CN107298699B - 通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方及方法，配方包括用于生产蛋白质的细胞提取物，用于生产蛋白质的外加反应物，用于生产蛋白质的基因质粒，浓度为10‑300mg/ml大分子拥挤试剂水溶液，大分子拥挤试剂为葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、牛血清白蛋白或血红蛋白。本发明的方法能够提高体外生物生产蛋白质产量，并满足蛋白类药物研发高通量、快速筛选的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方及方法，属于生物技术领域。
背景技术
多肽及蛋白质类物质在诊断、治疗或作为疫苗预防各种疾病方面发挥着重要作用。蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠，蛋白质药物已成为医药产品中的重要组成部分。
目前生产蛋白类药物主要有化学合成法、生物技术生产法、生物活性多肽改性、多肽天然产物研发。但这几类方法通常通量低、耗时长、操作复杂。而目前，高通量、快速高效研究已经成为蛋白质功能研究的趋势，传统方式已无法满足研究要求，这就需要我们探索一种高效合成蛋白质的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方。
本发明的第二个目的是提供一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方，包括：用于生产蛋白质的细胞提取物；用于生产蛋白质的外加反应物；用于生产蛋白质的基因质粒；浓度为10-300mg/ml大分子拥挤试剂水溶液；所述大分子拥挤试剂为葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、牛血清白蛋白或血红蛋白。
所述用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒和大分子拥挤试剂水溶液的体积比为(10-20):(15-35):1:(0.5-10)。
用于生产蛋白质的细胞提取物包括比例为1g:0.01～0.1ml:1～3ml的细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；所述缓冲溶液1为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；所述缓冲溶液2为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水；所述细胞为真核细胞或原核细胞。
用于生产蛋白质的外加反应物由按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：
所述氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为5-20mmol/L的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述反应缓冲液包括：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1.0-5.0mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水；
所述能量补充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮的重均分子质量范围为8000--400000。
一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的方法，包括如下步骤：将用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒和浓度为10-300mg/ml大分子拥挤试剂水溶液混合，置于恒温反应容器中，在25-37℃放置10min-48h。
用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒和大分子拥挤试剂水溶液的体积比为(10-20):(15-35):1:(0.5-10)。
用于生产蛋白质的细胞提取物包括比例为1g:0.01～0.1ml:1～3ml的细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；所述缓冲溶液1为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；所述缓冲溶液2为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水；所述细胞为真核细胞或原核细胞。
所述用于生产蛋白质的外加反应物由按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：
所述氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为5-20mmol/L的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述反应缓冲液包括：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1.0-5.0mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水；
所述能量补充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮的重均分子质量范围为8000-400000。
本发明的优点：
本发明的方法能够提高体外生物生产蛋白质产量，并满足蛋白类药物研发高通量、快速筛选的要求。
附图说明
图1是用本发明的通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方生产蛋白质产量检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
缓冲溶液1的组成见表1的实施例1-3
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 5mmol/L | 10mmol/L | 20mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 30mmol/L | 60mmol/L | 100mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 10mmol/L | 14mmol/L | 20mmol/L |
| 二硫苏糖醇 | 0.5mmol/L | 1mmol/L | 2mmol/L |
| 2-巯基乙醇 | 5mmol/L | 7mmol/L | 10mmol/L |
| 溶剂是去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
缓冲溶液2的组成见表2的实施例4-6
表2
| 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 5mmol/L | 10mmol/L | 20mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 30mmol/L | 60mmol/L | 100mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 10mmol/L | 14mmol/L | 20mmol/L |
| 二硫苏糖醇 | 0.5mmol/L | 1mmol/L | 2mmol/L |
| 溶剂是去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例7
细胞破碎产物的制备：
将培养后的麦胚细胞(真核细胞)收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。
用实施例7的方法，制备粉纹夜蛾、草地夜蛾、兔网织红细胞的细胞破碎产物。
用实施例7的方法，制备原核细胞大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的细胞破碎产物。
细胞破碎的方法除机械法外，还可以采用反复冻融法、超声处理法、酶解法、碱裂解法或化学渗透法。
用于生产蛋白质的细胞提取物的配方见表3实施例8-10
表3
细胞来源：
麦胚：http://www.000860.com/sxkg/
粉纹夜蛾QB-TN9-4s-CL-B：http://www.biovector.net/product/336508.html
大肠杆菌BL21(DE3)CICC23796：
http://sales.china-cicc.org/category.php？id＝1&sh＝jd&keywords＝23796
氨基酸混合液见表4实施例11-13
表4
反应缓冲液见表5实施例14-16
表5
能量补充液见表6实施例17-19
表6
| 实施例17 | 实施例18 | 实施例19 | |
| 三磷酸尿苷 | 1mmol/L | 2mmol/L | 3mmol/L |
| 三磷酸胞苷 | 1mmol/L | 2mmol/L | 3mmol/L |
| 三磷酸腺苷 | 1mmol/L | 2mmol/L | 3mmol/L |
| 三磷酸鸟苷 | 3mmol/L | 6mmol/L | 9mmol/L |
| 去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
用于生产蛋白质的外加反应物见表7实施例20-22(体积比，单位为mL)
表7
基因质粒可以购买或通过基因改造获得。
pRset-CFP(购于：Promega Corporation)
pRset-YFP(购于：Promega Corporation)
pRset-eGFP(购于：Promega Corporation)
上述质粒的举例是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，但并不对其进行限定，其它质粒也可以用于本发明。
实施例23
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方，包括：体积比为10：15：1：0.5的用于生产蛋白质的细胞提取物(实施例8制备)；用于生产蛋白质的外加反应物(实施例20制备)；用于生产蛋白质的基因质粒pRset-CFP；浓度为10mg/ml大分子拥挤试剂(重均分子质量为8000的聚乙二醇)水溶液；
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的方法，包括如下步骤：
将上述用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒和大分子拥挤试剂水溶液混合，置于恒温反应容器中，在37℃放置10min。蛋白质产量见图1。
实施例24
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方，包括：体积比为20：35：1：5的用于生产蛋白质的细胞提取物(实施例9制备)；用于生产蛋白质的外加反应物(实施例21制备)；用于生产蛋白质的基因质粒pRset-YFP；浓度为300mg/ml大分子拥挤试剂(重均分子质量为400000的聚蔗糖)水溶液；
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的方法，包括如下步骤：
将上述用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒和大分子拥挤试剂水溶液混合，置于恒温反应容器中，在25℃放置48h。蛋白质产量见图1。
用重均分子质量为400000的葡聚糖或重均分子质量为400000的聚乙烯吡咯烷酮替代本实施例的重均分子质量为400000的聚蔗糖，，其它同本实施例，可以高效体外生物生产蛋白质。
实施例25
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方，包括：体积比为15：25：1：10的用于生产蛋白质的细胞提取物(实施例10制备)；用于生产蛋白质的外加反应物(实施例22制备)；用于生产蛋白质的基因质粒pRset-eGFP；浓度为300mg/ml大分子拥挤试剂(牛血清白蛋白)水溶液；
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的方法，包括如下步骤：
将上述用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒和大分子拥挤试剂水溶液混合，置于恒温反应容器中，在37℃放置10h。蛋白质产量见图1。
实施例26
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方，包括：体积比为15：25：1：10的用于生产蛋白质的细胞提取物(实施例10制备)；用于生产蛋白质的外加反应物(实施例22制备)；用于生产蛋白质的基因质粒pRset-eGFP；作为大分子拥挤试剂的生物试剂(血红蛋白)水溶液10mg/ml。
通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的方法，包括如下步骤：
将上述用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒和大分子拥挤试剂水溶液混合，置于恒温反应容器中，在37℃放置5h。蛋白质产量见图1。
用甘油替代本实施例的血红蛋白，其它同本实施例，可以高效体外生物生产蛋白质。
对照例
体外生物生产蛋白质的配方，包括：体积比为10：15：1用于生产蛋白质的细胞提取物(实施例8制备)；用于生产蛋白质的外加反应物(实施例20制备)；用于生产蛋白质的基因质粒pRset-CFP；
体外生物生产蛋白质的方法，包括如下步骤：
将上述用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒混合，置于恒温反应容器中，在37℃放置10min。蛋白质产量见图1。
Claims (2)
1.一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的组合物，其特征是包括：体积比为10：15：1：0.5的用于生产蛋白质的细胞提取物；用于生产蛋白质的外加反应物；用于生产蛋白质的基因质粒pRset-CFP和浓度为10mg/ml重均分子质量为8000的聚乙二醇水溶液；
所述用于生产蛋白质的细胞提取物包括比例为1g:0.01ml:1ml的麦胚细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；所述缓冲溶液1为：5mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30mmol/L谷氨酸钾，10mmol/L谷氨酸镁，0.5mmol/L二硫苏糖醇，5mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；所述缓冲溶液2为：5mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30mmol/L谷氨酸钾，10mmol/L谷氨酸镁，0.5mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水；
所述用于生产蛋白质的外加反应物由按体积比为2:20:2:1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：
所述氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为5mmol/L的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述反应缓冲液包括：40mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80mmol/L谷氨酸钾、10mmol/L谷氨酸镁、10mmol/L 3-磷酸甘油酸、5mmol/L环磷酸腺苷、2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1mmol/L辅酶A、0.4mmol/L亚叶酸、1mg/mL转运核糖核酸、0.4mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水；
所述能量补充液包括：1mmol/L三磷酸尿苷，1mmol/L三磷酸胞苷，1mmol/L三磷酸腺苷，3mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
2.一种通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的方法，其特征是包括如下步骤：将体积比为10：15：1：0.5的用于生产蛋白质的细胞提取物、用于生产蛋白质的外加反应物、用于生产蛋白质的基因质粒pRset-CFP和浓度为10mg/ml重均分子质量为8000的聚乙二醇水溶液混合，置于恒温反应容器中，在37℃放置10min；
所述用于生产蛋白质的细胞提取物包括比例为1g:0.01ml:1ml的麦胚细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；所述缓冲溶液1为：5mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30mmol/L谷氨酸钾，10mmol/L谷氨酸镁，0.5mmol/L二硫苏糖醇，5mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；所述缓冲溶液2为：5mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30mmol/L谷氨酸钾，10mmol/L谷氨酸镁，0.5mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水；
所述用于生产蛋白质的外加反应物由按体积比为2:20:2:1的氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成：
所述氨基酸混合液，溶剂为去离子水；每种氨基酸的浓度均为5mmol/L的等摩尔浓度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
所述反应缓冲液包括：40mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80mmol/L谷氨酸钾、10mmol/L谷氨酸镁、10mmol/L 3-磷酸甘油酸、5mmol/L环磷酸腺苷、2mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1mmol/L辅酶A、0.4mmol/L亚叶酸、1mg/mL转运核糖核酸、0.4mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水；
所述能量补充液包括：1mmol/L三磷酸尿苷，1mmol/L三磷酸胞苷，1mmol/L三磷酸腺苷，3mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 300350 District, Jinnan District, Tianjin Haihe Education Park, 135 beautiful road, Beiyang campus of Tianjin University Applicant after: Tianjin University Address before: 300072 Tianjin City, Nankai District Wei Jin Road No. 92 Applicant before: Tianjin University |
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| GR01 | Patent grant | ||
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