CN111378706A - 通过Edc3基因敲除改变体外蛋白合成能力的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种改变体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的方法，其在真核生物的基因组中通过基因编辑技术将Edc3基因敲除，并将其用于体外无细胞蛋白合成体系。经试验验证，Edc3基因敲除能显著提高无细胞蛋白合成体系的蛋白表达能力。同时，本发明提供包含利用该基因改造方法进行改造的基因工程细胞的无细胞蛋白质合成体系及其蛋白合成方法及相应的试剂盒。

Description

通过Edc3基因敲除改变体外蛋白合成能力的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及Edc3基因敲除可以增强真核生物无细胞蛋白反应体系的蛋白合成能力。

背景技术

体外无细胞蛋白合成体系是指以外源的mRNA或者DNA为模板，利用细胞抽提物的酶系中来合成蛋白质的体外系统。与传统的体内重组表达系统相比，无细胞蛋白反应体系有很多优点，如可以表达具有细胞毒性的蛋白或者含有非天然氨基酸的特殊蛋白质，而且利用其操作简便性可以进行高通量药物筛选和蛋白质组学研究。目前常用的无细胞蛋白质合成系统包括原核的大肠杆菌系统，真核的麦胚提取物、兔网织红细胞裂解物以及酵母细胞抽提物系统。其中酵母细胞可以通过发酵途径大量获取，兼具真核系统的蛋白修饰功能和大规模工业化应用的优势。但是目前市场上还没有真正可产业化的体外无细胞蛋白合成系统，不高的蛋白合成能力，昂贵的合成成本是制约这一技术的主要因素之一。

Edc3 (Enhancer of mRNA-decapping protein 3)基因在真核生物中相对保守，其编码的蛋白产物能促进mRNA 5’去帽酶复合体的功能，去除5’帽子结构的mRNA更容易被细胞中的核酸外切酶进行5’到3’的降解。在酵母细胞中，Edc3和Pat1与翻译被抑制的mRNA结合，它们作为骨架蛋白进一步招募其他蛋白，比如Dhh1，Scd6，Dcp1/Dcp2, Lsm1-7和Xrn1等；这些蛋白形成的复合体进一步抑制mRNA的翻译，同时使得mRNA上结合的翻译因子进一步与mRNA脱离；然后蛋白复合体对mRNA 5’进行去帽，并进一步降解。除了作为mRNA 5’去帽的激活因子以外，在酵母中将Edc3基因敲除能上调YRA1和RPS28B两个基因的mRNA，其中YRA1参与到mRNA出核的早期过程，RPS28B是核糖体40S亚基的一个组成成分。

综上所述，Edc3能和RNA结合并且招募抑制翻译的Dhh1和Scd6蛋白以及降解mRNA的外切酶Xrn1，故推测Edc3蛋白可能对外源的mRNA模板翻译有抑制作用并导致其降解，同时Edc3的存在能抑制RPS28B基因转录从而导致核糖体的功能下降。故本发明通过敲除Edc3，测试其敲除是否对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力产生影响。

参考文献

1.Parker R. RNA degradation in Saccharomyces cerevisae. Genetics，2012.191:671-702.

2.Feng He, Chunfang Li, Bijoyita Roy, Allan Jacobson. Yeast Edc3 targetsRPS28B mRNA for decapping by binding to a 3’ untranslated region decay-inducing regulatory element. Molecular and Cellular Biology, 2014. 34: 1438–1451.

3.Nissan T., Rajyaguru P., She M., Song H., Parker R.Decapping activatorsin Saccharomyces cerevisiae act by multiple mechanisms. Mol. Cell, 2010. 39:773-783.

4.Harigaya Y., Jones B.N., Muhlrad D., Gross J.D., Parker R.Identification and analysis of the interaction between Edc3 and Dcp2 inSaccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol, 2010. 30:1446-1456.

5.Sharif H., Ozgur S., Sharma K., Basquin C., Urlaub H., Conti E.Structural analysis of the yeast Dhh1-Pat1 complex reveals how Dhh1 engagesPat1, Edc3 and RNA in mutually exclusive interactions. Nucleic Acids Res,2013. 41:8377-8390.

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9.He F., Li C., Roy B., Jacobson A. Yeast Edc3 targets RPS28B mRNA fordecapping by binding to a 3' untranslated region decay-inducing regulatoryelement.Mol. Cell. Biol, 2014. 34:1438-1451。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种提高体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的方法，从分子水平提高无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力，从而能够进一步实现无细胞蛋白合成体系节约成本、操作简单的目的。

本发明主要包括以下几个方面：

第一方面，提供一种改变体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）将待改造的真核细胞中原始存在的Edc3基因通过基因编辑技术去除，获得ΔEdc3改造菌株；

（2）以上述ΔEdc3改造菌株制备细胞裂解液或细胞提取物；

（3）将步骤（2）获得的细胞裂解液或细胞提取物用于体外无细胞蛋白质合成体系。

进一步的，所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。

进一步的，所述酵母细胞选自酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母之一或其任意组合。

进一步的，所述克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母之一或其任意组合。

第二方面，提供一种体外无细胞蛋白合成体系，所述合成体系至少包括以下组分：细胞裂解液或细胞提取物，所述细胞裂解液或细胞提取物由ΔEdc3改造菌株制备获得，所述ΔEdc3改造菌株为将待改造的真核细胞中原始存在的Edc3基因通过基因编辑技术去除获得。

进一步的，第二方面的所述合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：用于合成RNA的底物，用于合成蛋白的底物，聚乙二醇或其类似物，镁离子，钾离子，缓冲剂，RNA聚合酶，能量再生系统，二硫苏糖醇(DTT)，任选的水或水性溶剂。

第三方面，提供一种合成外源蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(i) 提供第二方面所述的体外无细胞蛋白合成体系；

(ii) 添加编码外源蛋白的DNA分子模板，在适合的条件下，孵育一段时间，合成所述的外源蛋白。

进一步的，第三方面的所述方法还包括：(iii)分离或检测所述外源蛋白。

进一步的，合适的条件包括反应温度为20-35℃，优选的为20-30℃，更优选的为25℃。

进一步的，孵育一段时间具体为0.5-20h，优选的为1-18h，更优选的为2-15 h，更优选的为3-12h；上述反应时间可根据具体情况人为确定，也可以为3-15h，也可以为3-20h，也可以为具体的时间点，如3h、5h、10h、15h、18h、20h。

第四方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒包括容器以及位于所述容器中的第二方面所述的体外无细胞蛋白合成体系中的组分。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明通过基因定向改造以及活性测定，首次验证敲除Edc3基因可以提高体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力；

(2)本发明通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对Edc3进行基因敲除改造，从而改变体外蛋白质合成能力；

(3)通过体外无细胞蛋白合成体系验证基因敲除对蛋白表达的影响，并依托无细胞蛋白体系的低成本、试验方便等优点，为基因定向改造提供试验研究平台。

(4)所形成的体外无细胞蛋白合成体系能够进一步实现降低成本、操作简单的目的。

附图说明

图1是pCas9_Edc3_gRNA1图谱示意图。该质粒带有K.lactis SNR52启动子和SNR52终止子，并带有kana筛选标记。

图2是pCas9_Edc3_gRNA2图谱示意图。

图3是pKMD1-ΔEdc3的质粒图谱示意图。KlEdc3的起始密码子上游879bp是HR1，终止密码子下游的888bp是HR2，质粒带有Amp筛选标记。

图4是ΔEdc3菌株和野生型菌株体外无细胞蛋白合成体系绿色荧光蛋白合成量的比较。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现Edc3基因敲除的细胞与野生型未改造细胞相比，能显著提高体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力，提高外源蛋白的表达产量。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

5’去帽复合体（decappingcomplex）

mRNA的5’去帽复合体是细胞中对mRNA的5’帽子结构进行去除的蛋白酶复合体。在酵母细胞中，该复合体主要包括催化亚基Dcp1/Dcp2和激活因子Pat1，Edc3，Dhh1，Scd6，以及负责对mRNA进行5’到3’降解的外切酶Xrn1。目前对该复合体参与的mRNA去帽以及降解过程主要为：首先，和帽子结合的翻译因子包括eIF4E和eIF4G从mRNA上脱离，从而暴露出5’帽子结构；其次，去帽酶复合体通过和mRNA结合的Edc3和Pat1等骨架蛋白被招募到mRNA上；最后就是具有Dcp2催化去帽反应，去掉帽子结构的mRNA迅速被Xrn1进行降解。

体外无细胞蛋白合成体系

本发明提供了一种表达外源蛋白的体外无细胞蛋白合成体系，所述合成体系主要至少包括：细胞裂解液或细胞提取物；所述细胞裂解液或细胞提取物来自于所述的Edc3敲除工程细胞，该工程细胞提取物中不含有Edc3基因的表达产物，即为ΔEdc3改造菌株制备细胞裂解液或细胞提取物。

进一步的，所述合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：用于合成蛋白质的底物、用于合成RNA的底物、RNA聚合酶、镁离子、钾离子、缓冲剂、能量再生系统、聚乙二醇(PEG)或其类似物、二硫苏糖醇(DTT)和任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂。

进一步的，所述细胞为真核细胞。所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。其中，所述酵母细胞选自酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母之一或其组合；克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母之一或其任意组合；较佳地，所述的酵母细胞为克鲁维酵母，更佳地为乳酸克鲁维酵母。

进一步的，所述细胞提取物为对酵母细胞的水性提取物。

进一步的，所述细胞提取物不含酵母内源性的长链核酸分子。

进一步的，所述的合成RNA的底物包括：核苷单磷酸、核苷三磷酸之一或其组合。

进一步的，所述的合成蛋白质的底物包括：20种天然氨基酸以及非天然氨基酸。

进一步的，所述镁离子来源于镁离子源，所述镁离子源选自下组：醋酸镁、谷氨酸镁之一或其组合。

进一步的，所述钾离子来源于钾离子源，所述钾离子源选自下组：醋酸钾、谷氨酸钾之一或其组合。

进一步的，所述能量再生系统选自下组：磷酸肌酸/磷酸肌酸酶系统、糖酵解途径及其中间产物能量系统之一、蔗糖或其组合。

进一步的，所述缓冲剂选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷之一或其组合。

进一步的，所述蛋白合成体系含有聚乙二醇(PEG)或其类似物。聚乙二醇或其类似物的浓度没有特别限制，通常，聚乙二醇或其类似物的浓度 (w/v)为0.1-8%，较佳地，0.5-4%，更佳地，1-2%，以所述蛋白合成体系的总重量计。代表性的PEG选自下组：PEG3000、PEG3350、PEG6000、PEG8000之一或其组合。

进一步的，所述聚乙二醇包括分子量(Da)为200-10000的聚乙二醇，如PEG200、400、1500、2000、4000、6000、8000、10000等，较佳地，分子量为3000-10000的聚乙二醇。

可选的方案为，本发明提供的蛋白合成体系包括：酵母细胞提取物，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，醋酸钾，醋酸镁，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)，胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)，胸腺嘧啶核苷三磷酸(TTP)，氨基酸混合物，磷酸肌酸，二硫苏糖醇(DTT)，磷酸肌酸激酶，RNA聚合酶，聚乙二醇，蔗糖。

在本发明中，所述的细胞提取物不含完整的细胞，典型的细胞提取物包括用于蛋白翻译的核糖体、转运RNA、氨酰tRNA合成酶、蛋白质合成需要的起始因子和延伸因子以及终止释放因子。此外，细胞提取物中还含有一些源自细胞的细胞质中的其他蛋白，尤其是可溶性蛋白。

在本发明中，所述的细胞提取物所含蛋白含量为20-100mg/ml, 较佳为50-100mg/ml。所述的测定蛋白含量方法为考马斯亮蓝测定方法。

在本发明中，所述的细胞提取物的制备方法不受限制，一种优选的制备方法包括以下步骤：

(i)提供细胞；

(ii)对细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的细胞；

(iii)对经洗涤的细胞进行细胞破碎处理，从而获得细胞粗提物；

(iv)对所述细胞粗提物进行固液分离，获得液体部分，即为细胞提取物。

在本发明中，所述的固液分离方式不受特别限制，一种优选的方式为离心。

在本发明中，所述离心条件不受特别限制，一种优选的离心条件为5000-100000g，较佳地，8000-30000g。

在本发明中，所述离心时间不受特别限制，一种优选的离心时间为0.5min-2h，较佳地，20min-50min。

在本发明中，所述离心的温度不受特别限制，优选的，所述离心在1-10℃下进行，较佳地，在2-6℃下进行。

在本发明中，所述的洗涤处理方式不受特别限制，一种优选的洗涤处理方式为采用洗涤液在pH为7-8(较佳地，7.4)下进行处理，所述洗涤液没有特别限制，典型的所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾、醋酸钾、醋酸镁、或其组合。

在本发明中，所述细胞破碎处理的方式不受特别限制，一种优选的所述的细胞破碎处理包括高压破碎、冻融(如液氮低温)破碎。

所述蛋白合成体系中的核苷三磷酸混合物为腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸。在本发明中，各种单核苷酸的浓度没有特别限制，通常每种单核苷酸的浓度为0.5-5mM，较佳地为1.0-2.0mM。

所述蛋白合成体系中的氨基酸混合物可包括天然或非天然氨基酸，可包括D型或L型氨基酸。代表性的氨基酸包括(但并不限于) 20种天然氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。每种氨基酸的浓度通常为0.01-0.5mM，较佳地0.02-0.2mM，如0.05、0.06、0.07、0.08 mM。

在优选例中，所述体外无细胞蛋白合成体系还含有蔗糖，所述蔗糖的浓度为0.03-40wt%，较佳地，0.08-10wt%，更佳地，0.1-5wt%，以所述蛋白合成体系的总重量计。

一种特别优选的体外无细胞蛋白合成体系，除了酵母细胞提取物之外，还含有以下组分：22 mM pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，30-150 mM醋酸钾，1.0-5.0 mM醋酸镁，1.5-4 mM核苷三磷酸混合物，0.08-0.24 mM的氨基酸混合物，25 mM磷酸肌酸，1.7mM二硫苏糖醇，0.27mg/mL磷酸肌酸激酶， 1%-4%聚乙二醇，0.5%-2%蔗糖， 0.027-0.054 mg/mL T7RNA聚合酶。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。

本发明以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，K. lactis)为实施例，但同样的设计和分析、实验方法也适用于其他酵母等低等真核细胞以及高等动物细胞。本发明中的基因改造方法为CRISPR-Cas9技术，但并不限于此，可以为已知的、现有的任意基因改造方法。

实施例1 通过CRISPR-Cas9敲除Edc3基因

1.1 Edc3序列检索及CRISPR gRNA质粒的构建

根据酿酒酵母（S.cerevisiae）的Edc3蛋白序列比对，确定K.lactis细胞中Edc3的基因编号为KLLA0A11308g。在Edc3基因编码序列靠近5’和3’分别选择PAM序列(NGG)，并确定对应的gRNA序列。本实施例中gRNA选择的原则为：GC含量适中(40%-60%)，避免poly T结构的存在。在本实施例中，KlEdc3 基因gRNA1的序列为TCAAATTGAGATCGAATTGA，KlEdc3基因gRNA2的序列为GGACATATACCCGGGTTTCT（KlEdc3基因的核酸编码序列为SEQ No.1;相应的氨基酸序列为SEQ No.2）。

KlEdc3 gRNA1的质粒构建及转化方法如下：使用引物pCas9-Edc3-gRNA1-PF： TCAAATTGAGATCGAATTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和pCas9-Edc3-gRNA1-PR：TCAATTCGATCTCAATTTGAAAAGTCCCATTCGCCACCCG，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。取扩增产物17 µL，加入0.2µL Dpn I，2 µL 10 × digestion buffer，混匀后37℃水浴3 h。取Dpn I处理后产物10 µL加入50 µL DH5α感受态细胞中，冰上放置30 min，42℃热激45 s后，加入1 mL LB液体培养基37℃振荡培养1 h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取2个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pCas9_Edc3_gRNA1。

KlEdc3 gRNA2的构建方法如下：使用引物pCas9-Edc3-gRNA2-PF： GGACATATACCCGGGTTTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和pCas9-Edc3-gRNA2-PR：AGAAACCCGGGTATATGTCCAAAGTCCCATTCGCCACCCG，以pCAS质粒为模板，进行PCR扩增。转化及鉴定方法同上，阳性质粒命名为pCas9_Edc3_gRNA2。

1.2 Edc3敲除供体DNA质粒构建及扩增

以pMD18T质粒为模板，以引物pMD18T-PF：ATCGTCGACCTGCAGGCATG和pMD18T-PR：ATCTCTAGAGGATCCCCGGG进行PCR扩增，取扩增产物17 µL，加入1 µL DpnI，2 µL 10 ×digestion buffer，混匀后37℃水浴3 h，获得质粒骨架线性片段pMD18T-vector。

1.2.1 构建供体质粒pMD18T-ΔEdc3

以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，用引物KlEdc3-HR1-PF：CAGGAAACAGCTATGACTACCCGGGGATCCTCTAGAGATGGTAGCTCCAATAATCCAAG和KlEdc3-HR1-PR：ACACATCTATCTTTACAGATATAAGTCAAAAGTGACTTGTTCTATAAACT进行PCR扩增，产物名为Edc3-HR1；以乳酸克鲁维酵母基因组DNA为模板，利用引物KlEdc3-HR2-PF：AGAAGCTATAAGTTTATAGAACAAGTCACTTTTGACTTATATCTGTAAAG和KlEdc3-HR2-PR：GTAAAACGACGGCCAGTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATAACTCCAACAACGACGTCAC进行PCR扩增，产物名为Edc3-HR2；

将扩增产物Edc3-HR1、Edc3-HR2和pMD18T-vector各1µL，加入3µL Cloning Mix(Transgene pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit，全式金公司，下同)，混匀后50℃水浴1h。水浴结束后置于冰上2min，将6µL反应液全部加入50µL Trans-T1感受态细胞(全式金公司，下同)中，冰上放置30min，42 ℃热激30 s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pMD18T-ΔEdc3。

1.3 K. lactis电转化

从-80℃冰箱取出感受态，冰上融化，加入200 ng质粒pCas9_Edc3_gRNA1，200ng质粒pCas9_Edc3_gRNA2和通过引物对pMD18T-ΔEdc3扩增得到的1000ng供体DNA片段，混匀后全部转入电击杯中，冰浴 2 min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为1.5kV，200 Ω，25μF)；电击结束后立即加入 700μL YPD，30℃，200rpm摇床孵育1～3 h；取2～200 μL接种于YPD(含G418抗性)平板，30℃培养2～3天至单菌落出现。

1.4 阳性鉴定

在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞基因组为模板，利用鉴定引物ΔEdc3-CF:CGCATTTTAACCGTTTAGCC和ΔEdc3-CR:TCTGCTTACCGGACTAACAT对样品进行PCR检测。阳性菌株条带2004bp，阴性菌株条带3411bp。经测序鉴定的阳性细胞株，命名为ΔEdc3。

实施例2体外无细胞蛋白合成体系

2.1 细胞提取物（细胞裂解液）的制备

细胞提取液的制备方法包括以下步骤：

(i)提供细胞，细胞为实施例1制备的ΔEdc3细胞株；

(ii)对细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的细胞；

(iii)对经洗涤的细胞进行细胞破碎处理，从而获得细胞粗提物；

(iv)对所述细胞粗提物进行固液分离，获得液体部分，即为细胞提取物（细胞裂解液）。

其中，固液分离方式不受特别限制，本实施例选择的方式为离心。离心条件为30000×g；离心时间为30min；离心4^oC下进行。

其中，洗涤处理方式不受特别限制，本实施例选择的洗涤处理方式为采用洗涤液在pH为7.4下进行处理，所述洗涤液没有特别限制，典型的所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾、醋酸钾、醋酸镁、或其组合。本实施例选择醋酸钾。

其中，细胞破碎处理的方式不受特别限制，一种优选的所述的细胞破碎处理包括高压破碎、冻融(如液氮低温)破碎。

2.2 体外无细胞蛋白合成体系的配制

终浓度为22 mM pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，30-150 mM醋酸钾，1.0-5.0 mM醋酸镁，1.5-4 mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸)，0.08-0.24 mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，25 mM磷酸肌酸，1.7 mM二硫苏糖醇，0.027-0.054 mg/mL T7 RNA 聚合酶，0.27 mg/mL磷酸肌酸激酶， 1% - 4%的聚乙二醇，0.5% - 2%的蔗糖，最后加入50 %体积的细胞提取物。

2.3 体外无细胞蛋白合成反应

上述体系中加入15 ng/µL增强型绿色荧光蛋白DNA，混匀后放置在20-30 ℃的环境中反应3h。

增强型绿色荧光蛋白(eGFP)活性测定：反应结束后，在96孔白板或384孔白板中加入10 µL反应液，立即放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer), 读数，检测增强型绿色荧光蛋白活性，相对荧光单位值(Relative Fluorescence Unit，RFU)作为活性单位，如图4所示。

其中ΔEdc3表示Edc3敲除的乳酸克鲁维酵母细胞株，WT表示野生型的乳酸克鲁维酵母细胞株。反应时间为3h时，ΔEdc3的RFU平均值为1386，WT的RFU平均值是946，ΔEdc3是WT的约1.47倍。该对比数据表明通过基因编辑技术敲除Edc3基因，能够显著提高体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力。

本发明实施例结果表明：

与野生型细胞株相比，本发明的Edc3基因敲除细胞株体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力提高了约47%。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 康码（上海）生物科技有限公司

<120> 通过Edc3基因敲除改变体外蛋白合成能力的方法及其应用

<130> 2018

<141> 2018-12-27

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

<400> 1

atgttgaatt tcaagggtta tcaaattgag atcgaattga aggacggcaa acgtatcaca 60

ggtacgctga aacaggtgag ccccaagtct ttgacattga ctgatgctgt tttccaagat 120

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ttggcaacac caattcagtt gttggagatg gaaaaaatcg cagacgaaaa attcatgctt 660

ccattgaaga cttcattaga acactcagga atacacattt caaggttgtt gagaaacatg 720

ttgaaatcgt acacccctcc tgctacttcc gatagtgacg cagtccccac cgttgttgca 780

ttcgtatctg gtggaaggag tggatcacgt tgtatctccg cattgagatg tctactctac 840

atcaaggata tcagatgcat catcgtgaat ccattcatca acgaacgtga aagtttcgac 900

gatgacatct ctacagaaca aataaacaaa attaagactt taaacaacgt gcatttccct 960

gactctttgg ctaaattgaa ggaactctta caaaatgaac caccatccat catcattgac 1020

gccctacaag gtttcgacga tactgtatca gacctcgatt tctcccctga ttcaaacgac 1080

aacatcgcgc aatacatcaa gtggatcaac tcacacgaaa ccgtctctgc ttgccttgaa 1140

gtcatctctt tcgattgtcc agcacatata gacccatcgt caggtgacgt tatcgaatcc 1200

gatttcgttc atccaactac catcctatcc actggctggc cattgcattg tctacctaaa 1260

ttgacacaaa tcttacctga ctggagaaac acatacgtct acgatacagg tgtcccacaa 1320

caaacgtacc tcttgaaacc taacctaaga aagttctaca aattggacat atacccgggt 1380

ttctcgggta ctcaagaact aaaatga 1407

<210> 2

<211> 468

<212> PRT

<213> 乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)

<400> 2

Met Leu Asn Phe Lys Gly Tyr Gln Ile Glu Ile Glu Leu Lys Asp Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ile Thr Gly Thr Leu Lys Gln Val Ser Pro Lys Ser Leu Thr

20 25 30

Leu Thr Asp Ala Val Phe Gln Asp Gly Gly Val Ser Pro Val Phe Lys

35 40 45

Ile Lys Ala Asp Lys Leu Tyr Asp Leu Lys Val Leu Lys Leu Pro Pro

50 55 60

Asn Ala Asn Val Lys Met Asn Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn

65 70 75 80

Gly Lys Gln Glu Lys Glu Lys Glu Lys Gly Lys Glu Arg Asp Arg Phe

85 90 95

Thr Glu Lys Ala Asp Glu Ile Trp Asp Thr Glu Met Ser Ser Asp Phe

100 105 110

Asp Phe Gln Gly Asn Leu Gln Arg Phe Asn Lys Lys Asp Ala Phe Lys

115 120 125

Asp Phe Gln Asn Val Glu Ile Pro Lys Asp Glu Thr Lys Ile Pro His

130 135 140

Asn Glu Met Val Thr Ala Gly Asn Val Lys Glu Thr Thr Ser Asp Ser

145 150 155 160

Asp Lys Ile Thr Glu Ser Ile Asn Ile Thr His Leu Leu Arg Asn Asp

165 170 175

Ser Ile Ala Ala Ser Leu Ala Asn Gln Arg Lys Thr Phe Thr Cys Gly

180 185 190

Ser Lys Asn Lys Ile Lys Val Pro Leu Ala Thr Pro Ile Gln Leu Leu

195 200 205

Glu Met Glu Lys Ile Ala Asp Glu Lys Phe Met Leu Pro Leu Lys Thr

210 215 220

Ser Leu Glu His Ser Gly Ile His Ile Ser Arg Leu Leu Arg Asn Met

225 230 235 240

Leu Lys Ser Tyr Thr Pro Pro Ala Thr Ser Asp Ser Asp Ala Val Pro

245 250 255

Thr Val Val Ala Phe Val Ser Gly Gly Arg Ser Gly Ser Arg Cys Ile

260 265 270

Ser Ala Leu Arg Cys Leu Leu Tyr Ile Lys Asp Ile Arg Cys Ile Ile

275 280 285

Val Asn Pro Phe Ile Asn Glu Arg Glu Ser Phe Asp Asp Asp Ile Ser

290 295 300

Thr Glu Gln Ile Asn Lys Ile Lys Thr Leu Asn Asn Val His Phe Pro

305 310 315 320

Asp Ser Leu Ala Lys Leu Lys Glu Leu Leu Gln Asn Glu Pro Pro Ser

325 330 335

Ile Ile Ile Asp Ala Leu Gln Gly Phe Asp Asp Thr Val Ser Asp Leu

340 345 350

Asp Phe Ser Pro Asp Ser Asn Asp Asn Ile Ala Gln Tyr Ile Lys Trp

355 360 365

Ile Asn Ser His Glu Thr Val Ser Ala Cys Leu Glu Val Ile Ser Phe

370 375 380

Asp Cys Pro Ala His Ile Asp Pro Ser Ser Gly Asp Val Ile Glu Ser

385 390 395 400

Asp Phe Val His Pro Thr Thr Ile Leu Ser Thr Gly Trp Pro Leu His

405 410 415

Cys Leu Pro Lys Leu Thr Gln Ile Leu Pro Asp Trp Arg Asn Thr Tyr

420 425 430

Val Tyr Asp Thr Gly Val Pro Gln Gln Thr Tyr Leu Leu Lys Pro Asn

435 440 445

Leu Arg Lys Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Tyr Pro Gly Phe Ser Gly Thr

450 455 460

Gln Glu Leu Lys

465

Claims (10)

1.一种改变体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）将待改造的真核细胞中原始存在的Edc3基因通过基因编辑技术去除，获得ΔEdc3改造菌株；

（2）以上述ΔEdc3改造菌株制备细胞裂解液或细胞提取物；

（3）将步骤（2）获得的细胞裂解液或细胞提取物用于体外无细胞蛋白质合成体系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酵母细胞选自酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母之一或其任意组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母之一或其任意组合。

5.一种体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述合成体系至少包括以下组分：细胞裂解液或细胞提取物，所述细胞裂解液或细胞提取物由ΔEdc3改造菌株制备获得，所述ΔEdc3改造菌株为将待改造的真核细胞中原始存在的Edc3基因通过基因编辑技术去除获得。

6.根据权利要求5所述的合成体系，其特征在于：所述合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：用于合成RNA的底物，用于合成蛋白的底物，聚乙二醇或其类似物，镁离子，钾离子，缓冲剂，RNA聚合酶，能量再生系统，二硫苏糖醇(DTT)，任选的水或水性溶剂。

7.一种合成外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(i) 提供权利要求5-6任一项所述的体外无细胞蛋白合成体系；

(ii) 添加编码外源蛋白的DNA分子模板，在适合的条件下，孵育一段时间，合成所述的外源蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，合适的条件包括反应温度为20-35℃。

9.根据权利要求7或8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(iii)分离或检测所述外源蛋白。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括容器以及位于所述容器中的权利要求5-6任一项所述的体外无细胞蛋白合成体系的组分。

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