCR产物回收，本实施例中所用试剂盒为康为世纪琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，也可以使用本领域中的其他回收试剂盒或试剂等。

3、同源重组和转化

(1)同源重组(武汉爱博泰克生物科技有限公司官网货号：RM20523)

目的片段	2uL
		pcDNA3.1(Invitrogen)(酶切后)	3uL
2X MultiF Seamless Assembly Mix	5uL

注：目的片段与载体比例根据回收后的浓度决定，摩尔比范围:3:1～10:1

(2)转化感受态细胞

a.取预冷好的1.5mlEP管，放在冰盒上，每管分装100uL-120uLDH5ɑ感受态(感受态在-80℃冰箱中取，放在冰中融化)，加入10uL重组产物(预冷效果更佳)并轻柔的吸打搅拌，加好后冰上放置30min。(此过程在超净台中进行)

b.42℃热水浴90S(严格控制时间)

c.冰上5min

d.加入800uL无抗LB/SOB培养基(此过程在超净台中进行)

e.37℃，220rmp摇床中复苏45min(严格控制时间)

f.5000rmp离心3min,集菌。

g.倒掉上清液，留大概200uL菌液，用移液器吸打混匀后加入相应抗性的平板中，倒入4-6颗玻璃珠，轻晃平板将菌液涂布均匀，倒掉玻璃珠，将平板倒置放在37℃培养箱过夜培养。(此过程在超净台中进行)

4、菌液PCR鉴定

(1)菌落PCR鉴定:20uL体系(武汉爱博泰克生物科技有限公司官网：货号：RK20605)

PCR仪扩增反应程序：

95℃/5min,(95℃/30S,58℃/30S,68℃/1min)35cycle,68℃/5min→4℃∞

5、测序

挑选正确的阳性克隆采用载体通用引物进行测序验证，测序正确后的表达质粒进行后续的蛋白表达。

二、瞬时转染

真核细胞HEK293F分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染质粒DNA进入细胞后不被整合到染色体中，以游离状态表达外源基因。瞬时转染周期短，能够快速获得目的蛋白，能够应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。

EXPI293F(人肾胚上皮细胞)作为哺乳动物细胞高密度表达系统，被广泛应用于表达重组DNA蛋白等生物制品的研究开发和规模化生产。

1、质粒DNA列表

编号	基因名	信号肽	区域	标签	质粒浓度(ng/ul)
						质粒1	MMP-7	A	18-267aa	C-6His	1100
质粒2	MMP-7	C	1-267aa	C-6His	1129
						质粒3	MMP-7	A	95-267aa	C-6His	1089
质粒4	MMP-7	A	95-267aa	humanFc-C-6His	1290
						质粒5	MMP-7	B	95-267aa	humanFc-C-6His	1000
质粒6	MMP-7	B	95-267aa	mouseFc-C-6His	1200

2、细胞转染

(1)在培养基中转染前一天以1.3E6细胞/ml分离细胞,细胞体积27mL；

(2)在转染之前，将所有试剂置于室温下；

(3)转染前，将细胞密度调节到2.6E6/mL；

(4)在无菌试管中用1.5mL Opti-MEM稀释总质粒DNA(ug)30ug；

(5)将90uL PEI(1mg/ml，pH7.1)加入稀释的1.5mL Opti-MEM中，混匀静置5min；

(6)将PEI的混合溶液加入到DNA的混合溶液中，翻转或移液混合(混匀的过程要求缓慢进行)；

(7)在室温下孵育20分钟(不要超过)；

(8)将DNA/PEI混合物加入细胞中，通过轻轻旋转将它们充分混合,混合后细胞总体积30Ml；

(9)转染后16-20小时第一次补料1.5mL，96小时后测活率及密度；

(10)收获转染后的细胞，收集上清液添加10mM AEBSF进行亲和纯化。

3、WB验证表达

(1)、样品制备：

1)取HEK293F转染后细胞100ul 3000r/min离心10min；

2)离心后取上清20ul加20ul 2*loading buffer制样，97℃加热10min，命名为上清(supernatant)；

3)沉淀使用100uL PBS进行悬浮后20ul加20ul 2*loading buffer制样，97℃加热10min，命名为细胞(cell)；

(2)、WB检测

1)取上样5ul进行SDS-PAGE电泳：根据目的蛋白的分子量的大小选择合适的分离胶浓度。电泳采用恒压模式，5％浓缩胶80V，当marker开始分离大约25min，调至120V，溴酚蓝至分离胶底部终止电泳；

2)转膜：组装顺序：转膜夹黑色面(负极)－海绵垫－3层滤纸－胶－膜－3层滤纸－海绵垫－红色面(正极)。转膜时间：200mA、90-180min；

3)封闭：转膜完成后标记并洗去转膜液(TBST、5minX2次)；清洗干净的膜放入盛有3％脱脂牛奶(TBST配制)的容器中，室温封闭60-90min；

4)6His-tag一抗孵育：封闭完成后，倒掉封闭液。加入用3％脱脂牛奶(TBST配制)1:7000稀释的一抗溶液，摇床上平缓摇动，室温孵育2h或4℃孵育过夜(4℃孵育后需室温再孵育15-30min)。一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

5)二抗孵育：一抗孵育完成前，将对应一抗种属的酶标二抗1：5000稀释到实验需要的量(TBST稀释)。将清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，摇床上缓慢摇动，于室温孵育60-80min。二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

6)曝光：用镊子将膜从TBST中取出，适当控干，置于凝胶托盘。用ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ等体积混合，均匀加至膜上，完全覆盖。底物与膜反应约30s，置于化学发光成像系统仪。设置的曝光时间为3S；10S；30S；60S；120S。

WB检测目的包括：蛋白表达大小是否正确；与高表达样本比较，获取蛋白表达量高/低信息；对于WB中无条带的项目，通过强曝光，如果可以出来条带判定为低表达，无条带的判断为无表达。

4、结果分析

(1)、细胞转染后分析结果如图6所示。

(2)、WB验证结果如下表及图7：

编号	基因名	信号肽	区域	标签	WB验证结果
						质粒1	MMP-7	A	18-267aa	C-6His	胞内表达
质粒2	MMP-7	C	1-267aa	C-6His	胞内表达
						质粒3	MMP-7	A	95-267aa	C-6His	胞内表达
质粒4	MMP-7	A	95-267aa	humanFc-C-6His	胞内外均有表达，主要在胞内表达
						质粒5	MMP-7	B	95-267aa	humanFc-C-6His	胞内外均有表达
质粒6	MMP-7	B	95-267aa	mouseFc-C-6His	胞内外均有表达

5、细胞上清纯化

将WB验证质粒4、质粒5、质粒6有分泌表达的细胞上清进行亲和纯化

(1)、His纯化流程

1)实验材料

纯化柱Polv-Prep@ChromatographyColumns：BIO-RAD731-1550；Ni Bestarose FF(上海博格隆)。

(2)、操作流程

1)孵育

取出灭菌的10ml纯化柱管，用无内毒素水冲洗柱管1-2次。从4℃冰箱取出Ni-IDA亲和纯化基质，用移液器吸取0.5ml基质加入纯化柱管中，待乙醇流完后(商品化基质用20％乙醇保存)，用无内毒素水清洗6个柱体积。柱体积是指纯化柱中基质的体积，而非柱管的体积。用Binding Buffer平衡填料6个柱体积。将平衡好的基质加入上清管中，用封口膜封口，置于旋转培养器上，20rpm，4℃，4hr-过夜。

2)流穿

孵育结束后，将离心管配平离心，600rpm，10min，4℃。将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿。同时留约5ml的上清用于悬浮基质，将基质转移至纯化柱管中，待流穿流完(此次流穿不用收集)。

3)洗脱与洗杂

a.向纯化柱管中加入3ml Washing Buffer洗柱，洗下基质中的杂蛋白。重力流，流出液用灭菌的5ml EP管收集，EP管需要插在冰上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续加入3ml WashingBuffer洗柱，直到G250不变蓝，结束Washing Buffer预洗脱。

b.加入0.5ml Elution Buffer 1洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 1预洗脱。

c.加入0.5ml Elution Buffer 2洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

d.加入0.5ml Elution Buffer3洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

e.加入0.5ml Elution Buffer4洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

f.将上面收集的流穿与洗脱液制样，一般为6*制样，即20ul蛋白+5ul 6*loading，进行SDS-PAGE电泳。

4)His-Tag标签纯化用缓冲液

缓冲液名称	成分
		Binding Buffer	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,10mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
Elution Buffer1	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,40mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
		Elution Buffer2	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,80mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
Elution Buffer3	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,250mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
		Elution Buffer4	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,500mM Imidazole,10％glycero pH 8.0

5)结果如图8所示

质粒4MMP-7A 95-267aa humanFc-C-6His纯化到蛋白浓度较低，表达量约为2.51mg/1000mL Cells。

质粒5MMP-7B 95-267aa humanFc-C-6His纯化到蛋白，蛋白纯度高，表达量约为24.53mg/1000mL Cells。

质粒6MMP-7B 95-267aa mouseFc-C-6His纯化到蛋白，蛋白纯度高，表达量约为10.2mg/1000mL Cells。

三、实验结论

由于基质金属蛋白酶(MMP)是一类锌依赖性内肽酶，可降解细胞外基质(ECM)的成分。MMP7主要由粘膜上皮细胞产生，能够降解各种ECM蛋白，包括蛋白聚糖、纤连蛋白、弹性蛋白和酪蛋白，导致蛋白的实际大小与理论大小存在一定差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉爱博泰克生物科技有限公司

<120> 一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法及应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 804

<212> DNA

<213> 基质金属蛋白酶(MMP-7)

<400> 1

atgcgactca ccgtgctgtg tgctgtgtgc ctgctgcctg gcagcctggc cctgccgctg 60

cctcaggagg cgggaggcat gagtgagcta cagtgggaac aggctcagga ctatctcaag 120

agattttatc tctatgactc agaaacaaaa aatgccaaca gtttagaagc caaactcaag 180

gagatgcaaa aattctttgg cctacctata actggaatgt taaactcccg cgtcatagaa 240

ataatgcaga agcccagatg tggagtgcca gatgttgcag aatactcact atttccaaat 300

agcccaaaat ggacttccaa agtggtcacc tacaggatcg tatcatatac tcgagactta 360

ccgcatatta cagtggatcg attagtgtca aaggctttaa acatgtgggg caaagagatc 420

cccctgcatt tcaggaaagt tgtatgggga actgctgaca tcatgattgg ctttgcgcga 480

ggagctcatg gggactccta cccatttgat gggccaggaa acacgctggc tcatgccttt 540

gcgcctggga caggtctcgg aggagatgct cacttcgatg aggatgaacg ctggacggat 600

ggtagcagtc tagggattaa cttcctgtat gctgcaactc atgaacttgg ccattctttg 660

ggtatgggac attcctctga tcctaatgca gtgatgtatc caacctatgg aaatggagat 720

ccccaaaatt ttaaactttc ccaggatgat attaaaggca ttcagaaact atatggaaag 780

agaagtaatt caagaaagaa atag 804

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> 基质金属蛋白酶(MMP-7)

<400> 2

Met Arg Leu Thr Val Leu Cys Ala Val Cys Leu Leu Pro Gly Ser Leu

1 5 10 15

Ala Leu Pro Leu Pro Gln Glu Ala Gly Gly Met Ser Glu Leu Gln Trp

20 25 30

Glu Gln Ala Gln Asp Tyr Leu Lys Arg Phe Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu

35 40 45

Thr Lys Asn Ala Asn Ser Leu Glu Ala Lys Leu Lys Glu Met Gln Lys

50 55 60

Phe Phe Gly Leu Pro Ile Thr Gly Met Leu Asn Ser Arg Val Ile Glu

65 70 75 80

Ile Met Gln Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Glu Tyr Ser

85 90 95

Leu Phe Pro Asn Ser Pro Lys Trp Thr Ser Lys Val Val Thr Tyr Arg

100 105 110

Ile Val Ser Tyr Thr Arg Asp Leu Pro His Ile Thr Val Asp Arg Leu

115 120 125

Val Ser Lys Ala Leu Asn Met Trp Gly Lys Glu Ile Pro Leu His Phe

130 135 140

Arg Lys Val Val Trp Gly Thr Ala Asp Ile Met Ile Gly Phe Ala Arg

145 150 155 160

Gly Ala His Gly Asp Ser Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn Thr Leu

165 170 175

Ala His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Leu Gly Gly Asp Ala His Phe

180 185 190

Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asp Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asn Phe

195 200 205

Leu Tyr Ala Ala Thr His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Met Gly His

210 215 220

Ser Ser Asp Pro Asn Ala Val Met Tyr Pro Thr Tyr Gly Asn Gly Asp

225 230 235 240

Pro Gln Asn Phe Lys Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys

245 250 255

Leu Tyr Gly Lys Arg Ser Asn Ser Arg Lys Lys

260 265

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 信号肽(MMP-7)

<400> 3

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 信号肽(MMP-7)

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 信号肽(MMP-7)

<400> 5

Met Arg Leu Thr Val Leu Cys Ala Val Cys Leu Leu Pro Gly Ser Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 6

<211> 228

<212> PRT

<213> 信号肽(MouseFc)

<400> 6

Ala Val Pro Arg Asp Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

1 5 10 15

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

20 25 30

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

35 40 45

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

50 55 60

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

145 150 155 160

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

165 170 175

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

180 185 190

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

195 200 205

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

210 215 220

Ser Pro Gly Lys

225

<210> 7

<211> 231

<212> PRT

<213> 信号肽(humanFc)

<400> 7

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 8

<211> 771

<212> DNA

<213> 基质金属蛋白酶(MMP-7)

<400> 8

ctgccgctgc ctcaggaggc gggaggcatg agtgagctac agtgggaaca ggctcaggac 60

tatctcaaga gattttatct ctatgactca gaaacaaaaa atgccaacag tttagaagcc 120

aaactcaagg agatgcaaaa attctttggc ctacctataa ctggaatgtt aaactcccgc 180

gtcatagaaa taatgcagaa gcccagatgt ggagtgccag atgttgcaga atactcacta 240

tttccaaata gcccaaaatg gacttccaaa gtggtcacct acaggatcgt atcatatact 300

cgagacttac cgcatattac agtggatcga ttagtgtcaa aggctttaaa catgtggggc 360

aaagagatcc ccctgcattt caggaaagtt gtatggggaa ctgctgacat catgattggc 420

tttgcgcgag gagctcatgg ggactcctac ccatttgatg ggccaggaaa cacgctggct 480

catgcctttg cgcctgggac aggtctcgga ggagatgctc acttcgatga ggatgaacgc 540

tggacggatg gtagcagtct agggattaac ttcctgtatg ctgcaactca tgaacttggc 600

cattctttgg gtatgggaca ttcctctgat cctaatgcag tgatgtatcc aacctatgga 660

aatggagatc cccaaaattt taaactttcc caggatgata ttaaaggcat tcagaaacta 720

tatggaaaga gaagtaattc aagaaagaaa catcaccatc accatcactg a 771

<210> 9

<211> 540

<212> DNA

<213> 基质金属蛋白酶(MMP-7)

<400> 9

tactcactat ttccaaatag cccaaaatgg acttccaaag tggtcaccta caggatcgta 60

tcatatactc gagacttacc gcatattaca gtggatcgat tagtgtcaaa ggctttaaac 120

atgtggggca aagagatccc cctgcatttc aggaaagttg tatggggaac tgctgacatc 180

atgattggct ttgcgcgagg agctcatggg gactcctacc catttgatgg gccaggaaac 240

acgctggctc atgcctttgc gcctgggaca ggtctcggag gagatgctca cttcgatgag 300

gatgaacgct ggacggatgg tagcagtcta gggattaact tcctgtatgc tgcaactcat 360

gaacttggcc attctttggg tatgggacat tcctctgatc ctaatgcagt gatgtatcca 420

acctatggaa atggagatcc ccaaaatttt aaactttccc aggatgatat taaaggcatt 480

cagaaactat atggaaagag aagtaattca agaaagaaac atcaccatca ccatcactga 540

Claims

1.一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒，其特征在于，包括能够依次编码信号肽和表达区域的DNA序列，所述信号肽和表达区域的氨基酸序列包括以下两种组合中的任一种：

所述DNA序列的C端添加humanFc-C-6His标签或mouseFc-C-6His标签；

所述mouseFc的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述humanFc的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒，其特征在于：编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中的第95-267aa位的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求1所述的一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒，其特征在于：所述表达质粒包括能够编码如SEQ ID NO.4所示信号肽+SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中的第95-267aa的DNA序列，所述DNA序列的C端添加humanFc-C-6His标签。

4.一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法，其特征在于，包括：将如权利要求1-3任一所述的重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒构建至哺乳动物表达载体中，利用哺乳动物细胞真核系统表达目标蛋白。

5.根据权利要求4所述的一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞包括HEK293F细胞或EXPI293F细胞。

6.根据权利要求4所述的一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法，其特征在于：目标蛋白表达后，利用Ni纯化柱对带有His-Tag标签的蛋白进行纯化。

7.根据权利要求4所述的一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法，其特征在于：细胞转染时采用瞬时转染方式。

8.根据权利要求4所述的一种重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法，其特征在于：转染过程中，细胞密度为2.6E6/mL。

9.如权利要求1-3任一所述的重组状态人源MMP-7蛋白的表达质粒在制备重组状态人源MMP-7蛋白中的应用。

10.如权利要求4-8任一所述的重组状态人源MMP-7蛋白的表达方法在制备重组状态人源MMP-7蛋白中的应用。