CN103320541A

CN103320541A - 鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重rt-pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN103320541A
Application number: CN2013102911796A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 张艳芳; 谢丽基; 刘加波; 庞耀珊; 范晴; 罗思思; 邓显文; 谢志勤
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN103320541B

Abstract

本发明公开了一种鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立鸭黄病毒和鸭瘟病毒的二重PCR的检测方法，实现同时检测和鉴别鸭黄病毒和鸭瘟病毒两种病原体，用于鸭黄病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭瘟病毒的混合感染，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。

Description

鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

鸭黄病毒(Bai yang dian virus，BYD)又名鸭坦布苏病毒，主要引起种鸭和蛋鸭食欲急剧减退、产蛋急剧下降，卵泡变性，卵泡膜出血为主要特征。2010年以来，我国福建、浙江、江苏、山东、安徽、河南、河北、广东等地相继报道暴发了一种引起鸭产蛋大幅下降的疾病，给蛋鸭养殖业造成了很大的经济损失。鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)是引起鸭、鹅等水禽的急性败血性传染病的一种疱疹病毒，该病为一种广泛嗜全身性感染的传染病，不同日龄、性别的鸭均可感染，但以番鸭、麻鸭、绵鸭易感性最高，在自然流行中，成年鸭和产蛋母鸭发病较为严重，自然感染则多见于大鸭，尤其是产蛋的母鸭，1月龄以下的雏鸭发病较少。各养鸭国家和地区均有该病的发生和流行，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。

由于BYD与DPV均可引起母鸭产蛋下降，发病特征在临床上有相似之处，特别是有混合感染时，更增加了临床诊断工作的难度。因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭黄病毒和鸭瘟病毒检测方法，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些疾病的控制争取宝贵的时间。目前，这两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应等特点。实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面存在一定劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重PCR的不足。但是，建立一个二重PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。目前，还未见应用二重PCR技术同时对鸭黄病毒和鸭瘟病毒进行检测和诊断的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测和鉴别鸭黄病毒和鸭瘟病毒两种病原体。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。

上述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测引物组在二重PCR扩增方面的应用，二重PCR扩增的退火温度为50.0℃-60.1℃。

二重PCR扩增的退火温度为55℃。

鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：A液：PCR反应液，含2×Taq PCR Mix、BYD上下游引物、DPV上下游引物、ddH₂O，BYD上下游引物分别是引物1和2，DPV上下游引物分别是引物3和4，引物1至4分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；B液：BYD+DPV模板，作为阳性对照；C液：ddH₂O，作为阴性对照。

PCR反应液含2×Taq PCR Mix12.5μL、BYD上下游引物各0.5ul、DPV上下游引物各0.5ul、ddH₂O8.5μL，其中各引物浓度均为50μmol/mL；μLB液含BYD+DPV模板各1μL，μLC液为1μL ddH₂O。

引物1至4在PCR反应液中的终浓度分别为0.2μmol/mL、0.2μmol/mL、1μmol/mL、1μmol/mL。

上述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒在二重PCR扩增方面的应用，二重PCR扩增的退火温度为50.0℃-60.1℃。

二重PCR扩增的退火温度为55℃。

针对目前缺乏对鸭黄病毒和鸭瘟病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究设计了两对特异性引物，据此建立了鸭黄病毒和鸭瘟病毒的二重PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可同时检测和鉴别鸭黄病毒和鸭瘟病毒两种病原体，用于鸭黄病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭瘟病毒的混合感染，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。

附图说明

图1是实施例2中二重PCR最佳引物浓度优化试验结果电泳图，图中：M：100bp DNAladder；1-7：DPV引物0.1μL、0.2μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL；1-7：BYD引物1.0μL、0.8μL、0.6μL、0.5μL、0.4μL、0.2μL、0.1μL；N：阴性对照。

图2是实施例2中二重PCR最佳退火温度优化试验结果电泳图，图中M：100bp DNAladder；1：50.0℃；2：50.7℃；3：51.5℃；4：52.3℃；5：53.4℃；6：54.4℃；7：55.5℃；8:56.6℃；9：57.7℃；10：58.6℃；11：59.5℃；12：60.1℃。

图3是实施例2中二重PCR特异性试验结果电泳图，图中M：100bp DNA ladder；N：阴性对照（ddH₂O）；1：鸭黄病毒的cDNA+鸭瘟病毒的DNA(等体积混合)；2：鸭瘟病毒的DNA；3：鸭黄病毒的cDNA；4：新城疫病毒的cDNA；5：鸭肝炎病毒的cDNA；6：番鸭细小病毒的DNA；7：鸭圆环病毒的DNA；8：H9亚型流感病毒的cDNA；9：减蛋综合症病毒的DNA。

图4是实施例2中二重PCR敏感性试验结果电泳图，图中M：100bp DNA ladder；1：50ng鸭新黄病毒cDNA和60ng鸭瘟病毒DNA；2：5ng鸭黄病毒cDNA和6ng鸭瘟病毒DNA；3：500pg鸭黄病毒cDNA和600pg鸭瘟病毒DNA；4：50pg鸭黄病毒cDNA和60pg鸭瘟病毒DNA；5：5pg鸭黄病毒cDNA和6pg鸭瘟病毒DNA；6：500fg鸭黄病毒cDNA和600fg鸭瘟病毒DNA；7：50fg鸭黄病毒cDNA和60fg鸭瘟病毒DNA；8：5fg鸭黄病毒cDNA和6fg鸭瘟病毒DNA。

图5是实施例4中二重PCR检测临床样本部分结果电泳图，图中M为100bp DNAladder；N为阴性对照(ddH₂O)；1为阳性对照(鸭黄病毒cDNA+鸭瘟病毒DNA)；2-16分别是鸭病料临床样本。

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

鸭黄病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”，中国动物检疫，已收录，待发表。

鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所；

新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭肝炎病毒AV2111株（以下简称为DHV I）购自中国兽医药品监察所；

番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18(6):5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010，37（11):156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

减蛋综合症病毒记载在“减蛋综合症植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

试剂：100bp Marker ladder、2×Taq PCR Mix、DNA/RNA提取试剂盒、反转录试剂均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；pMD18T vector试剂盒购自大连宝生物公司。

实施例1、引物的设计与合成

根据GenBank中BYD的E基因与DPV的UL6基因的保守序列，采用利用DNAStar软件进行多序列比对，在保守区用primer5.0设计引物。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成（表1）。

表1引物信息

实施例2、二重RT-PCR检测方法的建立

一、核酸的提取及RNA的反转录

参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取鸭瘟病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒和减蛋综合症病毒的DNA；同时抽提鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭源新城疫病毒的RNA，按反转录说明书将RNA反转录成cDNA，具体如下：建立如下反转录体系，总反应体积为20μL，上述病毒RNA按反转录说明书（北京全式金，AT301-02），RNA8μL，随机引物1μL，2×TS Reaction Mix10μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix1μL，25℃10min，42℃30min，85℃5min，4℃结束，得到鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭源新城疫病毒的cDNA，-30℃保存。

二、二重RT-PCR扩增体系的建立

1、反应体系的优化

对鸭黄病毒引物、鸭瘟病毒引物、模板等用量进行优化，多次重复试验后确定最佳反应用量，最终确定二重PCR反应体系为25μL：2×Taq PCR Mix(北京全式金，AS111-12)12.5μL、BYD上下游引物（引物1和2）各0.5μL(引物浓度均为50μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为1μmol/mL)、DPV上下游引物（引物3和4）各0.5μL(引物浓度均为50μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为1μmol/mL)、模板各1μL，加水至25μL。引物优化结果如图1所示，确定最佳引物浓度为BYD上下游引物各0.5μL，DPV上下游引物各0.5μL。

2、反应条件的优化

按照上述反应体系，模板为鸭黄病毒的cDNA和鸭瘟病毒的DNA的等体积混合物，将退火温度按50.0℃-60.1℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。结果如图2所示，可见，最佳退火温度为54.4℃。确定最佳的反应条件：94℃5min；94℃1min；54.4℃1min；72℃1min，35个循环；72℃10min。

三、二重RT-PCR特异性试验

按照上述二优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行二重PCR扩增，不同的是模板分别如下：

鸭黄病毒的cDNA+鸭瘟病毒的DNA(等体积混合)、鸭瘟病毒DNA、鸭黄病毒的cDNA、鸭新城疫病毒的cDNA、鸭肝炎病毒的cDNA、番鸭细小病毒的DNA、鸭圆环病毒的DNA、H9亚型流感病毒的cDNA、减蛋综合症病毒的DNA。结果如图3所示，可见，1-3有257bp和454bp的目的片段，其余均没有目的片段。说明，本发明的引物和方法有高特异性，可应用于鉴定未知样本是否感染鸭黄病毒和鸭瘟病毒：若得到257bp的片段，则样本中含有鸭黄病毒，反之则没有；若得到454bp的片段，则样本中含有鸭瘟病毒，反之则没有；若得到257bp和454bp的片段，则样本中含有鸭黄病毒和鸭瘟病毒，反之则没有。

四、二重PCR的敏感性试验

用DU800紫外分光光度计测得鸭黄病毒和鸭瘟病毒的核酸浓度分别为50ng/μL和60ng/μL，将二者分别进行10倍梯度稀释后等体积混合作为模板，按照上述优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行二重PCR扩增。结果如图4所示，可见，1-6均有目的片段扩出，因此建立的二重PCR方法对鸭黄病毒的核酸最低检出限为500fg；对鸭瘟病毒的核酸最低检出限为600fg。

实施例3、检测试剂盒的组装

根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

A液：PCR反应液，含2×Taq PCR Mix(北京全式金，AS111-12)12.5μL、BYD上下游引物各0.5μL(引物浓度均为50μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为1μmol/mL)、DPV上下游引物各0.5μL(引物浓度均为50μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为1μmol/mL)，加ddH₂O8.5μL。

B液：含BYD+DPV模板各1μL，作为阳性对照。

C液：含ddH₂O1μL，作为阴性对照。

实施例4、二重PCR检测临床样本

取实验室采集的40份(编号为1-40)鸭病料，分别提取鸭病料DNA和RNA，并将RNA反转录得到cDNA，将各个样本的DNA和cDNA混合(体积比为1∶1)，得到编号为1-40的混合样本。分别将上述编号为1-40的混合样本作为模板，按照实施例2优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行二重PCR扩增。参考上述诊断标准，若得到257bp的片段，则样本中含有鸭黄病毒，反之则没有；若得到454bp的片段，则样本中含有鸭瘟病毒，反之则没有；若得到257bp和454bp的片段，则样本中含有鸭黄病毒和鸭瘟病毒，反之则没有。

扩增结果如图5（其他病料电泳结果无条带显示，故未附）所示，可以看出，4、7、8、12有257bp目的片段，其余均无目的片段，40份鸭病料中只有检出4份鸭黄病毒，含有鸭黄病毒病毒的感染率为10.0％(4/40)。

Claims

1.鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1。

3.根据权利要求2所述的鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于：所述引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。

4.权利要求1所述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测引物组在二重PCR扩增方面的应用，其特征在于：所述二重PCR扩增的退火温度为50.0℃-60.1℃。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述二重PCR扩增的退火温度为55℃。

6.一种鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR反应液，含2×Taq PCR Mix、BYD上下游引物、DPV上下游引物、ddH₂O，BYD上下游引物分别是引物1和2，DPV上下游引物分别是引物3和4，引物1至4分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；

B液：BYD+DPV模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O，作为阴性对照。

7.权利要求6所述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液含2×Taq PCR Mix12.5μL、BYD上下游引物各0.5ul、DPV上下游引物各0.5ul、ddH₂O8.5μL，其中各引物浓度均为50μmol/mL；所述B液含BYD+DPV模板各1μL，所述C液为1μL ddH₂O。

8.权利要求7所述鸭黄病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测试剂盒在二重PCR扩增方面的应用，其特征在于：所述二重PCR扩增的退火温度为50.0℃-60.1℃。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述二重PCR扩增的退火温度为55℃。