CN106011163B - 一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无细胞表达信号蛋白的方法及系统，所述方法包括：将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)、磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)以及葡萄糖；配制氨基酸混合物及盐溶液；采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达。本发明能解决信号蛋白表达量低的问题。

Description

一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统
技术领域
本发明涉及蛋白制备领域，具体涉及一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统。
背景技术
信号蛋白大部分是膜蛋白，如何高效表达膜蛋白一直是信号蛋白研究领域的主要瓶颈,在大多数己经测序完成的各种基因组中,膜蛋白质的数量仅占全部基因数的三分之一左右而且仅有有限的膜蛋白大约九十几个的空间结构被测定,主要的原因是膜蛋白的极高疏水性导致其在细胞体内的表达产生对宿主细胞的毒性,导致蛋白质产率低,而且膜蛋白的不溶性表达和蛋白质的错误折叠会导致生物活性的降低甚至丧失。有些膜蛋白的体内表达将会干扰细胞膜的结构完整性,从而导致细胞的死亡。膜蛋白结构组学、膜蛋白功能组学研究一般需要级别的膜蛋白。所以如何实现信号蛋白的高效表达是蛋白质组学研究的热点和难点。蛋白同样在体内很难表达,很少有文章报道关于在体内的大量表达。
无细胞蛋白表达体系是一种以细胞抽提物为基础的体外合成蛋白质表达技术，具有遗传背景简单、反应操控简便、快速、方便、易于高通量等优点,正在被广泛地研究和应用，已成为研究生物反应系统的重要技术手段。近年来，无细胞蛋白表达系统在复杂蛋白、毒性蛋白和信号蛋白表达方面的优势逐渐体现，展示了其在生物制药领域的重要应用潜力。
无细胞蛋白合成的详细机制可概括如下：1)目标蛋白的质粒DNA或其直接的PCR产物，在T7RNA聚合酶的作用下，在体外无细胞蛋白合成系统中首先被转录为相应的mRNA。2)在无细胞蛋白合成系统中，利用抽提物中所包含的蛋白质合成蛋白表达所必须得翻译因子和酶，例如蛋白合成的氨酰-tRNA合成酶，转肽酶以及起始因子(IF)、延长因子(EF)、释放因子(RF)等，并人工补充氨基酸、tRNA和能源物质将mRNA翻译成蛋白质。3)无细胞蛋白合成系统中翻译后释放的mRNA被再次循环使用。
无细胞蛋白表达系统虽然有很多优点，但是要高效的合成蛋白质，必须保证系统中各成分在蛋白表达中都发挥作用，现有的一些无细胞蛋白表达系统仍然不能很好的表达信号蛋白，存在信号蛋白表达量低等问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的主要目的在于提供一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统，能解决信号蛋白表达量低的问题。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种无细胞表达信号蛋白的方法，包括：
将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；
采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；
配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)、磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)以及葡萄糖；
配制氨基酸混合物及盐溶液；
采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；
将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达。
作为进一步的优选，所述目标基因为GPCR(G蛋白偶联受体)的质粒DNA或其直接的PCR产物。
作为进一步的优选，所述目标基因为β2肾上腺素受体的质粒DNA或其直接的PCR产物，所述目标基因序列如SEQ ID NO.1所示。
作为进一步的优选，所述Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间。
作为进一步的优选，所述S30缓冲液包括：
作为进一步的优选，所述能量供应体系包括三磷酸腺苷(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、辅酶A(CoA)、丙酮酸激酶、环磷酸腺苷(cAMP)、磷酸肌酸、肌酸激酶、丙酮酸钠以及葡萄糖。
作为进一步的优选，所述氨基酸包括：丙氨酸(Alanine)、精氨酸(Arginine)、天冬酰胺(Asparagine)、天冬氨酸(Aspartic acid)、半胱氨酸(Cysteine)、谷氨基酸(Glutamicacid)、谷氨酰胺(Glutamine)、甘氨酸(Glycine)、组氨酸(Histidine)、异亮氨酸(Isoleucine)、亮氨酸(Leucine)、赖氨酸(Lysine)、蛋氨酸(Methionine)、苯基丙氨酸(Phenylalanine)、脯氨酸(Proline)、丝氨酸(Serine)、苏氨酸(Threonine)、色氨酸(Trptophan)、酪氨酸(Tyrosine)以及缬氨酸(Valine)。
作为进一步的优选，所述盐溶液包括醋酸镁、谷氨酸钾和醋酸钠。
作为进一步的优选，所述采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体为：将大豆卵磷脂、胆固醇溶解于乙醇中，配得卵磷脂乙醇溶液，打开超临界二氧化碳高压釜，将卵磷脂乙醇溶液混合液加入其中，密闭高压釜，经二氧化碳高压泵打入CO2，调整适宜的温度和压力，在指定的超临界温度、压强和时间下进行孵化制备脂质体，孵化结束后泄压释放CO2，旋转蒸发除去乙醇后，得到脂质体混悬液。
作为进一步的优选，所述卵磷脂/胆固醇脂质体在无细胞蛋白表达系统中的加入量为12mg/mL。
作为进一步的优选，所述表达时为连续性物质交换反应，通过半透膜向无细胞蛋白表达体系的反应液中连续加入补充液，用于进行高效的物质交换，及时去掉反应液的副产物，补充无细胞反应所需的底物和能量。
作为进一步的优选，所述表达反应时间可达36小时。
一种无细胞表达信号蛋白的系统，包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)、磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)和葡萄糖。
作为进一步的优选，所述卵磷脂/胆固醇脂质体的粒径为100-200nm。
所述无细胞表达信号蛋白系统应用于信号蛋白表达中。
本发明的有益效果是：
(1)、本发明无细胞蛋白表达系统的蛋白表达量大，大肠杆菌抽提物CECF(持续交换无细胞表达)的连续表达量可以达到5mg/mL，解决了真核细胞或信号蛋白表达量不高的问题。
(2)、本发明无细胞蛋白表达系统表达的信号蛋白具有活性，结构正确。
(3)、本发明大肠杆菌提取液采用能避免密码子偏好的ROSETTA(DE3)菌种来制备，采用S30缓冲液提取大肠杆菌核糖体，降低了杂蛋白含量；本发明以测OD的方式确定大肠杆菌表达对数期，选取Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间时，此时的菌体代谢旺盛，采用此生长阶段对数期的大肠杆菌菌体制备得到抽提物的活性相对较高。
(4)、本发明采用的能量供应体系价格低，且在表达时能持续供应无细胞反应所需的能量。
(5)、本发明采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体脂质体，制备的脂质体粒径小，浓度更大，粒径分布均匀，能结合更多的信号蛋白，蛋白表达量更大，活性更高。
(6)、本发明采用连续交换操作型方式进行蛋白表达，即采取连续性物质交换反应，提高了表达量，反应时间可以长达36个小时。
附图说明
图1为分别采用BL21(DE3)菌株和ROSETTA(DE3)菌株制备的S30提取液进行的无细胞表达电泳对比图。
图2为分别添加超声法和超临界法制备的脂质体后的无细胞表达电泳对比图。
具体实施方式
本申请通过提供一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统，解决了信号蛋白表达量低的问题。
本申请实施例无细胞表达信号蛋白的方法，包括：
1、将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；
2、采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；所述大肠杆菌抽提物用于提供转录、翻译因子和各种酶。
3、配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)和磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)和葡萄糖；所述能量供应体系用于提供合成所需的ATP；
4、配制氨基酸母液及盐溶液；所述氨基酸母液用于提供合成所需的氨基酸原料，所述盐溶液用于提供合成蛋白所需的舒适环境和底物；
5、采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；
6、将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸母液、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达。
步骤1中，表达载体的构建方法如下：
以总RNA为模板，参考RT-PCR试剂盒操作步骤进行RT-PCR反应。用1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。采用50μL的反应体系，具体如下所示：水(无核酸酶)22μL，AMV/Tfi 5×反应缓冲液10μL，dNTP混合物(每dNTP 10mmol/L)1μL，上游引物(10pmol/μL)5μL，下游引物(10pmol/μL)5μL，MgSO4(25mmol/L)2μL，轻微涡旋混匀后加入AMV反转录酶(5U/μL)1μL，DNA聚合酶(5U/μL)1μL，轻微振荡10s后加入模板RNA3μL。RT-PCR反应条件：50℃45min，反转录反应；94℃2min，灭活反转录酶及预变性；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃最终延伸10min，同时设立无菌水为模板的阴性对照。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，按照凝胶产物回收试剂盒说明书对目的片段切胶回收，将回收产物与PMD18-TVector按照摩尔比3∶1，在16℃条件下连接12h。然后将连接产物转化DH5α感受态细胞并涂布平板，挑取单个白色菌落提取质粒进行PCR和双酶切鉴定。
从阳性克隆菌株中提取质粒DNA，以其为模板，利用上述引物进行PCR扩增。然后用EcoRI和NotI限制性内切酶对PCR产物及pIX3.0载体分别进行双酶切，酶切产物参考1.2.4中的方法进行回收、连接、转化和质粒提取，经PCR和双酶切方法鉴定为阳性的重组质粒，并进行测序鉴定进一步验证结果。
步骤2中，以测OD的方式确定大肠杆菌表达对数期，选择对数生长期的细菌作为抽提物制备的原材料是最合适的，通过培养大肠杆菌，测定OD值来检测生长对数期。Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间,此时的菌体代谢旺盛，采用此生长阶段对数期的大肠杆菌菌体制备得到抽提物的活性相对较高。
所述S30缓冲液包括：
步骤3中，能量供应体系的建立如下:
以葡萄糖，丙酮酸盐和磷酸肌酸三种能量物质作为二次能量供应体系，建立ATP再生系统，反应式为
Glucose+2ADP+2Pi+2NAD+→2pyruvate+2ATP+2H2O+2NADH+2H+
CPK+PC+ADP→CPK+Creatine+ATP，
CPK–肌酸激酶,PC–磷酸肌酸，C–肌酸
Pyruvate+CoA+NAD→NADH+Acetyl-CoA+CO2
Acetyl-CoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O→CoA-SH+3NADH+3H+FADH2+GTP+2CO2,GTP+ADP→GDP+ATP
按照以上反应式，三种能量系统需要的物质包括ATP、GTP、NAD、CoA、丙酮酸激酶、cAMP、磷酸肌酸、肌酸激酶、丙酮酸钠以及葡萄糖。而且反应需要的阳离子为镁离子和钾离子。
步骤4中，所述氨基酸包括20种，分别是：Alanine、Arginine、Asparagine、Aspartic acid、Cysteine、Glutamic acid、Glutamine、Glycine、Histidine、Isoleucine、Leucine、Lysine、Methionine、Phenylalanine、Proline、Serine、Threonine、Trptophan、Tyrosine以及Valine。
步骤5中，所述采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体为：将大豆卵磷脂、胆固醇溶解于乙醇中，配得卵磷脂乙醇溶液，打开超临界二氧化碳高压釜，将卵磷脂乙醇溶液混合液加入其中。密闭高压釜，经二氧化碳高压泵打入CO2，调整适宜的温度和压力，在指定的超临界温度、压强和时间下进行孵化制备脂质体，孵化结束后泄压释放CO2，旋转蒸发除去乙醇后，得到脂质体混悬液，置冰箱中4℃保存。制备的脂质体粒径小，浓度更大，能结合更多的信号蛋白，蛋白表达量更大，活性更高。考虑到该受体的生物活性和脂质体制备的难度，选择在无细胞体系加入12mg/mL脂质体作为可溶性表达。
步骤6中所述表达时为连续性物质交换反应，通过半透膜向无细胞蛋白表达体系的反应液中连续加入补充液，用于进行高效的物质交换，及时去掉反应液的副产物，补充无细胞反应所需的底物和能量。所述表达反应时间可达36小时。
本申请实施例无细胞表达蛋白质的系统，包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)，所述能量供应体系包括丙酮酸(PEP)/丙酮酸激酶(PK)和磷酸肌酸(CP)/肌酸激酶(CK)和葡萄糖，所述卵磷脂/胆固醇脂质体的粒径为100-200nm。
上述无细胞表达信号蛋白系统应用于表达信号蛋白。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
实施例1：以猪β2肾上腺素受体为例进行本申请实施例的无细胞信号蛋白表达。
1)、表达载体的构建
以所提的猪肝细胞总RNA为模板，参考RT-PCR试剂盒操作步骤进行RT-PCR反应。用1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。采用50μL的反应体系，具体如下所示：水(无核酸酶)22μL，AMV/Tfi 5×反应缓冲液10μL，dNTP混合物(每dNTP 10mmol/L)1μL，上游引物(10pmol/μL)5μL，下游引物(10pmol/μL)5μL，MgSO4(25mmol/L)2μL，轻微涡旋混匀后加入AMV反转录酶(5U/μL)1μL，DNA聚合酶(5U/μL)1μL，轻微振荡10s后加入模板RNA 3μL。RT-PCR反应条件：50℃45min，反转录反应；94℃2min，灭活反转录酶及预变性；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃最终延伸10min，同时设立无菌水为模板的阴性对照。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，按照凝胶产物回收试剂盒说明书对目的片段切胶回收，将回收产物与PMD18-TVector按照摩尔比3∶1，在16℃条件下连接12h。然后将连接产物转化DH5α感受态细胞并涂布平板，挑取单个白色菌落提取质粒进行PCR和双酶切鉴定。将经以上步骤鉴定为阳性的重组质粒进行测序鉴定，序列表如SEQ ID NO.1所示，鉴定正确的质粒命名为pMD-18T-β2AR。
上游引物(F)：5′-CCGGAATTCGGGCAGCCCGGGAAC-3′
下游引物(R)：5′--AAAGCGGCCGCCAGCATGGAGTCATTTGTAC-3′
从阳性克隆菌株中提取质粒DNA，以其为模板，利用上述引物进行PCR扩增。然后用EcoRI和NotI限制性内切酶对PCR产物及pIX3.0载体分别进行双酶切，酶切产物按照胶回收试剂盒说明书的方法进行回收、连接、转化和质粒提取，经PCR和双酶切方法鉴定为阳性的重组质粒，并命名为pIX3.0-β2AR，并进行测序鉴定进一步验证结果。
2)、无细胞表达系统的构建
2.1大肠杆菌S30提取液的制备：
将种子液接到2×YT培养基，30℃培养。待OD600达到0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)。OD600≈3时，离心收菌。将每克湿菌体用20mL S30缓冲液A在4℃下冲洗3次，在液氮中浸2min后保存于-70℃，1～3d。将细胞用S30缓冲液A解冻重悬，4℃下离心收集，每克菌体重悬于1.27mL的S30缓冲液B中。130MPa的压强下，高压破碎菌体3次。立即离心2次(4℃，30000×g，30min)，取上清。加入0.3倍体积的预孵化缓冲液，37℃孵育80min。之后将粗提物装入透析管中，每7g湿菌在750mL S30缓冲液B中4℃下透析4次，每次45min。4℃、4000×g离心10min，吸取上清，分装至离心管中，在液氮中浸2min，贮存于-70℃。
S30缓冲液中成分与含量如下：
Figure BDA0000994488170000081
2.2能量供应体系的建立
能量供应体系中各成分及其用量如下表1：
表1
序号 试剂 使用浓度 储存温度
1 ATP 1-1.5mM -20℃
2 GTP 1.2-1.5mM -20℃
3 NAD 0.3-0.5mM -20℃
4 CoA 0.2-0.3mM -20℃
5 丙酮酸激酶 2.8μg/mL -20℃
6 cAMP 0.64mM -20℃
7 磷酸肌酸 50-70mM -20℃
8 肌酸激酶 0.3U/μL -20℃
9 丙酮酸钠 30-50mM -20℃
10 葡萄糖 60-80mM -20℃
2.3氨基酸母液及其他添加成分的配制
氨基酸母液的成分及用量见下表2，其他添加成分及用量见表3；
表2
Figure BDA0000994488170000092
表3
序号 试剂 使用浓度 储存温度
1 醋酸镁 2-15mM -20℃
2 谷氨酸钾 75-200mM -20℃
3 醋酸钠 20-30mM -20℃
4 亚叶酸 0.1-0.5mg/mL -20℃
5 tRNA混合液 0.17-0.2mg/mL -20℃
6 HEPES-KOH 30-50mM -20℃
7 DTT 1.2-2.5mM -20℃
8 PEG8000 1.8-2％ -20℃
9 亚精胺 0.25mM -20℃
10 RNA酶抑制剂 0.3U/μL -20℃
11 草酸 4.0mM -20℃
12 UTP 0.8-1.2mM -20℃
13 CTP 0.8-1.2mM -20℃
14 DnaK蛋白 0.1-0.5mM -20℃
2.4脂质体的制备和添加
将大豆卵磷脂、胆固醇溶解于乙醇中，配得卵磷脂乙醇溶液，打开超临界二氧化碳高压釜，将卵磷脂乙醇溶液混合液加入其中。密闭高压釜，经二氧化碳高压泵打入CO2，调整适宜的温度和压力，在指定的超临界温度、压强和时间下进行孵化制备脂质体，孵化结束后泄压释放CO2，旋转蒸发除去乙醇后，得到脂质体混悬液，置冰箱中4℃保存。在无细胞体系加入12mg/mL脂质体作为可溶性表达，所述卵磷脂/胆固醇脂质体的粒径为100-200nm。
2.5.连续交换操作器操作
补充液成分：
Figure BDA0000994488170000102
Figure BDA0000994488170000111
反应液成分：
Figure BDA0000994488170000112
Figure BDA0000994488170000121
反应液和补充液之间用截留分子量10kDa的半透膜间隔开，连续反应36个小时。小型的塑料盒经改造后作为补充液(FM)的容器，而封闭的透析容器，例如Falcon管或者塑料瓶经改造和安装合适的半透膜后作为反应液(RM)的容器。无细胞合成体系起始后置于20-30℃的恒温环境(水浴或者恒温箱)以150～200rpm的速率震荡或者搅拌，以确保反应液(RM)和补充液(FM)通过半透膜进行高效的物质交换，及时去掉反应液(RM)的副产物，补充无细胞反应所需的底物和能量。
2.6测量反应后ATP浓度确定反应时间
使用碧云天ATP检测试剂盒，每隔半小时取一次无细胞表达的反应液，通过以下方法测定ATP浓度：
检测步骤a.加100微升ATP检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5分钟，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底。
b.在检测孔或检测管内加上20微升样品或标准品，迅速用微量移液器混匀，至少间隔2秒后，用测光仪(luminometer)或液闪仪测定RLU值或CPM。
2.7表达蛋白的检验
(1)以罗氏RTS100为对照，计算表达量：经PCR扩增从质粒pMD-18T-β2AR得到了β2AR基因，利用pGEM-T载体作介导，定向克隆(NcoI和XhoI)至表达载体pIVEX2.4c，得到pIVEX2.4c-β2AR。用大肠杆菌无细胞蛋白质合成试剂盒(RTS100 E.coli HY kit)做体外反应。试剂盒中包含：大肠杆菌抽提物、20种氨基酸、T7RNA聚合酶和低分子量(LM)混合物等。再外加自行构建的质粒pIVEX2.4c-β2AR。反应在96孔板上进行，每个反应的体积是50μl。在30℃，220rpm的条件下反应4h后，通过SDS-PAGE来检测β2AR的表达情况。罗氏的RTS100的批次表达量可以达到650μg/mL,而本发明的抽提物CECF连续表达量可以达到5mg/mL，远大于罗氏的RTS100抽提物。
(2)以配体受体检测试验来证明表达活性
a.β2激动剂瘦肉精偶联生物素生物素标记瘦肉精操作步骤如下：4mg NHS修饰的Biotin(BNHS)和10mg瘦肉精溶于200μL二甲基甲酰胺，随后在室温缓慢摇振反应4h。最后将反应后的溶液滴加到15mL冰水中，过滤沉淀,并用冷水洗5次，真空干燥。以CH2Cl2-MeOH(体积比9:1)为洗脱剂，用柱色谱提纯瘦肉精并用HPLC检测纯度99％。
b.标准样品的制备瘦肉精溶于PBS缓冲溶液配制成质量浓度为1μg/mL的标准使用溶液，向已知无抗奶中加入此溶液调配含瘦肉精质量浓度一定的标准样品。随后，标准样品置于摇床15min充分混匀。
c.受体吸附分析步骤:4℃条件下，一定量β2肾上腺素受体固定在微孔板表面(加盖)过夜。在使用0.01mol/L PBS缓冲溶液(1.47g/L Na2HPO4，0.43g/L KH2PO4和6.79g/LNaCl；pH7.2)冲洗后，继续使用2％酪蛋白溶液封闭来避免非特异性吸附。然后使用PBS缓冲溶液冲洗3次，加100μL待测样品(做3个平行样)。如果样品中含有β2激动剂，β2激动剂将被β2肾上腺素受体所吸附并依据含量部分或全部占据其瘦肉精结合靶点。在恒温条件下培养30min后，加入100μL生物素化瘦肉精以占据余下的瘦肉精结合位点。经过30min培养后，使用清洗溶液(8.55g/L NaCl和0.25mL/L Tween-20)及PBS缓冲溶液清洗两次，加入100μL辣根过氧化物酶标记的亲和素(1:1500)培养30min以特异性吸附β2肾上腺素受体与生物素化瘦肉精复合体。使用清洗溶液和PBS缓冲溶液冲洗微孔板之后，加入100μL酶底物溶液。在反应进行10min后加入100μL 1mol/L HCl(H2SO4)以终止酶反应。若样品中含有瘦肉精残留，β2肾上腺素受体与生物素化瘦肉精复合物的生成量也就会少些，则复合物所能吸附的酶标亲和素的量相应的也会少些，最终导致酶解液的吸光度变小。即样品中的瘦肉精浓度与微孔中酶解液的吸光度呈反比。实验证明本发明制备的β2肾上腺素受体可以用于检测瘦肉精等β2激动剂。
(3)以BL21(DE3)菌株的表达量来对照ROSETTA(DE3)的表达量。
区别在于选BL21(DE3)的对数生长期在3-7h之间。Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间，此时的菌体代谢旺盛，采用此生长阶段对数期的大肠杆菌菌体制备得到抽提物的活性相对较高。分别以对数生长期的大肠杆菌进行S30抽提，抽提物进行无细胞表达，SDS-PAGE电泳鉴定表达量。如图1所示，泳道1是BL21(DE3)菌株制备的S30提取液进行的无细胞表达电泳图，泳道2是ROSETTA(DE3)菌株制备的S30提取液进行的无细胞表达电泳图，可以看出采用ROSETTA(DE3)菌株能更好的表达真核细胞的基因，Marker分子量116kDa,66kDa,45kDa,35kDa,25kDa,18kDa,14kDa。
(4)以超声法制备的脂质体来对照超临界法制备的脂质体。
超声法制备的脂质体：称取0.03g大豆脂质提取物粉末，溶解于适量三氯甲烷中，彻底溶解后用真空蒸发除去三氯甲烷，加入1ml水合缓冲液在55℃搅拌孵育1h，之后超声5-10min至溶液变澄清，即得到30mg/ml的脂质体。
对照本发明的超临界法制备的脂质体，表达完后的产物分离含信号蛋白的脂质体，比较表达量和表达活性，表达量通过SDS-PAGE检测，表达活性通过配体分析法进行分析。电泳结束后，用Epson扫描仪成像。如图2所示，泳道1是采用添加超声法制备的脂质体后的无细胞表达电泳图，泳道2是采用添加超临界法制备的脂质体后的无细胞表达电泳图，可以看出采用添加超临界法制备的脂质体有更高的表达量，且多为可溶性表达。
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
(1)、本发明无细胞蛋白表达系统的蛋白表达量大，大肠杆菌抽提物CECF连续表达量可以达到5mg/mL，解决了真核细胞或信号蛋白表达量不高的问题。
(2)、本发明无细胞蛋白表达系统表达的信号蛋白具有活性，结构正确。
(3)、本发明大肠杆菌提取液采用能避免密码子偏好的ROSETTA(DE3)菌种来制备，采用S30缓冲液提取大肠杆菌核糖体，降低了杂蛋白含量；本发明以测OD的方式确定大肠杆菌表达对数期，选取Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间时，此时的菌体代谢旺盛，采用此生长阶段对数期的大肠杆菌菌体制备得到抽提物的活性相对较高。
(4)、本发明采用的能量供应体系价格低，且在表达时能持续供应无细胞反应所需的能量。
(5)、本发明采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体脂质体，制备的脂质体粒径小，浓度更大，粒径分布均匀，能结合更多的信号蛋白，蛋白表达量更大，活性更高。
(6)、本发明采用连续交换操作型方式进行蛋白表达，即采取连续性物质交换反应，提高了表达量，反应时间可以长达36个小时。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉华美生物工程有限公司
<120> 一种无细胞表达信号蛋白的方法及表达系统
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1257
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400>
ATGGGGCAGCCCGGGAACCGCAGCGTCTTCTTGCTGGCGCCCAACGGAAGCCATGCGCCG 6 0
GACCAGGACGTCCCACAGGAGCGGGACGAGGCATGGGTGGTGGGCATGGCCATCGTCATG 120
TCGCTCATTGTCCTGGCCATCGTGTTTGGAAACGTGCTGGTCATCACAGCCATCGCCAAG 180
TTCGAGCGTCTCCAGACGGTCACCAACTACTTCATCACCTCCCTGGCCTGTGCTGACTTG 240
GTCATGGGCCTGGCGGTGGTGCCCTTTGGGGCCAGCCACATCCTCATGAAAATGTGGACT 300
TTCGGCAGTTTCTGGTGCGAGTTTTGGATTTCCATTGACGTGCTGTGCGTCACGGCCAGC 360
ATTGAGACCCTGTGCGTGATCGCCGTGGATCGCTACCTTGCCATCACGTCCCCCTTCAAG 420
TACCAGTGCCTGCTGACCAAGAACAAGGCCCGGGTGGTCATTCTGATGGTGTGGGTCGTG 480
TCGGGCCTTATCTCCTTCTTACCCATTAAGATGCACTGGTACCAGGCCACCCACCGGGAA 540
GCCTTAAACTGCTATGCAGAGGAGGCCTGCTGCGACTTCTTCACCAACCAGCCTTACGCC 600
ATCGCCTCTTCCATCGTGTCCTTCTACCTGCCCCTGGTAGTCATGGTCTTCGTCTACTCC 660
AGGGTCTTTCAAGTAGCCAGAAGGCAGCTCCAGAAGATCGACAAGTCTGAGGGCCGCTTC 720
CACGCCCAGAACCTCAGCCAAGCGGAGCAGGATGGGCGGAGCGGGCCGGGACATCGGAGG 780
TCCTCCAAGTTCTGCTTGAAGGAACACAAAGCCCTCAAGACGCTAGGGATCATCATGGGG 840
ACGTTCACCCTGTGCTGGCTGCCCTTCTTCATCGTCAACATTGTGCACGGGATCCATGAC 900
AACCTCATCCCCAAGGAAGTTTACATCCTGCTAAACTGGGTGGGCTACGTCAACTCGGCG 960
TTCAACCCCCTCATCTACTGCCGGAGTCCAGATTTCAGGATGGCCTTCCAGGAGCTTCTG 1020
TGCCTGCACAGGTCTTCCCTGAAGGCCTATGGGAATGGCTGCTCCAGCAACAGCAACGGT 1080
AGGACTGACTACACAGGGGAACAGAGTGGCTGTTACCTGGGGGAGGAGAAAGACAGCGAA 1140
CGGCTGTGTGAGGACGCCCCAGGCCCGGAAGGCTGTGCACACCGGCAAGGTACTGTGCCC 1200
GATGATAGCACTGATTCACAGGGGAGGAACTGTAGTACAAATGACTCCATGCTGTGA 1257

Claims (6)

1.一种无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：
将信号蛋白目标基因连接到pIX3.0载体上，获得表达质粒；
采用S30缓冲液提取大肠杆菌，得到大肠杆菌抽提物，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)；
配制能量供应体系，所述能量供应体系包括丙酮酸/丙酮酸激酶、磷酸肌酸/肌酸激酶以及葡萄糖；
配制氨基酸混合物及盐溶液；采用超临界法制备卵磷脂/胆固醇脂质体；
将所述表达质粒加入到包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体的无细胞蛋白表达系统中进行表达，所述表达时为连续性物质交换反应，通过半透膜向无细胞蛋白表达体系的反应液中连续加入补充液；
所述能量供应体系包括三磷酸腺苷、鸟苷三磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、辅酶A、丙酮酸激酶、环磷酸腺苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、丙酮酸钠以及葡萄糖；所述盐溶液包括醋酸镁、谷氨酸钾和醋酸钠；
所述氨基酸包括：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨基酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸；
所述目标基因为G蛋白偶联受体的质粒DNA或其直接的PCR产物。
2.根据权利要求1所述的无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述Rosetta(DE3)菌株的对数生长期在3-5h之间。
3.根据权利要求1所述的无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述S30缓冲液包括：
Figure FDA0002287860150000011
4.根据权利要求1所述的无细胞表达信号蛋白的方法，其特征在于：所述卵磷脂/胆固醇脂质体在无细胞蛋白表达系统中的加入量为12mg/mL。
5.如权利要求1-4任一项所述的无细胞表达信号蛋白的方法中使用的表达系统，其特征在于：包括大肠杆菌抽提物、能量供应体系、氨基酸混合物、盐溶液以及卵磷脂/胆固醇脂质体，所述大肠杆菌菌种为Rosetta(DE3)，所述能量供应体系包括丙酮酸/丙酮酸激酶、磷酸肌酸/肌酸激酶和葡萄糖。
6.如权利要求1-4任一项所述的无细胞表达信号蛋白的方法中使用的表达系统在信号蛋白表达中的用途。
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