CN110055270A - 一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法，其中的基因载体系统是双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因中的双巯基与金纳米颗粒连接。本发明的基因载体系统，在分子水平上拉近表达基因之间的空间距离，并应用于无细胞蛋白生产，由于表达基因空间距离的拉近，可以大大提高蛋白表达产量和生产效率。
Description
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，特别是涉及一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法。
背景技术
蛋白质作为基因功能的执行体，在调节生命活动方面具有重要作用，依赖于近几十年对蛋白质结构和功能知识的不断积累，蛋白质药物逐渐发展成熟，对肿瘤、感染、自身免疫性疾病、代谢性遗传病、各种老年病及退行性疾病等几乎所有疾病领域均具有重要影响，正在成为21世纪重要的治疗、预防和诊断用药。如何高效率、高产量的生产蛋白质是蛋白质药物的发展和应用的关键性问题。
无细胞蛋白合成系统(cell-free protein synthesis，CFPS)作为一种体外生命模拟体系，以外源脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)为模板，利用细胞提取物中的蛋白合成酶系、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、聚合酶和能量物质，在体外完成模拟细胞内蛋白合成与翻译后修饰过程。CFPS简便快速，避免了细胞系统蛋白合成过程中多步繁琐的基因克隆步骤，能够在极短时间内完成蛋白质的合成，这是传统的生物合成所不能实现的，而且相较于细胞系统，CFPS的可控性和可操作性更强，可在蛋白合成过程中，随时对系统进行人为干预，在生产蛋白药物方面具有潜在应用价值。
然而，提高CFPS系统合成效率是其应用于蛋白药物生产待解决的紧要问题。通过优化CFPS系统提高系统的蛋白表达量是扩大体外无细胞表达系统应用范围的关键程序。CFPS的优化可从体系微环境、细胞提取物、体系反应形式和基因等多个层次展开。基因作为目标蛋白的信息使者，其存在形式、结构和所处环境对于蛋白产量具有重要影响。通过构建不同基因载体结构，提高CFPS蛋白表达效率和产量已被初步证实是一条有效的优化CFPS系统的途径。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种双巯基修饰的三枝状DNA支架。
本发明的第二个目的是提供一种双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法。
本发明的第三个目的是提供双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因。
本发明的第四个目的是提供双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的制备方法。
本发明的第五个目的是提供一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统。
本发明的第六个目的是提供一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法。
本发明的第七个目的是提供一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，是由3种DNA单链组成；第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段；第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对。
优选地，第1种DNA单链的核苷酸数为38-78个；第2种DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22-26。
一种双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)取摩尔数相同的第1种DNA单链、第2种DNA单链和第3种DNA单链溶于80-100mM的NaCl水溶液中，混匀，置于PCR仪中，控制温度由95-90℃，在0.8-2小时内降温到25-4℃；第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段，第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列能与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列能与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列能与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对；
(2)按第1种DNA单链和补骨脂素摩尔比为1：10-100的比例，向步骤(1)中加入补骨脂素，混合，在365nm的紫外下照射，照射能量为1-4J，获得双巯基修饰的三枝状DNA支架。
优选地，所述第1种DNA单链的核苷酸数为38-78个；第2种DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22-26。
双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因，是双巯基修饰的三枝状DNA支架的第3种DNA单链的3-3段连接有含有目标蛋白基因的DNA序列。
双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的制备方法，包括如下步骤：向EP管中加入双巯基修饰的三枝状DNA支架，使终浓度为0.15-1.6μM，加入线性引物，使终浓度为0.15-1.6μM，加入含有目标蛋白基因的质粒，使终浓度为0.1-3ng/μl和1╳DNA聚合酶，用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因。
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统，是双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因中的双巯基与金纳米颗粒连接。
上述一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法，包括如下步骤：向EP管中加入金纳米颗粒和双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因，混合，于-20℃放置2-12小时，在室温下，使体系融化，得到一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统；金纳米颗粒与双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的摩尔比为1:2-30。
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用，包括如下步骤：按体积比为(10-20):(15-35):1的将细胞提取物，补充缓冲液，用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统混合，加入终浓度0.4-1.2mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于恒温反应容器中，在30℃表达目标蛋白。
本发明的一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统，在分子水平上拉近表达基因之间的空间距离，并应用于无细胞蛋白生产，由于表达基因空间距离的拉近，可以大大提高蛋白表达产量和生产效率。
附图说明
图1为双巯基修饰的三枝状DNA支架生成示意图。
其中的1为第1种DNA单链，它分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；2为第2种DNA单链，它分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；3为第3种DNA单链，分为3-1段、3-2段和3-3段，3-3段作为后续反应的引物的粘性末端序列。
图2为双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因制备流程图。
图3为本发明双巯基修饰的基因序列合成的电泳图，其中，M为DNA标准品；1为第一种双巯基修饰的基因序列；2为第二种双巯基修饰的基因序列。
图4为本发明的基因载体(2种基因)的示意图。
图5为本发明的用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统投射电子显微镜图片。
图6为本发明的以基因载体作为CFPS系统目标蛋白表达基因的蛋白表达情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1：缓冲溶液1的组成:
10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，60mmol/L谷氨酸钾，14mmol/L谷氨酸镁，1mmol/L二硫苏糖醇，7mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水补足至1L。
实施例2：缓冲溶液2的组成:
10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，60mmol/L谷氨酸钾，14mmol/L谷氨酸镁，1mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水补足至1L。
实施例3
细胞破碎产物的制备：
将培养后的大肠杆菌收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。(本发明以市售的大肠杆菌为例，并不对本发明作任何限定)
实施例4
细胞提取物的配方：由1g细胞破碎产物(实施例3制备)、0.06ml缓冲溶液1(实施例1)和2ml缓冲溶液2(实施例2)组成。
实施例5
氨基酸混合液组成：
每种氨基酸的浓度均为10mmol/L的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；溶剂为去离子水补足至1L。
实施例6
反应缓冲液的组成：
50mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、90mmol/L谷氨酸钾、15mmol/L谷氨酸镁、20mmol/L3-磷酸甘油酸、7.5mmol/L环磷酸腺苷、3.3mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2.6mmol/L辅酶A、0.6mmol/L亚叶酸、2mg/mL转运核糖核酸、0.6mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水补足至1L；
实施例7
能量补充液的组成：
2mmol/L三磷酸尿苷，2mmol/L三磷酸胞苷，2mmol/L三磷酸腺苷，6mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水补足至1L。
实施例8
补充缓冲液的组成：(体积比，单位为mL)
由按体积比为5:24:3的氨基酸混合液(实施例5制备)、反应缓冲液(实施例6制备)、能量补充液(实施例7制备)组成。
实施例9
一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，由3种DNA单链组成(见图1)。
第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第1种DNA单链的核苷酸数为38个，1-1段和1-2段的核苷酸数相同；
第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链的核苷酸数为38个，2-1段和2-2段的核苷酸数相同；
第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段，3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38个，3-1段和3-2段的核苷酸数相同；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22，共计60个；
第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；
第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对。
3-3段作为后续反应的引物的粘性末端序列。
第1种DNA单链分为1-1段(序列下面为波浪线)和1-2段(序列下面为双实线)
第2种DNA单链分为2-1段(序列下面为双实线)和2-2段(序列下面为虚线)
第3种DNA单链分为3-1段(序列下面为虚线)和3-2段(序列下面为波浪线)和3-3段(序列下面为单实线)
第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；
第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对。
实施例10
一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，由3种DNA单链组成。
第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第1种DNA单链的核苷酸数为78个，1-1段和1-2段的核苷酸数相同；
第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链的核苷酸数为78个，2-1段和2-2段的核苷酸数相同；
第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段，3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为78个，3-1段和3-2段的核苷酸数相同；3-3段的DNA单链的核苷酸数为26，共计104个；
第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；
第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对。
3-3段作为后续反应的引物的粘性末端序列。
第1种DNA单链分为1-1段(序列下面为波浪线)和1-2段(序列下面为双实线)
第2种DNA单链分为2-1段(序列下面为双实线)和2-2段(序列下面为虚线)
第3种DNA单链分为3-1段(序列下面为虚线)和3-2段(序列下面为波浪线)和3-3段(序列下面为单实线)
实施例11
双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)取摩尔数相同的实施例9的第1种DNA单链、第2种DNA单链和第3种DNA单链溶于80mM的NaCl水溶液中，混匀，置于PCR仪中，控制温度由95℃，在0.8小时内降温到25℃；
(2)按第1种DNA单链与补骨脂素的摩尔比为1：100的比例，向步骤(1)中加入补骨脂素，混合，在365nm的紫外下照射，照射能量为1J，获得双巯基修饰的三枝状DNA支架。
实施例12
双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)取摩尔数相同的实施例10的第1种DNA单链、第2种DNA单链和第3种DNA单链溶于100mM的NaCl水溶液中，混匀，置于PCR仪中，控制温度由90℃，在2小时内降温到4℃；
(2)按第1种DNA单链与补骨脂素的摩尔比为1：10的比例，向步骤(1)中加入补骨脂素，混合，在365nm的紫外下照射，照射能量为4J，获得双巯基修饰的三枝状DNA支架。
实施例13
双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的制备方法，包括如下步骤：
向EP管中加入实施例11制备的双巯基修饰的三枝状DNA支架，使终浓度为0.15μM，加入线性引物(5’GCGGGCCTCTTCGCTATTA 3’SEQ ID NO.4)，使终浓度为0.15μM，加入含有eGFP基因
(5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAGCTTTTCACTGGCGTTGTTCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCTAACTCGAGTAGTAGAACTCTCTCAACGTGTACGCCATAGCTAGCTACAACTCTCTCAACGTAACGTACCTAACGCATCGAACTCTCTCAACGTTACTATACTAAACTACCTAACTCTCTCAACGTACTACTGGAAAACTACCTGAATTCGAAGCTTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTT TTGCTGAAAG GAGGAACTATATCCGGAT3’SEQID NO.5)的质粒pRset-eGFP(pRset是商品)，使SEQ ID NO.5所示核酸序列的终浓度为0.1ng/μl，和1╳DNA聚合酶，最后使用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因，见图2和图3中的1泳道。
PCR程序如下：⑴95℃预热3min；⑵95℃变性30s；⑶55℃退火30s；⑷72℃延伸120s；(⑵～⑷重复30个循环)；⑸72℃最终延伸10min。
实施例14
双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因(带有编码T7 RNA聚合酶的基因)的制备方法，包括如下步骤：
向EP管中加入实施例12制备的双巯基修饰的三枝状DNA支架，使终浓度为1,6μM，加入线性引物(5’ATAGGGGTTCCGCGCACATTTCC 3’SEQ ID NO.9)，使终浓度为1.6μM，加入含有T7RNA聚合酶基因
(5’ATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAA3’SEQ ID NO.10)的质粒pQE-T7 RNAP(pQE是商品)，使SEQ ID NO.10所示核酸序列的终浓度为3ng/μl，和1╳DNA聚合酶，最后使用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的双巯基修饰基因。见图3中的2泳道)
该基因编码的T7 RNA聚合酶可以启动增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的表达。PCR程序如下：⑴95℃预热3min；⑵95℃变性30s；⑶55℃退火30s；⑷72℃延伸180s；(⑵～⑷重复30个循环)；⑸72℃最终延伸10min。
实施例15
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法，具体步骤如下：
(1)金纳米颗粒的制备：
以水为溶剂配制97mM的氯金酸母液取1.25ml氯金酸母液置于圆底烧瓶中，加入100ml去离子水，混匀后加热至80℃；称取50mg柠檬酸钠置于EP管，并向EP管中加入50ml去离子水，配制1mg/ml的柠檬酸钠水溶液；将配制的50ml的1mg/ml的柠檬酸钠水溶液加入盛有氯金酸溶液的圆底烧瓶中，进行氯金酸还原制得纳米金种子；
取2.5ml上述获得的纳米金种子置于干净的圆底烧瓶中，加入60ml去离子水，混匀；取10ml质量浓度0.1％的氯金酸水溶液加入圆底烧瓶中；向圆底烧瓶中滴入20ml6.4mg/ml的抗坏血酸水溶液；再滴入5ml 8mg/ml柠檬酸钠水溶液，并不停搅动；静置2小时，合成金纳米颗粒。
(2)向EP管中加入步骤(1)获得的金纳米颗粒、实施例13获得的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码eGFP的基因和实施例14获得的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的基因，按照金纳米：双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码eGFP的基因：双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的基因摩尔比为1:1:1比例混合。将混合后的体系置于-20℃放置2小时，室温下，体系融化，得到一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统。
实施例16
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法，具体步骤如下：
(1)金纳米颗粒的制备同实施例15的步骤(1)；
(2)向EP管中加入步骤(1)获得的金纳米颗粒、实施例13获得的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码eGFP的基因和实施例14获得的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的基因，按照金纳米：双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码eGFP的基因：双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的基因摩尔比为1:4:4比例混合。将混合后的体系置于-20℃放置6小时，室温下，体系融化，得到一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统。(图4和5)
实施例17
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法，具体步骤如下：
(1)金纳米颗粒的制备同实施例15步骤(1)；
(2)向EP管中加入步骤(1)获得的金纳米颗粒、实施例13获得的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码eGFP的基因和实施例14获得的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的基因，按照金纳米：双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码eGFP的基因：双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的基因摩尔比为1:15:15比例混合。将混合后的体系置于-20℃放置12小时，室温下，体系融化，得到一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统。
实施例18
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用，包括如下步骤：
将细胞提取物(实施例4制备)，补充缓冲液(实施例8制备)，提高无细胞蛋白表达的基因载体系统(实施例16制备)按体积比为10:15:1的比例混合，并加入终浓度1.2mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，将混合体系置于恒温反应容器中，在30℃放置12小时，表达目标蛋白。(图6中△表示)
实施例19
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用，包括如下步骤：
将细胞提取物(实施例4制备)，补充缓冲液(实施例8制备)，提高无细胞蛋白表达的基因载体系统(实施例15制备)按体积比为15:20:1的比例混合，并加入终浓度0.4mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，将混合体系置于恒温反应容器中，在30℃放置12小时，表达目标蛋白。
实验结果，其目标蛋白表达量高于对照。
实施例20
一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用，包括如下步骤：
将细胞提取物(实施例4制备)，补充缓冲液(实施例8制备)，提高无细胞蛋白表达的基因载体系统(实施例17制备)按体积比为20:35:1的比例混合，并加入终浓度1.2mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，将混合体系置于恒温反应容器中，在30℃放置12小时，表达目标蛋白。
实验结果，其目标蛋白表达量高于对照。
对照
双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因在无细胞蛋白质生产的应用，包括如下步骤：
将细胞提取物(实施例4制备)，补充缓冲液(实施例8制备)，双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码eGFP的基因(实施例13制备)和双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的带有编码T7 RNA聚合酶的基因(实施例14制备)，按体积比为10:15:0.5:0.5的比例混合，并保证两种基因的摩尔浓度与实施例18中的相等，将混合体系置于恒温反应容器中，在30℃放置12小时，表达目标蛋白。(图6中□表示)
结果如图6所示，基因载体系统作为无细胞蛋白合成系统的基因时，蛋白表达量高于双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因作为无细胞蛋白合成系统基因时的蛋白表达产量。
本发明提出以金纳米颗粒为载体，通过金-硫键将双巯基修饰的基因连接到金纳米颗粒表面，构建一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统，并应用于无细胞生产，提高蛋白表达效率及产量。非变性电泳验证得到双巯基修饰的三枝状DNA支架和双巯基修饰的基因序列；非变性电泳和投射电子显微镜验证得到基因纳米载体；构建的基因载体结构用于无细胞蛋白生产，蛋白产量明显升高。该方法已通过现场较佳实施例子进行描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统及其制备方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaccgata tcatatgtac attactatag tacctgag 38
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcaggtact atagtaatga tcatctatag tacagcct 38
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggctgtact atagatgatt acatatgata tcggtccata accgtattac cgcctttgag 60
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgggcctct tcgctatta 19
<210> 5
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac 60
tttaagaagg agatatacca tggagctttt cactggcgtt gttcccatcc tggtcgagct 120
ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 180
ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 240
caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 300
gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 360
cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 420
cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 480
gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 540
gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 600
cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 660
ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 720
ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatctaactc gagtagtaga actctctcaa 780
cgtgtacgcc atagctagct acaactctct caacgtaacg tacctaacgc atcgaactct 840
ctcaacgtta ctatactaaa ctacctaact ctctcaacgt actactggaa aactacctga 900
attcgaagct tgatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 960
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 1020
tgctgaaagg aggaactata tccggat 1047
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtatgcata tcgctacaca tggaccgata tcatatgtac attactatag tacctgagac 60
cgataggcat atgctagt 78
<210> 7
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actagcatat gcctatcggt ctcaggtact atagtaatga atcatctata gtacagccta 60
catcgtatac gttaaggc 78
<210> 8
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccttaacgt atacgatgta ggctgtacta tagatgattt acatatgata tcggtccatg 60
tgtagcgtat agcatacgta gctcctgaaa atctcgccaa gcta 104
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ataggggttc cgcgcacatt tcc 23
<210> 10
<211> 2652
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540
gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660
attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780
ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900
agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960
aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020
atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080
ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140
gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200
atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260
gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320
aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380
aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440
ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500
tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560
gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620
tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680
ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740
attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800
aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860
ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920
tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980
tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
Claims (9)
1.一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，其特征是由3种DNA单链组成，第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段；第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对。
2.根据权利要求1所述的一种双巯基修饰的三枝状DNA支架，其特征是第1种DNA单链的核苷酸数为38-78个；第2种DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22-26。
3.一种双巯基修饰的三枝状DNA支架的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)取摩尔数相同的第1种DNA单链、第2种DNA单链和第3种DNA单链溶于80-100mM的NaCl水溶液中，混匀，置于PCR仪中，控制温度由95-90℃，在0.8-2小时内降温到25-4℃；
第1种DNA单链分为1-1段和1-2段，在1-2段的3’端连接有巯基；第2种DNA单链分为2-1段和2-2段，在2-2段的3’端连接有巯基；第3种DNA单链分为3-1段、3-2段和3-3段，第1种DNA单链的1-1段核苷酸序列能与第3种DNA单链的3-2段核苷酸序列反向互补配对；
第1种DNA单链的1-2段核苷酸序列能与第2种DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2种DNA单链的2-2段核苷酸序列能与第3种DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对；
(2)按第1种DNA单链和补骨脂素摩尔比为1：10-100的比例，向步骤(1)中加入补骨脂素，混合，在365nm的紫外下照射，照射能量为1-4J，获得双巯基修饰的三枝状DNA支架。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述第1种DNA单链的核苷酸数为38-78个；第2种DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为38-78个；3-3段的DNA单链的核苷酸数为22-26。
5.双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因，其特征是双巯基修饰的三枝状DNA支架的第3种DNA单链的3-3段连接有含有目标蛋白基因的DNA序列。
6.权利要求5的双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的制备方法，其特征是包括如下步骤：向EP管中加入双巯基修饰的三枝状DNA支架，使终浓度为0.15-1.6μM，加入线性引物，使终浓度为0.15-1.6μM，加入含有目标蛋白基因的质粒，使终浓度为0.1-3ng/μl和1╳DNA聚合酶，用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因。
7.一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统，其特征是双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因中的双巯基与金纳米颗粒连接。
8.权利要求7的一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统的制备方法，其特征是包括如下步骤：向EP管中加入金纳米颗粒和双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因，混合，于-20℃放置2-12小时，在室温下，使体系融化，得到一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统；金纳米颗粒与双巯基修饰的三枝状DNA支架修饰的基因的摩尔比为1:2-30。
9.一种用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统在无细胞蛋白质生产的应用，其特征是包括如下步骤：按体积比为(10-20):(15-35):1的将细胞提取物，补充缓冲液，用于提高无细胞蛋白表达的基因载体系统混合，加入终浓度0.4-1.2mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于恒温反应容器中，在30℃表达目标蛋白。
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| CN107298699A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-10-27 | 天津大学 | 通过添加大分子拥挤试剂高效体外生物生产蛋白质的配方及方法 |
| CN107435063A (zh) * | 2016-05-27 | 2017-12-05 | 首都师范大学 | 一种快速制备巯基修饰DNA纳米金复合物(DNA‑AuNP)的方法 |
| CN107541510A (zh) * | 2017-09-29 | 2018-01-05 | 天津大学 | 枝状基因簇纳米材料及制备方法及应用 |
-
2019
- 2019-03-12 CN CN201910182969.8A patent/CN110055270A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107435063A (zh) * | 2016-05-27 | 2017-12-05 | 首都师范大学 | 一种快速制备巯基修饰DNA纳米金复合物(DNA‑AuNP)的方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| MARK R.等: "Thermostable Branched DNA Nanostructures as Modular Primers for Polymerase Chain Reaction", 《ANGEW. CHEM. INT. ED》 * |
| TAO ZHOU等: "pH-Responsive Size-Tunable Self-Assembled DNA Dendrimers", 《ANGEW. CHEM. INT. ED》 * |
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