CN105950513B - 一种标记细菌的silac培养基及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种标记细菌的SILAC培养基及其制备方法与应用。该培养基包括无机盐、碳源、无机氮源以及甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、脯、色、丝、酪、半胱、蛋、苏、天冬、谷、精、组等氨酸以及天冬酰胺、谷氨酰胺、重稳定同位素标记赖氨酸，稳定同位素标记赖氨酸的含量至少为200mg/L。本发明通过提高培养基中重稳定同位素标记赖氨酸的浓度，同时在培养基中添加了其他19种常见的氨基酸让该培养基的营养成分齐全，使得本发明所提供的标记细菌的SILAC培养基与现有技术相比具有以下优点：适用于多种细菌；细菌在该培养基中生长速度快；标记速度快，1～3代可以完成标记；操作简单、重复性好等。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基，特别涉及一种标记细菌的SILAC培养基及其制备方法与应用。
背景技术
细菌是自然界中种类和数量众多的群体。它与人类活动息息相关，有许多细菌是致病的，甚至能致命，相反也有许多细菌是有益的，特别是许多工程菌服务于人类，同时在人体的消化道中也有许多益生菌有助于人类健康。自人类基因组计划完成后，许多细菌如大肠杆菌等，其基因组也纷纷被测序解读，这也就为蛋白质组学的发展提供了契机。蛋白质组学能以一个细胞内全部蛋白质来解读生命现象，这为寻找药物靶点，生物标签以及了解微生物提供了有效的手段。
如上所述的蛋白质组学研究方法中，早期用于研究细菌蛋白质组学的是2-D电泳结合质谱鉴定。然而，2-D电泳有诸多局限，如蛋白质鉴定数量少，实验程序繁琐，疏漏了分子量较大、分子量较小以及极端等电点蛋白质，还疏漏了许多疏水性蛋白质。而在细菌中，疏水的膜蛋白质占有很大的比重，因此双向电泳技术损失了很多蛋白质的信息。以iTRAQ为代表的化学标记以及非标记定量也可以用于细菌蛋白质的定量。其中iTRAQ高效的标记样品中的肽段，而不受制于蛋白本身的理化性质，然而iTRAQ试剂盒昂贵，而且在标记前分别处理样品，特别是对下游进一步做肽段进行富集的实验，容易引入随机误差。但是与代谢标记和非标记定量技术相比，化学标记的肽段鉴定数量较少。非标记定量对样品的要求低，但是对质谱要求较高，而且多维度预分离导致了更差的再现性，因此由于实验的可重复性差种种原因限制了非标记定量技术的在蛋白质组学领域的广泛应用。
因此，相对而言，代谢标记是比较理想的定量细菌蛋白质组学的方法。在细菌的代谢标记中，15N标记虽然已经很好的应用于细菌中，但是这也同时要求细菌必须能生长在只以无机15N为氮源的能自身合成氨基酸等各种含氮产物的微生物中，然而许多的微生物为氨基酸或者维生素营养缺陷型，也就导致了细菌无法生长在这些只以无机铵盐为氮源的培养基中。同时，15N标记对搜索引擎提出了强大的挑战。
在众多蛋白质组学方法中，SILAC(Stable isotope labeling by amino acid incell culture，细胞稳定同位素标记技术)有蛋白质鉴定数量多，定量准确，容易操作，以及应用范围广等优点。然而SILAC在细菌蛋白组学中的应用却寥寥无几。一种利用SILAC标记大肠杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基(CN201210276080.4)以及论文Quantitativeproteomics reveals significant changes in cell shape and an energy shiftafter IPTG induction via an optimized SILAC approach for Escherichiacoli.Journal of proteome research 12,5978-5988，公开了一种利用重稳定同位素标记赖氨酸标记大肠杆菌的SILAC培养基。然而，在现有的技术中，如上述的论文和专利文献等均表明，在标记的过程中均不能向培养基中添加天冬氨酸和天冬酰胺，因为该专利的发明人认为在大肠杆菌中天冬氨酸和天冬酰胺会转化成赖氨酸，从而降低标记效率。在上述的技术中，并不能将常见的20种氨基酸添加到培养基中，而用于细菌的SILAC标记培养基一般都是限制性培养基，营养相对匮乏，缺乏氨基酸导致细菌生长速度会明显变慢。甚至，某些氨基酸营养缺陷型细菌在缺乏氨基酸的培养基中还不能生长。因此，现有技术至少有以下的缺点：(1)由于培养基的营养成分不足，缺少氨基酸，某些细菌不能在其中生长，导致适用范围小；(2)加入其他氨基酸使细菌能生长，导致标记效率下降；(3)由于采用单个氨基酸赖氨酸的标记，致使C末端为精氨酸的肽段无法参与定量，导致蛋白质组定量时减少了一半的定量数据，使定量的准确性下降；(4)由于现有技术标记速度慢，达到95％以上的标记效率需要传代次数多。因此急需一种定量准确、适用范围广、标记速度快的技术方法来满足细菌蛋白质组学的研究发展。
发明内容
本发明首要的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种标记细菌的SILAC培养基。该培养基含有20种生物生长所需要的氨基酸，且控制重稳定同位素标记赖氨酸的含量为200mg/L，使细菌普遍能够在该培养基中生长，并且被培养基中的重稳定同位素标记赖氨酸标记。本发明所提供的SILAC培养基具有适用范围广，用于标记细菌蛋白质组时操作简单的优点。
一种标记细菌的SILAC培养基，包括无机盐、碳源、氮源；所述氮源包括无机氮源和氨基酸；所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸以及重稳定同位素标记赖氨酸；所述重稳定同位素标记赖氨酸的含量至少为200mg/L。所述的培养基为限制性培养基，营养成分相对有限，当细菌生长在其中时，由于培养基中含有充足的重稳定同位素标记赖氨酸，细菌容易将重稳定同位素标记赖氨酸进行脱氨基作用，进而使重稳定同位素标记赖氨酸的碳骨架进入三羧酸循环，用于合成其他生命过程所需的物质，如合成其他氨基酸。重稳定同位素标记赖氨酸的碳骨架含有同位素13C，当该骨架用于合成其他氨基酸时候会改变氨基酸的分子量，导致在质谱仪分析后，蛋白质的质核比无法与数据库匹配而造成蛋白质鉴定量的减少或定量的错误。加入其他氨基酸，能有效的抑制相对应氨基酸的生物合成，提高蛋白质的鉴定数量以及提供蛋白质定量的准确性。其次是许多细菌为氨基酸缺陷型，或为了需要，需要敲除细菌的某些基因，导致在缺少某种氨基酸的培养基中细菌无法生长，加入各种常见的氨基酸在培养基中能使培养基具有最广泛的适用性。
优选地，所述的重稳定同位素标记赖氨酸为L-lysine-13C6 15N2或L-lysine-13C6 14N2。
优选地，所述重稳定同位素标记赖氨酸的浓度为200～400mg/L。发明人在研究过程中发现，当重稳定同位素标记赖氨酸的浓度大于等于200mg/L时，所选的模式细菌，如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌均能被重稳定同位素标记赖氨酸标记。
优选地，所述的精氨酸为重稳定同位素标记精氨酸。胰酶为蛋白质组样品分析前水解蛋白质最常用的酶，胰酶的酶切位点为肽链中精氨酸或赖氨酸的C末端肽键，因此采用双标记，即采用重稳定同位素标记赖氨酸和重稳定同位素精氨酸标记蛋白质，能使蛋白质在水解后，除蛋白质C末端的肽链外，所有肽链均带有同位素标记的氨基酸，保证了肽链的有效标记，大大的提高了鉴定效率和蛋白质定量的准确性。
优选地，所述的重稳定同位素标记精氨酸为L-argrinine-13C6 14N4或L-argrinine-13C6 15N4。
优选地，所述重稳定同位素标记精氨酸的浓度为30～400mg/L；优选为100～400mg/L；更优选为200～400mg/L。当重稳定同位素标记精氨酸的浓度低于30mg/L时，许多细菌会生长缓慢，如金黄色葡萄球菌，甚至会导致标记效率过低而无法用于定量蛋白质。其次重稳定同位素标记精氨酸价格相当昂贵，过高的浓度会造成极大的浪费。优选地，所述标记细菌的SILAC培养基还包括柠檬酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素、Tris-碱。添加上述物质能够使细菌更好地生长。自然界中或者为了某些需要会造成许多细菌为维生素的营养缺陷型或某些特定物质的营养缺陷型，增加柠檬酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素能够增加所述SILAC培养基的适用性。Tris碱溶液是良好的缓冲液，配合HCl使用可以配置所需的pH，使培养基更适合多种不同细菌的生长。
优选地，所述标记细菌的SILAC培养基中，所述无机氮源为硫酸铵，所述碳源为葡萄糖；所述无机盐为氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸亚铁。发明人经过反复实验，在尽量兼顾多种细菌生长的前提下，挑选了上述各种无机盐，有利于细菌在本发明所提供的SILAC培养基中生长状态更好。
优选地，所述标记细菌的SILAC培养基中，所述的甘氨酸的含量为100～400mg/L；所述的丙氨酸的含量为100～400mg/L；所述的缬氨酸的含量为100～400mg/L；所述的亮氨酸的含量为100～400mg/L；所述的异亮氨酸的含量为100～400mg/L；所述的苯丙氨酸的含量为100～400mg/L；所述的脯氨酸的含量为100～400mg/L；所述的色氨酸的含量为100～400mg/L；所述的丝氨酸的含量为100～400mg/L；所述的酪氨酸的含量为100～400mg/L；所述的半胱氨酸的含量为100～400mg/L；所述的蛋氨酸的含量为100～400mg/L；所述的天冬酰胺的含量为100～400mg/L；所述的谷氨酰胺的含量为100～400mg/L；所述的苏氨酸的含量为100～400mg/L；所述的天冬氨酸的含量为100～400mg/L；所述的谷氨酸的含量为100～400mg/L；所述的组氨酸的含量为100～400mg/L。发明人经过反复的实验和摸索，最终确定在上述各种氨基酸在该浓度范围内既能够有效的抑制相应氨基酸的生物合成，又不会造成细菌通过自身代谢途径合成精氨酸和赖氨酸，而导致重稳定同位素标记精氨酸和重稳定同位素标记赖氨酸的标记效率不合格。同时，细菌还能在该培养基中快速的生长。
优选地，所述标记细菌的SILAC培养基中，所述的精氨酸为重稳定同位素标记精氨酸，浓度为200mg/L；所述重稳定同位素标记赖氨酸的含量为200mg/L；所述氯化钙的浓度为16.58mg/L，所述氯化钾的浓度为3000mg/L，所述氯化钠的浓度为9500mg/L，所述硫酸镁的浓度为633mg/L，所述磷酸二氢钾的浓度为140mg/L，所述硫酸锰·H2O的浓度10mg/L，所述柠檬酸的浓度为6mg/L，所述硫胺素的浓度为2mg/L，所述尼克酸的浓度为2mg/L，所述泛酸的浓度为2mg/L，所述生物素的浓度为2mg/L，所述硫酸亚铁·7H2O的浓度为6mg/L，所述硫酸铵的浓度为4000mg/L，所述葡萄糖的浓度为5000mg/L，所述Tris-base的浓度为12100mg/L；所述甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸的浓度均为200mg/L。经过实验发现，在兼顾细菌生长速度，标记效率，氨基酸的相互转化各方面的问题的前提下，确定了SILAC培养基中各个组分的最优浓度，在上述条件下，细菌能够快速的生长；同时能够兼顾多种细菌的生长，能有效的防止氨基酸的相互转化，并且获得合格的，即大于等于95％的重稳定同位素标记精氨酸的标记效率和重稳定同位素标记赖氨酸的标记效率。
优选地，所述标记细菌的SILAC培养基中，所述的细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌和鲍曼不动杆菌中的至少一种。上述细菌中包含了革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，且上述多种细菌均为常见的模式生物，上述细菌能够被标记表明所述的SILAC培养基具有最广泛的适用性。
本发明所述的标记细菌的SILAC培养基，在标记细菌蛋白质组中的应用也属于本发明的保护范围。用本发明所述的SILAC培养基进行标记细菌进而获得细菌的定量蛋白质组数据，具有操作简单，所需时间短，定量准确率高，鉴定蛋白质数量多，重复性好的优点。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
发明人发现，添加到培养基中的重稳定同位素标记的氨基酸的标记效率会随着浓度的升高而升高；发明人猜想细菌会优先利用培养基中的氨基酸而抑制相应氨基酸的合成，从而使重稳定同位素标记赖氨酸在肽链中的占有率足够高，即保证足够高的标记效率。而且细菌在营养全面的培养基中生长速度快，同时标记效率也高。
本发明通过提高培养基中重稳定同位素标记赖氨酸的浓度至大于或等于200mg/L，同时在培养基中添加了其他19种常见的氨基酸让该培养基的营养成分齐全，使得本发明所提供的标记细菌的SILAC培养基与现有技术相比具有以下优点：适用于多种细菌；细菌在该培养基中生长速度快；标记速度快，1～3代可以完成标记；操作简单、重复性好等。
附图说明
图1为实施例1的蛋白质定量相关性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)制备不同配比的SILAC培养基
①培养基A，具体成分和含量如表1所示：溶剂为水。
表1
所述重稳定同位素标记赖氨酸为L-lysine-13C6 15N2
②培养基B：与培养基A的区别仅在于重稳定同位素标记赖氨酸的浓度为100mg/L。
③培养基C：与培养基A的区别仅在于重稳定同位素标记赖氨酸的浓度为150mg/L。
④培养基D：与培养基A的区别仅在于重稳定同位素标记赖氨酸的浓度为200mg/L。
⑤培养基E：与培养基A的区别仅在于重稳定同位素标记赖氨酸的浓度为300mg/L。
⑥培养基F：与培养基A的区别仅在于重稳定同位素标记赖氨酸的浓度为400mg/L。
⑦培养基G：与培养基F的区别仅在于所述精氨酸为重稳定同位素标记精氨酸，浓度为30mg/L；所述重稳定同位素标记精氨酸为L-argrinine-13C6 15N4。
⑧培养基H：与培养基G的区别仅在于所述的重稳定同位素标记精氨酸的浓度为100mg/L；所述重稳定同位素标记精氨酸为L-argrinine-13C6 14N4。
⑨培养基I：与培养基G的区别仅在于所述的重稳定同位素标记精氨酸的浓度为200mg/L。
⑩培养基J：与培养基G的区别仅在于所述的重稳定同位素标记精氨酸的浓度为400mg/L。
培养基K：与培养基D的区别仅在于所述重稳定同位素标记赖氨酸为L-lysine-13C6 14N2；所述甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸的浓度均为100mg/L。
培养基L：与培养基D的区别仅在于所述重稳定同位素标记赖氨酸为L-lysine-13C6 14N2；所述甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸的浓度均为400mg/L。
培养基M：具体成分和含量如表2所示：溶剂为水。
表2
所述重稳定同位素标记赖氨酸为L-lysine-13C6 14N2
(2)培养基A～M的效果检测
将每种培养基分别用于培养大肠杆菌(BW 25113，中国微生物菌种保藏中心)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、枯草芽孢杆菌(美国168)、铜绿假单胞杆菌(ATCC 9027)、鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)，于37℃、220rpm培养获细菌。按文献“Soufi,B.,Kumar,C.,Gnad,F.,Mann,M.,Mijakovic,I.,and Macek,B.(2010)Stable isotope labeling by aminoacids in cell culture(SILAC)applied to quantitative proteomics of Bacillussubtilis.Journal of proteome research 9,3638-3646”操作，提取并且用胰酶水解细菌蛋白质获得多肽；将多肽用液相串联质谱仪分析后，用MaxQuant进行搜索，在搜索结果中的“peptide.txt”文件中，将C末端分别以赖氨酸或精氨酸结尾的多肽数据分开，并且根据重链与轻链的比值分别计算得出重稳定同位素标记赖氨酸和重稳定同位素标记精氨酸的标记效率。所述重链即指含有重稳定同位素标记氨基酸的多肽。结果如表3所示。表中“H-Lys”为重稳定同位素标记赖氨酸，“H-Arg”为重稳定同位素标记精氨酸；“-”表示无相关数据。上述菌株均可通过商业途径获得，本实施例所用菌株从美国菌种保藏中心或中国微生物菌种保藏中心购买获得。
表3、各种细菌的重稳定同位素氨基酸的标记效率(％)
(3)定量蛋白质组可重复性检测
取所配制的SILAC培养基I于37℃、220rpm培养金黄色葡萄球菌ATCC29213，并且加入环丙沙星(CPFX)至浓度为0.6μg/L。同时，在相应的轻链培养基培养金黄色葡萄球菌ATCC29213作为对照。将被稳定同位素标记的和非标记的细菌等量混合进行定量蛋白质组分析，实验进行生物学重复两次，对同一蛋白质的两次变化值进行相关性分析，具体方法参见(Native SILAC:metabolic labeling of proteins in prototroph microorganismsbased on lysine synthesis regulation.Molecular&cellular proteomics:MCP 12,1995-2005)，求得皮尔逊相关系数r＝0.9528，实验重复结果一致性好，结果如图1所示。该结果表明，SILAC技术用于定量金黄色葡萄球菌差异蛋白质组时，具有优良的稳定性和高的重复性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种标记细菌的SILAC培养基，包括无机盐、碳源、氮源；所述氮源包括无机氮源和氨基酸；其特征在于：所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸以及重稳定同位素标记赖氨酸；所述重稳定同位素标记赖氨酸的含量至少为200mg/L。
2.根据权利要求1所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：所述重稳定同位素标记赖氨酸的浓度为200～400mg/L。
3.根据权利要求1所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：所述的精氨酸为重稳定同位素标记精氨酸。
4.根据权利要求3所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：所述重稳定同位素标记精氨酸的浓度为30 ～ 400 mg/L。
5.根据权利要求1所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：还包括柠檬酸、硫胺素、尼克酸、泛酸、生物素、Tris-碱。
6.根据权利要求5所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：所述无机氮源为硫酸铵，所述碳源为葡萄糖；所述无机盐为氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸亚铁。
7.根据权利要求1所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：
所述的甘氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的丙氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的缬氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的亮氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的异亮氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的苯丙氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的脯氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的色氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的丝氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的酪氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的半胱氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的蛋氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的天冬酰胺的含量为100～400 mg/L；
所述的谷氨酰胺的含量为100～400 mg/L；
所述的苏氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的天冬氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的谷氨酸的含量为100～400 mg/L；
所述的组氨酸的含量为100～400 mg/L。
8.根据权利要求6所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：所述的精氨酸为重稳定同位素标记精氨酸，浓度为200 mg/L；所述重稳定同位素标记赖氨酸的含量为200 mg/L；所述氯化钙的浓度为16.58 mg/L，所述氯化钾的浓度为3000 mg/L，所述氯化钠的浓度为9500mg/L，所述硫酸镁的浓度为633 mg/L，所述磷酸二氢钾的浓度为140 mg/L，所述硫酸锰•H2O的浓度10 mg/L，所述柠檬酸的浓度为6 mg/L，所述硫胺素的浓度为2 mg/L，所述尼克酸的浓度为2 mg/L，所述泛酸的浓度为2 mg/L，所述生物素的浓度为2 mg/L，所述硫酸亚铁•7H2O的浓度为6 mg/L，所述硫酸铵的浓度为4000 mg/L，所述葡萄糖的浓度为5000 mg/L，所述Tris-碱的浓度为12100 mg/L；所述甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸的浓度均为200 mg/L。
9.根据权利要求1～8任一项所述标记细菌的SILAC培养基，其特征在于：所述的细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌和鲍曼不动杆菌中的至少一种。
10.权利要求1～8任意一项所述的标记细菌的SILAC培养基在标记细菌蛋白质组中的应用。
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