CN102796682B

CN102796682B - 一种利用silac标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基

Info

Publication number: CN102796682B
Application number: CN 201210276080
Authority: CN
Inventors: 徐平; 平灵艳; 杨大福; 常蕾
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: CN102796682A

Abstract

本发明公开了一种利用SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基。本发明提供一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，包括无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶、盐酸噻胺和葡萄糖；所述无机盐为Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、NaCl、MgSO₄、NH₄Cl和CaCl₂。本发明的实验证明，本发明开发的一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，为标记大肠杆菌蛋白质组、定量内标的制备和高精度地定量蛋白质组研究创造了条件。

Description

一种利用SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基。

背景技术

大肠杆菌是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的简称，因1885年被Theodor Escherich发现而得名。大肠杆菌属细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，是革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢。

大肠杆菌在自然界广泛分布，也是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内，大多数不致病，与人终身相伴。其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，并产生有杀菌作用的大肠杆菌素，惠及其寄生的宿主。

由于菌体繁殖迅速，易培养，价廉，易变异且易被检出等诸多优点，大肠杆菌已经成为现代生物学中研究最多的一种模式生物。由于其结构简单，大肠杆菌被广泛用于生物化学、遗传学、分子生物学和代谢途径的研究，以揭示生命的奥秘。大肠杆菌对于分子遗传学的建立和发展以及生物工程的兴起均发挥了重要作用。Cohen和Boyer于1973年在大肠杆菌中创造了重组DNA技术，开创了基因工程研究的先河，使得该菌成为代谢途径和生物机制研究最透彻的微生物之一。

由于遗传背景清楚、载体和受体系统完备、技术操作简单、生长迅速、培养简单、重组子稳定和大规模发酵便宜等优点，使得大肠杆菌成为基因工程研究中最主要的原核受体菌，广泛应用于外源DNA的克隆和扩增、原核基因高效表达和基因文库构建等基础研究。用大肠杆菌生产的人生长激素、生长激素释放抑制因子、胰岛素等均已经取得了成功，并成功地实现了产业化，创造了巨大的产业价值。

尽管大肠杆菌具有诸多优点，但也给人类带来了诸多麻烦，如果控制不当，还可能引起突发事件。作为条件致病菌，在肠道中的大肠杆菌一旦离开肠道进入胆囊、尿道、膀胱、阑尾等，可引起炎症反应。当细菌由于如溃疡等因素导致的穿孔而进入腹腔时，通常会导致致命性的腹膜炎症感染。大肠杆菌的某些菌株本身还具有毒性（其中一些类似导致痢疾的毒素），可以导致食物中毒，使得细胞脱水引起腹泻等，并可引发群体的急性感染，如1996年5-8月份日本的O157：H7大肠杆菌引起的疫情，波及9000多人。不仅如此，由于许多大肠杆菌可在菌体死亡溶解后产生内毒素，对机体产生强烈的毒性，可引起宿主发热、毒血症、败血症、心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎、肾炎等严重疾患，甚至休克死亡，使得大肠杆菌所致疾病的治疗更为复杂。而抗药性基因的衍变以及在菌株间的广泛传播，使得耐药菌泛滥成灾，难治愈，死亡率高并且极易复发，这已经成为人类临床治疗的重大难题和养禽业的重大威胁，困扰和阻滞了养殖业的发展。因此，耐药基因及其质粒在大肠杆菌菌株间的转殖、衍变和耐药菌的产生、发展的系统生物学探索也同样具有重要的生物医学研究价值。

蛋白质是基因功能的直接执行者，且相互关联，共同执行细胞复杂的生命活动过程。蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质，并研究其功能的新兴学科。大肠杆菌的蛋白质组学研究，特别是定量蛋白质组学研究可以发现、鉴别基因差异和生物学处理的效应，揭示其分子调控网络及其分子机制。但由于技术的限制，早期大肠杆菌组学水平的蛋白质鉴定主要依靠双向凝胶电泳，难于分清所有的蛋白质及其量的变化。近来，基于液相色谱-质谱联用技术为简单蛋白质组的高覆盖奠定了技术基础。由于质谱本身并不是好的定量工具，定量蛋白质组学研究需要定量标准。目前基于细胞培养过程中的重稳定性同位素标记氨基酸的整体蛋白质组标记技术（stable isotope labelingby amino acid in cell culture，SILAC）已经成为定量蛋白质组学研究的金标准。

Krijgsveld等在进行¹⁵N标记的线虫定量蛋白质组学研究时利用¹⁵N标记的铵盐作为唯一氮源培养大肠杆菌，这种培养基不但价格昂贵，难以达到高水平标记，并且对数据处理要求较高。丁琛等利用哺乳动物细胞的SILAC培养基培养大肠杆菌，用于制备目标导向蛋白质组学研究用的重稳定性同位素标记肽段。但这种标记方法使用哺乳动物细胞的培养基，完全改变了普通的大肠杆菌培养基组成和特性，无法研究大肠杆菌的正常发酵条件，且价格昂贵。Carroll等利用M9盐基础培养基制备目标导向蛋白质组学研究用的重稳定性同位素标记肽段，尽管也获得了单个目的蛋白的较高的标记效率，但生长缓慢，也没有对标记过程进行有效监测，难于应用于定量蛋白质组学研究。由于缺乏有效的标记方法，至今还没有大肠杆菌高效SILAC培养基的问世和大规模定量蛋白质组学研究论文的发表，阻碍了大肠杆菌定量蛋白质组学研究的进展及其在发酵产业、基础医学研究中作用的发挥。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基。

本发明提供的专用培养基，包括无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶、盐酸噻胺和葡萄糖；

所述无机盐为Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、NaCl、MgSO₄、NH₄Cl和CaCl₂。

上述培养基中，所述组氨酸盐酸盐为L-组氨酸盐酸盐；所述异亮氨酸为L-异亮氨酸；所述缬氨酸为L-缬氨酸；所述亮氨酸为L-亮氨酸；所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸；所述色氨酸为L-色氨酸；所述丝氨酸为L-丝氨酸；所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定性同位素标记L-赖氨酸；所述精氨酸为L-精氨酸；所述苏氨酸为L-苏氨酸；所述酪氨酸为L-酪氨酸；所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。

上述培养基中，所述Na₂HPO₄·12H₂O、所述KH₂PO₄、所述NaCl、所述MgSO₄、所述NH₄Cl、所述CaCl₂、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为17100：3000：580：120：1000：11：1：10000：20：30：150：30：50：20：400：30：100：200：30：20：20：20。

上述培养基还包括水；所述培养基由所述Na₂HPO₄·12H₂O、所述KH₂PO₄、所述NaCl、所述MgSO₄、所述NH₄Cl、所述CaCl₂、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐、所述尿嘧啶和水组成。

上述培养基中，所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述培养基中的终浓度为17100mg/L；

所述KH₂PO₄在所述培养基中的终浓度为3000mg/L；

所述NaCl在所述培养基中的终浓度为580mg/L；

所述MgSO₄在所述培养基中的终浓度为120mg/L；

所述NH₄Cl在所述培养基中的终浓度为1000mg/L；

所述CaCl₂在所述培养基中的终浓度为11mg/L；

所述葡萄糖在所述培养基中的终浓度为10000mg/L；

所述盐酸噻胺在所述培养基中的终浓度为1mg/L；

所述L-组氨酸盐酸盐在所述培养基中的终浓度为20mg/L；

所述L-异亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；

所述L-缬氨酸在所述培养基中的终浓度为150mg/L；

所述L-亮氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；

所述L-苯丙氨酸在所述培养基中的终浓度为50mg/L；

所述L-色氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；

所述L-丝氨酸在所述培养基中的终浓度为400mg/L；

所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；

所述L-精氨酸在所述培养基中的终浓度为100mg/L；

所述L-苏氨酸在所述培养基中的终浓度为200mg/L；

所述L-酪氨酸在所述培养基中的终浓度为30mg/L；

所述L-蛋氨酸在所述培养基中的终浓度为20mg/L；

所述腺嘌呤硫酸盐在所述培养基中的终浓度为20mg/L；

所述尿嘧啶在所述培养基中的终浓度为20mg/L。

上述培养基中，所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸为L-lysine-¹³C₆或L-lysine-¹³C₆ ¹⁵N₂。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述的专用培养基的方法，包括如下步骤：按照所述终浓度将所述Na₂HPO₄·12H₂O、所述KH₂PO₄、所述NaCl、所述MgSO₄、所述NH₄Cl、所述CaCl₂、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐、所述尿嘧啶、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖和水混合，得到培养基。

上述的培养基在SILAC标记大肠杆菌蛋白质组中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法。

本发明提供的方法，为将大肠杆菌在上述的培养基中培养，实现SILAC标记大肠杆菌蛋白质组。

上述方法中，所述培养的方式为37℃培养7-12代。

本发明的实验证明，本发明开发的一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，可以专门用于SILAC标记大肠杆菌蛋白质组，不仅省却了营养缺陷型构筑的繁琐步骤和遗传条件限制，而且可以实现快速、高效地标记，为定量内标的制备和高效精确地定量蛋白质组研究创造了条件。

附图说明

图1为SILAC标记的大肠杆菌蛋白的色谱-质谱联用结果图

图2为SILAC标记的大肠杆菌蛋白的标记效率测试结果图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明可以通过以下实例更容易地理解，但本发明并不仅限于这些实例。

实施例1、SILAC标记大肠杆菌专用培养基

表1为SILAC标记大肠杆菌专用培养基组分

备注：无机试剂为普通分析纯国产试剂，轻标氨基酸均购自美国Amresco公司，L-lysine-¹³C₆购自美国CIL公司，货号：CNLM-291-0.25。

按照上述组分及其终浓度，用超纯水配置，得到SILAC标记大肠杆菌专用培养基。无机盐及葡萄糖采用高压灭菌的方式，氨基酸及维生素采用过滤除菌的方式。

实施例2、SILAC标记大肠杆菌专用培养基的应用

一、SILAC标记大肠杆菌专用培养基标记大肠杆菌

1、SILAC标记

实验室常用的基因工程改造的大肠杆菌，如E.coli BL21(DE3)等均可用本发明的培养条件进行培养。

挑取新鲜的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌落，接种到普通的含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基，220转/分钟转速下37℃培养10小时，10000g离心3分钟收集菌体，用无菌水清洗2遍，再按照OD₆₀₀初始值为0.00037（1.5/2¹²=0.00037）的密度接种于由实施例1制备的SILAC标记大肠杆菌专用培养基中，37℃培养12代至OD值约为1.5时，17000g离心5分钟，收集菌体，得到SILAC标记E.coli BL21(DE3)菌体。

2、检测

1）总蛋白的提取

以10mM pH 8.0的Tris缓冲液、0.1M的NaH₂PO₄、8M尿素、0.02%SDS和10mM β-巯基乙醇作为蛋白提取液，用玻璃珠（Biospec Products Inc.,Bartlesville）震荡破壁法裂解SILAC标记E.coli BL21(DE3)菌体。菌体-玻璃珠混合液在旋涡混合仪上最高速震荡1分钟，在冰上冷却1分钟，共14次得到裂解产物，再将裂解产物在17000g的条件下离心5分钟，收集上清得到总蛋白。用常用的Bradford法定量后用于蛋白酶消化。

2）消化

取5μg总蛋白经终浓度5mM的DTT处理30分钟后，用终浓度20mM的碘乙酰胺避光25℃下处理30分钟，再加入尿素至终浓度为8M变性30分钟，用50MmNH₄HCO₃稀释尿素至4M浓度，用10ng/μl的赖氨酸蛋白酶C（Lys-C：日本Wako公司,货号：125-05061）37℃消化14小时，得到肽段。

3）色谱-质谱联用分析

将上述所得的肽段以C18柱脱盐(3M,St.Paul,MN)，以10μl的5%乙腈和1%甲酸的色谱-质谱联用上样缓冲液进行溶解，取2μl进行色谱-质谱联用分析，具体参照文献Xu,P.;Duong,D.;Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatographyfor shotgun proteomics.J Proteome Res 2009,8(8),3944-50中记载的方法。

随机选取半胱氨酸合成酶A肽段IQGIGAGFIPANLDLK结果如图1（标记曲线的图说明的总体肽段的标记水平）所示，利用本发明开发的SILAC培养基对大肠杆菌进行12代培养，大肠杆菌的蛋白可以达到完全标记，所有肽段从开始时的全部为轻标赖氨酸的形式变为只有重稳定性同位素标记赖氨酸的形式。表明本申请开发的SILAC培养基培养12代后可以实现大肠杆菌蛋白质组的完全标记。

二、SILAC标记大肠杆菌的标记效率测定

按照上述第一部分中1的方法标记E.coli BL21(DE3)，并分别在1代、2代、3代、7代和12代取样，按照上述第一部分中2的方法进行提取总细胞蛋白、测定标记效率（为重标氨基酸替换轻标氨基酸的比例）。对每个样品的定量结果进行轻重标定量值的对数的分布分析。实验重复三次，结果取平均值。

结果表明如图2和表1所示，1代时标记效率为48.27%，2代时为73.88%，3代时为84.98%，7代时为98.46%，12代时为99.49%。表明本申请开发的SILAC培养基培养7代后已经接近完全标记，12代后可以实现大肠杆菌蛋白质组的完全标记。

表1为大肠杆菌标记效率

^#标记效率=标记后的重标信号/总信号

Claims

1.一种SILAC标记大肠杆菌专用培养基，包括无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶、盐酸噻胺和葡萄糖；

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：

所述组氨酸盐酸盐为L-组氨酸盐酸盐；所述异亮氨酸为L-异亮氨酸；所述缬氨酸为L-缬氨酸；所述亮氨酸为L-亮氨酸；所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸；所述色氨酸为L-色氨酸；所述丝氨酸为L-丝氨酸；所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定性同位素标记L-赖氨酸；所述精氨酸为L-精氨酸；所述苏氨酸为L-苏氨酸；所述酪氨酸为L-酪氨酸；所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：

所述Na₂HPO₄·12H₂O、所述KH₂PO₄、所述NaCl、所述MgSO₄、所述NH₄Cl、所述CaCl₂、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为17100：3000：580：120：1000：11：1：10000：20：30：150：30：50：20：400：30：100：200：30：20：20：20。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述培养基还包括水；所述培养基由所述Na₂HPO₄·12H₂O、所述KH₂PO₄、所述NaCl、所述MgSO₄、所述NH₄Cl、所述CaCl₂、所述盐酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记L-赖氨酸、所述L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐、所述尿嘧啶和水组成。

5.根据权利要求2-4中任一所述的培养基，其特征在于：

所述Na₂HPO₄·12H₂O在所述培养基中的终浓度为17100mg/L；