CN107349882B - 一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴及其制备方法 - Google Patents

一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴及其制备方法，其方法为：1)使用微流控芯片装置；2)将用于蛋白质合成的原料混合作为水相，从水相入口6注入；将油相从油相入口4注入；水相在十字通道13处受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，从微液滴出口7收集微液滴置于恒温反应容器中。本发明利用微流控芯片装置，可高速快捷地制备微液滴，所得到的微液滴大小均一、结构稳定，可以成为体外蛋白合成的场所，由于微液滴独特的微观尺度，部分模拟细胞环境，让原本工作于细胞环境下的蛋白质合成体系获得类似的环境，有助于蛋白质合成体系的工作。可以对蛋白质合成做到定量化，可将其应用到检测和诊断中。

Description

一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴及其制备方法及应用。
背景技术
20世纪以来，随着对各种生物大分子结构和功能的解构，生命科学逐渐破解了生物遗传变异的秘密，全面转入到分子层面上来解密生命过程。20世纪末，伴随着大量基因组测序工程的开展，各种生物体的遗传信息被破解，分子生物学兴起，得以利用分子操作对遗传信息进行重构，从而获得各种能够满足人需求的生物制品。
蛋白质是生命活动的主要承担者，各种生命活动都需要蛋白质的参与，而且蛋白质是遗传信息表达的直接产物，因而利用细胞体系来获得蛋白质成为了一个最直接的研究方向。在这一研究方向中，采用何种方式快速、简便、高效地合成蛋白质是最关键的问题。
在传统的生物合成蛋白质的方法中，一般都是通过转化或转染的方式将重组基因导入宿主细胞，然后利用细胞内的底物、蛋白质合成机器及相关酶系，在新的遗传背景下进行稳定扩增和表达，完成蛋白质的合成。然而传统的生物合成方法受生物体本身所限，需考虑细胞的培养和存活，调节各种环境因素，分离提纯也较为困难，而目前，高通量、大数据、快速高效研究已经成为蛋白质合成研究的趋势，传统方式已无法满足研究要求，而无细胞蛋白质合成方法则在这些方面优于传统方法，可以绕过转化细胞在体内表达的繁琐过程，不用受限于细胞本身，能够掺入非天然的及同位素标记的氨基酸，能够生产在体内不溶性或有毒性的蛋白质，此外，还会对蛋白质组筛选工程起到推动作用。
然而，目前关于无细胞蛋白质合成体系的研究多集中在宏观尺度下的蛋白质合成，试图通过各种手段来实现蛋白质合成过程的长期、高效，然而操作过于复杂，难以体现无细胞蛋白质合成简便、高效的特性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴。
本发明的第二个目的是提供一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴的制备方法，包括如下步骤：
1)使用微流控芯片装置，所述微流控芯片装置包括基板1，在基板1上设置有矩形环状微凹道2，横向短微凹道3的右端与矩形环状微凹道的左侧微凹道连接，横向长微凹道5与矩形环状微凹道的右侧微凹道垂直相通为十字通道13，在位于横向短微凹道3的左端位置贯穿基板设置有油相入口4，在横向长微凹道的左端位置贯穿基板设置有水相入口6，在横向长微凹道的右端位置贯穿基板设置有微液滴出口7，油相入口4通过管道与油相源10连接，水相入口6通过管道与水相源9连接，微液滴出口7连接有管道，基板1上覆盖有载玻片12；
2)将用于蛋白质合成的原料混合作为水相，在2-10℃通过管道从水相入口6注入；将油相通过管道从油相入口4注入；水相在十字通道13处受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，从微液滴出口7收集微液滴置于恒温反应容器中，在4-10℃存放。
矩形环状微凹道2的宽度为10-500μm、高度为10-500μm；横向短微凹道3的宽度为10-500μm、高度为10-500μm；横向长微凹道5的宽度为10-500μm、高度为10-500μm。
油相和水相的流速比为20～5:1，油相的流速为1μL/min-50μL/min。
油相由轻质矿物油和表面活性剂按体积比为100:1～10的比例组成，表面活性剂为EM 90或司盘80。
用于蛋白质合成的原料按体积比为(10-20):(15-35):1的比例包括组合物1、组合物2和基因。
所述基因为能表达所需蛋白质的基因，所述基因存在的形式为基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。
组合物1包括比例为1g:0.01～0.1ml:1～3ml的细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；
所述细胞破碎产物为真核细胞或原核细胞破碎产物；
所述缓冲溶液1为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；
所述缓冲溶液2为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。
组合物2由按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：
所述氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为5-20mmol/L的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述反应缓冲液包括：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1.0-5.0mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水；
所述能量补充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
上述方法制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴。
用于无细胞蛋白质合成的微液滴在无细胞蛋白质合成中的应用。
本发明的优点：
本发明利用微流控芯片装置，可以高速快捷地制备微液滴，所得到的微液滴大小均一、结构稳定，可以成为体外蛋白合成的场所，微液滴直径可为10μm-500μm。具体是以基因作为模板，利用细胞提取物中的蛋白质合成机器、蛋白质折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、三磷酸核糖核苷、核糖核酸聚合酶和能量物质等，共同构成无细胞蛋白质合成的原料，将无细胞蛋白质合成原料置于微液滴中，实现蛋白质合成与翻译后修饰。
本发明的方法简便快速，能够在极短时间内合成大量包有无细胞蛋白质合成原料的微液滴，在类似细胞大小的尺度内合成蛋白质。除无细胞蛋白质合成的优点外，由于微液滴独特的微观尺度，部分模拟细胞环境，让原本工作于细胞环境下的蛋白质合成体系重新获得类似的环境，有助于蛋白质合成体系的工作。同时，由于微液滴大小的可控性、形状的均一性、相互的独立性，可以对蛋白质合成做到定量化，可将其应用到检测和诊断中。
附图说明
图1是微流控芯片装置示意图。
图2是图1A-A剖面示意图。
图3是实施例29制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴的显微镜明场下的照片。
图4是实施例29制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴荧光照片，可见青色荧光。
图5是实施例30制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴的显微镜明场下的照片。
图6是实施例30制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴滴荧光照片，可见黄色荧光。
图7是实施例31制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴的显微镜明场下的照片。
图8是实施例31制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴滴荧光照片，可见绿色荧光。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1-3为缓冲溶液1，见表1
表1
实施例1 实施例2 实施例3
三羟甲基氨基甲烷 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
谷氨酸钾 100mmol/L 60mmol/L 30mmol/L
谷氨酸镁 20mmol/L 15mmol/L 10mmol/L
二硫苏糖醇 2mmol/L 1mmol/L 0.5mmol/L
2-巯基乙醇 10mmol/L 8mmol/L 5mmol/L
溶剂是去离子水 补足至1L 补足至1L 补足至1L
实施例4-6为缓冲溶液2，见表2。
表2
实施例4 实施例5 实施例6
三羟甲基氨基甲烷 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
谷氨酸钾 100mmol/L 60mmol/L 30mmol/L
谷氨酸镁 20mmol/L 15mmol/L 10mmol/L
二硫苏糖醇 2mmol/L 1mmol/L 0.5mmol/L
溶剂是去离子水 补足至1L 补足至1L 补足至1L
实施例7
细胞破碎产物的制备：
将培养后的大肠杆菌(大肠埃希氏菌BL21(DE3)CICC 23796，购买于CICC)收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。
细胞破碎的方法除机械法外，还可以采用反复冻融法、超声处理法、酶解法、碱裂解法或化学渗透法。
还可以选用真核细胞进行破碎。
实施例8-10为组合物1，见表3.
表3
实施例8 实施例9 实施例10
细胞破碎产物 实施例7制备1g 实施例7制备1g 实施例7制备1g
缓冲溶液1 实施例1制备0.1ml 实施例2制备0.05ml 实施例3制备0.01ml
缓冲溶液2 实施例4制备3ml 实施例5制备2ml 实施例6制备1ml
实施例11-13为氨基酸混合液，见表4
表4
实施例11 实施例12 实施例13
甘氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
丙氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
缬氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
亮氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
异亮氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
脯氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
苯丙氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
色氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
甲硫氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
酪氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
丝氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
苏氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
半胱氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
天冬酰胺 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
谷氨酰胺 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
天冬氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
谷氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
赖氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
精氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
组氨酸 20mmol/L 10mmol/L 5mmol/L
溶剂为去离子水 补足至1L 补足至1L 补足至1L
实施例14-16为反应缓冲液，见表5
表5
实施例14 实施例15 实施例16
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 60mmol/L 50mmol/L 40mmol/L
谷氨酸钾 120mmol/L 100mmol/L 80mmol/L
谷氨酸镁 25mmol/L 18mmol/L 10mmol/L
3-磷酸甘油酸 40mmol/L 25mmol/L 10mmol/L
环磷酸腺苷 10mmol/L 8mmol/L 5mmol/L
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 4mmol/L 3mmol/L 2mmol/L
辅酶A 4mmol/L 3mmol/L 1mmol/L
亚叶酸 0.8mmol/L 0.6mmol/L 0.4mmol/L
转运核糖核酸 5mg/ml 3mmol/L 1mmol/L
亚精胺 0.8mmol/L 0.6mmol/L 0.4mmol/L
去离子水 补足至1L 补足至1L 补足至1L
实施例17-19为能量补充液，见表6
表6
实施例17 实施例18 实施例19
三磷酸尿苷 3mmol/L 2mmol/L 1mmol/L
三磷酸胞苷 3mmol/L 2mmol/L 1mmol/L
三磷酸腺苷 3mmol/L 2mmol/L 1mmol/L
三磷酸鸟苷 9mmol/L 6mmol/L 3mmol/L
去离子水 补足至1L 补足至1L 补足至1L
实施例20-22为组合物2(各组份为体积比)见表7
表7
实施例20 实施例21 实施例22
氨基酸混合液 8mL实施例11制备 5mL实施例12制备 2mL实施例13制备
反应缓冲液 30mL实施例14制备 25mL实施例15制备 20mL实施例16制备
能量补充液 5mL实施例17制备 3mL实施例18制备 2mL实施例19制备
核糖核酸聚合酶水溶液 1mL 150μg/ml 1mL 70μg/ml 1mL 5μg/ml
基因质粒可以购买或通过基因改造获得。
pRset-CFP(购于：Promega Corporation)
pRset-YFP(购于：Promega Corporation)
pRset-eGFP(购于：Promega Corporation)
上述质粒的举例是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，但并不对其进行限定，其它质粒也可以用于本发明。
实施例23-25为油相
表8
实施例23 实施例24 实施例25
轻质矿物油 100mL 100mL 100mL
表面活性剂 10mL EM 90 5mL EM 90 1mL司盘80
EM 90(德固赛)
实施例26-28为用于蛋白质合成的原料
表9
实施例26 实施例27 实施例28
组合物1 20mL实施例8制备 15mL实施例9制备 10mL实施例10制备
组合物2 35mL实施例20制备 25mL实施例21制备 15mL实施例22制备
基因 1mL质粒pRset-CFP 1mL质粒pRset-YFP 1mL质粒pRset-eGFP
实施例29
一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴的制备方法，包括如下：
1)使用微流控芯片装置，所述微流控芯片装置包括基板1，在基板1上设置有矩形环状微凹道2，横向短微凹道3的右端与矩形环状微凹道的左侧微凹道连接，横向长微凹道5与矩形环状微凹道的右侧微凹道垂直相通为十字通道13，在位于横向短微凹道3的左端位置贯穿基板设置有油相入口4，在横向长微凹道的左端位置贯穿基板设置有水相入口6，在横向长微凹道的右端位置贯穿基板设置有微液滴出口7，油相入口4通过管道与油相源10连接，水相入口6通过管道与水相源9连接，微液滴出口7连接有管道，基板1上覆盖有载玻片12；
矩形环状微凹道2的宽度为100μm、高度为100μm；所述横向短微凹道3的宽度为100μm、高度为100μm；所述横向长微凹道5的宽度为100μm、高度为100μm；
2)将用于蛋白质合成的原料(实施例26)混合作为水相，在5℃通过管道从水相入口6注入；将油相(实施例23)通过管道从油相入口4注入；水相在十字通道13处受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，从微液滴出口7收集微液滴，见图3，置于恒温反应容器中，在4℃存放。
油相和水相的流速比为10:1，油相的流速为20μL/min。
将微液滴升温至37℃放置1h，基因表达，得到青色荧光蛋白，见图4。
实施例30
一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴的制备方法，包括如下：
1)微流控芯片装置同实施例29步骤1)；其中矩形环状微凹道2的宽度为10μm、高度为10μm；所述横向短微凹道3的宽度为10μm、高度为10μm；所述横向长微凹道5的宽度为10μm、高度为10μm；
2)将用于蛋白质合成的原料(实施例27)混合作为水相，在2℃通过管道从水相入口6注入；将油相(实施例24)通过管道从油相入口4注入；水相在十字通道13处受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，从微液滴出口7收集微液滴，见图5，置于恒温反应容器中，在10℃存放。
油相和水相的流速比为5:1，所述油相的流速为1μL/min。
将微液滴升温至37℃放置1h，基因表达，得到黄色荧光蛋白，见图6。
实施例31
一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴的制备方法，包括如下：
1)微流控芯片装置同实施例29步骤1)；其中矩形环状微凹道2的宽度为500μm、高度为500μm；所述横向短微凹道3的宽度为500μm、高度为500μm；所述横向长微凹道5的宽度为500μm、高度为500μm；
2)将用于蛋白质合成的原料(实施例28)混合作为水相，在10℃通过管道从水相入口6注入；将油相(实施例25)通过管道从油相入口4注入；水相在十字通道13处受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，从微液滴出口7收集微液滴，见图7，置于恒温反应容器中，在6℃存放。
油相和水相的流速比为20:1，所述油相的流速为50μL/min。
将微液滴升温至在37℃放置1h，基因表达，得到绿色荧光蛋白，见图8。

Claims (6)

1.一种用于无细胞蛋白质合成的微液滴的制备方法，其特征是包括如下步骤：
1)使用微流控芯片装置，所述微流控芯片装置包括基板(1)，在基板(1)上设置有矩形环状微凹道(2)，横向短微凹道(3)的右端与矩形环状微凹道的左侧微凹道连接，横向长微凹道(5)与矩形环状微凹道的右侧微凹道垂直相通为十字通道(13)，在位于横向短微凹道(3)的左端位置贯穿基板设置有油相入口(4)，在横向长微凹道的左端位置贯穿基板设置有水相入口(6)，在横向长微凹道的右端位置贯穿基板设置有微液滴出口(7)，油相入口(4)通过管道与油相源(10)连接，水相入口(6)通过管道与水相源(9)连接，微液滴出口(7)连接有管道，基板(1)上覆盖有载玻片(12)；
2)将用于蛋白质合成的原料混合作为水相，在2-10℃通过管道从水相入口(6)注入；将油相通过管道从油相入口(4)注入；水相在十字通道(13)处受到油相的剪切力，分散形成油包水微液滴，从微液滴出口(7)收集微液滴置于恒温反应容器中，在4-10℃存放；
用于蛋白质合成的原料按体积比为(10-20):(15-35):1的比例包括组合物1、组合物2和基因；
所述基因为能表达所需蛋白质的基因，所述基因存在的形式为基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种；
组合物1包括比例为1g:0.01-0.1ml:1-3ml的细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；
所述细胞破碎产物为真核细胞或原核细胞破碎产物；
所述缓冲溶液1为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；
所述缓冲溶液2为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水；
所述组合物2由按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：
所述氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为5-20mmol/L的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述反应缓冲液包括：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1.0-5.0mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水；
所述能量补充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述矩形环状微凹道(2)的宽度为10-500μm、高度为10-500μm；所述横向短微凹道(3)的宽度为10-500μm、高度为10-500μm；所述横向长微凹道(5)的宽度为10-500μm、高度为10-500μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述油相和水相的流速比为20-5:1，所述油相的流速为1μL/min-50μL/min。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征是所述油相由轻质矿物油和表面活性剂按体积比为100:1-10的比例组成，所述表面活性剂为EM90或司盘80。
5.权利要求1-4之一的方法制备的用于无细胞蛋白质合成的微液滴。
6.权利要求5的用于无细胞蛋白质合成的微液滴在无细胞蛋白质合成中的应用。
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