CN112458094B - Gprc5d蛋白的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种GPRC5D蛋白的制备方法和应用，该GPRC5D蛋白的制备方法包括如下步骤：优化GPRC5D原始核苷酸序列，基因合成，以合成基因为模板，经PCR反应，获得目的片段；将目的片段连接到质粒基因上，形成重组质粒；将重组质粒直接置于培养体系中进行培养，获得反应产物液；纯化所述反应产物液，获得GPRC5D全长蛋白。与现有技术相比，本发明GPRC5D蛋白的制备方法采用无细胞表达系统制备获得GPRC5D全长蛋白，便于后续作为骨髓瘤的新靶点进行研究试验。

Description

GPRC5D蛋白的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种GPRC5D蛋白的制备方法和应用。
背景技术
G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCRs)因能结合和调节G蛋白活性而得。迄今为止，已报道的G蛋白偶联受体有近2000种，是人体中分布最广、地位最重要的膜蛋白受体，介导各种信号通路，具有重大研究价值。
G蛋白偶联受体的肽链结构主要由N末端、7个跨膜α螺旋、3个胞外环、3～4个胞内环以及C末端组成。其中，位于胞外的N端常常被糖基化，位于胞内C端，多表现为磷酸化；7个跨膜的α螺旋反复穿过细胞膜的脂质双分子层。
按照G蛋白偶联受体一级结构的同源性，主要分为A、B、C三个族。其中C族又称为神经递质/钙受体样受体族，一级结构具有以下共同特点：ECL1与ECL2之间以二硫键相连；ICL3很短且高度保守；C末端无棕榈酰化位点，不形成ICL4；TM中的保守氨基酸残基不同于A、B族受体。C族受体又分为5个亚族：谷氨酸受体、C-氨基丁酸(GABA)受体、钙受体、鼻神经外激素受体以及味觉受体。
其中，GPRC5D(G-protein coupled receptor family C group 5member D)蛋白属于C族，具有GABA-B样受体活性。GPRC5D先前在多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓细胞中的浆细胞被鉴定发现，然而其蛋白表达谱并不确定。后续有研究显示：GPRC5D在恶性骨髓浆细胞上表达，CD138阳性多发性骨髓瘤细胞上的GPRC5D表达与BCMA表达不具有相关性，这表明GPRC5D在临床上是一个理想靶标，并有望成为研究多发性骨髓瘤的新靶点。
目前，市面上暂时没有包含多次跨膜区域的GPRC5D重组蛋白产品，仅有含1-27aa、256-345aa的片段蛋白产品，但是胞内片段蛋白或胞外片段蛋白在蛋白的活性作用研究及相应药物筛选等应用上具有较明显的局限性。如果能够获得GPRC5D全长蛋白的完整构象，则对于GPRC5D蛋白的结构、活性研究更具有说服力，对于靶向GPRC5D CAR-T治疗多发性骨髓瘤具有较高利用价值，同时也有助于研究该家族其他亚家族成员的结构和活性。
但是，GPRC5D全长蛋白作为多次跨膜的G蛋白偶联受体的一种，不易通过传统方法制备获得，主要原因在于：GPRC5D全长蛋白作为跨膜蛋白，会和细胞膜紧密结合，纯化过程中需要加入较强的裂解液成分，会破坏跨膜蛋白。
发明内容
基于此，有必要提供一种GPRC5D蛋白的制备方法和应用，能够通过体外无细胞表达系统制备获得具有完整构象的GPRC5D全长蛋白，便于进行靶点研究。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种可采用无细胞表达体系表达GPRC5D蛋白的基因，其序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提供一种含可采用无细胞表达体系表达GPRC5D蛋白的基因的重组质粒。
本发明还提供一种含可采用无细胞表达体系表达GPRC5D蛋白的基因的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
按照如SEQ ID NO.2所示的序列进行基因合成，并以该合成基因为模板，经PCR反应，获得目的片段；
将质粒载体进行双酶切，形成双酶切产物；
将所述双酶切产物与所述目的片段进行连接反应，即得。
优选地，所述质粒载体为pET23b载体。
进一步地，在形成双酶切产物的步骤中，所述双酶切位点优选为BamHI和XhoI。
在其中一些实施例中，在获得目的片段的步骤中，所采用引物对的序列分别如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供一种GPRC5D蛋白的制备方法，包括如下步骤：
将上述重组质粒直接置于培养体系中，于温度25～35℃、搅拌速率100～300rpm条件下进行培养，获得反应产物液；其中，所述培养体系主要由包括如下组分：大肠杆菌抽提物、磷酸盐缓冲液、复合氨基酸和T7 RNA聚合酶。所述大肠杆菌抽提物的抽提方法为：通过压力破碎大肠杆菌，离心，收集上清液，即得。
采用Ni-NTA柱分离纯化所述反应产物液，得GPRC5D全长蛋白。
在其中一些实施例中，采用Ni-NTA柱分离纯化所述反应产物液包括如下步骤：预处理镍柱；将所述反应产物液进行预处理，制备获得上样溶液，上样于预处理后的镍柱；采用不同浓度的咪唑洗脱液进行梯度洗脱，洗脱获得目的蛋白。
优选地，所述梯度洗脱为依次采用20mM咪唑缓冲液、60mM咪唑缓冲液、100mM咪唑缓冲液、500mM咪唑缓冲液进行洗脱；在梯度洗脱过程中采用卡马斯亮蓝法、SDS-PAGE检测监测目标蛋白峰。
本发明提供一种GPRC5D全长蛋白，该GPRC5D全长蛋白在制备骨髓瘤检测、鉴定试剂盒或者筛选预防、治疗骨髓瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)通过优化GPRC5D原始核苷酸序列，并采用含优化后的GPRC5D基因构建重组质粒，在无细胞表达体系中可有效表达GPRC5D全长蛋白。
(2)本发明GPRC5D蛋白的制备方法的步骤相对简单，生产周期短。
(3)本发明获得的GPRC5D全长蛋白具有完整的跨膜区间，纯度高。
附图说明
图1为实施例1中HU-GPRC5D-pET23b载体构建的重组质粒图谱。
图2为HU-GPRC5D-pET23b载体构建过程中琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，M均为Marker，图2A中泳道1对应检测PCR扩增合成基因所得的GPRC5D目的片段，图2B中泳道1对应检测pET23b酶切片段，图2C中泳道1对应检测重组质粒HU-GPRC5D-pET23b菌落PCR产物。
图3为实施例2无细胞表达体系小量表达GPRC5D蛋白的SDS-PAGE检测图。其中，M均为Marker，泳道1对应上清样品，泳道2对应沉淀样品。
图4为实施例3无细胞表达体系放大表达GPRC5D蛋白的SDS-PAGE检测图。其中，M均为Marker，泳道1对应上清样品，泳道2对应沉淀经Ni-NTA纯化技术沉淀样品。
图5为实施例4中纯化后的GPRC5D蛋白经His tag Monoclonal Antibody进行Western Blot检测图。
图6为GPRC5D蛋白与GYPA蛋白的结合试验所绘制的拟合曲线图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1构建HU-GPRC5D-pET23b载体
参见图1，本实施例提供一种重组质粒HU-GPRC5D-pET23b的构建方法，包括如下步骤：
S1，优化GPRC5D原始核苷酸序列。
本步骤针对GPRC5D原始核苷酸序列进行优化，获得优化后的GPRC5D序列。相关序列见下表1：
表1 GPRC5D相关基因及蛋白序列表
Figure BDA0002780834860000051
Figure BDA0002780834860000061
按照优化后的GPRC5D核苷酸序列，送至武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成，获得GPRC5D合成基因。
S2，基因扩增。
本步骤针对优化后的GPRC5D核苷酸序列设计引物，优选引物如下表2所示：
表2引物序列表
Figure BDA0002780834860000062
引物由金开瑞生物工程有限公司合成。
以GPRC5D合成基因为模板，进行PCR扩增反应，PCR所用的酶及buffer源自Cusabio。PCR所用的酶及buffer为Cusabio自产。PCR扩增反应体系如下表3所示：
表3 PCR扩增反应体系
试剂 用量体积(μL)
模板 4
上游引物 2
下游引物 2
10×Buffer 20
dNTPs 16
pFu聚合酶 2
水 154
PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min；15℃保温5min。反应结束后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
根据目的片段的大小切胶，放置干净离心管。离心管放置-80℃冰箱内，15min后取出室温溶解，用1mL蓝色枪头将胶捣碎，12000r/min离心2min。离心后上清移至的新空白EP管，备用。
S3，构建重组质粒HU-GPRC5D-pET23b。
本步骤采用优化后的pET23b载体(cusabio)进行双酶切反应，反应体系如下表4所示：
表4双酶切反应体系
试剂 用量体积(μL)
载体 20
BufferO 15
BamHI(赛默飞) 4
XhoI(赛默飞) 4
水 150
用枪轻轻吹吸混合均匀，37℃水浴酶切20h以上，回收双酶切产物。具体步骤参见回收试剂盒说明书。
将回收的GPRC5D DNA目的片段与回收的载体pET23b双酶切产物进行连接反应，连接反应体系如下表5：
表5连接反应体系
试剂 用量体积(μL)
目的片段 4
pET23b载体 1
Buffer 0.2
Enzyme(cusabio) 2.5
水 2.3
总计 10
置于冰上15min，转化后得到重组质粒。
S4，阳性克隆筛选，并抽提重组质粒。
从-80℃冰箱中取出TOP10感受态细胞，打开盖子，加入步骤S3转化获得的重组质粒(10μL)，轻轻吹吸并旋转小枪头，使DNA与感受态细胞充分混匀，冰上30min，42℃热击90s，冰上1min；加入700μL预热的LB培养基，置37℃摇床中，158r摇动1.5h。
采用6000r离心4min，在超净台里面吸掉700μL上清液，剩余菌液混匀，涂至含有氨苄青霉素的平板上；倒置平板，于37℃恒温培养箱中培养，12～16h后可出现菌落。
对于阳性克隆的筛选，分装40μL不加抗生素的LB培养基至PCR管，每种克隆挑取6个单菌落至PCR管混匀，放置于37℃摇床中，220r摇动2h。每管取2μL作为模板进行菌液PCR，其中PCR回收产物和H2O分别作为阳性和阴性对照的模板。
PCR反应完后进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果呈阳性，则选择3个呈阳性结果的相应PCR管的单克隆菌液接种至3mL含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，第二天进行保种，并选取一个克隆提取质粒，同时该克隆送测序。
测序无误后准备质粒抽提，流程参见质粒回收试剂盒，获得抽提的重组质粒。
在实施例中，检测验证相关目标基因片段的SDS-PAGE检测图见图2。
其中，由图A可以看出，GPRC5D基因目的片段长度约为1075bp，与预期目标的一致。
由图B可以看出，载体pET23b(约3665bp)经双酶切后回收，1％琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，目的载体长度约为为3665bp，与预期目标的一致。
由图C可以看出，重组质粒HU-GPRC5D-pET23b转化大肠杆菌后，挑阳性菌落进行PCR验证所得GPRC5D基因目的片段长度为1075bp，与预期目标的一致。
实施例2无细胞表达体系小量表达GPRC5D蛋白
本实施例提供一种利用无细胞表达体系小量表达GPRC5D蛋白的方法，包括如下步骤：
S1，将培养体系物料(共1mL)加入反应装置中，形成小量转录表达体系。其中，该培养体系物料的组成包括体积比为50:10:3:30的大肠杆菌抽提物、复合氨基酸溶液、T7 RNA聚合酶溶液和磷酸缓冲液(pH范围7.4～7.6)。其中，大肠杆菌抽提物的抽提方法为：通过压力破碎大肠杆菌，离心，收集上清液，即得。
再加入步骤S1构建并抽提的重组质粒模板1-5μL，置于温度30℃、搅拌速率180rpm条件下，反应过夜，形成含目标蛋白的反应产物液。
S2，将反应产物液置于4℃条件下，12000rpm离心10min，分离得上清液样品和沉淀样品。分别对上清液样品和沉淀样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果见图3。
由图3可以看出，沉淀样品中显现42kDa左右的目的蛋白条带，符合目的蛋白分子量预期，说明本发明实现了利用无细胞表达系统在体外环境下进行重组蛋白的有效表达。
实施例3无细胞表达体系放大表达GPRC5D蛋白
本实施例提供一种利用步骤S1构建并抽提的重组质粒HU-GPRC5D-pET23b放大表达GPRC5D蛋白的方法，包括如下步骤：
S1，将反应所需的氨基酸混合物、酶等培养体系物料(与实施例2中的培养体系物料组成相同)加入反应装置中，形成放大转录表达体系。
再加入步骤S1构建并抽提的重组质粒HU-GPRC5D-pET23b模板10μL，置于温度30℃、搅拌速率180rpm条件下，反应过夜，形成含目标蛋白的反应产物液。
S2，将反应产物液置于4℃条件下，12000rpm离心10min，分离得上清液和沉淀样品。沉淀样品首先采用去垢剂(0.05％FOS-12)溶解。
S3，采用镍柱进行蛋白纯化。
镍柱重生和平衡过程的程序依次如下：用H2O洗脱3个柱体积→用0.1M EDTA洗脱2个柱体积→用水洗脱4个柱体积→用Ni2SO4缓冲液洗脱5个柱体积→用pH4.0缓冲液洗1个柱体积→用水洗5个柱体积→用NTA-0洗5个柱体积→待上一步的NTA-0全部流尽后，用NTA-0+0.05％DDM(0.05％Fos-12)洗脱1个柱体积。
制备上样溶液的步骤如下：取S2步骤去垢获得的膜蛋白沉淀，用1xPBS重悬，于4℃条件下采用11000rpm离心10min，取沉淀。该操作再重复一遍。沉淀用等体积的反应缓冲液重悬，放入静音混合仪内(4℃)旋转。待悬液澄清后，于4℃条件下采用11000rpm离心10min，取上清用来进一步纯化。将溶解好的上清液加入已平衡好的镍柱中，补适量体积的NTA-0。放入静音混合仪内(4℃)，轻柔混匀过夜。
接穿透。
用含20mM咪唑的洗杂Buffer洗杂，接一滴液体用G250检测对比颜色，当颜色变浅与对照一致，表明可以洗脱目的蛋白。平衡Buffer2洗1个柱体积。再依次用含60mM咪唑、100mM咪唑、500mM咪唑的洗脱Buffer洗脱，定时取10μL洗脱溶液用G250检测对比颜色，寻找目标洗脱峰。洗脱体积根据颜色对比决定。柱子继续用500mM咪唑洗2个柱体积彻底去杂，再用水洗4个柱体积，用0.1M EDTA洗2个柱体积，用水洗5个柱体积，再采用20％乙醇封柱。
其中，洗脱下来的液体分别超滤后进行SDS-PAGE检测，结果见4。
由图4可以看出，无细胞放大表达体系获得的沉淀样品经Ni-NTA纯化技术纯化可以得到1mg/L的GPRC5D重组蛋白，重组蛋白纯度约为80％。
另外，将纯化获得的GPRC5D重组蛋白经His tag Monoclonal Antibody进行Western Blot检测，结果如图5所示。
实施例4无细胞体系放大表达GPRC5D蛋白与GYPA蛋白的结合试验
实验方法：将GPRC5D重组蛋白(D04686c2g0批次冻干粉，通过实施例3制备获得)用CB缓冲液稀释成10μg/mL后加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入100μL 4％PBSM稀释后的GYPA蛋白(Cusabio，CSB-EP010074HU)(GYPA蛋白从600μg/mL开始2倍梯度稀释18个梯度)，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后；每孔加入100μL MYC tag Monoclonal Antibody(Cusabio，CSB-MA000041M0m，以4％PBSM按1：1000稀释)，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Antibody；HRP conjugated(Cusabio，CSB-PA573747，以4％PBSM按1：5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μLTMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL H2SO4(2mol/L)终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。
吸光度值读出后，导出EXCEL表格，测试结果如下表6所示。将对应分组标记好，然后将实验组浓度1-浓度18数据复制到Graphpad软件里面，作图，读取EC50数据，最后导出曲线图，如图6所示。
表6 ELISA法测定的OD450nm值汇总表(复孔)
Figure BDA0002780834860000111
Figure BDA0002780834860000121
通过计算可得，当GPRC5D重组蛋白包被10μg/ml，GYPA蛋白(Cusabio，CSB-EP010074HU)从600μg/ml开始2倍梯度稀释18个梯度，对照组正常的情况下，GPRC5D与GYPA蛋白结合的EC50为13.72-24.72μg/mL。说明本发明制备的GPRC5D蛋白结构与天然蛋白结构相似，可以与GYPA蛋白结合。
另外，本发明制备获得的GPRC5D全长蛋白还在制备骨髓瘤检测、鉴定试剂盒(作为)或者筛选预防、治疗骨髓瘤药物中的应用。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉华美生物工程有限公司
<120> GPRC5D蛋白的制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1038
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atgtacaagg actgcatcga gtccactgga gactattttc ttctctgtga cgccgagggg 60
ccatggggca tcattctgga gtccctggcc atacttggca tcgtggtcac aattctgcta 120
ctcttagcat ttctcttcct catgcgaaag atccaagact gcagccagtg gaatgtcctc 180
cccacccagc tcctcttcct cctgagtgtc ctggggctct tcggactcgc ttttgccttc 240
atcatcgagc tcaatcaaca aactgccccc gtacgctact ttctctttgg ggttctcttt 300
gctctctgtt tctcatgcct cttagctcat gcctccaatc tagtgaagct ggttcggggt 360
tgtgtctcct tctcctggac gacaattctg tgcattgcta ttggttgcag tctgttgcaa 420
atcattattg ccactgagta tgtgactctc atcatgacca gaggtatgat gtttgtgaat 480
atgacaccct gccagctcaa tgtggacttt gttgtactcc tggtctatgt cctcttcctg 540
atggccctca cattcttcgt ctccaaagcc accttctgtg gcccgtgtga gaactggaag 600
cagcatggaa ggctcatctt tatcactgtg ctcttctcca tcatcatctg ggtggtgtgg 660
atctccatgc tcctgagagg caacccgcag ttccagcgac agccccagtg ggacgacccg 720
gtcgtctgca ttgctctggt caccaacgca tgggttttcc tgctgctgta catcgtccct 780
gagctctgca ttctctacag atcgtgtaga caggagtgcc ctttacaagg caatgcctgc 840
cccgtcacag cctaccaaca cagcttccaa gtggagaacc aggagctctc cagagcccga 900
gacagtgatg gagctgagga ggatgtagca ttaacttcat atggtactcc cattcagccg 960
cagactgttg atcccacaca agagtgtttc atcccacagg ctaaactaag cccccagcaa 1020
gatgcaggag gagtataa 1038
<210> 2
<211> 1038
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
atgtacaaag attgcattga gagcaccggt gattattttc tgctgtgtga tgccgaaggt 60
ccgtggggta ttattctgga aagcctggca attctgggta ttgttgttac cattctgctg 120
ctgctggcat ttctgtttct gatgcgtaaa attcaggatt gcagccagtg gaatgttctg 180
ccgacacagc tgctgtttct gctgagcgtt ctgggtctgt ttggtctggc atttgcattt 240
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tgtgttagct ttagctggac caccattctg tgtattgcaa ttggttgtag cctgctgcag 420
attattatcg caaccgaata tgttaccctg attatgaccc gtggcatgat gtttgtgaat 480
atgaccccgt gtcagctgaa tgttgatttt gttgttctgc tggtgtatgt gctgttcctg 540
atggcactga ccttttttgt tagcaaagca accttttgtg gtccgtgcga aaattggaaa 600
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gaactgtgta ttctgtatcg tagctgtcgt caagaatgtc cgctgcaggg taatgcatgt 840
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gatgccggtg gtgtttaa 1038
<210> 3
<211> 345
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys
1               5                   10                  15
Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Ser Leu Ala Ile Leu
            20                  25                  30
Gly Ile Val Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Phe Leu Met
        35                  40                  45
Arg Lys Ile Gln Asp Cys Ser Gln Trp Asn Val Leu Pro Thr Gln Leu
    50                  55                  60
Leu Phe Leu Leu Ser Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Phe Ala Phe
65                  70                  75                  80
Ile Ile Glu Leu Asn Gln Gln Thr Ala Pro Val Arg Tyr Phe Leu Phe
                85                  90                  95
Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser
            100                 105                 110
Asn Leu Val Lys Leu Val Arg Gly Cys Val Ser Phe Ser Trp Thr Thr
        115                 120                 125
Ile Leu Cys Ile Ala Ile Gly Cys Ser Leu Leu Gln Ile Ile Ile Ala
    130                 135                 140
Thr Glu Tyr Val Thr Leu Ile Met Thr Arg Gly Met Met Phe Val Asn
145                 150                 155                 160
Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr
                165                 170                 175
Val Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Phe Phe Val Ser Lys Ala Thr Phe
            180                 185                 190
Cys Gly Pro Cys Glu Asn Trp Lys Gln His Gly Arg Leu Ile Phe Ile
        195                 200                 205
Thr Val Leu Phe Ser Ile Ile Ile Trp Val Val Trp Ile Ser Met Leu
    210                 215                 220
Leu Arg Gly Asn Pro Gln Phe Gln Arg Gln Pro Gln Trp Asp Asp Pro
225                 230                 235                 240
Val Val Cys Ile Ala Leu Val Thr Asn Ala Trp Val Phe Leu Leu Leu
                245                 250                 255
Tyr Ile Val Pro Glu Leu Cys Ile Leu Tyr Arg Ser Cys Arg Gln Glu
            260                 265                 270
Cys Pro Leu Gln Gly Asn Ala Cys Pro Val Thr Ala Tyr Gln His Ser
        275                 280                 285
Phe Gln Val Glu Asn Gln Glu Leu Ser Arg Ala Arg Asp Ser Asp Gly
    290                 295                 300
Ala Glu Glu Asp Val Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Thr Pro Ile Gln Pro
305                 310                 315                 320
Gln Thr Val Asp Pro Thr Gln Glu Cys Phe Ile Pro Gln Ala Lys Leu
                325                 330                 335
Ser Pro Gln Gln Asp Ala Gly Gly Val
            340                 345
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
gccgcgcggc agccggacca tgtacaaaga ttgcattg 38
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
gagtttctgc tcagcggccg caacaccacc ggcatcct 38

Claims (2)

1.一种GPRC5D蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建重组质粒HU-GPRC5D-pET23b：
以合成的序列如SEQ ID NO.2所示的可采用无细胞表达体系表达GPRC5D蛋白的基因为模板，采用序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对进行PCR反应，获得目的片段，将目的片段与质粒载体pET23b的双酶切产物连接；
将所述重组质粒HU-GPRC5D-pET23b直接置于培养体系中，所述培养体系的组分为：体积比为50:10:3:30的大肠杆菌抽提物、复合氨基酸溶液、T7 RNA聚合酶溶液和磷酸缓冲液，pH范围7.4~7.6，于温度25~35℃、搅拌速率100~300rpm条件下进行培养，获得反应产物液；分离纯化所述反应产物液：预处理镍柱；将所述反应产物液进行预处理，制备获得上样溶液，上样于预处理后的镍柱；采用不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱，洗脱获得目的蛋白；所述大肠杆菌抽提物的抽提方法为：通过压力破碎大肠杆菌，离心，收集上清液，即得。
2.根据权利要求1所述的GPRC5D蛋白的制备方法，其特征在于，所述双酶切位点为BamHI和XhoI。
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