CN107488672A - 一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统及其制备方法，制备方法为将组合物1、组合物2、基因以及生物分子保护剂按体积比为(10‑20):(20‑30):1:(1‑5)的比例混匀，得混合物，冷冻干燥，得到冻干粉，常温储存；所述生物分子保护剂为(0.01‑0.02)g/ml的黏土水溶液、(1.7‑2.6)g/ml的海藻糖水溶液、体积分数为(30％‑50％)的甘油水溶液、(0.5‑1)g/ml的葡聚糖水溶液和(0.6‑1)g/ml的甜菜碱水溶液中至少一种。本发明实现了无细胞蛋白合成系统的常温存储问题，降低了存储和运输成本。在使用时，只需将冻干粉用去离子水溶解，系统即可以开始表达蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统及其制备方法，属于生物合成领域。
背景技术
传统的蛋白表达是指通过细菌、酵母、植物细胞或动物细胞等表达外源基因的生物学技术。随着科学技术的发展，与蛋白质相关的前沿领域逐渐兴起，无细胞蛋白合成系统应运而生，其是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞提取物中补加各种底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统(Smith MT，Bennett AM，Hunt JM，et al.Creating a completely“cell－free”system for protein synthesis[J].Biotechnol Prog，2015，10:2157.)。无细胞蛋白表达系统具有诸多优势，例如表达周期短、反应条件易控制、蛋白产量高、可表达细胞不能表达的蛋白质，甚至是对细胞有毒害作用的特殊蛋白质，这使得它在高通量表达目的蛋白和合成生物学方面得到了广泛的应用(Hodgman C E,Jewett M C.Cell-freesynthetic biology:Thinking outside the cell[J].Metabolic Engineering,2012,14(3):261-269.)。
然而，无细胞蛋白合成系统的低温存储问题是限制其应用的关键性问题之一。由于无细胞蛋白系统中存在大量合成蛋白所需要的酶系，需储存在-20℃或-80℃的低温或超低温条件下(Smith M T,Berkheimer S D,Werner C J,et al.Lyophilized Escherichiacoli-based cell-free systems for robust,high-density,long-term storage.[J].Biotechniques,2014,56(4):186.。当流行病爆发时，往往需要大量的无细胞合成系统用于合成蛋白质，此时无细胞合成系统的存储和运输便会耗费大量的设备投资，因此亟需一种可实现常温储存无细胞蛋白合成系统及方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统。
本发明的第二个目的是提供一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统的制备方法，包括以下步骤：
将组合物1、组合物2、基因以及生物分子保护剂按体积比为(10-20):(20-30):1:(1-5)的比例混匀，得混合物，冷冻干燥，得到冻干粉，常温储存；
所述的组合物1按比例为1g:0.01～0.1ml:1～3ml包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；
所述的组合物2包括体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液：
所述生物分子保护剂为(0.01-0.02)g/ml的黏土水溶液、(1.7-2.6)g/ml的海藻糖水溶液、体积分数为(30％-50％)的甘油水溶液、(0.5-1)g/ml的葡聚糖水溶液和(0.6-1)g/ml的甜菜碱水溶液中至少一种。
基因存在的形式为基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。
细胞为真核细胞或原核细胞。
缓冲溶液1优选为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；
缓冲溶液2优选为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。
氨基酸混合液优选为用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸加入水配成的等摩尔浓度的、摩尔浓度为5-20mmol/L的混合液。
反应缓冲液包括：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1.0-5.0mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水。
能量补充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
冷冻干燥的步骤优选为：将步骤(1)所述混合物在液氮中速冻，再用冷冻干燥机冷冻4-48小时。
上述方法制备的可常温储存的无细胞蛋白合成系统。
本发明的优点：
本发明实现了无细胞蛋白合成系统的常温存储问题，降低了无细胞蛋白合成系统的存储和运输成本。本发明的系统在使用时，只需将冻干粉用去离子水溶解，系统即可以开始表达蛋白质。
附图说明
图1为CFP的表达量随保存时间的变化。
图2为eGFP的表达量随保存时间的变化。
图3为YFP的表达量随保存时间的变化。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1-3为缓冲溶液1，见表1。
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 100mmol/L | 60mmol/L | 30mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 20mmol/L | 15mmol/L | 10mmol/L |
| 二硫苏糖醇 | 2mmol/L | 1mmol/L | 0.5mmol/L |
| 2-巯基乙醇 | 10mmol/L | 8mmol/L | 5mmol/L |
| 溶剂是去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例4-6为缓冲溶液2，见表2。
表2
| 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 100mmol/L | 60mmol/L | 30mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 20mmol/L | 15mmol/L | 10mmol/L |
| 二硫苏糖醇 | 2mmol/L | 1mmol/L | 0.5mmol/L |
| 溶剂是去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例7
细胞破碎产物的制备：
将培养后的大肠杆菌(大肠埃希氏菌BL21(DE3)CICC 23796，购买于CICC)收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。
细胞破碎的方法除机械法外，还可以采用反复冻融法、超声处理法、酶解法、碱裂解法或化学渗透法。
破碎过程采用超声波细胞粉碎机，功率为20W，每个循环超声5s，停10s，总时间为1h(每次取10-15mL进行破碎)。
实施例8-10为组合物1，见表3.
表3
| 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 | |
| 细胞破碎产物 | 实施例7制备1g | 实施例7制备1g | 实施例7制备1g |
| 缓冲溶液1 | 实施例1制备0.1ml | 实施例2制备0.05ml | 实施例3制备0.01ml |
| 缓冲溶液2 | 实施例4制备3ml | 实施例5制备2ml | 实施例6制备1ml |
实施例11-13为氨基酸混合液，见表4
表4
实施例14-16为反应缓冲液，见表5
表5
| 实施例14 | 实施例15 | 实施例16 | |
| 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | 60mmol/L | 50mmol/L | 40mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 120mmol/L | 100mmol/L | 80mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 25mmol/L | 18mmol/L | 10mmol/L |
| 3-磷酸甘油酸 | 40mmol/L | 25mmol/L | 10mmol/L |
| 环磷酸腺苷 | 10mmol/L | 8mmol/L | 5mmol/L |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | 4mmol/L | 3mmol/L | 2mmol/L |
| 辅酶A | 4mmol/L | 3mmol/L | 1mmol/L |
| 亚叶酸 | 0.8mmol/L | 0.6mmol/L | 0.4mmol/L |
| 转运核糖核酸 | 5mg/ml | 3mmol/L | 1mmol/L |
| 亚精胺 | 0.8mmol/L | 0.6mmol/L | 0.4mmol/L |
| 去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例17-19为能量补充液，见表6
| 实施例17 | 实施例18 | 实施例19 | |
| 三磷酸尿苷 | 3mmol/L | 2mmol/L | 1mmol/L |
| 三磷酸胞苷 | 3mmol/L | 2mmol/L | 1mmol/L |
| 三磷酸腺苷 | 3mmol/L | 2mmol/L | 1mmol/L |
| 三磷酸鸟苷 | 9mmol/L | 2mmol/L | 3mmol/L |
| 去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例20-22为组合物2(各组份为体积比)见表7
| 实施例20 | 实施例21 | 实施例22 | |
| 氨基酸混合液 | 8mL实施例11制备 | 5mL实施例12制备 | 2mL实施例13制备 |
| 反应缓冲液 | 30mL实施例14制备 | 25mL实施例15制备 | 20mL实施例16制备 |
| 能量补充液 | 5mL实施例17制备 | 3mL实施例18制备 | 2mL实施例19制备 |
| 核糖核酸聚合酶水溶液 | 1mL 150μg/ml | 1mL 70μg/ml | 1mL 5μg/ml |
实施例23
一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统的制备方法，于包括以下步骤：
将组合物1(实施例8制备)、组合物2(实施例20制备)、基因(pRset-CFP(购于：Promega Corporation))以及0.01g/ml的黏土水溶液按体积比为20:25:1:5的比例混匀，得混合物，在液氮中速冻，再用冷冻干燥机冷冻48小时，得到冻干粉，常温储存。
实施例24
一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统的制备方法，于包括以下步骤：
将组合物1(实施例9制备)、组合物2(实施例21制备)、基因(pRset-eGFP(购于：Promega Corporation))以及2.6g/ml的海藻糖水溶液，按体积比为10:30:1:1的比例混匀，得混合物，在液氮中速冻，再用冷冻干燥机冷冻4小时，得到冻干粉，常温储存。
实施例25
一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统的制备方法，于包括以下步骤：
将组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)、基因(pRset-YFP(购于：Promega Corporation))以及体积分数为30％的甘油水溶液，按体积比为15:20:1:3的比例混匀，得混合物，在液氮中速冻，再用冷冻干燥机冷冻24小时，得到冻干粉，常温储存。
质粒可以购买或通过基因改造获得。
pRset-CFP(购于：Promega Corporation)
pRset-YFP(购于：Promega Corporation)
pRset-eGFP(购于：Promega Corporation)
实验证明，基因还可以是能表达所需蛋白质的基因，所述基因存在的形式为基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。
实验证明，用0.02g/ml的黏土水溶液、1.7g/ml的海藻糖水溶液、体积分数为50％的甘油水溶液、0.5g/ml的葡聚糖水溶液、1g/ml的葡聚糖水溶液、0.6g/ml的甜菜碱水溶液、1g/ml的甜菜碱水溶液或由0.02g/ml的黏土水溶液和1.7g/ml的海藻糖水溶液按体积比为1:1的比例组成的混合溶液分别替代实施例25中的体积分数为30％的甘油水溶液，其它同实施例25，可分别获得可常温储存的无细胞蛋白合成系统。
实验证明，用实施例7的方法对真核细胞进行破碎，用破碎后的细胞破碎产物，采用实施例25的方法进行一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统的制备。
实施例26
取实施例23获得的可常温储存的无细胞蛋白合成系统(20℃储存)1微克冻干粉用50微升的去离子水溶解，在30℃下放置10h，基因表达，得到青色荧光蛋白，蛋白的表达量与保存时间的变化关系如图1所示。
实施例27
取实施例24获得的可常温储存的无细胞蛋白合成系统(25℃储存)1微克冻干粉用50微升的去离子水溶解，在30℃下放置8h，基因表达，得到绿色荧光蛋白，蛋白的表达量与保存时间的变化关系如图2所示。
实施例28
取实施例25获得的可常温储存的无细胞蛋白合成系统(30℃储存)1微克冻干粉用50微升的去离子水溶解，在30℃下放置12h，基因表达，得到黄色荧光蛋白，蛋白的表达量与保存时间的变化关系如图3所示。
Claims (9)
1.一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将组合物1、组合物2、基因以及生物分子保护剂按体积比为(10-20):(20-30):1:(1-5)的比例混匀，得混合物，冷冻干燥，得到冻干粉，常温储存；
所述的组合物1按1g:0.01～0.1ml:1～3ml比例包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；
所述的组合物2按(2-8):(20-30):(2-5):1的体积比包括氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液：
所述生物分子保护剂为(0.01-0.02)g/ml的黏土水溶液、(1.7-2.6)g/ml的海藻糖水溶液、体积分数为(30％-50％)的甘油水溶液、(0.5-1)g/ml的葡聚糖水溶液和(0.6-1)g/ml的甜菜碱水溶液中至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述基因为能表达所需蛋白质的基因，所述基因存在的形式为基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述细胞为真核细胞或原核细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述缓冲溶液1为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；
所述缓冲溶液2为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述氨基酸混合液为用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸加入水配成的等摩尔浓度的、摩尔浓度为5-20mmol/L的混合液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述反应缓冲液包括：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2-4mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1-4mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1-5mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是能量补充液包括：1-3mmol/L三磷酸尿苷，1-3mmol/L三磷酸胞苷，1-3mmol/L三磷酸腺苷，3-9mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是冷冻干燥的步骤为：将步骤(1)所述混合物在液氮中速冻，再用冷冻干燥机冷冻4-48小时。
9.权利要求1-8之一所述的方法制备的可常温储存的无细胞蛋白合成系统。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 300350 District, Jinnan District, Tianjin Haihe Education Park, 135 beautiful road, Beiyang campus of Tianjin University Applicant after: Tianjin University Address before: 300072 Tianjin City, Nankai District Wei Jin Road No. 92 Applicant before: Tianjin University |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20171219 |