CN110331147A - 一种mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

一种mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。本发明还公开了一种核酸分子，其依次包括启动子、可转录区段甲、可转录区段乙、可转录区段丙和多聚腺苷酸序列；在所述启动子驱动下，所述可转录区段甲、所述可转录区段乙、所述可转录区段丙和多聚腺苷酸序列可被共同转录产生共同转录物，所述区段甲编码所述共同转录物中的5’端非翻译区；所述区段丙编码所述共同转录物中的3’端非翻译区；所述可转录区段甲为序列1‑4所示的DNA分子；所述可转录区段丙为5‑8所示的DNA分子。所述mRNA分子是以所述核酸分子为模板进行体外转录得到的。本发明提供的核酸分子或mRNA分子可用于制备治疗多种肿瘤的药物。

Description

一种mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物技术和治疗领域，具体涉及mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用，特别涉及OX40L mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
信使RNA(mRNA)在生物体内通常是由DNA通过转录而来，携带基因组信息并能够翻译成蛋白质的单链核糖核酸。真核生物mRNA一般由5’端的帽子结构(CAP)，5’端非翻译区(5’UTR)，翻译区(CDS)，3’端非翻译区(3’UTR)以及3’端的多聚核苷酸尾巴(Poly(A))组成。其中帽子一般由m7G构成，也包含m6A等修饰。mRNA的转录通常遵循碱基互补配对原则，与DNA不同的是，mRNA没有胸腺嘧啶(T)，而是由尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T)。在体内的转录过程主要发生在细胞核。一般DNA在体内转录成mRNA的前体，后者通过各种酶切作用，被加工成成熟的mRNA。成熟的mRNA穿过细胞核核孔，和细胞质中的核糖体结合，在tRNA的帮助下，按照三碱基对应一个密码子的原则翻译出相应的氨基酸，氨基酸通过肽键链接形成多肽，这一过程叫做翻译。
如上所述，转录通常发生在生物体内，但如果将转录所需的RNA转录酶、NTP、CAP等原料在体外无细胞体系中，以合成的DNA为模板，模拟体内的转录过程得到的mRNA，这样的技术叫做体外转录，该技术可以控制任意基因的转录过程和翻译蛋白，用于各种疾病的治疗。普通的体外转录技术通常针对具体的基因，没有优化的UTR和密码子，导致转录和翻译的效率偏低，并且难以大批量生产制备。
发明内容
本发明的目的是提供mRNA的制备方法及其在多种肿瘤治疗中的应用。
本发明首先保护一种核酸分子。所述核酸分子依次包括启动子、可转录区段甲、可转录区段乙、可转录区段丙和多聚腺苷酸序列；在所述启动子驱动下，所述可转录区段甲、所述可转录区段乙、所述可转录区段丙和所述多聚腺苷酸序列可被共同转录产生共同转录物，所述区段甲编码所述共同转录物中的5’端非翻译区；所述区段丙编码所述共同转录物中的3’端非翻译区；
所述可转录区段甲为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1或序列2或序列3或序列4所示的DNA分子；
(a2)将序列1或序列2或序列3或序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1或序列2或序列3或序列4具有相同功能的DNA分子；
所述可转录区段乙为编码肽或蛋白质的核酸序列；
所述可转录区段丙为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5或序列6或序列7或序列8所示的DNA分子；
(b2)将序列5或序列6或序列7或序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5或序列6或序列7或序列8具有相同功能的DNA分子。
上述核酸分子，所述启动子可为T3启动子或T7启动子或SP6启动子；具体可为T7启动子。
所述多聚腺苷酸序列的长度可为20-120bp；具体可为30bp。
上述核酸分子可以是闭合环状分子，也可以为线性分子。
上述核酸分子，所述肽或蛋白质可为现有技术中常见的肽或蛋白质。
在本发明的一个具体实施例中，所述蛋白质为mcherry。
在本发明的另一个具体实施例中，所述蛋白质为OX40L。
含有上述核酸分子的载体也属于本发明的保护范围。
本发明又保护一种mRNA分子。所述mRNA分子依次包括5’端帽子结构、5’端非翻译区、肽或蛋白质的编码区、3’端非翻译区和多聚腺苷酸序列；
所述5’端帽子结构为3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构或m7G(5’)ppp(5’)G标准帽结构；
所述5’端非翻译区为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列9或序列10或序列11或序列12所示的RNA分子；
(c2)将序列9或序列10或序列11或序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9或序列10或序列11或序列12具有相同功能的RNA分子；
所述3’端非翻译区为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列13或序列14或序列15或序列16所示的RNA分子；
(d2)将序列13或序列14或序列15或序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13或序列14或序列15或序列16具有相同功能的RNA分子。
上述mRNA分子中，所述肽或蛋白质可为现有技术中常见的肽或蛋白质。具体可为mcherry或OX40L。
在本发明的一个具体实施例中，所述mRNA为OX40L mRNA，所述OX40L mRNA依次包括5’端帽子结构、5’端非翻译区、OX40L蛋白质的编码区、3’端非翻译区和多聚腺苷酸序列。所述5’端帽子结构为3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构，所述5’端非翻译区如序列11所示，所述OX40L蛋白质的编码区序列如序列17所示，所述3’端非翻译区如序列13所示，所述多聚腺苷酸序列由30个碱基A组成。
本发明还保护上述mRNA分子的制备方法。所述制备方法包括如下步骤：
1)提供上述核酸分子；
2)将所述核酸分子作为转录模板进行体外转录，得到所述mRNA分子；
所述体外转录体系包括帽子结构类似物和底物；
所述帽子结构类似物可为3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构类似物或m7G(5’)ppp(5’)G标准帽结构类似物(3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构类似物或m7G(5’)ppp(5’)G标准帽结构类似物均为现有技术中的商品)；
所述底物由三磷酸腺苷ATP、三磷酸鸟苷GTP、三磷酸胞苷CTP、1-甲基-假尿嘧啶核苷1-MePU组成，或所述底物由三磷酸腺苷ATP、三磷酸鸟苷GTP、三磷酸胞苷CTP、假尿嘧啶核苷PU组成，或所述底物由三磷酸腺苷ATP、三磷酸鸟苷GTP、三磷酸胞苷CTP、三磷酸尿苷UTP组成。
进一步的，所述1)中，可采用PCR扩增或限制性内切酶线性化质粒DNA的方法制备得到上述核酸分子。
所述2)中，所述体外转录体系由所述转录模板、转录酶、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构类似物或m7G(5’)ppp(5’)G标准帽结构类似物、1-甲基-假尿嘧啶核苷1-MePU或假尿嘧啶核苷PU或三磷酸尿苷UTP、三磷酸腺苷ATP、三磷酸鸟苷GTP、三磷酸胞苷CTP、反应缓冲液和水组成；
更进一步的，所述3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构类似物或m7G(5’)ppp(5’)G标准帽结构类似物在转录体系中的浓度均可为2.5U/μl。
所述底物在转录体系中的浓度均可为15mM。
按照上述方法制备得到的mRNA分子或序列7或序列8所示的可转录区段丙或序列15或序列16所示的3’端非翻译区也均属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种产品。所述产品的活性成分为上述核酸分子或上述载体或上述mRNA分子或按照上述方法制备得到的mRNA分子；所述产品的功能为抑制肿瘤生长或治疗肿瘤。
如下m1)-m4)任一所述的应用也属于本发明的保护范围：
m1)上述可转录区段甲和/或可转录区段丙在制备mRNA分子中的应用；
m2)上述核酸分子或载体在制备mRNA分子中的应用；
m3)上述可转录区段甲或可转录区段丙或上述核酸分子或上述载体或上述mRNA分子或按照上述方法制备得到的mRNA分子或上述产品在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用；
m4)上述可转录区段甲或可转录区段丙或上述核酸分子或上述载体或上述mRNA分子或按照上述方法制备得到的mRNA分子或上述产品在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
上述任一所述产品或应用中，所述肿瘤可为现有技术中的常见肿瘤，如肺癌或黑色素瘤。
上述任一所述产品或应用中，所述产品可为药物或制剂。
本发明通过对mRNA分子5’端非翻译区、3’端非翻译区序列及体外转录体系中底物及帽子结构进行优化，提供了一种mRNA分子的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。实验证明：本发明的mRNA制备方法可明显提高mRNA翻译效率，通过将本发明制备的OX40L mRNA导入免疫细胞中表达，能够激活免疫系统，杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长，尤其是有效抑制肺癌细胞和黑素瘤细胞的生长。
附图说明
图1为线性化DNA模板示意图。
图2为不同cap测试结果。
图3为不同U修饰底物的测试结果。
图4为5’UTR测试结果。
图5为3’UTR测试结果。A为不同的3’端非翻译区(3’UTR)-24小时测试结果；B为不同的3’端非翻译区(3’UTR)-48小时测试结果。
图6为体外转录的OX40L mRNA在细胞内的表达水平。
图7为体外转录的OX40L mRNA在抑制肺癌生长中的效果。
图8为体外转录的OX40L mRNA在抑制黑色素瘤生长中的效果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的mcherry载体是将mcherry编码基因序列插入载体骨架Puc57的Not I和BamH I酶切位点间后得到的。载体骨架Puc57是Thermo Fisher的产品，货号为SD0171。
下述实施例中的OX40L载体(人)是将人OX40L编码基因序列(NM_003326.5)插入载体骨架Puc57的EcoR I和Xba I酶切位点间后得到的；OX40L载体(鼠)是将小鼠OX40L编码基因序列(NM_009452.2)插入载体骨架Puc57的BsmB I单酶切位点间后得到的。
下述实施例中的293T细胞购自中科院典藏细胞库，使用含10％的胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基(Gibco)(含1.5mM L-Glutamine，100U/ml penicillin，100μg/mlStreptomycin)，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中进行常规培养。
下述实施例中所涉及的序列如表1和表2所示。
表1、T7启动子加不同5’UTR序列
注：加粗字母为T7启动子序列，下划线斜体字母为5’UTR序列，小写字母gccacc、gccaag均是kozrk序列。
表2、不同3’UTR序列加poly(A)尾
注：加粗字母为3’UTR序列，aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa为poly(A)序列。
本发明的5’UTR的编码序列为如下四种中的任一种：
miniUTR3：AGACTgccaccATGG(序列1)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列9所示。
miniUTR3+3kozrk：AGACTgccaccATGgccaccATGgccaccATGG(序列2)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列10所示。
miniUTR7：AGACTgccaagATGG(序列3)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列11所示。
miniUTR7+3kozrk：AGACTGCCAAGATGGCCAAGATGGCCAAGATGG(序列4)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列12所示。
本发明的3’UTR的编码序列为如下四种中的任一种：
HBA2：GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCA(序列5)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列13所示。
MOD：TAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCTCCATAAAGTAGGAAACACTACAGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(序列6)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列14所示。
高GC：GCGGGCAGCGAGGCACACCGGGCCCTGTCCCACGTGCCCGGCTTTTCATCGGACCGCCTTGCCCCGCGCGGACGGGCGGCGAGAGAGCGCCTGTCTAGGC(序列7)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列15所示。
高AT：ATAAATTAGTCAAATTATTGAACTAACCTGAAGTTTAACTATAGAGCTTGATTCAAAATTACGATATAAGTTTTAAAATGGCTTCATTGCTTATAACTGT(序列8)，其编码的5’UTR的核酸序列如序列16所示。
实施例1、不同cap修饰的mcherry mRNA及其细胞转染实验
一、不同cap修饰的mcherry mRNA的制备
1、体外转录模板的制备
以mcherry载体为模板，采用T7通用引物(GGCTGCGCAACTGTTGGGAAGG)和反向通用引物(ttttttttttttttttttttttttttttttGCCGCCCACTCAGACTTTATTCAAAGACCACTG)进行PCR扩增，得到PCR产物(线性化DNA)，该PCR产物依次包括T7启动子、5’UTR、mcherry编码基因序列和多聚腺苷酸序列(30个碱基A)。其中，5’UTR序列为表1中的对照组所示的序列。
PCR反应体系(50μl)如下：2Xmax Buffer 25μl、dNTP 1μl、mcherry载体2μl(10ng/μl)、T7通用引物2μl、反向通用引物2μl、max酶1μl、DEPC水补足50μl。如无特殊说明，PCR反应体系中的试剂均为南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号：P507-01)中的产品。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，42cycles；72℃5min；16℃1min。
2、体外转录
以步骤1获得的线性化DNA作为转录模板进行体外转录，获得mcherry mRNA。根据cap的不同，体外转录体系分为如下各组：
体外转录体系1(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNACap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水2μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。
体外转录体系2(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、m7G(5’)ppp(5’)G RNA CapStructure Analog(标准帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水4μl。m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。
体外转录体系3(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水6μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。
如无特殊说明，上述体外转录体系中的试剂均为Thermo Fisher Scientific的TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit(货号：K441)中的产品。
体外转录反应条件：37℃转录2h后，加1μl DNaseI(Thermo Fisher Scientific)，混匀后37℃反应30min消化掉模板，然后RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化。
二、不同cap修饰的mcherry mRNA的细胞转染实验
1、将293T细胞(购自中科院典藏细胞库)在10cm dish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用1ml PBS洗涤细胞两次。
2、加入1ml Trypsin-EDTA solution(0.05％Trypsin-EDTA，Gibco)，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置1-2分钟。
3、加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4、血球计数板计数，将细胞稀释至3×106细胞/ml。
5、按1×105细胞/孔的浓度接种24孔板(Corning)，混匀后于37℃、5％CO2培养24小时。
6、利用Lipofectamin2000转染试剂将体外转录的mcherry mRNA转染293T细胞，具体操作方法如下：
(1)在1.5ml EP管中加入100μl DMEM培养基，分别加入1μg步骤一转录得到的mRNA，取另一1.5ml EP管，加入100μl DMEM，加入1μl lipofectamin2000(Invitrogen)，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～30分钟。
(2)吸去24孔板中的培养液，每孔加入300μl无血清的DMEM培养液。
(3)将转染混合物逐滴加入24孔板中，混匀后，在培养箱中温育6小时。
(4)吸弃转染液，分别在24h，48h，72h和96h共四个时间段进行荧光拍照。
荧光拍照结果显示，只有加M7G-3-OME修饰的cap(3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)GRNACap Structure Analog)，转录出来的mRNA才具有很强的荧光，表明该M7G-3-OME修饰的cap有利于提高mcherry mRNA在细胞内的翻译效率(图2)。
实施例2、以不同修饰的U作为底物制备的mcherry mRNA及其细胞转染实验
一、以不同修饰的U作为底物制备mcherry mRNA
1、体外转录模板的制备
以mcherry载体为模板，采用T7通用引物和反向通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物(线性化DNA)，该PCR产物依次包括T7启动子、5’UTR、mcherry编码基因序列和多聚腺苷酸序列(30个碱基A)。其中，5’UTR序列为表1中的对照组所示的序列。
PCR反应体系(50μl)如下：2Xmax Buffer 25μl、dNTP 1μl、mcherry载体2μl(10ng/μl)、T7通用引物2μl、反向通用引物2μl、max酶1μl、DEPC水补足50μl。如无特殊说明，PCR反应体系中的试剂均为南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号：P507-01)中的产品。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，42cycles；72℃5min；16℃1min。
2、体外转录
以步骤1获得的线性化DNA作为转录模板进行体外转录，获得mcherry mRNA。
根据底物U的修饰方式不同，体外转录体系分为如下各组：
体外转录体系1(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNACap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))(Hongene，货号：R5-027)2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水2μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA CapStructure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。
体外转录体系2(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNACap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、P UTP(假尿嘧啶核苷(PU))(Hongene，货号：R5-022)2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水2μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。PU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。
体外转录体系3(20μl)：5X Reaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)GRNA Cap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP2μl、CTP 2μl、UTP(三磷酸尿苷)(Hongene，货号：R5331)2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水2μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。UTP、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。
如无特殊说明，上述体外转录体系中的试剂均为Thermo Fisher Scientific的TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit(货号：K441)中的产品。
体外转录反应条件：37℃转录2h后，加1μl DNaseI(Thermo Fisher Scientific)，混匀后37℃反应30min消化掉模板，然后RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化。
二、以不同修饰的U作为底物制备的mcherry mRNA的细胞转染实验
1、将293T细胞(购自中科院典藏细胞库)在10cm dish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用1ml PBS洗涤细胞两次。
2、加入1ml Trypsin-EDTA solution(0.05％Trypsin-EDTA，Gibco)，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置1-2分钟。
3、加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4、血球计数板计数，将细胞稀释至3×106细胞/ml。
5、按1×105细胞/孔的浓度接种24孔板(Corning)，混匀后于37℃、5％CO2培养24小时。
6、利用Lipofectamin2000转染试剂将体外转录的mcherry mRNA转染293T细胞，具体操作方法如下：
(1)在1.5ml EP管中加入100μl DMEM培养基，分别加入1μg步骤一转录得到的mRNA，取另一1.5ml EP管，加入100μl DMEM，加入1μl lipofectamin2000(Invitrogen)，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～30分钟。
(2)吸去24孔板中的培养液，每孔加入300μl无血清的DMEM培养液。
(3)将转染混合物逐滴加入24孔板中，混匀后，在培养箱中温育6小时。
(4)吸弃转染液，分别在6h，24h，48h，72h，96h(重复上述细胞传代)，120h，144h，170h共八个时间段进行荧光拍照。
荧光拍照结果显示，采用不同U原料体外转录的mRNA均能在细胞内进行mcherry蛋白的翻译，其中1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU)表达最强(图3)。
实施例3、不同5’UTR序列制备的mcherry mRNA及其细胞转染实验
一、不同5’UTR序列制备mcherry mRNA的方法
1、体外转录模板的制备
以mcherry载体为模板，采用不同的5’UTR+T7通用引物(引物序列分别为表1中的miniUTR3、miniUTR3+3kozrk、miniUTR7、miniUTR7+3kozrk、T7通用引物(对照组))和反向通用引物进行PCR扩增，分别得到PCR产物(线性化DNA)，该PCR产物依次包括T7启动子、5’UTR、mcherry编码基因序列和多聚腺苷酸序列。5’UTR序列分别为序列1-4所示的序列和表1中的对照组所示的序列。
PCR反应体系(50μl)如下：2Xmax Buffer 25μl、dNTP 1μl、mcherry载体2μl(10ng/μl)、不同的5’UTR+T7通用引物2μl、反向通用引物2μl、max酶1μl、DEPC水补足50μl。如无特殊说明，PCR反应体系中的试剂均为南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号：P507-01)中的产品。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，42cycles；72℃5min；16℃1min。
2、体外转录
分别以步骤1获得的线性化DNA作为转录模板进行体外转录，获得mcherry mRNA。
体外转录体系(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNACap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水4μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。如无特殊说明，上述体外转录体系中的试剂均为Thermo Fisher Scientific的TranscriptAid T7High YieldTranscription Kit(货号：K441)中的产品。
体外转录反应条件：37℃转录2h后，加1μl DNaseI(Thermo Fisher Scientific)，混匀后37℃反应30min消化掉模板，然后RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化。
二、不同5’UTR序列的mcherry mRNA的细胞转染实验
1、将293T细胞(购自中科院典藏细胞库)在10cm dish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用1ml PBS洗涤细胞两次。
2、加入1ml Trypsin-EDTA solution(0.05％Trypsin-EDTA，Gibco)，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置1-2分钟。
3、加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4、血球计数板计数，将细胞稀释至3×106细胞/ml。
5、按1×105细胞/孔的浓度接种24孔板(Corning)，混匀后于37℃、5％CO2培养24小时。
6、利用Lipofectamin2000转染试剂将体外转录的mcherry mRNA转染293T细胞，具体操作方法如下：
(1)在1.5ml EP管中加入100μl DMEM培养基，分别加入1μg步骤一转录得到的mRNA，取另一1.5ml EP管，加入100μl DMEM，加入1μl lipofectamin2000(Invitrogen)，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～30分钟。
(2)吸去24孔板中的培养液，每孔加入300μl无血清的DMEM培养液。
(3)将转染混合物逐滴加入24孔板中，混匀后，在培养箱中温育6小时。
(4)吸弃转染液，分别在24h，48h共两个时间段进行荧光拍照。
荧光拍照结果显示，采用不同的5’UTR的mRNA均能在细胞内进行mcherry蛋白的翻译，其中5’UTR为序列9-12的mcherry mRNA表达量要比对照组的5’UTR表达量高(图4)。
实施例4、不同3’UTR序列制备的mcherry mRNA及其细胞转染实验
一、不同3’UTR序列制备mcherry mRNA的方法
1、体外转录模板的制备
以mcherry载体为模板，采用miniUTR7+T7通用引物(引物序列为表1中的miniUTR7)和不同的3’UTR+poly(A)反向引物(引物序列分别为表2中HBA2、MOD、高GC、高AT、反向通用引物(对照组))进行PCR扩增，分别得到PCR产物(线性化DNA)，该PCR产物依次包括T7启动子、5’UTR、mcherry编码基因序列、3’UTR和多聚腺苷酸序列。5’UTR序列为序列3所示的序列。3’UTR序列分别为序列5-8所示的序列和表2中的对照组所示的序列。
PCR反应体系(50μl)如下：2Xmax Buffer25μl、dNTP 1μl、mcherry载体2μl(10ng/μl)、miniUTR7+T7通用引物2μl、不同的3’UTR+反向通用引物2μl、max酶1μl、DEPC水补足50μl。如无特殊说明，PCR反应体系中的试剂均为南京诺唯赞生物科技有限公司(VazymeBiotech Co.,Ltd)的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号：P507-01)中的产品。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，42cycles；72℃5min；16℃1min。
2、体外转录
分别以步骤1获得的线性化DNA作为转录模板进行体外转录，获得mcherry mRNA。
体外转录体系(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNACap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水4μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。如无特殊说明，上述体外转录体系中的试剂均为Thermo Fisher Scientific 的TranscriptAid T7High YieldTranscription Kit(货号：K441)中的产品。
体外转录反应条件：37℃转录2h后，加1μl DNaseI(Thermo Fisher Scientific)，混匀后37℃反应30min消化掉模板，然后RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化。
二、以不同修饰的U作为底物制备的mcherry mRNA的细胞转染实验
1、将293T细胞(购自中科院典藏细胞库)在10cm dish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用1ml PBS洗涤细胞两次。
2、加入1ml Trypsin-EDTA solution(0.05％Trypsin-EDTA，Gibco)，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置1-2分钟。
3、加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4、血球计数板计数，将细胞稀释至3×106细胞/ml。
5、按1×105细胞/孔的浓度接种24孔板(Corning)，混匀后于37℃、5％CO2培养24小时。
6、利用Lipofectamin2000转染试剂将体外转录的mcherry mRNA转染293T细胞，具体操作方法如下：
(1)在1.5ml EP管中加入100μl DMEM培养基，分别加入1μg步骤一转录得到的mRNA，取另一1.5ml EP管，加入100μl DMEM，加入1μl lipofectamin2000(Invitrogen)，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～30分钟。
(2)吸去24孔板中的培养液，每孔加入300μl无血清的DMEM培养液。
(3)将转染混合物逐滴加入24孔板中，混匀后，在培养箱中温育6小时。
(4)吸弃转染液，分别在24h，48h共两个时间段进行荧光拍照。
荧光拍照结果显示，采用不同的3’UTR(序列13-16)的mRNA均能在细胞内进行mcherry蛋白的翻译(图5)。
实施例5、OX40L mRNA的制备及其细胞动物实验
一、OX40L mRNA的制备
(一)人OX40L mRNA的制备
1、体外转录模板的制备
以OX40L载体(人)为模板，采用Mini7UTR+T7通用引物(表1中的miniUTR7)和HBA23UTR+反向通用引物(表2中的HBA2)进行PCR扩增，得到PCR产物(线性化DNA)，该PCR产物依次包括T7启动子、5’UTR、人OX40L编码基因序列(序列17)、3’UTR和多聚腺苷酸序列。5’UTR序列为序列3所示的序列。3’UTR序列为序列5所示的序列。
PCR反应体系(50μl)如下：2Xmax Buffer 25μl、dNTP 1μl、OX40L载体2μl(10ng/μl)、Mini7UTR+T7通用引物2μl、HBA2 3UTR+反向通用引物2μl、max酶1μl、DEPC水补足50μl。如无特殊说明，PCR反应体系中的试剂均为南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme BiotechCo.,Ltd)的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号：P507-01)中的产品。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，42cycles；72℃5min；16℃1min。
2、体外转录
以步骤1获得的线性化DNA作为转录模板进行体外转录，获得人OX40L mRNA。
体外转录体系(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNACap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水4μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。如无特殊说明，上述体外转录体系中的试剂均为Thermo Fisher Scientific的TranscriptAid T7High YieldTranscription Kit(货号：K441)中的产品。
体外转录反应条件：37℃转录2h后，加1μl DNaseI(Thermo Fisher Scientific)，混匀后37℃反应30min消化掉模板，然后RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化。
(二)小鼠OX40L mRNA的制备
1、体外转录模板的制备
以OX40L载体(鼠)为模板，采用Mini7UTR+T7通用引物(表1中的miniUTR7)和HBA23UTR+反向通用引物(表2中的HBA2)进行PCR扩增，得到PCR产物(线性化DNA)，该PCR产物依次包括T7启动子、5’UTR、小鼠OX40L编码基因序列(序列18)、3’UTR和多聚腺苷酸序列。5’UTR序列为序列3所示的序列。3’UTR序列为序列5所示的序列。
PCR反应体系(50μl)如下：2Xmax Buffer 25μl、dNTP 1μl、OX40L载体2μl(10ng/μl)、Mini7UTR+T7通用引物2μl、HBA2 3UTR+反向通用引物2μl、max酶1μl、DEPC水补足50μl。如无特殊说明，PCR反应体系中的试剂均为南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme BiotechCo.,Ltd)的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(货号：P507-01)中的产品。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃20s，42cycles；72℃5min；16℃1min。
2、体外转录
以步骤1获得的线性化DNA作为体外转录模板进行体外转录，获得小鼠OX40LmRNA。
体外转录体系(20μl)：5XReaction Buffer 4μl、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNACap Structure Analog(防反帽结构类似物，New England Biolabs)2μl、GTP 2μl、ATP 2μl、CTP 2μl、1-N-Me-Pseudo UTP(1-甲基-假尿嘧啶核苷(1-MePU))2μl、上述PCR产物2μl、转录酶2μl、DEPC水4μl。3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog在体系中的终浓度为2.5U/μl。1-MePU、GTP、ATP、CTP在体系中的终浓度均为15mM。如无特殊说明，上述体外转录体系中的试剂均为Thermo Fisher Scientific的TranscriptAid T7High YieldTranscription Kit(货号：K441)中的产品。
体外转录反应条件：37℃转录2h后，加1μl DNaseI(Thermo Fisher Scientific)，混匀后37℃反应30min消化掉模板，然后RNA纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化。
二、人OX40L mRNA细胞转染实验
1、将293T细胞(购自中科院典藏细胞库)在10cm dish中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用1ml PBS洗涤细胞两次。
2、加入1ml Trypsin-EDTA solution(0.05％Trypsin-EDTA，Gibco)，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置1-2分钟。
3、加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4、血球计数板计数，将细胞稀释至3×106细胞/ml。
5、按1×105细胞/孔的浓度接种24孔板(Corning)，混匀后于37℃、5％CO2培养24小时。
6、利用Lipofectamin2000转染试剂将体外转录的OX40L-mRNA转染293T细胞，具体操作方法如下：
(1)在1.5ml EP管中加入100μl DMEM培养基，分别加入1μg步骤一制备的OX40LmRNA(步骤一的(一)中制备的人OX40L mRNA)，取另一1.5mlEP管，加入100μl DMEM，加入1μllipofectamin2000，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～30分钟。
(2)吸去24孔板中的培养液，每孔加入300μl无血清的DMEM培养液。
(3)将转染混合物逐滴加入24孔板中，混匀后，在培养箱中温育6小时。
(4)吸弃转染液，收集48小时的细胞裂解液，WB检测OX40L的表达情况(OX40L抗体购买自ThermoFisher，货号：PA5-34516)。
实验结果表明：人OX40L mRNA能在相应的细胞系中表达(图6)。
三、小鼠OX40L mRNA动物实验
1、肿瘤小鼠模型构建：将C57BJ/6小鼠(6周龄，雌性，购自北京维通利华公司)在背部肩胛骨处分别接种黑素瘤细胞系B16F10(中科院细胞库)或肺癌细胞系LLC-LEWIS(中科院细胞库)，各105/只小鼠。
2、肿瘤小鼠模型给药：按照如下公式计算肿瘤大小：瘤体测量公式：(长*宽2)/2，待肿瘤大小为100mm3时开始肿瘤原位给药，根据是否给药分为如下各组：
实验组(小鼠OX40L mRNA)：每只给药剂量：3μg OX40L mRNA；给药周期为一周两次，持续2-3周。药物制备方法具体如下：取OX40L mRNA(步骤一的(二)中制备的小鼠OX40LmRNA)3μg，在1.5ml EP管中加入100μl DMEM混匀，取另一1.5ml EP管，加入100μl DMEM，加入3μl lipofectamin2000，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～30分钟，备用。
对照组(control)：肿瘤原位多点打等体积的生理盐水。
3、肿瘤生长曲线：每周测量2次肿瘤大小及体重，当瘤体过大时，处死小鼠，并根据不同时间检测的肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线。
肺癌小鼠模型的肿瘤生长曲线如图7所示，黑素瘤小鼠模型的肿瘤生长曲线如图8所示。从图中可以看出：OX40L mRNA可抑制肿瘤生长，具备抑制多种肿瘤生长的能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110>苏州吉玛基因股份有限公司 苏州吉诺瑞生物科技有限公司
<120>一种mRNA的制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
<160>18
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
agactgccac catgg 15
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
agactgccac catggccacc atggccacca tgg 33
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
agactgccaa gatgg 15
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
agactgccaa gatggccaag atggccaaga tgg 33
<210>5
<211>110
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc 60
tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaagtctga gtgggcagca 110
<210>6
<211>139
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
taataggctg gagcctcggt ggcctagctt cttgcccctt gggcctcccc ccagcccctc 60
ctccccttcc tgcacccgta ccccctccat aaagtaggaa acactacagt ggtctttgaa 120
taaagtctga gtgggcggc 139
<210>7
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
gcgggcagcg aggcacaccg ggccctgtcc cacgtgcccg gcttttcatc ggaccgcctt 60
gccccgcgcg gacgggcggc gagagagcgc ctgtctaggc 100
<210>8
<211>100
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
ataaattagt caaattattg aactaacctg aagtttaact atagagcttg attcaaaatt 60
acgatataag ttttaaaatg gcttcattgc ttataactgt 100
<210>9
<211>15
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>9
agacugccac caugg 15
<210>10
<211>33
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>10
agacugccac cauggccacc auggccacca ugg 33
<210>11
<211>15
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>11
agacugccaa gaugg 15
<210>12
<211>33
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>12
agacugccaa gauggccaag auggccaaga ugg 33
<210>13
<211>110
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>13
gcuggagccu cgguagccgu uccuccugcc cgcugggccu cccaacgggc ccuccucccc 60
uccuugcacc ggcccuuccu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcagca 110
<210>14
<211>139
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>14
uaauaggcug gagccucggu ggccuagcuu cuugccccuu gggccucccc ccagccccuc 60
cuccccuucc ugcacccgua cccccuccau aaaguaggaa acacuacagu ggucuuugaa 120
uaaagucuga gugggcggc 139
<210>15
<211>100
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>15
gcgggcagcg aggcacaccg ggcccugucc cacgugcccg gcuuuucauc ggaccgccuu 60
gccccgcgcg gacgggcggc gagagagcgc cugucuaggc 100
<210>16
<211>100
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>16
auaaauuagu caaauuauug aacuaaccug aaguuuaacu auagagcuug auucaaaauu 60
acgauauaag uuuuaaaaug gcuucauugc uuauaacugu 100
<210>17
<211>552
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>17
atggaaaggg tccaacccct ggaagagaat gtgggaaatg cagccaggcc aagattcgag 60
aggaacaagc tattgctggt ggcctctgta attcagggac tggggctgct cctgtgcttc 120
acctacatct gcctgcactt ctctgctctt caggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa 180
agtatcaaag tacaatttac cgaatataag aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa 240
aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt 300
tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc caggaagtca acattagcct tcattaccag 360
aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg 420
gcctctctga cttacaaaga caaagtctac ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg 480
gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc 540
tgtgtccttt ga 552
<210>18
<211>597
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>18
atggaagggg aaggggttca acccctggat gagaatctgg aaaacggatc aaggccaaga 60
ttcaagtgga agaagacgct aaggctggtg gtctctggga tcaagggagc agggatgctt 120
ctgtgcttca tctatgtctg cctgcaactc tcttcctctc cggcaaagga ccctccaatc 180
caaagactca gaggagcagt taccagatgt gaggatgggc aactattcat cagctcatac 240
aagaatgagt atcaaactat ggaggtgcag aacaattcgg ttgtcatcaa gtgcgatggg 300
ctttatatca tctacctgaa gggctccttt ttccaggagg tcaagattga ccttcatttc 360
cgggaggatc ataatcccat ctctattcca atgctgaacg atggtcgaag gattgtcttc 420
actgtggtgg cctctttggc tttcaaagat aaagtttacc tgactgtaaa tgctcctgat 480
actctctgcg aacacctcca gataaatgat ggggagctga ttgttgtcca gctaacgcct 540
ggatactgtg ctcctgaagg atcttaccac agcactgtga accaagtacc actgtga 597

Claims (10)

1.一种核酸分子，其依次包括启动子、可转录区段甲、可转录区段乙、可转录区段丙和多聚腺苷酸序列；在所述启动子驱动下，所述可转录区段甲、所述可转录区段乙、所述可转录区段丙和所述多聚腺苷酸序列可被共同转录产生共同转录物，所述区段甲编码所述共同转录物中的5’端非翻译区；所述区段丙编码所述共同转录物中的3’端非翻译区；
所述可转录区段甲为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1或序列2或序列3或序列4所示的DNA分子；
(a2)将序列1或序列2或序列3或序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1或序列2或序列3或序列4具有相同功能的DNA分子；
所述可转录区段乙为编码肽或蛋白质的核酸序列；
所述可转录区段丙为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5或序列6或序列7或序列8所示的DNA分子；
(b2)将序列5或序列6或序列7或序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5或序列6或序列7或序列8具有相同功能的DNA分子。
2.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于：所述启动子为T3启动子或T7启动子或SP6启动子；
或，所述启动子为T7启动子。
3.含有权利要求1或2所述的核酸分子的载体。
4.一种mRNA分子，其依次包括5’端帽子结构、5’端非翻译区、肽或蛋白质的编码区、3’端非翻译区和多聚腺苷酸序列；
所述5’端帽子结构为3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构或m7G(5’)ppp(5’)G标准帽结构；
所述5’端非翻译区为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列9或序列10或序列11或序列12所示的RNA分子；
(c2)将序列9或序列10或序列11或序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9或序列10或序列11或序列12具有相同功能的RNA分子；
所述3’端非翻译区为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列13或序列14或序列15或序列16所示的RNA分子；
(d2)将序列13或序列14或序列15或序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13或序列14或序列15或序列16具有相同功能的RNA分子。
5.根据权利要求1或2所述的核酸分子或权利要求4所述的mRNA分子，其特征在于：所述多聚腺苷酸序列的长度为20-120bp；
或，所述蛋白质为OX40L或mcherry。
6.权利要求4或5所述的mRNA分子的制备方法，包括如下步骤：
1)提供权利要求1或2或5所述的核酸分子；
2)将所述核酸分子作为转录模板进行体外转录，得到所述mRNA分子；
所述体外转录体系包括帽子结构类似物和底物；
所述帽子结构类似物为3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G防反帽结构类似物或m7G(5’)ppp(5’)G标准帽结构类似物；
所述底物由三磷酸腺苷ATP、三磷酸鸟苷GTP、三磷酸胞苷CTP、1-甲基-假尿嘧啶核苷1-MePU组成，或所述底物由三磷酸腺苷ATP、三磷酸鸟苷GTP、三磷酸胞苷CTP、假尿嘧啶核苷PU组成，或所述底物由三磷酸腺苷ATP、三磷酸鸟苷GTP、三磷酸胞苷CTP、三磷酸尿苷UTP组成。
7.按照权利要求7或8所述的方法制备得到的mRNA分子。
8.序列7或序列8所示的可转录区段丙；
或，序列15或序列16所示的3’端非翻译区。
9.一种产品，其活性成分为权利要求1或2或5所述的核酸分子或权利要求3所述的载体或权利要求4或5所述的mRNA分子或按照权利要求6或7所述的方法制备得到的mRNA分子；所述产品的功能为抑制肿瘤生长或治疗肿瘤。
10.如下m1)-m4)任一所述的应用：
m1)权利要求1中所述的可转录区段甲和/或可转录区段丙在制备mRNA分子中的应用；
m2)权利要求1或2或5所述的核酸分子或权利要求3所述的载体在制备mRNA分子中的应用；
m3)权利要求1中所述的可转录区段甲或可转录区段丙或权利要求1或2或5所述的核酸分子或权利要求3所述的载体或权利要求4或5所述的mRNA分子或按照权利要求6或7所述的方法制备得到的mRNA分子或权利要求9所示的产品在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用；
m4)权利要求1中所述的可转录区段甲或可转录区段丙或权利要求1或2或5所述的核酸分子或权利要求3所述的载体或权利要求4或5所述的mRNA分子或按照权利要求6或7所述的方法制备得到的mRNA分子或权利要求9所示的产品在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
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