CN110904135B

CN110904135B - 蛋白质基础表达体系、合成系统及制备方法

Info

Publication number: CN110904135B
Application number: CN201911397087.XA
Authority: CN
Inventors: 杨修竹; 庄淼; 贺亮
Original assignee: Suzhou Perotin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Perotin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN110904135A

Abstract

本申请提供了一种蛋白质基础表达体系、合成系统及制备方法。蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；所述补充体系包括第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体。

Description

蛋白质基础表达体系、合成系统及制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质表达技术领域，特别是涉及一种蛋白质基础表达体系、合成系统及制备方法。

背景技术

重组蛋白现已广泛的应用到生物和生物医学领域。随着科学技术的发展，体外蛋白表达技术因其独特的开放体系特点，允许控制反应条件、反应物的组分、直接监控反应表达等优点，成为了一种强有力的蛋白表达方法。目前国内外能够进行体外蛋白表达的系统很多，例如原核表达系统大肠杆菌、真核表达系统酵母、麦胚、昆虫和人源系统等。其中原核表达系统大肠杆菌因其制备相对简单、价格低廉、蛋白产量高等优点成为最普遍使用的系统。

现有技术的蛋白合成系统，需要额外添加复杂配方的能量混合液、亚精胺等，存在成本高、配置困难、耗时较长、蛋白质的表达量低的问题。

发明内容

本发明提供了一种蛋白质基础表达体系、合成系统及制备方法，以解决现有技术成本高、配置困难、耗时较长的问题。

为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种蛋白质基础表达体系，包括：细胞提取物和补充体系；

所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体。

优选地，所述细胞提取物选自大肠杆菌细胞提取物、酵母细胞提取物、小麦胚芽提取物、昆虫细胞提取物、兔网织红细胞提取物、CHO细胞提取物中的任意一种或几种的任意组合。

优选地，所述细胞提取物的体积占蛋白质基础表达体系的20％-50％；例如，可以列举的为：20％、25％、30％、35％、40％、50％等；更优选地，所述细胞提取物的体积占蛋白质基础表达体系的35％。

优选地，所述第一缓冲液的摩尔浓度为2～100mM；或/和

所述镁盐中含有的镁离子的摩尔浓度为0.5～20mM；或/和

所述钾盐中含有的钾离子的摩尔浓度为100～350mM；或/和

所述草酸盐的摩尔浓度为0.5～10mM；或/和

所述氨基酸或氨基酸混合物的摩尔浓度为1～3mM；或/和

所述核苷酸混合物的摩尔浓度为0.5～1.5mM。

优选地，上述的蛋白质基础表达体系，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液；或/和

所述镁盐为谷氨酸镁或/和醋酸镁；或/和

所述钾盐为谷氨酸钾或/和醋酸钾；或/和

所述草酸盐为草酸钾或/和草酸钠；或/和

所述氨基酸或氨基酸混合物为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸二十种氨基酸中的至少一种或多种的混合；或/和

所述核苷酸混合物为核苷三磷酸NTP或核苷酸NMP。

优选地，所述核苷三磷酸NTP包括如下任一组合：

组合A：腺苷三磷酸ATP、鸟苷三磷酸GTP、尿苷三磷酸UTP和胞苷三磷酸CTP；

组合B：腺苷三磷酸ATP和鸟苷三磷酸GTP。

优选地，所述核苷酸NMP包括如下任一组合：

组合C：腺嘌呤核苷酸AMP、鸟嘌呤核苷酸GMP、尿嘌呤核苷酸UMP和胞嘌呤核苷酸CMP；

组合D：腺嘌呤核苷酸AMP和鸟嘌呤核苷酸GMP。

优选地，所述补充体系还包括全氟化碳乳剂或其功能等同体。

优选地，所述的全氟化碳乳剂选自Fluosol、乳剂二号、Perftoran、Oxypherol、Oxyfluor、TherOx、(Oxygent)AF0144、FlutecPP9中的任意一种或多种的组合。

第二方面，本发明提供了一种蛋白合成系统，包括：上述任一项所述的蛋白质基础表达体系，以及目的基因；

所述目的基因，为目标蛋白质编码核酸；

所述目的基因在总体系的浓度为0.1～50ng/μL。

优选地，所述目的基因包括环状双链DNA、线状双链dsDNA、mRNA中的至少一种。

第三方面，本发明提供了一种上述任一项所述的蛋白质基础表达体系的制备方法，包括：

制备细胞提取物；

制备补充体系；

将所述细胞提取物与所述补充体系按照比例混合均匀。

优选地，上述的蛋白质基础表达体系的制备方法，所述制备细胞提取物的方法为大肠杆菌细胞裂解上清液的制备方法，包括：

对大肠杆菌菌株进行单克隆与筛选；

将筛选出的所述单克隆以至少一次的形式接种于液体培养基中培养，得到培养物；

对所述培养物离心、洗涤；

对洗涤后的菌体进行破碎、离心取上清液，得到裂解上清液。

优选地，上述的蛋白质基础表达体系的制备方法，所述制备补充体系的方法包括：将第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体。

优选地，上述的蛋白质基础表达体系的制备方法，将所述细胞提取物与所述补充体系按照比例混合均匀。

本申请的技术方案具有以下有益效果：

1、本申请蛋白合成体系制备简单，成本低，可实施性高。

2、本申请蛋白合成体系比传统细胞内蛋白生产方法相比省时省力，可表达细胞内不易表达的毒性蛋白、膜蛋白等。

3、本申请蛋白合成体系反应适应性广，即使在静置条件下，蛋白表达产量也很高。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例1、实施例2和对比例1中制备的细胞提取物的蛋白表达量的柱形图；

图2为本申请实施例3中不同体积比的细胞提取物对蛋白表达产量的影响柱形图；

图3为本申请实施例4中不同镁离子浓度对蛋白表达产量的影响柱形图。

图4为本申请实施例5中不同钾离子浓度对蛋白表达产量的影响柱形图。

图5为本申请实施例6中不同草酸盐浓度对蛋白表达产量的影响柱形图。

图6为本申请实施例7中不同全氟化碳乳剂浓度对蛋白表达产量的影响柱形图。

图7为本申请实施例8和对比例2中静置反应条件下蛋白表达产量的柱形图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下将以图式揭露本发明的多个实施方式，为明确说明起见，许多实务上的细节将在以下叙述中一并说明。然而，应了解到，这些实务上的细节不应用以限制本发明。也就是说，在本发明的部分实施方式中，这些实务上的细节是非必要的。此外，为简化图式起见，一些习知惯用的结构与组件在图式中将以简单的示意的方式绘示之。

术语说明：

功能等同体：功能等同体是指能够实现相同功能的物质。

例如：第一缓冲液或其功能等同体是指生物化学和分子生物学中常用缓冲液，如磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，Good’s缓冲液(两性离子缓冲液)等，均能够实现缓冲效果。

其中，mM代表毫摩尔每升。

实施例1：

本申请实施例1的蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；

1)细胞提取物的制备方法：

复苏-80℃保存的大肠杆菌，在2YT+P平板上划线，37℃培养至少15小时，至单克隆形成，其中，所述2YT+P平板组成为：16克每升的胰蛋白胨，10克每升的酵母提取物，5克每升的氯化钠，40mM的磷酸氢二钾，22mM的磷酸二氢钾，1.5％琼脂。

挑所述单克隆接种于盛有2YT+P液体培养基的无菌培养管中，在37℃恒温条件下以220rpm转速，培养8小时，得到菌体A；将所述菌体A按1：50比例接种于50毫升2YT+P液体培养基中，在37℃恒温条件下以220rpm转速，培养8小时，得到菌体B；将所述菌体B按1：100比例接种于600毫升2YT+P液体培养基中，在37℃恒温条件下以220rpm转速，至光密度OD 600值为0.6～1.0时，加终浓度1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG诱导后，在37℃恒温条件下以220rpm转速，继续培养10小时，至光密度OD 600值为7.0～8.0；其中，所述2YT+P液体培养基组成为：16克每升的胰蛋白胨，10克每升的酵母提取物，5克每升的氯化钠，40mM的磷酸氢二钾，22mM的磷酸二氢钾，得到细胞培养物。

将所述细胞培养物转移至离心管中，在4℃恒温条件下，以5000g转速，离心5分钟，弃上清液，得到菌体C；重复洗涤一次，即采用预冷的第二缓冲液将菌体C完全分散至无可见块状沉淀，在4℃恒温条件下，以5000g转速，离心5分钟，弃上清液，得到菌体D；所述第二缓冲液组成为：14mM的谷氨酸镁，60mM的谷氨酸钾，50mM的三羟甲基氨基甲烷，2mM的二硫苏糖醇，乙酸调至pH 8.2。

称重所述菌体D，1克菌体D中加入1.5毫升第三缓冲液，充分重悬，4℃条件下，高压破碎菌体D，得到裂解液；第三缓冲液组成为：14mM谷氨酸镁，150mM谷氨酸钾，2mM二硫苏糖醇，Tris调至pH 8.2；将得到的所述裂解液在4℃恒温条件下，以12000g转速，离心10分钟，取上清液得到裂解上清液。

2)补充体系的配制：

补充体系的各个组分及其在蛋白合成系统中的终浓度如下表所示，其中所用的溶剂为去离子水。配制时可将其浓度按比例增加配制成浓缩液。

3)蛋白质基础表达体系：将上述制得的裂解上清液作为细胞提取物，与补充体系混合均匀得到蛋白质基础表达体系。

蛋白质基础表达体系	体积
		1)细胞提取物	4μL
2)补充体系(10×)	2μL

4)蛋白合成系统：将上述蛋白质基础表达体系与目的基因(绿色荧光蛋白基因)混合均匀得到蛋白合成系统。

按下表将各个组分添加到PCR管中，混合均匀，置于ThermoMixer恒温混匀仪中，在30℃、1000rpm的条件下进行震荡16小时后取出。

5)使用酶标仪，在激发光485nm、发射光535nm，曝光时间0.1s条件下测定荧光蛋白表达量；

结果见图1，如图1所示，在荧光强度200000时，绿色荧光蛋白含量为0.78毫克每毫升，且图1中的柱形图的纵坐标表示蛋白的荧光强度，其在一定范围内正比于蛋白表达量；即：荧光强度越高，代表合成的绿色荧光蛋白越多。因此，从图1可以看到，实施例1的蛋白表达量高于对比例1的蛋白表达量。

实施例2：

本申请实施例2的蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；

1)细胞提取物的制备方法，如实施例1所述；

2)补充体系的配制：

补充体系的各个组分及其在蛋白质合成系统中的终浓度如下表所示，其中所用的溶剂为去离子水。配制时可将其浓度按比例增加配制成浓缩液。

蛋白质基础表达体系	体积
		1)细胞提取物	4μL
2)补充体系(10×)	2μL
		3)全氟化碳乳剂	6μL

4)蛋白质合成系统：将上述蛋白质基础表达体系与目的基因(绿色荧光蛋白基因)混合均匀得到蛋白质合成系统。

结果见图1，如图1所示，在荧光强度200000时，绿色荧光蛋白含量为0.78毫克每毫升，且图1中的柱形图的纵坐标表示蛋白的荧光强度，其在一定范围内正比于蛋白表达量；即：荧光强度越高，代表合成的绿色荧光蛋白越多。因此，从图1可以看到，实施例1的蛋白表达量高于对比例1的蛋白表达量，并且实施例2在实施例1基础上蛋白表达量进一步提升。

实施例3：

本申请实施例3的蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；

其他步骤同实施例1，在上述蛋白质合成体系中，分别采用总蛋白浓度为40mg/mL的细胞提取物体积分别占蛋白质合成系统中20％(v/v)、25％(v/v)、30％(v/v)、35％(v/v)、40％(v/v)、50％(v/v)时，30℃反应16小时，结果如图2所示。从图2可以看出当细胞提取物体积占比为35％的时候效果最佳，在20％～50％区间内，其荧光强度都不低于200000。

实施例4：

本申请实施例4的蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；

其他步骤同实施例1，在上述蛋白质合成体系中，分别采用0、0.5、2、4、8、12、16和20毫摩尔每升的谷氨酸镁，30℃反应16小时，结果如图3所示。从图3可以看出当镁离子浓度为8毫摩尔每升的时候效果最佳，在0.5-16毫摩尔每升区间内，其荧光强度都不低于200000。

实施例5：

本申请实施例5的蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；

其他步骤同实施例1，在上述蛋白质合成体系中，分别采用100、130、180、230、280、330和350毫摩尔每升的谷氨酸钾，30℃反应16小时，结果如图4所示。从图4可以看出当钾离子浓度为280毫摩尔每升的时候效果最佳，在130-330毫摩尔每升区间内，其荧光强度都不低于200000。

实施例6：

本申请实施例6的蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；

其他步骤同实施例1，在上述蛋白质合成体系中，分别采用0、0.5、1、2.7、4、5和10毫摩尔每升的草酸钾，30℃反应16小时，结果如图5所示。从图5可以看出当草酸钾浓度为2.7毫摩尔每升的时候效果最佳，在2.7-5毫摩尔每升区间内，其荧光强度都不低于200000。

实施例7：

本申请实施例7的蛋白质基础表达体系包括：细胞提取物和补充体系；

其他步骤同实施例2，在上述蛋白质合成体系中，分别采用0、5％(v/v)、10％(v/v)、20％(v/v)、30％(v/v)、40％(v/v)、50％(v/v)的全氟化碳乳剂(全氟化甲基萘烷perfluoromethyl-decalin，Flutec PP9)；30℃反应16小时，结果如图6所示。从图6可以看出当全氟化碳乳剂浓度为30％(v/v)的时候效果最佳，在5％～50％(v/v)区间内，其荧光强度都不低于270000。

实施例8：

1)细胞提取物的制备方法，如实施例2所述；

2)补充体系的配制，如实施例2所述；

3)蛋白质基础表达体系，如实施例2所述；

按下表将各个组分添加到PCR管中，混合均匀，置于恒温箱中，在30℃的条件下静置16小时后取出。

结果如图7所示。从图7可以看出在静置反应条件下，本实施例蛋白表达量仍可达到300000以上，反应条件适应性强；而与之对应的对比例2由于没有振荡，蛋白表达量大幅下降至100000以下，其反应体系不适宜在静置条件下反应。

对比例1：

传统蛋白质表达体系

1)细胞提取物的制备方法，如实施例1所述；

2)补充体系的配制：

对比例2：

传统蛋白质表达体系静置反应条件

传统蛋白质合成系统配制如对比例1所述，将上述蛋白质基础表达体系与目的基因(绿色荧光蛋白基因)混合均匀得到蛋白质合成系统。

1)按下表将各个组分添加到PCR管中，混合均匀，置于恒温箱中，在30℃的条件下进行静置16小时后取出。

2)使用酶标仪，在激发光485nm、发射光535nm，曝光时间0.1s条件下测定荧光蛋白表达量；

本发明的以上所述的具体实例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蛋白质基础表达体系，其特征在于，所述蛋白质基础表达体系由细胞提取物和补充体系组成；

所述补充体系由第一缓冲液、镁盐、钾盐、草酸盐、氨基酸混合物、核苷酸混合物和全氟化碳乳剂组成；

所述细胞提取物选自大肠杆菌细胞提取物；

所述第一缓冲液的摩尔浓度为2~100 mM；

所述镁盐中含有的镁离子的摩尔浓度为0.5~20 mM；

所述钾盐中含有的钾离子的摩尔浓度为100~350 mM；

所述草酸盐的摩尔浓度为0.5~10 mM；

所述氨基酸混合物中各氨基酸的摩尔浓度为1~3 mM；

所述核苷酸混合物中各核苷酸的摩尔浓度为0.5~1.5 mM；

所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液；

所述镁盐为谷氨酸镁；

所述钾盐为谷氨酸钾；

所述草酸盐为草酸钾；

所述氨基酸混合物为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸的混合物；

所述核苷酸混合物为核苷三磷酸NTP，所述核苷三磷酸NTP包括腺苷三磷酸ATP、鸟苷三磷酸GTP、尿苷三磷酸UTP和胞苷三磷酸CTP；

所述全氟化碳乳剂采用FlutecPP9；

所述全氟化碳乳剂的浓度为5-50%。

2.一种蛋白合成系统，其特征在于，包括：权利要求1所述的蛋白质基础表达体系，以及目的基因；

所述目的基因，为目标蛋白质编码核酸；

所述目的基因在总体系的浓度为0.1~50 ng/μL。

3.根据权利要求2所述的蛋白质合成系统，其特征在于，所述目的基因包括环状双链DNA、线状双链dsDNA、mRNA中的至少一种。