CN116640819B - α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法及其在二肽合成上的应用 - Google Patents

α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法及其在二肽合成上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种α‑氨基酸脂酰基转移酶的制备方法及其在二肽合成上的应用。其中，二肽合成的方法包括：利用α‑氨基酸脂酰基转移酶进行二肽合成反应，得到二肽；其中，α‑氨基酸脂酰基转移酶具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的保守区域。利用本申请的α‑氨基酸脂酰基转移酶，能够进行多种功能二肽的合成，底物谱较广，且部分酶的合成效率较高，能够较好地用于工业放大，成本低，收率高，实现了真正的绿色化学。

Description

α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法及其在二肽合成上的应用
技术领域
本发明涉及酶技术领域，具体而言，涉及一种α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法及其在二肽合成上的应用。
背景技术
二肽是最简单的肽，由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键组成。尽管二肽的结构简单，但它具有广泛的生物活性，能够对生物体的生理代谢等生命活动起到调节作用。以抗生素、抗病毒、抗癌、激素及免疫调节作用为基础的肽需求量逐年增加，并广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等领域。比如肌肽（Carnosine，β-alanyl-His）具有抗氧化、抗炎、抗糖化的作用；双甘氨肽（Gly-Gly）在医药上用作血液保存和蛋白质药物细胞色素C水针剂的稳定剂；丙谷二肽（Ala-Gln）作为手术病人的重要营养补充剂；阿斯巴甜（Asp-Phe methyl ester）是广泛使用的一种甜味剂；Ala-Phe，Ile-Phe，Pro-Gly二肽是咸味增强剂；Ile-Tyr，Lys-Trp，Val-Tyr，Ile-Trp是降压肽，Arg-Trp具有镇痛作用的，Lys-Glu具有抗肿瘤活性等等。虽然越来越多的功能二肽被发现，但是目前只有阿斯巴甜和Ala-Gln实现了商业化生产。化学法合成二肽有一定的局限性，比如过程中涉及到氨基酸的保护和去保护相关操作，产物会发生消旋，合成成本较高，甚至需要加入有毒试剂等，因此找到合适高效的二肽合成方法一直是一个热点问题。
α-氨基酸酯酰基转移酶（Aet）能够以丙氨酸甲酯盐酸盐作为酰基供体，与另一亲核试剂谷氨酰胺反应生成Ala-Gln二肽，整个过程不需要ATP参与，合成效率较高（A noveland efficient enzymatic method for the production of peptides fromunprotected starting materials. J Biotechnol. 2005 Jan 26;115(2):211-20.；Genecloning and characterization of α-amino acid ester acyl transferase inEmpedobacter brevis ATCC14234 and Sphingobacterium siyangensis AJ2458. BiosciBiotechnol Biochem. 2011;75(11):2087-92.）。目前已经报道的Aet虽然催化效率较高，但是底物谱普遍较窄，只有少量的二肽（不超过30种）被报道可以用Aet进行合成，这制约着Aet在合成多种二肽产品上的广泛应用。因此，开发具有广泛底物谱的α-氨基酸酯酰基转移酶有着非常重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法及其在二肽合成上的应用，以解决现有技术中α-氨基酸脂酰基转移酶底物谱较窄的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种制备二肽的方法，方法包括：利用α-氨基酸脂酰基转移酶进行二肽合成反应，得到二肽；其中，α-氨基酸脂酰基转移酶具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的保守区域。
进一步地，α-氨基酸脂酰基转移酶选自氨基酸序列如SEQ ID NOs：2-11所示的α-氨基酸脂酰基转移酶中的任意一种或多种 。
进一步地，二肽合成反应的底物包括作为酰基供体的底物和作为亲核试剂的底物，其中，作为酰基供体的底物选自氨基酸的酯盐酸盐，作为亲核试剂的底物为氨基酸；优选地，氨基酸的酯盐酸盐包括氨基酸的甲酯盐酸盐、氨基酸的乙酯盐酸盐或氨基酸的异丙酯盐酸盐；优选地，氨基酸的酯盐酸盐中的氨基酸及作为亲核试剂的氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸或酪氨酸。
进一步地，二肽包括Gly-Gln、Gly-Tyr、Gly-Gly、Ala-Gln或Arg-Trp。
进一步地，在碱性环境中进行二肽合成反应。
进一步地，碱性环境为碱性缓冲液，优选碱性缓冲液包括pH值为8-8.5，0.1-0.2M的Tris-HCl。
进一步地，二肽合成反应的反应温度为20-25℃；优选地，反应时间为1.5-2h。
进一步地，二肽合成反应结束后，方法还包括对α-氨基酸脂酰基转移酶进行加热灭活，加热灭活的温度为75-85℃；优选地，加热灭活的时间为10-15min。
进一步地，以湿菌泥质量/底物质量计，进行二肽合成反应的含有α-氨基酸脂酰基转移酶的湿菌泥质量与底物质量之比为1:1-10，优选为1：10。
根据本发明的另一方面，提供了一种α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法，其特征在于， 将上述的方法中的α-氨基酸脂酰基转移酶的基因克隆至表达载体中，得到重组载体；将重组载体导入大肠杆菌中，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导α-氨基酸脂酰基转移酶的表达，得到培养液；将培养液进行超声破碎后离心，得到α-氨基酸脂酰基转移酶；优选地，表达载体包括pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19；优选地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选地，原核细胞为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；更优选地，大肠杆菌的菌种为BL21；优选地，真核细胞为酿酒酵母和毕赤酵母；优选地，重组载体中的α-氨基酸脂酰基转移酶的基因的3’端或5’端包括标签基因；优选地，标签基因包括编码MBP蛋白、编码NusA蛋白、编码Trx蛋白、编码SUMO蛋白、编码DsbA蛋白、编码TF蛋白或编码GST蛋白的DNA序列；更优选地，标签基因包括编码MBP蛋白、编码SUMO蛋白、编码TF蛋白的DNA序列。
应用本发明的技术方案，利用本申请的α-氨基酸脂酰基转移酶，能够进行多种功能二肽的合成，底物谱较广，且部分酶的合成效率较高，能够较好地用于工业放大，成本低，收率高，实现了真正的绿色化学。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中的α-氨基酸脂酰基转移酶在二肽合成反应中底物谱普遍较窄，只有少量的二肽（不超过30种）被报道可以用α-氨基酸脂酰基转移酶进行合成，这制约着α-氨基酸脂酰基转移酶在合成多种二肽产品上的广泛应用。因此，开发具有广泛底物谱的α-氨基酸酯酰基转移酶有着非常重要的意义。在本申请中发明人通过大批量筛选得到了一系列可以广泛用于生产功能二肽的α-氨基酸脂酰基转移酶，上述筛选得到的酶能够参与合成超过200种的二肽，大大扩宽了二肽产品生产的市场，因而提出了本申请的一系列保护方案。
本发明的第一种典型的实施方式中，提供了一种制备二肽的方法，该方法包括：利用α-氨基酸脂酰基转移酶进行二肽合成反应，得到二肽；其中，α-氨基酸脂酰基转移酶具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的保守区域。
SEQ ID NO：1：
YGISYPGFYST。
本申请通过对一系列α-氨基酸脂酰基转移酶的氨基酸序列的序列比对，发现了一类具有上述保守氨基酸序列区域的酶，对广泛种类的二肽合成至关重要。在一种优选的实施例中，上述α-氨基酸脂酰基转移酶选自氨基酸序列如SEQ ID NOs：2-11所示的α-氨基酸脂酰基转移酶中的任意一种或多种。上述α-氨基酸脂酰基转移酶是来源于物种Sphingobacterium和Pedobacter的野生型α-氨基酸脂酰基转移酶的氨基酸序列。需要说明的是，本申请中并不仅限于这些酶，任何包含有上述保守区域的野生型或其变形的α-氨基酸脂酰基转移酶均适用于本申请。
已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人, Probing thecombining site of an anti-carbohydrate antibody by saturation –mutagenesis:role of the heavy-chain CDR3 residues. Biochem.32:1180-1187(1993) ；Kobayashi等人, Tryptophan H33 plays an important role in pyrimidine (6-4) pyrimidonephotoproduct binding by a high-affinity antibody. Protein Eng.12(10) :879-884(1999) ；和Burks等人, In vitro scanning saturation mutagenesis of an antibodybinding pocket. Proc Natl Acad Sci U S A. 94:412-417(1997))。
SEQ ID NO：2：
MKKGITIFSALLIAFSFKAAAQSTAESNYVKEHYEKTEIAIPMRDGVKLFTTIYSPKDKSQSYPVLLNRTPYTVGPYGPNEYKPSLGNFPAMAKEGYIFVYQDVRGKWMSEGTFEDVRPTTLKKGKKDIDESTDTYDLLEWLSKNLKNYNGKAGMYGISYPGFYSTVSLVKTHPSLKAVSPQAPVTNWYIGDDFHHNGVLFTGDAFKFMSSFGIPRPQPITPNQAPHTFQYPSKDVYQFYLTGGTAKDLKNTYFADSVKFWNDAFAHPHYDQFWKDRLILPHLTNVKPAVMIVGGFFDAEDAYGTFETYKKIEEQNPQNKSILVAGPWFHGGWVRSDGSSFGDIQFDQKTSVTYQEKFELPFFNYYLKGKGDFKAAEANIFVTGSNQWKSFDKWPPKDVEDKKLYLQPQGKLDFEKVGRTDSWDEYVSDPNKPVPYQGGVMESRTREYMIDDQRFASSRPDVMVYQTEPLTADITIVGPIKNFLKVSTSGTDADYVVKLIDVYPANSPSFNNKVMDGYQMLVRGEIMAGKYRNSFEKAEPMQPGFVTDIKYTMPDVAHTFKKGHRIMIQVQNTWFPIAERNPQQFFEGYEATATDYRKATHRIFHDVNNASYIEFSVLK。
SEQ ID NO：3：
MKNTISYLTLALLSASQLHAQTAADSAYVRDHYEKTEVAIPMRDGKKLFTAIYSPKDKSKKYPVLLNRTPYTVSPYGQNEYKKSLGNFPQMMHEGYIFVYQDVRGKWMSEGDFEDIRPTTYSKDKKAIDESTDTYDALEWLQKNLKNYNGKAGLYGISYPGFYSTVGLVKTHPSLKAVSPQAPVTDWYIGDDFHHNGVLFLQDAFTFMSTFGVPRPKPITPDQFKGKIQIKEADKYNFFAEAGTARELKEKYFGDSVQFWNDLFKHPDYDDFWKSRVITNSLQEVRPAVMVVGGFFDAEDAYGTFKTYQSIEDKSKKNNSILVAGPWYHGGWVRAEGNYLGDIQFEKKTSITYQEQFEQPFFKYYLKDEGNFAPSEANIFVSGSNEWKHFEQWPPKNVETKKLYFQPQGKLGFDKVQRTDSWDEYVTDPNKPVPHQGGLIQNRTREYMVDDQRFAASRPDVMVYQTEPLTEDLTIVGPIKNFLKVSSTGTDADYVVKLIDVYPNDAASYQGKTMAGYQMMVRGEIMAGKYRNGFDKAQALTPGMVEKVNFEMPDVAHTFKKGHRIMVQVQNSWFPLAERNPQVFLAPYTATKADFRKATQRIFHDVNNATYIEFSVLKD。
SEQ ID NO：4：
MKNTISCLTLALLSASQLHAQTAADSAYVRDHYEKTEVAIPMRDGKKLFTAIYSPKDKSKKYPVLLNRTPYTVSPYGQNEYKKSLGNFPQMMREGYIFVYQDVRGKWMSEGDFEDIRPTTYNKDKKAIDESTDTYDALEWLQKNLKNYNGKAGLYGISYPGFYSTVGLVKTHPSLKAVSPQAPVTDWYIGDDFHHNGVLFLQDAFTFMSTFGVPRPKPITPDQFKGKIQIKEADKYNFFAEAGTARELKEKYFGDSVQFWNDLFKHPDYDDFWKSRVITNSLQEVKPAVMVVGGFFDAEDAYGTFKTYQSIEDKSKRNNSILVAGPWYHGGWVRAEGNYLGDIQFEKKTSITYQEQFEQPFFKYYLKDEGNFAPAEANIFVSGSNEWKHFEQWPPKNVETKKLYFQPQGKLGFDKVQRTDSWDEYVTDPNKPVPHQGGLIQNRTREYMVDDQRFAASRPDVMVYQTEPLTEDLTIVGPIKNFLKVSSTGTDADYVVKLIDVYPNDAASYQGKTMAGYQMMVRGEIMAGKYRNGFDKAQALTPGMVEKVNFEMPDVAHTFKKGHRIMVQVQNSWFPLAERNPQVFLPSYTATKADFRKATQRIFHDVNNATYIEFSVLKD。
SEQ ID NO：5：
MKNTISYLTLALLSASQLHAQTPADSAYVRDHYEKTEVAIPMRDGKKLFTAIYSPKDKSKKYPVLLNRTPYTVSPYGQNEYKKSLGNFPAMMREGYIFVYQDVRGKWMSEGNFEDIRPTTYSKDKKAFDESTDTYDALEWLQKNLKNYNGKAGLYGISYPGFYSTVGLVKTHPSLKAVSPQAPVTDWYIGDDFHHNGVLFLQDAFTFMSTFGVPRPKPITPDQFKSKIQIKEADKYNFFLEAGTARELKEKYFGDSVQFWNDLFKHPDYDDFWKSRVITNSLQEVKPAVMVVGGFFDAEDAYGTFKTYQSIEDKSKKNNSILVAGPWYHGGWVRAEGNYLGDIQFEKKTSVTYQEQFEQPFFKYYLKDEGNFAPSEANIFVSGSNEWKHFEQWPPKNVEIKKLYFQPQGKLGFDKVQRTDSWDEYVTDPNKPVPHQGGLIQNRTREYMVDDQRFAASRPDVMVYQTEPLTEDLTIVGPIKNFLKVSSTGTDADYVVKLIDVYPNDAASYQGKTMAGYQMMVRGEIMAGKYRNGFEKAQALTPGMVEKVNFEMPDVAHTFKKGHRIMVQVQNSWFPLAERNPQVFLAPYTATKADFRKATQRIFHDVNNATYIEFSVLKD。
SEQ ID NO：6：
MPRIKHLLFILLFSYGLSASAQNIDSIYVRENYTKIERSIPMRDGVKLFTAIYIPKDQNRKYPFLINRTPYTVAPYGADKYKLSLGNFPAMMREGFIFVYQDVRGKWMSEGTFDDIRPHIANKKSKKQIDESSDTYDTIDWLVKNIKNNNGKAGIYGISYPGFYSTASLPESHPALKAVSPQAPVTDWFIGDDFHHNGVLFLMDAFSFMTTFGVPRPKPITPDLGPKGLKFPIQDNYRFYLEAGSIKNLKDKYMGDSIRFWNNLFAHPNLDTFWQARNIQRHLKSVKPAVMVVGGFFDAEDAYGTFSTYKSIEKQNPSANNILVMGPWYHGGWVRSTGSSFGDIEFGQPTSLQYQERFELPFFKYYLKGQGDFKPAEANIFVTGSNEWKSFGTWPPKDTEQKTLYLQPNGKLSFDKVQRTDSWDEYVSDPNTPVPYQEGVQAKRTREYMIDDQRFAARRPDVKVYQTDALTEDITLTGPVLANLVVSTTGTDADYVVKLIDVYPEDAPAPVPNPKNILMGGFQMLVRGEIMRGKYRNSFEKPEAMVPGLVTKVNYALPDVAHTFRKGHKIMIQVQNSWFPLGDRNPQKFMDIYTAEPSDFQKATQRIFHDVNNASSITISVLK。
SEQ ID NO：7：
MNLTRIFSLLFCLLIANQLMAQQTDSAYVRENYTKIERQIPMRDGVKLFTSIYIPKNQSKKYPFLINRTPYTVAPYGEDKYKLSLGNFPAMMREGFIFVYQDVRGRWMSEGTFADIRPQQTGKKSKNAIDESTDTYDTIDWLVKNVKGNNGNAGIYGISYPGFYSTTSLPNAHPALKAVSPQAPVTDWFMGDDFHHRGTLFLMDAFSFMGSFGVPRPKPITPDKGPKGFQFPIEDNYRFYLEAGSVKSLKDKYFADSIKFWNDLFKHPNLDTFWKARLITPHLTNVKPAVMVVGGFFDAEDAYGTFATYKAIEKQNPGANNILVAGPWFHGGWVRSDGSSFGDIPFGKTTSIDYQEQYELPFFKHYLKGEGDFNAAEANIFVTGSNEWKKFKTWPPQGVESKNLYLQPNGKLAFEKVGRTDSWDEYVSDPNNPVPYQDGIQSKRTREYMIDDQRFAARRPDVKSYQTDALTEDITLTGPVLANLVVSTTGTDADYVVKLIDVYPEDAPNPEPNPKNLIMGGYEMLVRGEIMRGKYRNSFEKPEAFIPGTITKVNYPLPDVAHTFKKGHKIMIQIQNSWFPLADRNPQKFMDIYQAEPQDFQKATHKIYHDVHNSSYITVSVLK。
SEQ ID NO：8：
MKKVLIIFSVFLITISLQVKAQVTLEPNYVKEHYEKKEIAIPMRDGVKLFTTIYTPKDKSQQYPVLLNRTPYTVGPYGEDKFKESLGNFPAMTTEGYIFVYQDVRGKWMSEGTFEDIRPTNLKKGKREIDESTDTYDLLEWLSKNLQNYNGKAGMYGISYPGFYSTVSLVKTHPSLKAVSPQAPVTNWYMGDDFHHNGILFTGDAFKFMSSFGIPRPKPITPDQAPQTFQYPSKDVYQFYLDAGTAKDLKDKYFADSVKFWNDVFAHPHYDQFWKDREILPHVKNVKPAVMIVGGFFDAEDTYGTFETYKTIEKQNPNNNSILVVGPWFHGGWVRGDGSSFGDIQFDQKTSVTYQEQFELPFFNYYLKGKGDFKASEANIFITGSNQWKAFEKWPPQEVEDKKLYLQPQGKLGFDQVKRTDSWDEYVSDPNKPVPYQAGIMESRTREYMIDDQRFASSRPDVMVYQTEPLAADLTIVGPIKNFLKVSTSGTDADYVVKLIDVYPANSPSFNNKVMDGYQMLVRGEIMAGKYRNGFEKAEAMQPGFVTAIDYTMPDVAHTFKKGHRIMLQVQNTWFPLAERNPQQFFEGYEATAGDYRKATHRIFHDVNNSSYIQFAILK。
SEQ ID NO：9：
MNLSKILGIVICLFVSHEMFAQQPDSAYVRENYTKIERQIPMRDGVKLFTSIYIPKNQSKKYPFLINRTPYTVAPYGEDKYKLSLGNFPAMMREGFIFVYQDVRGRWMSEGTFEDIRPQTLKKGKKDIDESTDTYDTIDWLVKNIKNNNGNAGIYGISYPGFYSTTSLPNAHPALKAVSPQAPVTDWFIGDDFHHGGALFLMDAFSFMSGFGVPRPKPITPDKGPKGFNFPIQDNYRFYLESGSVKNLKDKYFADSIKFWNNLVKHPNLDTFWKARYIIPHLKNVKPAVMVVGGFFDAEDAYGTFATYKAIEKQNPEANNILVAGPWFHGGWVRSDGASFGDIKFGKTTSIDYQQQFELPFFKHYLKGEGDFKAAEANIFVTGSNEWKKFGSWPPKEVETKNLYLQPNGKLAFEKVGRTDSWDEYVSDPNHPVPYQDGVQAKRTREYMIDDQRFAARRPDVKTYQTDALKDDITLTGPVLANLVVSTTGTDADYVVKLIDVYPEDEPNPSPNPNNIMMGGYEMLVRGEILRGKYRNTFEKPEAFVPGAITKVNYALPDVAHTFKKGHKIMIQIQNSWFPLADRNPQKFMDIYQAEPGDFQKATHKIYHDTSNSSYISVSVLK。
SEQ ID NO：10：
MKNTISCLTLALLSASQLHAQTAADSAYVRDHYEKTEVAIPMRDGKKLFTAIYSPKDKSKKYPVLLNRTPYTVSPYGQNEYKKSLGNFPQMMREGYIFVYQDVRGKWMSEGDFEDIRPTTYSKDKKAIDESTDTYDALEWLLKNLKNYNGKAGLYGISYPGFYSTVGLVKTHPSLKAVSPQAPVTDWFIGDDFHHNGVLFLQDAFTFMSTFGVPRPKPITPDQFKGKIQIKEADKYNFFAEAGTARELKEKYFGDSVQFWNDLFKHPDYDDFWKSRVITNSLQEVKPAVMVVGGFFDAEDAYGTFKTYQSIEDKSKKNNSILVAGPWYHGGWVRAEGNYLGDIQFEKKTSITYQEQFEQPFFKYYLKDEGNFAPSEANIFVSGSNEWKHFEQWPPKNVETKKLYFQPQGKLGFDKVQRTDSWDEYVTDPNKPVPHQGGLIQNRTREYMVDDQRFAASRPDVMVYQTEPLTEDLTIVGPIKNFLKVSSTGTDADYVVKLIDVYPNDAASYQGKTMAGYQMMVRGEIMAGKYRNGFDKAQALTPGMVEKVNFEMPDVAHTFKKGHRIMVQIQNSWFPLAERNPQVFLAPYTATKADFRKATQRIFHDVNNATYIEFSVLKD。
SEQ ID NO：11：
MKTTISFLALTLFAGGQLHAQTNTDSAYVRDHYEKTEVTVPMRDGKKLFTVIYSPKDKSKKYPILLNRTPYTVGPYGQNEYKKSLGNFPAMMRDGYIFVYQDVRGKWMSEGDFEDVRPTNLSKDKKAIDESTDTYDVLEWLQKNLQNYNGKAGLYGISYPGFYSTVGLVKTHPSLKAVSPQAPVTDWFIGDDFHHNGVLFLQDAFTFMSTFGVPRPKPIRPNQFTSKIQINEVDKYNFFLEAGTARELKEKYFGDSVQFWNNLFKHPNYDDFWKSRVITNYLQDVKPAVMVVGGFFDAEDAYGTFKTYQSIEEKSKTNNSVLVAGPWYHGGWVRAAGDYLGDIQFEKKTSITYQEKFEQPFFSHYLKEEGSFSPAEANIFISGSNEWKQFEQWPPKNVETKKLYFQPQGKLGFEKVQRTDSWDEYVTDPNKPVPHQGGLIQNRTREYMVDDQRFAASRPDVMVYETAPLTEDITIVGPIKNFLKVASTGTDADYIVKLIDVYPSDAPSFDGKPMAGYQMMVRGEIMAGKYRNGFDKPQPLTPGKVEKVDFVMPDVAHTFKKGHRIMVQVQNSWFPLAERNPQVFMAPYTATKTDFRKATQRIFHDVNNATYIEFDILKD。
本申请的α-氨基酸酯酰基转移酶（Aet）能够利用多种底物进行二肽合成，以氨基酸酯盐酸盐作为酰基供体，与另一亲核试剂氨基酸反应生成二肽。因而，任何α-氨基酸脂酰基转移酶能够作用的底物均适用于本申请。在一种优选的实施例中，二肽合成反应的底物包括作为酰基供体的底物和作为亲核试剂的底物，其中，作为酰基供体的底物选自氨基酸的酯盐酸盐，作为亲核试剂的底物为氨基酸。在一种优选的实施例中，氨基酸的酯盐酸盐包括氨基酸的甲酯盐酸盐、氨基酸的乙酯盐酸盐或氨基酸的异丙酯盐酸盐，利用以上三种氨基酸的酯盐酸盐作为底物能够较高效地进行二肽的合成。更优选地，氨基酸的酯盐酸盐包括氨基酸的甲酯盐酸盐。
任何能够利用本申请的α-氨基酸酯酰基转移酶（Aet）进行二肽合成的底物中氨基酸种类均适用与本申请，在一种优选的实施例中，氨基酸的酯盐酸盐中的氨基酸及作为亲核试剂的氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸或酪氨酸。
其中，二肽合成的反应方程式如下：
R1和R2代表20种氨基酸的侧链；R3代表甲基、乙基或异丙基。
本申请中的α-氨基酸脂酰基转移酶具有更加广泛的底物，能够合成的二肽的种类也更多，因而在实际应用中可以根据实际情况合成任何需要的二肽。在一种优选的实施例中，合成的二肽包括Gly-Gln、Gly-Tyr、Gly-Gly、Ala-Gln或Arg-Trp。特别是利用α-氨基酸脂酰基转移酶合成得到一些重要的功能二肽。其中，二肽是由一分子氨基酸的α-羧基和另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键组成，广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等领域。如甘氨酰谷氨酰胺（Gly-Gln）可替代谷氨酰胺作为细胞培养的营养物质，提高细胞的产量；甘酪二肽（Gly-Tyr）是一种降压肽；双甘氨肽（Gly-Gly）在医药上用作血液保存和蛋白质药物细胞色素C水针剂的稳定剂；丙谷二肽（Ala-Gln）作为手术病人的重要营养补充剂；Arg-Trp具有镇痛作用。
在一种优选的实施例中，本申请的二肽合成反应于碱性环境下进行。任何能够实现将利用α-氨基酸脂酰基转移酶进行二肽合成反应的环境保持碱性环境的条件均适用于本申请。在一种优选的实施例中，碱性环境为碱性缓冲液。在一种优选的实施例中，碱性缓冲液包括pH值为8-8.5，0.1-0.2M的Tris-HCl。
任何能够完成二肽合成反应的反应条件均适用于本申请，从二肽的反应效率及消耗的能耗角度考虑，在一种优选的实施例中，二肽合成反应的反应温度为20-25℃；反应时间为1.5-2h。在该反应温度和时间条件下，反应效率高，且能耗相对更少。
在一种优选的实施例中，二肽合成反应结束后，方法还包括对α-氨基酸脂酰基转移酶进行加热灭活。在反应后对α-氨基酸脂酰基转移酶进行灭活处理，及时灭活酶停止合成反应，有利于提高合成二肽的反应效率，以避免反应时间过长影响二肽生成物的质量。在一种优选的实施例中，二肽合成反应后进行灭活，加热灭活的温度为75-85℃；加热灭活的时间为10-15min。
任何利用α-氨基酸脂酰基转移酶进行二肽合成反应的酶及底物的占比均适用于本申请。为进一步提高二肽合成的反应效率，在一种优选的实施例中，以湿菌泥质量/底物质量计，进行二肽合成反应的具有α-氨基酸脂酰基转移酶的湿菌泥质量与底物质量之比为1:1-10，优选为1：10。
本发明的第二种典型的实施方式中，提供了一种α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法，将上述α-氨基酸脂酰基转移酶的基因克隆至表达载体中，得到重组载体；将重组载体导入大肠杆菌中，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导α-氨基酸脂酰基转移酶的表达，得到培养液；将培养液进行超声破碎后离心，得到α-氨基酸脂酰基转移酶。通过常规的原核表达蛋白的方法完成对α-氨基酸脂酰基转移酶的表达生产。
除非特别指明，本申请中所使用的分子生物学实验方法，基本上参照J .Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F .M .Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons ,Inc .，1995中的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本申请，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。
任何能够正常表达α-氨基酸脂酰基转移酶的重组质粒均适用于本申请，在一种优选的实施例中，表达载体包括pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b（+）、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。任何能够正常诱导表达α-氨基酸脂酰基转移酶的宿主细胞均适用于本申请，在一种优选的实施例中，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；原核细胞为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；大肠杆菌的菌种为BL21；真核细胞为酿酒酵母和毕赤酵母。任何能够促进α-氨基酸脂酰基转移酶基因表达的基因元件或序列均适用于本申请，在一种优选的实施例中，重组载体中的α-氨基酸脂酰基转移酶的基因的3’端或5’端包括标签基因。在一种优选的实施例中，标签基因包括编码MBP蛋白、编码NusA蛋白、编码Trx蛋白、编码SUMO蛋白、编码DsbA蛋白、编码TF蛋白或编码GST蛋白的DNA序列；在一种更优选的实施例中，标签基因包括编码MBP蛋白、编码SUMO蛋白、编码TF蛋白的DNA序列。带有上述的标签基因的重组载体能够促进α-氨基酸脂酰基转移酶基因表达，更为高效地生产α-氨基酸脂酰基转移酶。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1 α-氨基酸酯酰基转移酶Aet酶液的制备
通过文献检索和基因挖掘得到酶库的酶源，之后通过人工化学合成的方法获得不同来源的α-氨基酸酯酰基转移酶Aet，并在5’端引入内切酶位点NdeI和3’端引入内切酶位点XhoI，基因合成于pUC19，获得pUC19-Aet。将表达载体pET-28a(+)进行双酶切（NdeI+XhoI），同时α-氨基酸酯酰基转移酶的基因pUC19-Aet双酶切（NdeI+XhoI），切出编码Aet基因片段与表达载体pET-28a(+)连接，获得含有α-氨基酸酯酰基转移酶的大肠杆菌重组质粒pET-28a(+)-Aet，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/ Aet。另外，为了提高蛋白表达量，将不同的融合标签MBP(麦芽糖结合蛋白)、NusA（转录终止抗终止因子）、Trx（硫氧还蛋白A）、SUMO（泛素相关小修饰蛋白）、DsbA（蛋白二硫键折叠异构体）、TF（触发因子）和GST（谷胱甘肽S-转移酶）等，通过同源重组的方法构建到蛋白的N端，进行融合表达。添加融合标签后的蛋白表达量都由了不同程度的提高。
取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株4 ml，接种于含400 mL LB培养基的2 L三角瓶，37℃ 200 rpm振荡培养2-3 h后，OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.02 mM IPTG，16℃诱导18 h，诱导结束，4℃离心收集菌体。每g菌泥用10 mL 0.1M Tris-HCl（pH 8.0）重悬菌体，通过超声破碎，离心，收集上清，获得催化反应的粗酶液。
注：实施例中所用的试验材料和试剂描述如下：
1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET-28a(+)及菌株BL21（DE3）
2、培养基：大肠杆菌培养基LB（10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，pH7.0）。
实施例2 酶筛选
本实施例选择了酶库中的超过200个α-氨基酸酯酰基转移酶以及未报道的但可能具有相同功能的酶进行筛选，均以合成二肽Gly-Tyr进行筛选，筛选体系（1 mL）：12.5 mg（100 mM）甘氨酸甲酯盐酸盐，18.1 mg（100 mM）酪氨酸, 粗酶液62.5 uL，0.1M Tris-HCl（pH 8.0），20℃反应2 h。反应体系80℃加热10min，离心后进行HPLC分析，对其中有活性的酶的反应结果统计如下（表1），除下表中的10种酶外，其余190种酶均没有反应活性，即摩尔转化率为0%。
表1：
。
注：上表中，+代表摩尔转化率大于小于10%， ++代表摩尔转化率大于等于10%且小于20%。其中摩尔转化率为反应后体系中的二肽的摩尔数/（单一氨基酸摩尔数+二肽的摩尔数）×100%。
实施例3
对表1中筛选得到的10个不同Aet酶进行氨基酸序列的同源比对，发现有一段高度保守的序列YGISYPGFYST（SEQ ID NO：1），结构上位于活性中心附近，是比较重要的氨基酸。之后又对筛选中没有活性的酶进序列分析，在大部分没有活性的酶中都没有同时发现以上保守序列，因此推测可能与二肽的合成功能相关。
为了进一步确认SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：11中，这段高度保守的序列是催化合成Gly-Tyr二肽的关键，我们对这个保守区的氨基酸进行了同类型氨基酸的突变（表2），并进行与实施例2相同的反应体系进行验活。
表2：
。
从实验结果看出，保守序列里的部分氨基酸突变为空间结构或者化学特性较为相似的相应氨基酸后，酶的催化活性基本丧失，说明这些序列高度保守，是SEQ ID NO：2至SEQID NO：11的基本特征，也是酶合成二肽的基本骨架，对于二肽的合成至关重要。
实施例4
对SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：13合成Gly-Gln二肽的活性进行考察，反应体系如下（1 mL）：12.5 mg（100 mM）甘氨酸甲酯盐酸盐，14.6 mg（100 mM）谷氨酰胺, 粗酶液62.5uL，0.1M Tris-HCl（pH 8.0），20℃反应2 h。反应体系80℃加热10min，离心后进行HPLC分析，反应结果统计如下（表3）：
表3：
。
注：上表中，+代表摩尔转化率小于20%， ++代表摩尔转化率大于等于20%且小于30%，+++代表摩尔转化率大于等于30%且小于40%，++++代表摩尔转化率大于40%。
实施例5
对SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：13合成Ala-Gln二肽的活性进行考察，反应体系如下（1 mL）：13.9 mg（100 mM）丙氨酸甲酯盐酸盐，14.6 mg（100 mM）谷氨酰胺, 粗酶液62.5uL，0.1M Tris-HCl（pH 8.0）, 20℃反应2 h。反应体系80℃加热10min，离心后进行HPLC分析，反应结果统计如下（表4）：
表4：
。
注：上表中，+代表摩尔转化率小于20%， ++代表摩尔转化率大于等于20%且小于30%，+++代表摩尔转化率大于等于30%且小于40%，++++代表摩尔转化率大于40%。
实施例6
使用活性较好SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5，进行上述实施例中合成Gly-Tyr、Gly-Gln和Ala-Gln的反应，底物由甲酯盐酸盐换成乙酯盐酸盐和异丙酯盐酸盐，反应体系如下（1 mL）：100 mM乙酯盐酸盐/异丙酯盐酸盐，100 mM谷氨酰胺/酪氨酸, 粗酶液62.5 uL，0.1M Tris-HCl（pH 8.0）, 20℃反应2 h。反应体系80℃加热10min，离心后进行HPLC分析，反应结果统计如下（表5）：
表5：
。
注：上表中，+代表摩尔转化率大于5%，小于20%。
如上反应，对于Gly-Tyr、Gly-Gln和Ala-Gln的合成反应，底物由甲酯盐酸盐换成乙酯盐酸盐和异丙酯盐酸盐后，同样明显都检测到了相应的活性（尽管酶活性有所下降）。证明甲酯盐酸盐可以用其他衍生酯替代。
实施例7
对SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：11合成Gly-Gly二肽的活性进行考察，反应体系如下（1 mL）：100 mM甘氨酸甲酯盐酸盐，100 mM甘氨酸, 粗酶液62.5 uL，0.1M Tris-HCl（pH8.0）, 20℃反应2 h。反应体系80℃加热10min，离心后进行HPLC分析，反应结果统计如下（表6）：
表6：
。
注：上表中，+代表摩尔转化率小于20%， ++代表摩尔转化率大于等于20%且小于30%，+++代表摩尔转化率大于等于30%且小于40%，++++代表摩尔转化率大于40%。
实施例8
对以上实施例中活性较好SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5进行20种氨基酸甲酯盐酸盐和20种氨基酸的反应，考察其底物谱范围。反应体系如下（1 mL）： 100 mM不同氨基酸甲酯盐酸盐(下表第一列)，14.6 mg（100 mM）不同氨基酸(下表第一行), 粗酶液62.5 uL，0.1M Tris-HCl（pH 8.0）, 20℃反应2 h。反应体系80℃加热10min，离心后进行LC-MS分析，反应结果统计如下（表7和表8）：
表7：
。
注：此表为SEQ ID NO：2的反应结果，第一列为所示氨基酸的甲酯盐酸盐，第一行为所示氨基酸。*代表0≤摩尔转化率＜1%， **代表摩尔转化率大于等于1%且小于10%，***代表摩尔转化率大于10%。
表8：
。
注：此表为SEQ ID NO：5的反应结果，第一列为氨基酸的甲酯盐酸盐，第一行为所示氨基酸。不同数量的*代表所在行的氨基酸甲酯盐酸盐与所在列的氨基酸的反应情况，*代表0≤摩尔转化率＜1%， **代表摩尔转化率大于等于1%且小于10%，***代表摩尔转化率大于10%。
其中，只要反应的摩尔转化率＞0即表明该反应能够合成二肽，如上结果，SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：5有较广泛的底物谱，能够用于多种功能二肽的合成。另外，对SEQ IDNO：3到 SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6到SEQ ID NO：11这9个酶也分别进行了如上的底物谱验证，结果表明这8个酶对大部分反应也都有二肽合成的活性，尽管活性普遍偏低（1＜摩尔转化率＜10%）。
实施例9
对SEQ ID NO：2进行合成Gly-Tyr、Gly-Gln和Ala-Gln的反应放大。反应体系如下（1 L）： 分别400 mM甘氨酸甲酯盐酸盐和丙氨酸甲酯盐酸盐，400 mM酪氨酸和谷氨酰胺，粗酶液30 mL，0.1M Tris-HCl（pH 8.0）, 20℃反应2 h。反应结束后，进行反应体系的后处理分离、纯化，得到的终产品送HPLC和 NMR检测纯度和含量，结果统计如下（表9）：
表9：
。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：（1）本发明中，经酶筛选得到10个有二肽合成活性的酶SEQ ID NO：2- SEQ ID NO：11，存在高度保守的氨基酸序列区域，且与二肽合成活性相关，构成了这10个酶的催化活性的基本骨架。
（2）SEQ ID NO：2- SEQ ID NO：11除了可以用来合成Gly-Tyr外、还可以用于Gly-Gln、Gly-Gly和Ala-Gln等多种功能二肽的合成，底物谱较广，且部分酶的合成效率较高。
（3）本发明中得到的酶，可以较好的用于工业放大，成本低，收率高，实现了真正的绿色化学。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备二肽的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用α-氨基酸脂酰基转移酶进行二肽合成反应，得到所述二肽；
所述α-氨基酸脂酰基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：2或5所示的α-氨基酸脂酰基转移酶；
所述二肽合成反应的底物包括作为酰基供体的底物和作为亲核试剂的底物，其中，所述作为酰基供体的底物选自氨基酸的酯盐酸盐，所述作为亲核试剂的底物为氨基酸；
所述氨基酸的酯盐酸盐中的氨基酸及所述作为亲核试剂的所述氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸或酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸的酯盐酸盐包括氨基酸的甲酯盐酸盐、氨基酸的乙酯盐酸盐或氨基酸的异丙酯盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二肽包括Gly-Gln、Gly-Tyr、Gly-Gly、Ala-Gln或Arg-Trp。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在碱性环境中进行所述二肽合成反应。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述二肽合成反应的反应温度为20-25℃，反应时间为1.5-2h。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述二肽合成反应结束后，所述方法还包括对所述α-氨基酸脂酰基转移酶进行加热灭活，
所述加热灭活的温度为75-85℃，所述加热灭活的时间为10-15min。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，以湿菌泥质量/底物质量计，进行所述二肽合成反应的含有所述α-氨基酸脂酰基转移酶的湿菌泥质量与所述底物质量之比为1:1-10。
8.一种α-氨基酸脂酰基转移酶的制备方法，其特征在于，将权利要求1中所述的方法中的所述α-氨基酸脂酰基转移酶的基因克隆至表达载体中，得到重组载体；
将所述重组载体导入宿主细胞中，得到重组菌株；
培养所述重组菌株，诱导所述α-氨基酸脂酰基转移酶的表达，得到培养液；
将所述培养液进行超声破碎后离心，得到所述α-氨基酸脂酰基转移酶。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体中的所述α-氨基酸脂酰基转移酶的基因的3’端或5’端包括标签基因。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述标签基因包括编码MBP蛋白、编码NusA蛋白、编码Trx蛋白、编码SUMO蛋白、编码DsbA蛋白、编码TF蛋白或编码GST蛋白的DNA序列。
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