CN106399591B - I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,首先分别选取鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒中高度保守的基因为目标片段I和目标片段Ⅱ,设计并合成相应的特异性引物I和特异性引物Ⅱ;然后分别对鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的基因组RNA和DNA进行提取,将其混合作为模板,进行二重PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳对得到的二重PCR产物进行分析。本发明提供的鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法操作简单、省时省力,可以在同一个反应体系中进行PCR和RT‑PCR,同时对DNA病毒(鸭瘟病毒)和RNA病毒(鸭肝炎病毒)进行扩增和检测,大大减少分别检测所花费的时间和人力成本;本方法具有良好的特异性,能够扩增出高度特异的片段,并且产物杂质极少,适合推广使用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,特别涉及一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种在雏鸭间传播迅速和高度致死性的传染病,主要特征为肝脏肿大,有出血斑点和神经症状,在新疫区,本病致死率很高,可达90%以上。鸭肝炎病毒I型属于小RNA病毒科,呈球形或类球形,直径在20-40NM,无囊膜,无血凝性,可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力强,在自然环境中可较长时间存活。DHV病毒II型属于星状病毒,DHV病毒III型属于小RNA病毒。DVH病毒三种血清型之间无交叉保护作用。目前在我国鸭肝炎病毒I型是主要的流行血清型。
鸭瘟又名鸭病毒性肠炎,是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。该病可引起7日龄以上的雏鸭发病。该病的特征是流行广泛,传播迅速,发病率和死亡率极高。引起鸭瘟的病原体鸭瘟病毒(DPV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)疱疹病毒属(Herpesvirus)中的滤过性的病毒,病毒粒子呈球形,直径为120~180nm,有囊膜,病毒核酸型为DNA。病毒在病鸭体内分散于各种内脏器官、血液、分泌物和排泄物中,其中以肝、肺、脑含毒量最高。本病毒对禽类和哺乳动物的红细胞没有凝集现象,毒株间在毒力上有差异,但免疫原性相似。
I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒是危害养鸭业的两种重要病原,引起雏鸭混合感染,导致大批雏鸭染病死亡,造成严重的损失。目前对这两种病毒通常需要分别进行检测,费时费力,成本较高。多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR,是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,可用于同时鉴定多种微生物。授权公告号为CN104450939B的发明专利公开了一种粉大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速检测方法,可同时对粉蕉枯萎病和大蕉枯萎病的病菌进行检测。灵敏度高、方便快捷、省时省力。因此,如果能开发出一种同时检测I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的方法,将会大大节约人力和时间成本。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法。
本发明具体技术方案如下:
本发明提供了一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括如下步骤:
(1)选取I型鸭肝炎病毒中高度保守的基因为目标片段I,设计并合成相应的特异性引物对I,所述特异性引物对I的序列如下:
上游引物P1:5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT 3'(如SEQ ID NO.1所示);
下游引物P2:5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA 3'(如SEQ ID NO.2所示);
(2)选取鸭瘟病毒中高度保守的基因为目标片段Ⅱ,设计并合成相应的特异性引物对Ⅱ,所述特异性引物对Ⅱ的序列如下:
上游引物P3:5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC 3'(如SEQ ID NO.3所示);
下游引物P4:5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT 3'(如SEQ ID NO.4所示);
(3)分别对I型鸭肝炎病毒的基因组RNA和鸭瘟病毒的基因组DNA进行提取;
(4)将步骤(3)中得到的DNA和RNA混合作为模板,联合使用特异性引物I和特异性引物Ⅱ进行二重PCR扩增;
(5)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)中得到的二重PCR产物进行分析。
上述方法可以同时对DNA病毒(鸭瘟病毒)和RNA病毒(I型鸭肝炎病毒)进行扩增和检测,从一套实验中同时得到两份结果,大大减少分别检测所花费的时间和人力成本;特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ均具有良好的特异性,能够扩增出高度特异的片段,并且杂质极少,也为后续的鉴定操作提供了便利。
进一步地,所述二重PCR的反应体系中包括如下组分:
I型鸭肝炎病毒基因组RNA≥2.65ng/mL、鸭瘟病毒基因组DNA≥1.35ng/mL、特异性引物对I0.15~0.4μM、特异性引物对Ⅱ0.15~0.4μM、dNTP 0.4mM、M-MLV 1U/μL、RNA酶抑制剂2U/μL、DNA聚合酶0.05U/μL以及体积份数为10~30%的10×PCR反应液。
进一步地,所述反应体系中所述特异性引物对I和所述特异性引物对Ⅱ的浓度均为0.35μM。
进一步地,所述反应体系中所述I型鸭肝炎病毒基因组RNA的浓度为2.65*10-3~2.65μg/mL,所述鸭瘟病毒基因组DNA的浓度为1.35*10-3~1.35μg/mL。
进一步地,所述二重PCR的反应条件如下:
45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,54~60℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
上述反应体系和反应条件均经过优化,使用其对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒同时进行PCR扩增,可以在同一条件下、一次实验中同时获得两种获得产量较高、特异性好、纯度高的产物,操作简单、省时省力;RNA酶抑制剂可以抑制环境中存在的微量RNA酶的活性,防止模板RNA被降解,有助于后续实验的顺利进行。
进一步地,所述目的片段I的长度为399bp,所述目的片段Ⅱ的长度为232bp。
本发明的有益效果是:本发明提供的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法操作简单、省时省力,可以在同一个反应体系中进行PCR和RT-PCR,同时对DNA病毒(鸭瘟病毒)和RNA病毒(I型鸭肝炎病毒)进行扩增和检测,从一套实验中同时得到两份结果,大大减少分别检测所花费的时间和人力成本;根据I型鸭肝炎病毒RNA和鸭瘟病毒DNA的保守序列设计的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ均具有良好的特异性,能够扩增出高度特异的片段,并且产物杂质极少,适合推广使用。
附图说明
图1为不同引物用量的二重PCR扩增电泳图;
其中:M:DL2000DNA Marker;1:0.3μL;2:0.4μL;3:0.5μL;4:0.6μL;5:0.7μL;6:0.8μL;
图2为不同退火温度的二重PCR扩增电泳图;
其中:M:DL2000DNA Marker;1:54℃;2:55℃;3:56℃;4:57℃;5:58℃;6:59℃;7:60℃;
图3为不同模板浓度的二重PCR扩增电泳图;
其中:M:DL2000DNA Marker;1:2.65μg/mL DHV+1.35μg/mL DEV;2:0.265μg/mLDHV+0.135μg/mL DEV;3:26.5ng/mL DHV+13.5ng/mL DEV;4:2.65ng/mL DHV+1.35ng/mLDEV;5:0.265ng/mL DHV+0.135ng/mL DEV;6:26.5pg/mL DHV+13.5pg/mL;
图4为不同病毒种类的二重PCR扩增电泳图;
其中:M:DL2000DNA Marker;1.DHV+DEV;2.DHV;3.DEV;4.AIV;5.ARV;6.AEV;7.EDSV;8.GPV;9.MDPV;10.NDV;11.DTMUV。
具体实施方式
实施例1
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括如下步骤:
(1)选取I型鸭肝炎病毒中高度保守的基因为目标片段I,设计并合成相应的特异性引物对I,所述特异性引物对I的序列如下:
上游引物P1:5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT 3';
下游引物P2:5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA 3';
(2)选取鸭瘟病毒中高度保守的基因为目标片段Ⅱ,设计并合成相应的特异性引物对Ⅱ,所述特异性引物对Ⅱ的序列如下:
上游引物P3:5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC 3';
下游引物P4:5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT 3';
(3)分别对I型鸭肝炎病毒的基因组RNA和鸭瘟病毒的基因组DNA进行提取;
(4)将步骤(3)中得到的DNA和RNA混合作为模板,联合使用特异性引物I和特异性引物Ⅱ进行二重PCR扩增;
(5)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)中得到的二重PCR产物进行分析。
实施例2
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例2所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.3μL、2×PCR缓冲液6.0μL、10mmol/L的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、200U的反转录酶1.0μL、40U/μL的RNA酶抑制剂0.5μL,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例3
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例3所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(0.265μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(0.135μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.4μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例4
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例2所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(26.5ng/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(13.5ng/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.5μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例5
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例3所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65ng/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35ng/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.6μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例6
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例2所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例7
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例3所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(0.265μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(0.135μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.8μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例8
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例2所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,54℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例9
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例3所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例10
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例3所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例11
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例2所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,57℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例12
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例3所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例13
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例2所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液6.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,59℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
实施例14
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法,包括实施例3所述的各步骤,其中二重PCR的反应体系和反应条件如下:
反应体系:I型鸭肝炎病毒基因组RNA 1.0μL(2.65μg/mL)、鸭瘟病毒基因组DNA1.0μL(1.35μg/mL)、10μmol/L的特异性引物对I和特异性引物对Ⅱ各0.7μL、10×PCR缓冲液2.0μL、0.4mM的dNTP 4.0μL、200U的PCR聚合酶1.0μL、M-MLV 1U、RNA酶抑制剂1U,,用ddH2O水补足至20μL。
反应条件:45℃保持30min,94℃保持2min;94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸40s,共40个循环;循环结束后72℃延伸10min,最后4℃终止反应。
对照例1
对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒进行二重PCR扩增,采用的模板浓度为I型鸭肝炎病毒RNA0.265ng/ml、鸭瘟病毒DNA0.135ng/ml,反应体系和反应条件同实施例14。
对照例2
对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒进行二重PCR扩增,采用的模板浓度为I型鸭肝炎病毒RNA26.5pg/ml、鸭瘟病毒DNA13.5pg/ml,反应体系和反应条件同实施例14。
对照例3
以I型鸭肝炎病毒(DHV)的基因组RNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例4
以鸭瘟病毒(DEV)的基因组DNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例5
以禽流感病毒(AIV)的基因组RNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例6
以鸭黄病毒(ARV)的基因组RNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例7
以禽传染性脑脊髓炎病毒(AEV)的基因组RNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例8
以减蛋综合征病毒(DESV)的基因组DNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例9
以小鹅瘟病毒(GPV)的基因组DNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例10
以番鸭细小病毒(MDPV)的基因组DNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例11
以新城疫病毒(DESV)的基因组RNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
对照例12
以鸭坦布苏病毒(DESV)的基因组RNA为模板,采用实施例14所述的PCR方法进行PCR扩增。
实验例1
二重PCR反应条件的优化
(1)最适引物用量的确定
以实施例2~7为实验例1~6,分别按照所述反应体系和反应条件进行二重PCR扩增,PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳并用紫外灯扫描拍照,比较各条带的清晰度和宽度。
如图1所示,当退火温度控制在58℃时,10μmol/L的引物用量在0.3~0.8μL范围内均可以获得明亮、清晰的条带、达到较好的PCR效果,其中引物用量达到0.7μL时,两条条带的清晰度和亮度均达到最适效果。因此,反应体系中引物的最适用量为0.7μL,即引物的最适浓度为0.35μM。
(2)最适退火温度的确定
以实施例8~14为实验例1~7,分别按照所述反应体系和反应条件进行二重PCR扩增,PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳并用紫外灯扫描拍照,比较各条带的清晰度和宽度。
如图2所示,当10μmol/L的引物用量控制在0.7μL、退火温度在54~60℃时范围内梯度变化时,均可以获得明亮、清晰的条带、达到较好的PCR效果,其中引物用量退火温度达到58℃时,两条条带的清晰度和亮度均达到最佳效果。因此,反应条件中最适的退火温度为58℃。
实验例2
敏感性试验
以实施例2~5中得到的PCR产物为实验组2~5,以对照例1~2中得到的PCR产物为对照组1~2,用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,电泳电压120V、时间20min,比较条带情况。
如图3所示,经过二重PCR后能扩增出肉眼可见的条带的最低浓度为2.65ng/mL和1.35ng/mL,低于该浓度则无法扩增。因此,该二重PCR方法最低能检测2.65ng/mL的I型鸭肝炎病毒RNA和1.35ng/mL的鸭瘟病毒DNA。
实验例3
特异性试验
以实施例12中得到的扩增产物为实验例1,分别以对照例3~12中得到的扩增产物作为对照组1~10,用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,电泳电压120V、时间20min,比较条带情况。
如图4所示,DHV扩增条带为399bp,DEV扩增条带为232bp,均与实施例14中的扩增条带大小相符;而AIV,ARV,REV,EDSV,GPV,MDPV,NDV,DTMUV病毒均未扩增出条带。这表明该二重PCR扩增方法具有高度特异性。
实验例4
临床试验
从江苏徐州地区的鸭群中随机抽取166份肛拭子,依照实施例20提供的检测方法对样品中的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒同时进行检测。结果显示,检出I型鸭肝炎病毒2份,阳性率为1.2%;鸭瘟病毒43份,阳性率为26%;未检测出其他常见病毒。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> 鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcttaaggc ccggtgcccc gttct 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtagggtag ggaatagtaa agtaa 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgggaaggct ttcggtcgc 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cattcgcgcc tttgctaaat tctct 25
Claims (5)
1.一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测试剂盒,其特征在于,包括用于对I型鸭肝炎病毒基因组RNA中高度保守的目的片段I进行RT-PCR扩增的的特异性引物对I、以及用于对鸭瘟病毒基因组DNA中高度保守的目的片段Ⅱ进行PCR扩增的特异性引物对Ⅱ,所述特异性引物对I的序列如下:
上游引物P1:5'AGCTTAAGGCCCGGTGCCCCGTTCT 3';
下游引物P2:5'GGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAA 3';
所述特异性引物Ⅱ的序列如下:
上游引物P3:5'TGGGAAGGCTTTCGGTCGC 3';
下游引物P4:5'CATTCGCGCCTTTGCTAAATTCTCT 3'。
2.如权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测试剂盒,其特征在于,还包括反应混合液,所述反应混合液中包括如下组分:dNTP 0.4mM、M-MLV 1U/μL、RNA酶抑制剂2U/μL、DNA聚合酶0.05U/μL以及体积份数为10~30%的10×PCR反应液。
3.如权利要求2所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测试剂盒,其特征在于,所述特异性引物对I和所述特异性引物对Ⅱ均添加到所述反应混合液中,其中所述特异性引物对I的浓度为0.15~0.4μM、所述特异性引物对Ⅱ的浓度为0.15~0.4μM;应用所述反应混合液制备反应体系时,向所述反应混合液中加入样品的量为I型鸭肝炎病毒基因组RNA≥2.65ng/mL、鸭瘟病毒基因组DNA≥1.35ng/mL。
4.如权利要求3所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测试剂盒,其特征在于,所述反应体系中,所述特异性引物对I和所述特异性引物对Ⅱ的浓度均为0.35μM,所述I型鸭肝炎病毒基因组RNA的浓度为2.65*10-3~2.65μg/mL,所述鸭瘟病毒基因组DNA的浓度为1.35*10-3~1.35μg/mL。
5.如权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法PCR检测试剂盒,其特征在于,所述目的片段I的长度为399bp,所述目的片段Ⅱ的长度为232bp。
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