CN115992159A - 一种获得目标蛋白的方法、融合蛋白、载体及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请的实施例公开了一种获得目标蛋白的方法、融合蛋白、载体及应用。所述获得目标蛋白的方法包括：用包含编码目标蛋白的核酸的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养所述大肠杆菌细胞的步骤；其中，所述目标蛋白以形成融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白包含：目标蛋白；在N末端的S标签；以及在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域。本申请提供的方法能够实现高效的目标蛋白的胞外分泌表达，目标蛋白可以在较短时间内大量分泌表达，且可直接从培养基进行蛋白的提取或检测。
Description
技术领域
本申请一般涉及医药技术领域，一种获得目标蛋白的方法、融合蛋白、载体及应用。
背景技术
大肠杆菌是表达外源蛋白最常用的宿主菌之一，具有生长周期短，培养成本低，适合工业化生产等特点。但是由于它大多将外源蛋白滞留在菌体内部，导致蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性，使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐，分泌表达是解决上述问题的有效方法之一。
大肠杆菌共有五种类型的分泌系统，其中广泛用于分泌重组蛋白的主要是I型和II型分泌系统。相较于II型系统的周质表达，I型分泌系统介导的跨膜孔道直接外排更有优势，其能避免周质蛋白酶的降解，不需要破碎细胞，回收与纯化更能容易操作；另外，培养基中空间足够大，利于外源蛋白的过量表达。然而现有的I型分泌系统对外源蛋白的分泌表达效率非常低，相关研究也较少，远远达不到实际应用的需求。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请的一个目的是提供一种获得目标蛋白的方法，所述方法至少通过对位于融合蛋白N端的标签和C端的靶向序列进行针对性选择而使得大肠杆菌细胞具有较高的胞外分泌表达目标蛋白的水平，以快捷、高产量地生产目标蛋白。
本申请的另一目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白通过N末端的S标签以及C末端的靶向序列，使得目标蛋白可直接且高表达量地分泌至大肠杆菌胞外培养基中，无需破碎大肠杆菌菌体即可获得高表达量的目标蛋白，降低内毒素的污染以及目标蛋白在胞内的降解。
本申请的目的不限于上述目的，上述未提及的本申请的其他目的和优点可以从以下描述中进行理解，并通过本申请的实施方式更清晰地进行理解。此外，容易理解的是，可以通过权利要求中披露的特征及其组合来实现本申请的目的和优点。
具体地，本申请提供以下技术方案：
在申请的一个方面，本申请提供了获得目标蛋白的方法，包括：
用包含编码目标蛋白的核酸的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养所述大肠杆菌细胞的步骤；
其中，所述目标蛋白以形成融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白包含：
目标蛋白；
在N末端的S标签；以及
在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域。
在其中的一个实施例中，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。
在其中的一个实施例中，所述融合蛋白还包含选自His标签、GST标签、Strep标签和MBP标签中任意一种或多种标签序列，所述标签序列位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间。
在其中的一个实施例中，所述标签序列为两个，分别位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间，以及所述S标签与所述目标蛋白之间。
在其中的一个实施例中，所述融合蛋白还包含两个分别位于在所述目标蛋白的N端和C端的蛋白酶识别序列。
在其中的一个实施例中，所述蛋白酶识别序列选自TEV蛋白酶识别序列、凝血酶识别序列、肠激酶识别序列、3C蛋白酶识别序列和内含肽中的至少一种。
在其中的一个实施例中，所述方法进一步包括：
收集并纯化培养液上清，使纯化后的所述培养液上清与蛋白酶接触，以便获得游离的目标蛋白，其中所述蛋白酶基于所述蛋白酶识别序列确定。
在本申请的另一个方面，本申请提供了一种适于胞外分泌表达的融合蛋白，包含：
目标蛋白；
在N末端的S标签；以及
在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域的靶向序列。
在其中的一个实施例中，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。
在其中的一个实施例中，还包含选自His标签、GST标签、Strep标签和MBP标签中任意一种或几种的标签序列，所述标签序列位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间。
在其中的一个实施例中，所述标签序列为两个，分别位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间，以及所述S标签与所述目标蛋白之间。
在其中的一个实施例中，还包含两个分别位于在所述目标蛋白的N端和C端的蛋白酶识别序列。
在其中的一个实施例中，所述蛋白酶识别序列选自TEV蛋白酶识别序列、凝血酶识别序列、肠激酶识别序列、3C蛋白酶识别序列和内含肽中的至少一种。
在申请的另一个方面，本申请提供了一种表达载体，其包含编码如上所述的融合蛋白的核酸。
本申请同时提供了上述获得目标蛋白的方法在目标蛋白活性检测、亲和力检测或突变体筛选中的应用。
本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
1、本申请提供的获得目标蛋白的方法能够实现目标蛋白的高效胞外分泌表达，具有工艺简单、快捷高效和成本低等优势，在活性蛋白、多肽、抗体表位和抗原表位等相关蛋白的融合表达、活性检测、亲和力检测和突变体筛选中具有广阔的应用空间。
2、本申请提供的的融合蛋白表达载体能够实现高效的目标蛋白的胞外分泌表达，目标蛋白可以在较短时间内大量分泌表达，且可直接从培养基进行蛋白的提取或检测。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本申请一种实施例的融合蛋白的结构示意图，1表示目标蛋白，2表示S标签，3表示靶向序列，4表示标签序列，5表示蛋白酶识别序列。
图2为本申请融合蛋白N端标签的筛选，采用不同标签肽置于融合蛋白N端，包括F：Flag tag，H：His tag；M：Myc tag，S：S tag，T：T7 tag。W为全菌表达蛋白，S为培养基上清。
图3为本申请一种实施例的大肠杆菌基因工程菌株构建筛选方案示意图。
图4为本申请一种实施例的大肠杆菌基因工程菌株表达方案示意图。
图5为本申请一种实施例的大肠杆菌基因工程菌株中S tag对三种模式标签肽胞外分泌表达的促进作用；三种模式标签肽分别为：F：Flag tag；M：Myc tag；T：T7 tag。SDS-PAGE条带样品W为全菌蛋白，S为培养基中的蛋白。
图6为本申请一种实施例的大肠杆菌基因工程菌株中S tag对三种模式抗菌肽胞外分泌表达的促进作用；三种模式抗菌肽分别为：C：Cecropin A,P3：PEW300，是Cecropin A的碱性突变体；L：LL37；A12：Aurein 1.2。SDS-PAGE条带样品W为全菌蛋白，S为培养基中的蛋白。
图7为RGDS及其突变RGES多肽的融合蛋白表达上清与表达整合素的U87MG细胞结合的流式图。
图8为IL-15融合蛋白表达的培养基加入到Mo7e细胞培养体系中的EC50值结果图。
图9为本申请一种实施例的目标蛋白制备的纯化方案示意图
图10为本申请所述单链Fc抗体结构示意图；其中，RGDS为靶向整合素的多肽，与常规具有二聚化能力的Fc或突变后失去二聚化能力的单链Fc(mFc)分别融合表达，作为目的蛋白，STHRGDSFcTHHly经过TEV酶切及Ni柱纯化可得到二聚体的RGDSFc，STHRGDSmFcTHHly经过TEV酶切及Ni柱纯化可得到单链RGDSmFc。
图11为单链抗体融合蛋白RGDSmFc制备过程的SDS-PAGE图。
图12为抗原表位拆分示意图。
图13为本申请一种实施例的大肠杆菌基因工程菌株构建和抗原表位筛选应用示意图。
图14本申请所述基于特定片段的表达菌株文库第一轮鉴定结果。
图15本申请所述基于特定片段的表达菌株文库第二轮鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
定义
融合蛋白：如本文所用，“融合蛋白”意指通过基因重组方法、化学方法或其他适当方法连结(亦即，融合)的生物性活性多肽与效应物分子。若有需要，融合分子可经由氨基酸连接子于一个或数个位置融合。融合蛋白可以以单体或多聚体(例如二聚体)的形式存在。
目标蛋白：如本文所用，“目标蛋白”是指拟通过大肠杆菌家族成员表达获得的外源蛋白。其可以是任何蛋白，包括寡肽、多肽、细胞因子、单域抗体、单链抗体、Fab、Fc片段、抗体表位、抗原表位以及重组蛋白等。在一个实施方式中，所述目标蛋白是细胞因子，例如IL-15。在一个实施方式中，所述目标蛋白是抗菌肽，例如Cecropin A、LL37、Aurein 1.2。
标签蛋白：如本文所用，“标签蛋白”是指与目标蛋白的N-或C-末端融合的短的(优选地2-20个氨基酸、更优选地4-20个氨基酸)氨基酸序列。
靶向序列：如本文所用，“靶向序列”是指与目标蛋白的N-或C-末端融合的能够引导融合蛋白分泌至大肠杆菌家族成员胞外域的氨基酸序列。其包括但不限于能直接分泌到胞外的蛋白片段、外膜蛋白F或渗透压诱导的蛋白Y。在一个实施方式中，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。在一个实施方式中，所述靶向序列为能够按照I型分泌系统向大肠杆菌细胞外转运合成的融合蛋白的序列。
蛋白酶识别序列：如本文所用，“蛋白酶识别序列”是指被关联蛋白酶识别并切割的氨基酸序列，可通过关联蛋白酶在特定位点处的切割以便获得游离的目标蛋白。其中关联蛋白酶包括那些具有单一特定识别序列的蛋白酶，其在一个或多个氨基酸的特定序列内或一个或多个氨基酸的特定序列附近切割。
内含肽：如本文所用，“内含肽”是存在于前体蛋白质中的一段氨基酸序列，在前体蛋白转变为成熟蛋白的过程中，它靠自我剪切的方式从前体蛋白中释放出来，内含肽可以为人工断裂内含肽、或天然断裂内含肽，或具有剪切功能的内含肽突变体。
发明详述
一种获得目标蛋白的方法，包括：
用包含编码目标蛋白的核酸的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养所述大肠杆菌细胞的步骤；
其中，所述目标蛋白以形成融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白包含：
目标蛋白；
在N末端的S标签；以及
在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域。
在本实施例中，靶向序列可使融合蛋白按I型分泌系统向大肠杆菌细胞的胞外进行分泌表达。本申请意外发现当在融合蛋白的N端添加S标签时，融合蛋白在胞外的分泌表达水平显著提高，说明S标签可辅助提高大肠杆菌I型分泌系统的表达效率。
其中，S标签为来源于胰腺核糖核酸酶A(RNase A)N末端的短肽，其长度和氨基酸组成可根据融合蛋白表达量进行调整，以获得最优的表达效果。在一个优选例中，S标签的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。在一个优选例中，编码S标签的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
其中，大肠杆菌细胞包括大肠杆菌种中的任何细菌，包括但不限于E.coliK12、E.coli DH 5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coliRosetta(DE3)、E.coliJM109(DE3)、E.coli S17(λpir)、E.coli CC118(λpir)等。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。
大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌系统是最典型的Ⅰ型分泌系统，由HlyB(ABC转位酶)、HlyD(膜融合蛋白，MFP)和TolC(外膜蛋白OMP)三种蛋白成分组成，HlyB可识别位于HlyA羧基端的信号肽序列，引发上述3种蛋白装配成转运复合体，形成一个连续性的跨越外膜、胞周质和内膜的可溶性中空导管，不经过周质中间体直接将HlyA分泌至细胞外培养基中。因此，将目标蛋白与此信号肽序列融合同样可以被分泌至胞外。
在本实施例中，在获得目标蛋白时，采用包含编码HlyB和HlyD的核酸的辅助质粒载体与包含编码目标蛋白的核酸的表达载体同时转化大肠杆菌细胞。
在一个优选例中，溶血素A信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。在一个优选例中，编码溶血素A信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述融合蛋白还包含选自His标签、GST标签、Strep标签和MBP标签中任意一种或多种标签序列，所述标签序列位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间。即融合蛋白从N端至C端依次包含S标签、目标蛋白、标签序列和靶向序列，其中标签序列有助于融合蛋白的纯化，便于分泌后的纯化及检测。
具体地，本申请使用的标签序列用于与离子交换树脂、特别是阳离子交换树脂结合。所述标签序列应适当地包括带电荷的氨基酸残基，例如K、R、H、D和E。其中，标签序列的氨基酸组成和长度可根据所述融合蛋白的大小、氨基酸组成和电荷进行调整以优化与离子交换树脂的结合。在一个优选例中，标签序列的长度可以是4-20或更多个氨基酸。优选地，所述标签序列的长度在4-12个氨基酸之间。
进一步地，在一个优选例中，所述标签序列为His标签，即包含Hn，其中n≥2。在另一个优选例中，所述标签序列为His6标签，即标签序列的氨基酸序列为HHHHHH。在一个优选例中，编码His6标签的核苷酸序列为catcaccatcatcaccac。
进一步地，在一个优选例中，所述融合蛋白包含从N端至C端顺次连接的S标签、目标蛋白、标签序列和靶向序列。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述标签序列为两个，分别位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间，以及所述S标签与所述目标蛋白之间。标签序列设置为两个将更便于目标蛋白的分离纯化。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述融合蛋白还包含两个分别位于在所述目标蛋白的N端和C端的蛋白酶识别序列。
在本实施例中，两个蛋白酶识别序列分别位于目标蛋白与标签序列之间，在融合蛋白表达后，可通过采用与所述蛋白酶识别序列关联的蛋白酶在特定位点切割该蛋白酶识别序列，从而获得游离的目标蛋白。当切割后，目标蛋白的C-末端和N-末端不含有额外残基或含有少量残基，所述目标蛋白的质量显著提高，且大大方便了后续产品的纯化。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述蛋白酶识别序列选自TEV蛋白酶识别序列、凝血酶识别序列、肠激酶识别序列、3C蛋白酶识别序列和内含肽中的至少一种，优选所述蛋白酶识别序列为TEV蛋白酶识别序列。在一个优选例中，TEV蛋白酶识别序列的氨基酸序列为ENLYFQG。在一个优选例中，编码TEV蛋白酶识别序列的核苷酸序列为gagaacctgtacttccaaggg。
进一步地，在其中的一个实施例中，融合蛋白包含自N端至C端顺次连接的S标签、标签序列、蛋白酶识别序列、目标蛋白、蛋白酶识别序列、标签序列及靶向序列(如图1所示)，即所述融合蛋白包含如下式所示的结构：
S标签-标签序列-蛋白酶识别序列-目标蛋白-蛋白酶识别序列-标签序列-靶向序列，其中“-”表示共价键。
在一个优选例中，本申请提供的融合蛋白可任选地含有连接肽，即S标签与标签序列之间、标签序列与蛋白酶识别序列之间、蛋白酶识别序列与目标蛋白之间、蛋白酶识别序列与标签序列之间、和/或标签序列与靶向序列之间通过任选的连接肽连接。连接肽可以是例如G、S、GG、GS、SS、SG或GGSGG。连接肽大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，连接肽应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个部分在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免连接肽中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
在另一个优选例中，本申请提供的融合蛋白各部分之间通过共价键(例如肽键)直接连接。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述方法进一步包括：
收集并纯化培养液上清，使纯化后的所述培养液上清与蛋白酶接触，以便获得游离的目标蛋白，其中所述蛋白酶基于所述蛋白酶识别序列确定。
其中，在适合表达融合蛋白的条件下培养大肠杆菌细胞，融合蛋白分泌表达，直接从细胞或细胞培养物上清液中回收即得。合适的表达所述融合蛋白的条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于大肠杆菌细胞生长的条件下进行培养。当大肠杆菌细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的融合蛋白分泌到细胞外。
其中对培养液上清(即融合蛋白)纯化的步骤是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀剂处理、离心、超处理、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术及这些方法的组合
其中，当所述培养液上清与蛋白酶在适当的条件下接触时，蛋白酶切割融合蛋白中的蛋白酶识别序列，即可获得游离的目标蛋白。蛋白酶切割融合蛋白的方法是本领域技术人员所熟知的。
所述方法还包括对目标蛋白进行分离和纯化的步骤。分离和纯化的的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀剂处理、离心、超处理、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术及这些方法的组合。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述方法包括通过第一离子交换层析纯化所述培养液上清和通过第二离子交换层析纯化所述游离的目标蛋白的步骤。
其中，在采用第一离子交换层析纯化所述培养液上清时，融合蛋白中的标签序列与第一离子交换层析所用的层析柱结合，经过洗脱可获得纯化后的融合蛋白，进一步采用第二离子交换层析对经蛋白酶切割后的融合蛋白进行纯化，含有标签序列的片段与第二离子交换层析所用的层析柱结合，而目标蛋白不结合，存在于流穿液中，收集流穿液即得目标蛋白。
本申请还提供了一种适于胞外分泌表达的融合蛋白，包含：
目标蛋白；
在N末端的S标签；以及
在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域的靶向序列。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。
进一步地，在其中的一个实施例中，还包含选自His标签、GST标签、Strep标签和MBP标签中任意一种或几种的标签序列，所述标签序列位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述标签序列为两个，分别位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间，以及所述S标签与所述目标蛋白之间。
进一步地，在其中的一个实施例中，还包含两个分别位于在所述目标蛋白的N端和C端的蛋白酶识别序列。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述蛋白酶识别序列选自TEV蛋白酶识别序列、凝血酶识别序列、肠激酶识别序列、3C蛋白酶识别序列和内含肽中的至少一种。
本申请的融合蛋白与上述获得目标蛋白的方法具有相对应的技术效果，此处不再一一赘述。
本申请还提供编码融合蛋白的核酸和相应的表达载体。
本申请的核酸可以是DNA分子或RNA分子，也可以是核酸类似物。在本申请中的核酸分子可以包含天然存在的核酸残基或人工生成的核酸残基。本申请的核酸分子可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的，并且若没有另外指出，则没有任何大小限制。核酸分子还可以包含启动子，启动子可以是同源或异源的。
本申请的核酸分子可以克隆到载体中。本申请的“载体”包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它在遗传工程中通常使用的载体。在一个优选的实施方式中，这些载体适用于大肠杆菌细胞的稳定转化，例如以转录本申请的核酸分子。
本申请的载体可以是表达载体。已经在文献中广泛描述的合适的原核表达载体都可用于本申请。在一个实施方式中，表达载体可以含有标志基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点、启动子以及转录终止信号。在启动子和终止信号之间，优选地，有至少一个能够插入期望表达的核酸序列/分子的限制性位点。优选的，本申请的表达载体选自pET系列表达载体、pGEX系列表达载体、pcDNA系列表达载体、pMF系列表达载体，更优选本申请的表达载体是pET-28a表达载体，具有T7启动子和卡那霉素抗性筛选基因。
本申请还提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，其包含如上所述的核酸或表达载体。其优选为通过将本申请上述的表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到，其能够以胞外分泌方式高产目标蛋白，即相当于提供了一种新型的原核细胞胞外分泌表达系统。
进一步地，在其中的一个实施例中，所述大肠杆菌基因工程菌株还包含辅助质粒载体，所述辅助质粒载体包含编码HlyB和HlyD的核酸。该大肠杆菌基因工程菌株作为一种新型的I型胞外分泌表达系统能够高效的以胞外分泌的方式生成目标蛋白。
本申请同时提供了上述获得目标蛋白的方法在目标蛋白的活性检测、亲和力检测、或突变体筛选中的应用。
例如在目标蛋白的活性或亲和力检测中，收集含有融合蛋白的大肠杆菌培养上清液，并将上清液样品加入到检测体系中，进行活性和亲和力分析。
再如，当目标蛋白为抗体或抗原表位，当采用上述大肠杆菌基因工程菌株对特定的某个或某些抗体或抗原表位的亲和力进行检测时，可被视为在进行抗体或抗原表位的筛选，其可通过如下步骤进行：
1)通过PCR或DNA化学合成等方法获得抗体或抗原表位库的基因序列库，将基因片段插入到目标蛋白的位置构建重组表达质粒，获得质粒库；
2)将质粒库和辅助质粒载体同时转化大肠杆菌宿主细胞，涂布在添加IPTG和阿拉伯糖诱导剂以及卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜，获得单克隆菌落；
3)取一张NC膜，将其与LB平板都做好标记后，将NC膜覆盖在平板上，静置5分钟；
4)取下NC膜，进行后续的抗原、抗体孵育及显色，将显色的克隆位置对应到原平板，即获得具有高亲和力的抗体或抗原表位表达的单克隆；
5)挑选所筛选到的单克隆菌落，培养后进行表达质粒测序，获得所筛选到的抗体序列或抗原表位序列。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
实施例1
S标签(S tag，下文简称S)提高大肠杆菌表达系统胞外表达分泌效率研究
以往研究中，HlyA信号肽(下文简称Hly)能够实现胞外分泌表达，但效率较低。为促进外源蛋白或多肽的分泌表达效率，以THHly为模式蛋白进行研究，其中T为TEV酶切位点(下文简称T)，H为His，Hly为HlyA信号肽。在融合蛋白的N端使用不同的标签，包括Flag、His、Myc、S和T7 tag，比较诱导表达后融合蛋白的表达和分泌效率，具体步骤如下：
1)构建表达质粒：设计引物进行常规PCR或重叠延伸PCR，将Flag、His、Myc、S和T7tag标签序列与THHly片段连接，并在两端加上同源重组片段；使用Xba I与XhoI限制性内切酶消化载体，使用试剂盒回收载体酶切产物和PCR产物并测量回收产物浓度，按说明书用量加入各片段进行同源重组，将所获得的目标片段插入pET-28a质粒；
2)质粒转化：将重组产物转化感受态DH5α菌株，涂布卡那霉素平板，得到含有表达质粒pET-NTHHly(N表示不同的标签)的克隆菌株；在确定序列正确后保存相关克隆菌株和质粒至-80度冰箱；
3)构建辅助质粒载体：设计引物进行常规PCR，获得编码HlyB和HlyD的核苷酸片段，其中HlyB的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，编码HlyB的核苷酸片段如SEQ ID No.6，HlyD的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，编码HlyD的核苷酸片段如SEQ ID No.8；以pBAD-gIII C为骨架，将前述的HlyB和HlyD以一段核糖体结合区域相连后插入pBAD启动子的下游，获得辅助质粒载体；其中HlyB、HlyD之间核糖体结合位点核苷酸序列为cagaaagaacagaagaat。
4)构建表达菌株：将表达质粒和辅助质粒载体共同转化BL21(DE3)菌株，涂布氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板，挑取数个转化子进行培养、质粒抽提和酶切鉴定，得到含有转移质粒和辅助质粒的表达菌株；
5)融合蛋白诱导检测：取酶切正确的菌株夜培养液，以1％的体积分数转接至含LB培养基(Amp 100μg/mL+Kan 10μg/mL)的摇瓶中，37度、220rpm培养2h后，加入0.08％的阿拉伯糖，37度、220rpm诱导；4h后，加入0.1mMIPTG，20度、150rpm继续诱导4h，取1mL培养液转移至离心管中，12000g*5min离心后，转移上清至新离心管中，沉淀用1mLH2O重悬，将菌体和上清分别制备样品进行SDS-PAGE检测。
结果如图2所示。可见各标签融合后的蛋白分泌产量进行Flag<Myc<T7<His<S，即Stag具有最高的表达分泌水平。由于S tag与HlyA的组合在外源蛋白胞外分泌表达方面产生了新的优势，可作为新的分泌表达系统，用于外源蛋白的快速表达和检测、筛选以及制备。
实施例2
S标签促进目的蛋白分泌表达的表达菌株构建和筛选
1)构建表达质粒：设计引物进行常规PCR或重叠延伸PCR，将SHT、目的蛋白(下文简示为X)和THHly片段连接，并在两端加上同源重组片段；使用Xba I与XhoI限制性内切酶消化载体，使用试剂盒回收载体酶切产物和PCR产物并测量回收产物浓度，按说明书用量加入各片段进行同源重组，将所获得的目标片段插入pET-28a质粒；
2)质粒转化：将重组产物转化感受态DH5α菌株，涂布卡那霉素平板，得到含有表达质粒pET-SHTXTHHly的克隆菌株；在确定序列正确后保存相关克隆菌株和质粒至-80度冰箱；
3)构建表达菌株：将表达质粒和与实施例1中相同方法构建的辅助质粒载体共同转化BL21(DE3)菌株，涂布氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板，挑取数个转化子进行培养、质粒抽提和酶切鉴定，得到含有转移质粒和辅助质粒的表达菌株(图3)；取酶切正确的菌株培养液，使用商品化细菌冻存液将其冻存至-80度冰箱。
实施例3
采用本申请所述获得目标蛋白的方法进行外源蛋白分泌表达
取一定体积分数的表达菌株过夜培养物转接至摇瓶中培养，在固定时间点分别添加阿拉伯糖和IPTG进行诱导。以SHTXTHHly系统为例，其具体操作如图4所示，包括以下步骤：
1)转接含有表达质粒和辅助质粒的冻存菌至LB培养基(Amp 100μg/mL+Kan 10μg/mL)中，37度、220rpm过夜培养；
2)培养12h后，取过夜培养液，以1％的体积分数转接至含LB培养基(Amp 100μg/mL+Kan 10μg/mL)的摇瓶中，37度、220rpm培养；
3)培养2h后，加入0.08％的阿拉伯糖，37度、220rpm诱导；
4)诱导培养4h后，加入0.1mMIPTG，20度、150rpm诱导；
5)诱导培养4h后，取培养液转移至离心管中，12000g*5min离心后转移上清至新离心管中，待后续检测及纯化。
采用该培养体系和诱导表达方法，验证S tag对HlyA介导的外源蛋白表达分泌的促进作用，将实施例1中分泌水平较低的融合蛋白FTHHly、MTHHly、TTHHly的N端加上SHT标签，结果如图5所示，三个融合蛋白的表达分泌水平均显著提高，说明所构建的新的胞外可溶性表达纯化系统SHTXTHHly具有良好的生产效率。
将上述实验中的模式标签更换为抗菌肽，分别为Cecropin A(简写为C)，PEW300(简写为P3，是Cecropin A的碱性突变体)；LL37(简写为L)；A12：Aurein 1.2(简写为A12)，进一步验证SHTXTHHly系统的分泌表达能力。从图6可见，其N端融合SHT后，表达分泌水平显著提升，说明所构建的新的胞外可溶性表达纯化系统SHTXTHHly能够应用于不同性质的蛋白及多肽，具有良好的通用性。
实施例4
采用本申请所述获得目标蛋白的方法进行目的蛋白突变体筛选
RGDS能够与肿瘤细胞表面的整合素分子特异性结合，以RGDS为模式肽，其氨基酸序列为RGDS，核苷酸序列为cgcggtgacagc。采用实施例3相同的步骤表达RGDS及突变体RGES(氨基酸序列为RGES，核苷酸序列为cgcggtgaaagc)，获得融合蛋白SHTRGDSTHHly和SHTRGESTHHly。将含有融合蛋白的大肠杆菌诱导表达上清液直接与U87 MG人胶质瘤细胞孵育，并使用PE标记的羊抗鼠二抗和鼠抗S tag抗体作为二抗，孵育后流式检测，结果如图7所示，融合蛋白中的RGDS序列能够结合细胞表面的整合素，荧光信号较LB阴性对照显著右移，而突变后RGES失去与整合素结合的能力，因此荧光信号为阴性。该方法可广泛应用于目的蛋白活性的快速检测及筛选符合预期特征的突变体。
实施例5
采用本申请所述获得目标蛋白的方法进行目的蛋白活性快速检测
以重组细胞因子IL-15为模式蛋白，采用实施例3相同的方法进行诱导表达，获得含有融合蛋白SHTIL15THHly，取上清进行Mo7e细胞增殖实验，并以商品化IL-15单体蛋白作为对照。具体操作步骤如下：
1)用含有10ng/mL商业化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的1640完全培养基(RPMI 1640，Gibco，USA)悬浮培养Mo7e细胞；实验前，用不含hGM-CSF的完全培养基洗涤两次，将细胞密度稀释至4×105/mL，96孔板每孔加入50μL细胞悬液，即每孔20000个细胞。
2)将细胞饥饿4h后，每孔加入50μL含有不同浓度SHTIL15THHly或IL-15蛋白的培养基；
3)37℃培养4天后加入10μL/孔CCK-8(Cell counting kit-8，CCK-8)溶液，37℃孵育2-3小时后检测在450nm波长处吸收值。数据采用S曲线拟合绘制增殖曲线，并计算各组蛋白促进Mo7e细胞增殖的EC50值。
结果如图8所示，SHTIL15THHly融合蛋白的EC50为801pM，IL-15对照蛋白EC50值为294pM。二者活性接近，说明采用诱导表达SHTIL15THHly的LB上清液能够直接进行活性检测。由于本申请构建的胞外分泌表达系统具有较高的效率，使得培养基中目的蛋白含量较高。另一方面，LB培养基中的蛋白均为经过消化的、分子量低于3kDa的短肽，对目的蛋白活性鉴定带来干扰的可能性很小。，这些特征满足使用培养基直接进行目的蛋白活性检测的条件。这是本申请所描述的胞外分泌表达系统的优势。
实施例6
采用本申请所述获得目标蛋白的方法所制备的外源蛋白的纯化
收集诱导后的培养基上清，可使用镍柱纯化后获得目标蛋白融合蛋白，经TEV酶切和第二步镍柱进行纯化后获得目标蛋白。以RGDS融合单链Fc抗体分子RGDSmFc为例，说明采用本申请所述胞外分泌表达系统的纯化步骤。
纯化过程如图9所示，具体包括：
1)使用0.45μm滤膜过滤诱导表达的培养基上清，此为上样液；
2)打开纯化系统，设置1mL/min 20％乙醇进行冲洗，同时接入Smart His 6FF纯化柱；
3)置换为水，1mL/min冲洗10mL，置换为平衡液(20mM PBS+300mM NaCl)，1mL/min流入；
4)平衡后置换为上样液，1mL/min流入，共20mL，同时收集流穿液，收集完毕后置换为平衡液，1mL/min流入；
5)置换为洗脱液(20mM PBS+300mM NaCl+200mM咪唑)，1mL/min流入，收集洗脱液；
6)置换为再生液(20mM PBS+300mM NaCl+400mM咪唑)，1mL/min流入；
7)置换为水，1mL/min冲洗10mL。置换为20％乙醇，1mL/min冲洗10mL，卸下纯化柱，保存于4度；
8)保存上样液、流穿液和洗脱液，此时融合蛋白存在于洗脱液中，待后续进一步检测或纯化；
9)取2mL洗脱液，加入222μL TEV buffer和25μL TEV酶(偶联His tag)，放至4度进行酶切；
10)取酶切液，使用上样缓冲液稀释体积至5mL，转移至离心管中；
11)打开纯化系统，按照上述融合蛋白纯化相同的步骤进行第二次Ni柱纯化，并收集上样液、流穿液和洗脱液，此时目的蛋白存在于流穿液中。
采用上述步骤，纯化正常二聚化形式的RGDSFc以及单链形式的RGDSmFc，其结构如图10所示。采用SDS-PAGE分析纯化过程中各步骤的产物，如图11所示，可见第一步Ni柱纯化洗脱液E1中含有较纯的SHTRGDSmFcTHHly融合蛋白，酶切之后，第二步Ni柱上样的流穿液中含有高纯度的目的蛋白RGDSmFc，而洗脱液E2中含有带有His标签的HHly以及SHT片段。但SHT片段由于分子量小于蛋白marker，因此在图11中不可见。
实施例7
采用本申请所述获得目标蛋白的方法进行抗原表位的快速筛选
本实施例以人甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)为模式抗原，以靶向人GAPDH的鼠单克隆抗体(Proteintech，Cat No:60004-1-Ig)为模式抗体，该抗体靶向GAPDH的具体表位未知。采用本发明的胞外分泌表达系统进行抗原表位的快速筛选和鉴定可采用两种方案：
方案一，平板菌落克隆筛选，具体步骤如下：
1)由于一般抗原表位长度为5-10个氨基酸，将全长335aa的GAPDH蛋白依次拆分为20aa长度的肽段，且相邻肽段有10aa的重叠(如图12所示)；
2)合成每段多肽的双链编码oligo DNA库，并在上游和下游分别添加与S tag和His tag重叠的单链接头序列，通过同源重组等方法，将oligo库与已含有S tag和His tag-HlyA线性化载体进行同源重组，构建SXHHly的表达质粒库；
3)采用两步转化法，第一步将辅助质粒转化到BL21(DE3)菌株，挑选单克隆并测序正确后，制备电转感受态细胞，第二步将表达质粒库转化到该感受态细胞中，并涂布到10个含有氨苄青霉素、卡那霉素、阿拉伯糖和IPTG的LB平板上。其中氨苄青霉素和卡那霉素作为筛选压力，保证转化子的阳性率，阿拉伯糖和IPTG分别诱导辅助蛋白和目标蛋白，实现目标蛋白的分泌表达；
4)取37度过夜培养的表达菌株平板，观察到大量转化子出现。取NC膜或甲醇活化的PVDF膜铺至平板上，标记其与平板相对应的位置，静置数分钟后使用PBST洗涤、脱脂牛奶封闭、GADPH一抗孵育、PBST洗涤、二抗孵育、PBST洗涤和TMB显色液孵育，观察显色结果，如图13所示；
5)将阳性克隆所对应的克隆进行培养，抽提质粒，进行表达质粒的测序，根据插入到表达质粒载体中的序列，推导该序列所编码的多肽序列，即为GAPDH抗体所识别的表位。
方案二，采用多轮递进，逐步缩小范围，具体实施步骤如下：
1)抗原序列分割：将全长335aa的GAPDH蛋白按长度平均分为1-70aa、54-123aa、107-176aa、160-229aa、213-282aa和266-335aa共6段，每段70aa，重叠区为17aa；
2)表达质粒构建：设计引物进行常规PCR扩增出6个片段的基因，按照实施例2的步骤构建6个表达质粒；
3)融合蛋白诱导表达：将表达质粒和辅助质粒一同转化感受态BL21(DE3)菌株，共6管感受态划线涂布于涂布含有氨苄青霉素、卡那霉素、阿拉伯糖和IPTG的LB平板的6个区域，放至细菌培养箱中培养。其中氨苄青霉素和卡那霉素作为筛选压力，保证转化子的阳性率，阿拉伯糖和IPTG分别诱导辅助蛋白和目标蛋白，实现目标蛋白的分泌表达；
4)平板菌落印迹和免疫印迹：取37度过夜培养的表达菌株平板，观察到6个区域均有大量转化子出现。取NC膜或甲醇活化的PVDF膜铺至平板上，静置数分钟后使用PBST洗涤、脱脂牛奶封闭、GADPH一抗孵育、PBST洗涤、二抗孵育、PBST洗涤和TMB显色液孵育，观察显色结果，确定靶向表位为1-70aa区间内，如图14所示；
5)继续将1-70aa依次分割为1-14aa、1-28aa、15-42aa、42-70aa和57-70aa共5段，重复以上2)、3)、4)的步骤，观察最终的显色结果，如图15所示，1-28aa为阳性，但1-14aa和15-28aa不单独含有靶向表位。
采用上述两种方案，均可以快速把表位范围缩小到10-20个氨基酸，如需获得精确抗原表位信息，可将肽的分割范围进一步缩小，重复以上筛选步骤，或进行氨基酸突变，如丙氨酸扫描。该方法能够应用于其他分子相互作用的肽段、活性区域的检测和筛选。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
Claims (15)
1.一种获得目标蛋白的方法，其特征在于，包括：
用包含编码目标蛋白的核酸的表达载体转化大肠杆菌细胞，培养所述大肠杆菌细胞的步骤；
其中，所述目标蛋白以形成融合蛋白的形式进行表达，所述融合蛋白包含：
目标蛋白；
在N末端的S标签；以及
在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白还包含选自His标签、GST标签、Strep标签和MBP标签中任意一种或多种标签序列，所述标签序列位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述标签序列为两个，分别位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间，以及所述S标签与所述目标蛋白之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白还包含两个分别位于在所述目标蛋白的N端和C端的蛋白酶识别序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶识别序列选自TEV蛋白酶识别序列、凝血酶识别序列、肠激酶识别序列、3C蛋白酶识别序列和内含肽中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
收集并纯化培养液上清，使纯化后的所述培养液上清与蛋白酶接触，以便获得游离的目标蛋白，其中所述蛋白酶基于所述蛋白酶识别序列确定。
8.一种适于胞外分泌表达的融合蛋白，其特征在于，包含：
目标蛋白；
在N末端的S标签；以及
在C末端的靶向序列，所述靶向序列使所述融合蛋白靶向至大肠杆菌细胞胞外域的靶向序列。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向序列包含溶血素A信号肽。
10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，还包含选自His标签、GST标签、Strep标签和MBP标签中任意一种或几种的标签序列，所述标签序列位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述标签序列为两个，分别位于所述目标蛋白与所述靶向序列之间，以及所述S标签与所述目标蛋白之间。
12.根据权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，还包含两个分别位于在所述目标蛋白的N端和C端的蛋白酶识别序列。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白酶识别序列选自TEV蛋白酶识别序列、凝血酶识别序列、肠激酶识别序列、3C蛋白酶识别序列和内含肽中的至少一种。
14.一种表达载体，其特征在于，包含编码权利要求8-13任一项所述的融合蛋白的核酸。
15.权利要求1-7任一项所述的获得目标蛋白的方法在目标蛋白活性检测、亲和力检测或突变体筛选中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN117567640A (zh) * | 2023-11-09 | 2024-02-20 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种在大肠杆菌宿主细胞中高效表达与纯化重组蛋白的融合标签肽及其应用 |
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2022
- 2022-07-20 CN CN202210856072.0A patent/CN115992159A/zh active Pending
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| CN117567640A (zh) * | 2023-11-09 | 2024-02-20 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种在大肠杆菌宿主细胞中高效表达与纯化重组蛋白的融合标签肽及其应用 |
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