KR102603693B1 - 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 vlrb 단백질에 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 항원에 특이적인 서열을 포함하는 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 순차적으로 연결된, V5 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 링커 코딩 서열; 및 폴돈(foldon) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 숙주 세포에 의해 생산된, 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질 및 상기 융합 단백질이 자가조립에 의해 3합체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
제일 하위 척추동물인 무악류(jawless vertebrate)인 칠성장어(lamprey)와 먹장어(hagfish)에서 동정된 VLR(variable lymphocyte receptor)은 LRR(leucine rich repeat) 모듈 1~12개를 재배열(somatic rearrangement)하여 만들어진 폴리펩타이드로 항체처럼 적응면역 기능을 한다. 이는 다중 도메인(multi-domain) 결합체로 형성되는 분자량이 큰 유악류 유래 항원 수용체(면역글로불린의 경우 약 150kDa)에 비해 크기가 작은 단일 폴리펩타이드로 현재까지 발견된 면역글로불린 구조를 사용하지 않는 유일한 항원 수용체로 기존의 항체 대용물질이 될 수 있다.
VLRB 단백질은 그 다양성이 산술적으로 대략 1014 이상이 가능하며 pH, 온도 등과 같은 주변 환경의 변화에 훨씬 안정적인 장점이 있다. 따라서, 먹장어의 적응면역 체계를 이용하면 원하는 특정 항원에 대한 맞춤형 항체를 보다 저렴하고, 쉽고, 빠르게 제작할 수 있으며, 기존의 다양한 항체 시장에 정면으로 맞설 수 있는 강력한 경쟁적 대체 항체 후보물질이 될 것으로 사료된다.
한편, 한국등록특허 제1934578호에는 '소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 마우스 항체 유래 Fc 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1972894호에는 '소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C 말단 서열이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 먹장어 항체 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 중에서 항원과 결합할 수 있는 부위는 그대로 유지하면서 3차원 구조를 결정하는 카복시-말단 부위의 소수성 테일 도메인 코딩 유전자를 제거하고, 3합체 형성이 가능한 폴돈 도메인(박테리오파지 T4의 피브리틴 단백질의 카복시 말단 도메인)을 도입하여 보다 높은 항원 결합력 그리고 보다 작은 분자량을 가지는 VLRB 융합 단백질을 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 표적 항원에 특이적인 서열을 포함하는 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 순차적으로 연결된, V5 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 링커 코딩 서열; 및 폴돈(foldon) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 숙주 세포에 의해 생산된, 표적 항원에 특이적인 서열을 포함하는 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질; V5 에피토프; 링커; 및 폴돈 도메인이 순차적으로 연결된 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질이 자가조립에 의해 3합체의 다량체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 배양한 숙주 세포 또는 이의 배양액으로부터 융합 단백질의 3합체를 수득하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다가 항체를 표적 항원 함유 의심 시료에 처리하여 표적 항원을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다가 항체를 유효성분으로 함유하는 표적 항원 검출용 조성물을 제공한다.
일반적으로 항체에 항원 결합 부위가 1개 늘어나면 항원과의 결합력 Kd값이 10배 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 개발된 3합체 먹장어 항체는 항원 결합 부위가 3곳으로 일반적인 면역글로불린보다 1부위가 많으면서도, 분자량은 약 30 kDa이상 작은 것이 특징이다. 따라서, 일반 면역글로불린보다 작은 크기이면서 보다 강한 항원 결합력을 가지므로, 항체를 이용한 다양한 연구에 폭넓게 활용가능할 것으로 사료된다.
도 1은 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 폴돈 도메인이 연결된 3합체 융합 단백질의 제작 모식도이다.
도 2는 3합체 융합 단백질 발현에 이용된 벡터맵이다.
도 3은 제조된 3합체 융합 단백질을 비환원적, 또는 환원적 조건의 SDS-PAGE에서 확인한 결과이다.
도 4는 3합체 융합 단백질의 증진된 항원 특이 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 2는 3합체 융합 단백질 발현에 이용된 벡터맵이다.
도 3은 제조된 3합체 융합 단백질을 비환원적, 또는 환원적 조건의 SDS-PAGE에서 확인한 결과이다.
도 4는 3합체 융합 단백질의 증진된 항원 특이 결합력을 ELISA로 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 항원에 특이적인 서열을 포함하는 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 순차적으로 연결된, V5 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 링커 코딩 서열; 및 폴돈(foldon) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 폴돈 도메인은 박테리오파지 T4의 피브리틴 단백질의 카복시 말단 도메인(C-terminal domain of T4 fibritin)이며, 베타-프로펠러 구조(β-propeller conformation)를 채택하고, 자동적으로 3합체화될 수 있다. 본 발명에 따른 폴돈 도메인의 범위는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 펩타이드와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 자가조립에 의해 3합체의 다량체를 형성하는 활성을 의미한다.
또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 V5 에피토프는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 링커는 GS (Gly-Ser) 링커 및 GPP (Gly-Pro-Pro) 링커일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 V5 에피토프와 링커 서열은 VLRB 단백질과 폴돈 도메인 연결 시 3합체 구조 형성 부위가 VLRB 단백질의 항원 결합 부위의 3차원적 구조를 방해하지 않기 위해 사용되었다.
또한, 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 신호 펩타이드(SP), LRRNT(N-terminal capped LRR), LRR(leucine-rich repeat), LRRVs(variable LRR modules), CP(connecting peptide), LRRCT(C-terminal capped LRR) 및 Stalk 도메인으로 이루어진 단백질일 수 있으며, 항원 인식 부위인 LRRVs와 LRRCT 도메인을 포함하고 있어 표적 항원에 대한 결합능이 있는 VLRB 단백질이다. 다시 말하면, 본 발명의 먹장어 유래 VLRB 단백질은 야생형 VLRB 단백질의 구조에서 C-말단의 소수성 테일 도메인만 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질을 코딩하는 유전자는, 표적하는 항원에 대해 결합력이 가장 우수한 VLRB 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 표적 항원으로 면역화된 먹장어의 VLRB cDNA 라이브러리로부터 유래할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
본 발명의 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질을 코딩하는 유전자와 폴돈 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(Escherichia coli) Rosetta, 대장균 JM109, 대장균 BL21, 대장균 RR1, 대장균 LE392, 대장균 B, 대장균 X 1776, 대장균 Dα, 대장균 W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 및 동물세포(예컨대, HEK(Human embryonic kidney) 293, CHO(Chinese hamster ovary), WI-38, BHK(Baby hamster kidney), COS-7, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 숙주 세포에 의해 생산된, 표적 항원에 특이적인 서열을 포함하는 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질; V5 에피토프; 링커; 및 폴돈 도메인이 순차적으로 연결된 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 먹장어 유래 VLRB 단백질의 stalk 도메인의 C-말단에 V5 에피토프; GS (Gly-Ser) 링커 및 GPP (Gly-Pro-Pro) 링커; 폴돈 도메인이 순차적으로 연결된 융합 단백질이다.
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질이 자가조립에 의해 3합체의 다량체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체를 제공한다.
본 발명의 다가 항체는, 표적 항원에 대한 결합능은 유지하면서 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질이 3합체의 다량체 형태로 이루어진 것으로, 폴돈 도메인이 중심부에 위치하고, 먹장어 유래 VLRB 단백질이 외부로 돌출되는 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발ㄹ명의 다가 항체는 먹장어 항체인 VLRB 단백질을 3개 포함하고 있어, 항원 결합능이 현저히 증가된 항체이다.
본 발명은 또한,
(a) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 배양한 숙주 세포 또는 이의 배양액으로부터 융합 단백질의 3합체를 수득하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 다가 항체의 제조방법은 구체적으로, 면역원 또는 항원을 먹장어에 주사하여 면역화시키고, 면역화된 먹장어의 혈액을 채취하여 림프구를 분리하고, 림프구의 총 RNA를 추출하여 이를 기반으로 성숙한 VLRBs의 mRNA를 확보한 후, 이를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행하여 C-말단의 소수성 부위를 제외한 VLRBs의 cDNA 풀(pool)을 준비하였다. 상기와 같이 준비된 cDNA의 각 클론들과 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터(도 2)를 제작하였다. 그 후, 각 재조합 발현 벡터로 293-F 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 293-F 세포를 배양한 후, 배양액을 수득하여 면역원 또는 항원과의 반응성을 ELISA 실험을 통해 확인하였다. 최종적으로 면역원 또는 항원과의 결합력이 우수한 클론들을 선별하고, 선별된 클론들의 배양액을 비환원 및 환원 조건에서 웨스턴 블롯팅하여 다량체가 형성된 것을 확인하였다. 면역원 또는 항원은 바이러스, 미생물, 단백질 등 다양한 종류를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체를 제공한다.
본 발명의 상기 다가 항체는 표적 항원에 대한 결합능은 유지하면서 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질이 3합체의 다량체 형태로 이루어진 것으로, 표적 항원과 결합할 수 있는 먹장어 VLRB 단백질을 3개 포함하고 있어, 항원 결합능이 현저히 증가된 다가 항체이다.
본 발명은 또한, 상기 다가 항체를 표적 항원 함유 의심 시료에 처리하여 표적 항원을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 표적 항원 검출 방법에서 상기 시료는 음식물, 물, 특정 또는 불특정 미생물을 포함하는 용액, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 표적 항원 검출 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 검출하고자 하는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 다가 항체를 이용하여 실시될 수 있다. 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 표적 항원 존재 여부를 검출하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명의 다가 항체와 표적 항원과의 결합체 검출은 간접(indirect) ELISA(direct enzyme linked immunosorbent assay) 또는 샌드위치(sandwich) ELISA 방법을 통해 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 간접 ELISA 방법 및 샌드위치-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 다가 항체의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다.
본 발명은 또한, 상기 다가 항체를 유효성분으로 함유하는 표적 항원 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 표적 항원 검출용 조성물은 표적 항원에 대한 결합능은 유지하면서 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질이 3합체의 다량체 형태로 이루어진 다가 항체를 유효성분으로 포함하고 있어, 항원-항체 반응에 기반하여 표적 항원 검출에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '다량체' 또는 '중합체'는 서로 혼용되어 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 3합체 융합 단백질의 제조
먹장어의 야생형 VLRB (variable lymphocyte receptor B) 유전자 중 구형태 중합체를 이루며 강한 소수성 부위를 코딩하는 C-말단부위 유전자를 결실하고 삼중체 형성 폴돈 도메인(foldon domain) 펩타이드(서열번호 1)를 연결시키기 위하여 하기 표 1과 같은 프라이머 세트를 주문하여 합성하였다.
| 프라이머명 | 염기서열(5'→3') |
| Igk Xba I Fwd | caTCTAGAATGGAGACAGACACACTCCTGC (서열번호 12) |
| stalk FLD link Rev | CCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCGGTACGCGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCACTACCTGGGCCCCAGAGGCCCGCGTTC (서열번호 13) |
| stalk FLD link Fwd | GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGATCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCCCTCCCGGACCTCCTGGACCCCCTGGACCCCCCGGG (서열번호 14) |
| FLD stop Rev | TCACAGAAAGGTGCTCAGCAGCACCCACTCGCCGTCCTTCCTCACGTAGGCCTGGCCGTCTCTGGGGGCCTCGGGGATGTAGCCGCTCCCGGGGGGTCCAGGGG (서열번호 15) |
먼저 Igk Xba I Fwd와 stalk FLD link Rev를 이용하여 이미 발굴된 OmpA 특이 먹장어 항체 유전자를 주형으로하여 PCR 산물을 획득하였다. 또한 먹장어 항체 C-말단 부위에 폴돈 도메인을 연결시키기 위해 두 종류의 프라이머 세트, 즉 stalk FLD link Fwd와 FLD stop Rev를 98℃에서 단일가닥으로 만들고 상온에서 천천히 식혀 두 프라이머가 결합(annealing)되도록 유도하였다. 얻어진 두 종류의 PCR 산물을 각각 10ng 정도로 희석하고 Igk Xba I Fwd와 FLD stop Rev를 프라이머 세트로 하여 두 PCR 산물을 연결시켰으며 PCR 조건은 다음과 같다: 1st step (95℃ for 3 min) > 2nd step (95℃ for 20 sec > 60℃ for 10 sec > 72℃ for 1 min) 32 cycles 반복 > 3rd step (72℃ for 5 min).
최종적으로 얻어진 PCR 산물은 Xba I으로 가수분해하고 pTracer EF/A 벡터(Invitrogen, 미국)의 Xba I/Pme I 부위에 클로닝하여 삽입시킨 후 DNA 염기서열 분석으로 재조합 벡터를 선별하여 pOmpVLR-FLD 벡터를 제작하였다(도 2). 제작한 먹장어 항체 유전자는 다른 종류의 항원-특이적 먹장어 항체 유전자로 치환하기 용이하게 Sfi I 자리 두 곳으로 연결되어 있으며 먹장어 항체 C-말단 부위는 보편적으로 많이 사용되는 V5 에피토프를 함유하며, 3합체 연결 시 구조적인 거리 확보를 위해 GS 링커와 GPP 링커를 연결시켰고, 마지막으로 삼중체 형성 가능한 폴돈 도메인을 연결시켰다. 상기 재조합 벡터, pOmpVLR-FLD는 폴돈 도메인이 결합된 융합 단백질을 발현하며 최종적으로 3합체의 OmpA 특이적 VLRB 중합체 단백질이 제작될 것으로 예상되었다. 제작된 벡터 및 폴돈 도메인이 포함되지 않아 단량체로 발현되는 먹장어 항체 벡터 pOmpVLR는 각각 HEK 293-F 인간 세포주(Gibco, 미국)에 Lipofectamine 2000(Invitrogen)를 통해 4시간 동안 형질도입시켰고 발현 배지로 재배양하였다. 형질도입 72시간 후, 배양 상층액을 회수하여 웨스턴 블롯팅 및 항원 특이적 결합능을 수행하기 위한 ELISA를 수행하였다.
| regions | 아미노산 서열 |
| LRRNT | CPSRCSCSGTTVSCNSRSLTSVPSGFPASTT (서열번호 5) |
| LRR1 | VLHLGGNKLQSIPSGVFD (서열번호 6) |
| 4 LRRVs | KLTQLTRLDLDDNQLKFLPNGVFDKLTKLTILGLETNQLQSLPSGVFDNLSKLKELYLYSNKLQSLPSGLFDKLTQLTNLQLYSNQLKSVPDGVFD (서열번호 7) |
| CP | RLTSLQYIYLYSN (서열번호 8) |
| LRRCT | PWDCTCPGIRYLSEWINKNSGIVYYYDGSHSVDPDSAKCSGSGKPVRSIICP (서열번호 9) |
| stalk | TTTTTTTTTTMPTTTTLPTTTKMSMVKVPLVPPEAFGRVMNA (서열번호 10) |
| 연결부위 SfiI | GLWGPGS (서열번호 11) |
| V5 epitope | GKPIPNPLLGLDST (서열번호 2) |
| GS linker | RTGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 3) |
| GPP linker | GPPGPPGPPGPPGS (서열번호 4) |
| foldon domain | GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (서열번호 1) |
실시예 2. 3합체 융합 단백질의 규명
클로닝된 먹장어 유래 야생형 VLRB은 C-말단이 제거된 단일체 먹장어 항체(mono Ab)와 폴돈 도메인이 연결된 3합체 먹장어 항체(FLD Ab)이며, 비환원 조건의 SDS-PAGE에서 각각 단일체 및 3합체로 발현된다는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 웨스턴 블랏은 먹장어 VLRB의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체(한국등록특허 제2171950호)를 사용하여 수행하였다. 또한, 2% β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)이 처리된 환원적 조건에서는 3합체 먹장어 항체(FLD Ab) 역시 단일체 형태로 환원된다는 사실을 확인하였다(도 3).
실시예 3. 3합체 융합 단백질의 증진된 항원 특이 결합력 검증
항-OmpA 단일체 먹장어 항체(OmpA-mono) 또는 3합체 먹장어 항체(OmpA-FLD)의 항원 특이적 결합능을 ELISA로 검증하였다. 항원 선택적 결합 여부를 판별하기 위해 BSA(bovine serum albumin)으로 코팅된 ELISA 플레이트에 mono 및 FLD를 처리한 결과, 두 항체 모두 결합하지 않는 것을 확인하였다(도 4 BSA-mono, BSA-FLD). 반면, OmpA 단백질 항원으로 코팅된 ELISA 플레이트에서는 mono 항체와 FLD 항체가 항원과 결합하는 것이 확인되었으나, FLD 항체가 mono 항체 대비 항원 결합능에 현저한 차이를 확연히 보이는 것으로 확인되었으며, 항원 농도 의존적으로 그 결합능이 증가되는 것이 관찰되었다(도 4).
<110> EarwynTech
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protein with deleted hydrophobic tail domain and uses thereof
<130> PN21255
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> foldon domain
<400> 1
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V5 epitope
<400> 2
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GS linker
<400> 3
Arg Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GPP linker
<400> 4
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-OmpA VLRB_NRRNT
<400> 5
Cys Pro Ser Arg Cys Ser Cys Ser Gly Thr Thr Val Ser Cys Asn Ser
1 5 10 15
Arg Ser Leu Thr Ser Val Pro Ser Gly Phe Pro Ala Ser Thr Thr
20 25 30
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-OmpA VLRB_LRR1
<400> 6
Val Leu His Leu Gly Gly Asn Lys Leu Gln Ser Ile Pro Ser Gly Val
1 5 10 15
Phe Asp
<210> 7
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-OmpA VLRB_4LRRVs
<400> 7
Lys Leu Thr Gln Leu Thr Arg Leu Asp Leu Asp Asp Asn Gln Leu Lys
1 5 10 15
Phe Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Lys Leu Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Leu Glu Thr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Ser Gly Val Phe Asp
35 40 45
Asn Leu Ser Lys Leu Lys Glu Leu Tyr Leu Tyr Ser Asn Lys Leu Gln
50 55 60
Ser Leu Pro Ser Gly Leu Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Thr Asn Leu
65 70 75 80
Gln Leu Tyr Ser Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp
85 90 95
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-OmpA VLRB_CP
<400> 8
Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Tyr Leu Tyr Ser Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-OmpA VLRB_LRRCT
<400> 9
Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile
1 5 10 15
Asn Lys Asn Ser Gly Ile Val Tyr Tyr Tyr Asp Gly Ser His Ser Val
20 25 30
Asp Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser
35 40 45
Ile Ile Cys Pro
50
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-OmpA VLRB_stalk
<400> 10
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Met Pro Thr Thr Thr Thr
1 5 10 15
Leu Pro Thr Thr Thr Lys Met Ser Met Val Lys Val Pro Leu Val Pro
20 25 30
Pro Glu Ala Phe Gly Arg Val Met Asn Ala
35 40
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SfiI site
<400> 11
Gly Leu Trp Gly Pro Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
catctagaat ggagacagac acactcctgc 30
<210> 13
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
ccaccaccag aaccaccacc accagaacca ccaccggtac gcgtagaatc gagaccgagg 60
agagggttag ggataggctt accactacct gggccccaga ggcccgcgtt c 111
<210> 14
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt 60
ggtggtggtt ctggccctcc cggacctcct ggaccccctg gaccccccgg g 111
<210> 15
<211> 104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
tcacagaaag gtgctcagca gcacccactc gccgtccttc ctcacgtagg cctggccgtc 60
tctgggggcc tcggggatgt agccgctccc ggggggtcca gggg 104
Claims (10)
- 표적 항원에 특이적인 서열을 포함하는 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 순차적으로 연결된, V5 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 링커 코딩 서열; 및 폴돈(foldon) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 재조합 발현 벡터로서,
상기 V5 에피토프는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 링커는 서열번호 3 및 4의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 폴돈 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 신호 펩타이드(SP), LRRNT(N-terminal capped LRR), LRR(leucine-rich repeat), LRRVs(variable LRR modules), CP(connecting peptide), LRRCT(C-terminal capped LRR) 및 Stalk 도메인으로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
- 제1항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제4항의 숙주 세포에 의해 생산된, 표적 항원에 특이적인 서열을 포함하는 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질; V5 에피토프; 링커; 및 폴돈 도메인이 순차적으로 연결된 융합 단백질.
- 제5항의 융합 단백질이 자가조립에 의해 3합체의 다량체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체.
- (a) 제1항의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 배양한 숙주 세포 또는 이의 배양액으로부터 융합 단백질의 3합체를 수득하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체의 제조방법. - 제7항의 방법에 의해 제조된 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체.
- 제6항 또는 제8항의 다가 항체를 표적 항원 함유 의심 시료에 처리하여 표적 항원을 검출하는 방법.
- 제6항 또는 제8항의 다가 항체를 유효성분으로 함유하는 표적 항원 검출용 조성물.
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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ID=85801387
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210121570A KR102603693B1 (ko) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 vlrb 단백질에 폴돈 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도 |
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116763915B (zh) * | 2023-08-17 | 2023-11-03 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101972899B1 (ko) * | 2017-04-24 | 2019-04-26 | 경상대학교산학협력단 | 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 C4bp 올리고머화 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도 |
| KR101934578B1 (ko) * | 2017-05-18 | 2019-01-07 | 경상대학교산학협력단 | 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 마우스 항체 유래 Fc 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-09-13 KR KR1020210121570A patent/KR102603693B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BMC Biotechnol. 2017 Jul 3,17(1):57 |
| J Mol Biol. 2004 Dec 3, 344(4):1051-69. |
| Mol Immunol. 2018 Dec,104:54-60. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20230038903A (ko) | 2023-03-21 |
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