ES2334887T3 - Sintesis in vitro mejorada de proteinas activas que contienen enlaces disulfuro. - Google Patents
Sintesis in vitro mejorada de proteinas activas que contienen enlaces disulfuro. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2334887T3 ES2334887T3 ES01968701T ES01968701T ES2334887T3 ES 2334887 T3 ES2334887 T3 ES 2334887T3 ES 01968701 T ES01968701 T ES 01968701T ES 01968701 T ES01968701 T ES 01968701T ES 2334887 T3 ES2334887 T3 ES 2334887T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- enzymes
- proteins
- synthesis
- glutathione
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
Abstract
Método para la síntesis in vitro mejorada de polipéptidos plegados correctamente que comprenden uno o más enlaces disulfuro, comprendiendo la mejora: sintetizar dicho polipéptido en una mezcla de reacción que comprende un extracto biológico que ha sido tratado previamente con un agente desactivante de sulfhidrilo que alquila o acetila los grupos sulfhidrilo libres; y un tampón redox comprende uno o más de glutatión, ditiotreitol, ditioeritritol, β-mercaptoetanol, tioglicolato y cisteína.
Description
Síntesis in vitro mejorada de proteínas
activas que contienen enlaces disulfuro.
Escherichia coli es un organismo
ampliamente utilizado para la expresión de proteínas heterólogas.
Crece fácilmente hasta una densidad celular elevada en sustratos
económicos para proporcionar productividades volumétricas
excelentes y económicas. Diversas técnicas genéticas bien
establecidas y varios vectores de expresión justifican además el
uso de Escherichia coli como huésped de producción. Sin
embargo, es necesaria una velocidad elevada de síntesis de
proteínas, pero ni mucho menos es suficiente, para la producción
eficaz de biomoléculas activas. Con el fin de ser biológicamente
activa, la cadena polipeptídica debe plegarse en la estructura
tridimensional nativa correcta, incluyendo la formación apropiada de
enlaces disulfuro.
En muchos casos, se ha observado que los
polipéptidos recombinantes se secuestran en agregados refráctiles
grandes conocidos como cuerpos de inclusión. Se pueden recuperar
proteínas activas a partir de los cuerpos de inclusión a través de
un ciclo de solubilización inducido por desnaturalizante de los
agregados, seguido de la eliminación del desnaturalizante en
condiciones que favorecen el plegamiento. Aunque la formación de
cuerpos de inclusión puede facilitar algunas veces la purificación
de proteínas expresadas; en la mayoría de ocasiones, el
replegamiento de las proteínas agregadas sigue siendo un
desafío.
Se han realizado varios intentos para mejorar el
plegamiento de proteínas heterólogas en el citoplasma bacteriano.
Además de los métodos tradicionales, incluyendo la disminución de la
temperatura del cultivo, el creciente conocimiento del mecanismo y
efectores del plegamiento de proteínas ha permitido establecer
nuevas estrategias para resolver el problema de agregación.
Estudios in vitro han demostrado que,
para la gran mayoría de los polipéptidos, el plegamiento es un
proceso espontáneo dirigido por la secuencia de aminoácidos y las
condiciones del disolvente. Aunque el estado nativo está
termodinámicamente favorecido, la escala de tiempo para el
plegamiento puede variar desde milisegundos a días. Las barreras
cinéticas se introducen, por ejemplo, por la necesidad para la
alineación de subunidades y subdominios. Particularmente con
proteínas eucariotas, las reacciones covalentes deben tener lugar
para que se formen proteínas correctamente plegadas. Estos últimos
tipos de reacciones incluyen la formación de enlaces disulfuro, la
isomerización cis/trans de la cadena polipeptídica alrededor de los
enlaces peptídicos de prolina, el procesado de preproteínas y la
ligación de grupos prostéticos. Estas limitaciones cinéticas dan
lugar a la acumulación de intermedios parcialmente plegados, que
contienen superficies "pegajosas" hidrofóbicas expuestas que
favorecen la auto-asociación y formación de
agregados.
La expresión de proteínas de mamífero es más
complicada que las proteínas bacterianas, ya que la mayoría de
ellas requieren enlaces disulfuro intramoleculares para su
actividad. De este modo, se requieren efectores adicionales, tales
como foldasas y un potencial redox adecuado, para conseguir sus
estructuras nativas. Aunque es espacio periplásmico de
Escherichia coli proporciona un entorno oxidante, así como
proteínas plegables, tales como DsbA, B, C, y D; en muchos casos,
la simple secreción de proteínas complejas en el espacio
periplásmico no es suficiente para formar en laces disulfuro
correctos.
Se ha observado que proteínas accesorias
conocidas como foldasas y chaperones ayudan en el plegamiento
correcto de proteínas in vivo. Las foldasas tienen una
actividad catalítica que sirve para acelerar las etapas covalentes
limitantes de la velocidad en el plegamiento. Los chaperones, por
otro lado, realizan muchas funciones, la más importante de ellas es
proporcionar un medio para que las proteínas nacientes se plieguen
sin el proceso competitivo de auto-asociación.
Además de los chaperones moleculares bien caracterizados, tales como
las proteínas GroEL y DnaK, se han identificado un conjunto de
proteínas citoplásmicas adicionales que afectan al plegamiento de
proteínas heterólogas.
Tras el descubrimiento de numerosas foldasas
bacterianas o eucariotas y sus funciones específicas en la
oxidación e isomerización de enlaces disulfuro, se han realizado
muchos intentos para utilizar estas proteínas en el espacio
periplásmico o incluso en el citoplasma de Escherichia coli
(véase, por ejemplo, Bessette et al. (1999)). Se ha
observado que la coexpresión de chaperones moleculares resuelve
parcialmente el problema de la formación de cuerpos de inclusión en
la expresión de ciertas proteínas recombinantes (véase, por ejemplo,
Richardson et al. (1998) Trends Biochem. Sci. 23:
138-143; y Bukau et al. (1998) Cell 92:
351-366).
Sin embargo, el efecto de los chaperones
moleculares es bastante específico del producto y la coexpresión de
cada chaperón molecular con las proteínas diana es a menudo
dificultosa. Además, en algunos casos, la expresión de un chaperón
molecular es perjudicial o incluso dañina para el crecimiento
celular. A pesar de los recientes avances, la expresión de
proteínas de mamífero correctamente plegadas en Escherichia
coli aún sigue siendo un gran desafío. Esto es debido
principalmente a las dificultades en el control de los parámetros
clave para la formación de enlaces disulfuro incluyendo el
potencial redox en el interior de las células.
Durante varias décadas, la síntesis de proteínas
in vitro ha servido como una herramienta eficaz para la
expresión a escala de laboratorio de materiales genéticos clonados o
sintetizados. En los últimos años, se ha considerado la síntesis de
proteínas in vitro como una alternativa a la tecnología
convencional de ADN recombinante debido a las desventajas asociadas
con la expresión celular. In vivo, las proteínas se pueden
degradar o modificar mediante diversas enzimas sintetizadas con el
crecimiento de la célula, y, después de la síntesis, se pueden
modificar mediante procesado post-traduccional, tal
como glicosilación, desamidación u oxidación. Además, muchos
productos inhiben procesos metabólicos y su síntesis debe competir
con otros procesos celulares requeridos para reproducir la célula y
para proteger su información genética.
Debido a que está esencialmente libre de la
regulación celular de la expresión génica, la síntesis de proteínas
in vitro presenta ventajas en la producción de proteínas
citotóxicas, inestables o insolubles. La sobreproducción de
proteínas más allá de una concentración predeterminada puede ser
difícil de obtener in vivo, ya que los niveles de expresión
son regulados por la concentración de producto. La concentración de
proteína acumulada en la célula afecta en general a la viabilidad
celular, de manera que la sobreproducción de la proteína deseada es
difícil de obtener. En un proceso de aislamiento y purificación,
muchos tipos de proteína son insolubles o inestables, y son
degradadas por proteasas intracelulares o agregadas en cuerpos de
inclusión, de manera que la tasa de pérdida es elevada.
La síntesis in vitro supera muchos de
estos problemas (véase Kim y Swartz (1999) Biotechnol. Bioeng. 66:
180-188; y Kim y Swartz (2000) Biotechnol. Prog. 16:
385-390). Además, a través de la expresión
simultánea y rápida de varias proteínas en una configuración
múltiple, esta tecnología puede proporcionar una herramienta
valiosa para el desarrollo de arrays combinatorios para la
investigación y el cribado de proteínas. Además, se pueden
incorporar de manera eficaz varios tipos de aminoácidos no naturales
en proteínas con objetivos específicos (Noren et al. (1989)
Science 244: 182-188).
Merk et al., 1999, J. Biochem., Vol. 125,
pág. 328-333, describe la síntesis de dos
anticuerpos anti-lisozima de cadena única en un
sistema de expresión de E. coli libre de células en presencia
de glutatión reducido y oxidado, proteína disulfuro isomerasa (PDI)
y chaperones.
Qu y Green, 1995, DNA and Cell Biology, Vol. 14,
No. 9, pág. 741-751, describe el plegamiento y
ensamblaje de una molécula MHC de clase II en un sistema libre de
células.
Ryabova et al., 1997, Nature Biotech.,
Vol. 15, pág. 79-84, describe la producción de
fragmentos scFv funcionales en un sistema de traducción libre de
células de E. coli que incluye proteína disulfuro isomerasa
(PDI).
A diferencia de la expresión génica in
vivo, la síntesis de proteínas libres de células utiliza una
maquinaria traduccional aislada en lugar de células completas. Como
resultado, este método elimina la necesidad de mantener la
fisiología celular y permite el control directo de varios parámetros
para optimizar la síntesis/plegamiento de proteínas diana. De
particular interés es el problema de la síntesis libre de células de
proteínas de mamífero biológicamente activas que tienen múltiples
enlaces disulfuro. La presente invención se dirige a la síntesis
acoplada y plegamiento de proteínas de mamífero a través del control
del potencial redox durante la síntesis de proteínas.
Se proporcionan métodos para la síntesis in
vitro mejorada de moléculas proteicas mediante la optimización
de las condiciones redox en la mezcla de reacción tal como se define
en las reivindicaciones. Se incluye un tampón redox para mantener
el medio de oxidación apropiado para la formación de enlaces
disulfuro adecuados, por ejemplo, mediante la inclusión de
glutatión en una proporción apropiada de la forma oxidada con
respecto a la reducida.
La mezcla de reacción se modifica además
preferiblemente para disminuir la actividad de moléculas en el
extracto, por ejemplo, enzimas endógenas que presentan una actividad
reductora. Dichas moléculas se desactivan químicamente antes de la
síntesis de proteínas libres de células, por ejemplo, mediante el
tratamiento de los extractos con yodoacetamida (IAA), u otros
compuestos que desactivan irreversiblemente grupos sulfhidrilo
libres. La presencia de enzimas endógenas que presentan actividad
reductora se puede disminuir además mediante el uso de extractos
preparados a partir de células modificadas genéticamente que
presentan mutaciones desactivadotas en dichas enzimas, por ejemplo,
tiorredoxin reductasa, glutatión reductasa, etc.
Además de estabilizar el potencial redox de la
mezcla de reacción, la síntesis in vitro puede aumentarse
además mediante la inclusión de proteínas accesorias que ayudan al
plegamiento correcto de proteínas in vivo. De particular
interés es la inclusión de foldasas, proteínas con una actividad
catalítica que sirven para acelerar las etapas covalentes limitantes
de la velocidad en el plegamiento, por ejemplo, PDI, dsbC, etc.
La figura 1 muestra el reactor utilizado para
las reacciones semicontinuas.
La figura 2 es un gráfico que representa a
síntesis de uroquinasa y su actividad enzimática durante una
reacción semicontinua.
La figura 3 es un gráfico de barras que
representa el cambio en el potencial redox durante la síntesis
semicontinua.
\newpage
\global\parskip0.910000\baselineskip
La figura 4 es la evolución con el tiempo que
muestra la reducción de glutatión en una reacción de síntesis
discontinua.
La figura 5 muestra la reducción de glutatión en
presencia de extractos de diferentes cepas bacterianas.
La figura 6 es un gráfico de barras que
representa la expresión de uroquinasa en extractos de control y
tratados con IAA.
La figura 7 muestra las evoluciones con el
tiempo de la reducción de glutatión y la actividad enzimática de
producto en extractos de control y tratados con IAA.
La figura 8 es la evolución con el tiempo de la
síntesis de uroquinasa en presencia de PDI o dsbC.
Se proporcionan métodos para la síntesis in
vitro mejorada de proteínas biológicamente activas,
particularmente proteínas que comprenden uno o más enlaces
disulfuro tal como se definen en las reivindicaciones. Se modifica
la mezcla de reacción para la síntesis de proteínas in vitro
para mejorar el plegamiento de proteínas y la formación de enlaces
disulfuro. Se incluye un tampón redox en la mezcla de reacción para
mantener el medio oxidante adecuado, por ejemplo, mediante la
inclusión de glutatión en una proporción adecuada de la forma
oxidada con respecto a la reducida. El tampón redox se estabiliza
además mediante la desactivación de reacciones con oxidorreductasas
endógenas. La inclusión de un tampón redox permite la producción de
proteínas bioactivas que requieren la formación de uno o más
enlaces disulfuro intramoleculares para la actividad.
Las moléculas endógenas que reducen el tampón
redox se desactivan químicamente antes de la síntesis, por ejemplo,
mediante el tratamiento de los extractos con compuestos, tales como
yodoacetamida (IAA), que desactivan irreversiblemente grupos
sulfhidrilo libres.
En algunos métodos de la síntesis de proteínas
in vitro, se utilizan enzimas endógenas para la generación o
reabastecimiento de fuentes de energía utilizadas en la reacción
(véase, por ejemplo, la solicitud de patente en trámite 091270,814).
En algunos casos, dichas enzimas endógenas se desactivan mediante
la etapa de desactivación química descrita anteriormente, y en ese
caso, puede ser deseable reabastecer estas enzimas de una fuente
exógena, antes o conjuntamente con la síntesis. A modo de ejemplo,
si se desea el uso de fuentes de energía secundarias no
tradicionales, tales como intermedios glicolíticos tempranos (por
ejemplo, glucosa 6-fosfato), la actividad de
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa se puede
restablecer mediante cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica.
La presencia de enzimas endógenas que presentan
actividad reductora se puede disminuir además mediante el uso de
extractos preparados a partir de células modificadas genéticamente
que tienen mutaciones desactivantes en dichas enzimas, por ejemplo,
tiorredoxin reductasa, glutatión reductasa, etc.
Además de tamponar el potencial de redox de la
mezcla de reacción, la síntesis in vitro se puede mejorar
además mediante la inclusión de proteínas accesorias que ayudan al
plegamiento correcto de proteínas in vivo. De particular
interés es la inclusión de foldasas, proteínas con una actividad
catalítica que sirven para acelerar las etapas covalentes
limitantes de la velocidad en el plegamiento, por ejemplo, PDI,
dsbC, etc.
Estos métodos son aplicables a reacciones
continuas, semicontinuas o discontinuas. En el sistema semicontinuo,
incluso cuando las enzimas endógenas reductoras no están
desactivadas, el nivel de oxidación del tampón redox se recuperará
sustancialmente después de una incubación prolongada. La
recuperación de un medio oxidante en la cámara de reacción permite
que la proteína sintetizada adquiera enlaces disulfuro y actividad.
Sin embargo, los extractos con oxidorreductasas desactivadas
proporcionan una formación más rápida de proteínas bioactivas.
Para algunas reacciones sintéticas, por ejemplo,
reacciones múltiples, es preferible utilizar un sistema discontinuo
en lugar de semicontinuo. Para los métodos de síntesis discontinua,
la mezcla de reacción se modifica preferiblemente para disminuir la
actividad de moléculas en el extracto, por ejemplo, enzimas
endógenas, que tienen actividad reductora.
Debe entenderse que la presente invención no se
limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o
géneros animales y reactivos concretos descritos, ya que éstos
pueden variar. También debe entenderse que la terminología
utilizada en la presente invención tiene el objetivo de describir
sólo realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de
la presente invención que estará limitada únicamente por las
reivindicaciones adjuntas.
Tal como se utiliza en la presente invención las
formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los
referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo
contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "una
célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia
a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y
equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la materia,
etcétera. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en
la presente invención tienen el mismo significado tal como es
entendido habitualmente por un experto en la materia a la que
pertenece la invención, a menos que se indique claramente lo
contrario.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El plegamiento, tal como se utiliza en la
presente invención, se refiere a la estructura tridimensional de
polipéptidos y proteínas, donde las interacciones entre los residuos
de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Aunque las
interacciones no covalentes son importantes para determinar la
estructura, normalmente los péptidos y proteínas de interés tendrán
enlaces covalentes intramoleculares y/o intermoleculares formados
por dos residuos de cisteína. Para proteínas y polipéptidos
naturales o derivados o variantes de los mismos, el plegamiento
correcto es normalmente la disposición que da lugar a una actividad
biológica óptima, y se puede monitorizar convenientemente mediante
ensayos de actividad, por ejemplo, unión de ligando, actividad
enzimática, etc.
En algunos casos, por ejemplo, cuando el
producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en
actividad biológica serán menos importantes. El plegamiento correcto
de dichas moléculas se puede determinar en base a propiedades
físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelaje, y
similares.
La síntesis in vitro, tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a la síntesis de polipéptidos
libre de células en una mezcla de reacción que comprende extractos
biológicos y/o reactivos determinados. La mezcla de reacción
comprenderá por lo menos ATP, una fuente de energía; un molde para
la producción de la macromolécula, por ejemplo, ADN, ARNm, etc.;
aminoácidos, y dichos cofactores, enzimas y otros reactivos que son
necesarios para la síntesis, por ejemplo, ribosomas, ARNt,
polimerasas, factores de transcripción, etc. Dichos sistemas de
reacción sintéticos son bien conocidos en la técnica y se han
descrito en la literatura. La reacción de síntesis libre de células
se puede realizar de forma discontinua, en flujo continuo o flujo
semicontinuo, tal como se conoce en la técnica.
Tampón redox. La mezcla de reacción sintética en
la presente invención se modifica mediante la adición de un tampón
redox, que comprende uno o más de glutatión, ditiotreitol,
ditioeritritol, \beta-mercaptoetanol,
tioglicolato y cisteína. La concentración de agente reductor y la
proporción de la forma oxidada con respecto a la reducida necesaria
para conseguir el poder reductor deseado para el tiempo de reacción
seleccionado variarán según la fuerza del agente reductor, el nivel
de O_{2} en el sistema y el tiempo de reacción.
En una realización preferida, se utiliza
glutatión como agente tamponador redox y se añade en una
concentración de por lo menos aproximadamente 1 mM y no más de
aproximadamente 25 mM, preferiblemente a una concentración de
aproximadamente 5 a 10 mM.
El tampón redox puede comprender las formas
oxidadas y reducidas del compuesto sulfhidrilo e una proporción
ente aproximadamente 10:1 a 1:1 de las formas oxidada: reducida,
normalmente en una proporción entre aproximadamente 5:1 a 2:1, y
puede estar en una proporción de 4:1.
Extractos biológicos. Para los objetivos de la
presente invención, los extractos biológicos son cualquier
preparación que comprende los componentes de una maquinaria de
síntesis de proteínas, normalmente un extracto de células
bacterianas, donde dichos componentes son capaces de expresar un
ácido nucleico que codifica una proteína deseada. De este modo, un
extracto bacteriano comprende componentes que son capaces de
traducir ácido ribonucleico mensajero (ARNm) que codifica una
proteína deseada y, opcionalmente, comprende componentes que son
capaces de transcribir ADN que codifica una proteína deseada. Dichos
componentes incluyen, por ejemplo, ARN polimerasa dirigida a ADN
(ARN polimerasa), cualquier activador de la transcripción que sea
requerido para el inicio de la transcripción de ADN que codifica la
proteína deseada, ácidos ribonucleicos de transferencia (ARNts),
aminoacil ARNt sintetasas, ribosomas 70S,
N10-formiltetrahidrofolato,
formilmetionina-ARNtfMet sintetasa,
peptidiltransferasa, factores de iniciación, tales como
IF-1, IF-2 e IF-3,
factores de elongación, tales como EF-Tu,
EF-Ts, y EF-G, factores de
liberación, tales como RF-1, RF-2, y
RF-3, y similares.
En una realización preferida de la invención, la
mezcla de reacción comprende extractos de células bacterianas, por
ejemplo extractos de E. coli S30, tal y como se conoce en la
técnica. Por conveniencia, el organismo utilizado como fuente de
extractos puede referirse como el organismo fuente. Los métodos para
producir extractos activos se conocen en la técnica, por ejemplo
pueden encontrarse en Pratt (1984), Coupled
transcription-translation in prokaryotic
cell-free systems, pág. 179-209, en
Hames, B. D. y Higgins, S. J. (ed.), Transcription and Translation:
A Practical Approach, IRL Press, New York. Kudlicki et al.
(1992) Anal Biochem 206(2):389-93 modifican
el extracto libre de células de E. coli S30 mediante la
recogida de la fracción ribosómica del S30 mediante
ultracentrifugación. Aunque dichos extractos son una fuente útil de
ribosomas y otros factores necesarios para la síntesis proteica,
también pueden contener cantidades pequeñas de enzimas responsables
de reacciones secundarias indeseables que no están relacionadas con
la síntesis proteica, pero que modulan el medio oxidante de la
reacción, y que pueden actuar para reducir los grupos en el
polipéptido naciente y el tampón redox.
Extractos optimizados por redox. Los
extractos biológicos para los métodos presentes se optimizan
preferiblemente para eliminar sustancialmente enzimas y otras
biomoléculas presentes en el extracto que actúan para reducir el
tampón redox. Los enzimas indeseables pueden eliminarse o, en
cualquier caso, desactivarse en la mezcla de reacción.
Las moléculas endógenas que tienen grupos
sulfhidrilo libres se desactivan antes del inicio de la síntesis
mediante el tratamiento con un compuesto que bloquea químicamente
los sulfhidrilos mediante alquilación o acetilación de los
sulfhidrilos libres. A continuación, se elimina el compuesto
desactivante de la mezcla de reacción, por ejemplo mediante
diálisis, etc.
\newpage
Los agentes desactivantes útiles incluyen
yodoacetamida, N-etil maleimida, yodoacetato,
N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico-1-naftil)etilen
diamina, etc., tal y como se conoce en el arte; especialmente los
compuestos que incluyen yodoacetamidas, maleimidas, haluros
bencílicos y bromometilcetonas. La concentración de agente
desactivante y la longitud de tiempo para la reacción se
determinarán mediante el compuesto específico que se ha elegido. El
agente desactivante se añade en una concentración que elimina
sustancialmente la actividad reductora de sulfhidrilo endógeno,
mientras mantiene la actividad sintética del extracto. Ambas
actividades se determinan fácilmente mediante los métodos
ilustrados en los ejemplos indicados. Normalmente, se mantendrá por
lo menos aproximadamente el 50% de la actividad sintética, más
normalmente por lo menos aproximadamente el 75%, y preferiblemente
por lo menos aproximadamente el 90%. Como ejemplo, cuando el agente
desactivante es yodoacetamida, puede añadirse en una concentración
desde aproximadamente 1 hasta 10 mM, e incubarse entre 15 a 60
minutos.
Además del uso de un agente desactivante para
tratar previamente los extractos biológicos, puede modificarse
adicionalmente la actividad reductora del extracto mediante la
modificación genética de la cepa fuente para "noquear"
(knock-out), o desactivar genéticamente
enzimas que tienen esta actividad indeseable. Dichas enzimas pueden
incluir tioredoxin reductasa, glutatión reductasa, y similares.
La secuencia codificante para la enzima se
"noquea", en cualquier caso, se desactiva en el cromosoma del
organismo fuente, mediante la supresión de toda la secuencia
codificante o parte de la misma; inserción por desplazamiento del
marco; mutaciones dominantes negativas, etc. Los genomas de un
conjunto de organismos, incluyendo E. coli, se han
secuenciado completamente, facilitando de este modo las
modificaciones genéticas. Por ejemplo, un método de estrategia de
"noqueo" sin marcador es descrito por Arigoni et al.
(1998) Nat Biotechnol 16(9):851-6.
Un método preferido para desactivar genes
dirigidos está descrito por Hoang et al. (1998) Gene 212:
77-86. En este método, se emplean vectores de
reemplazo de genes que contienen un gen de resistencia a
tetraciclina y un ge que codifica levan sacarasa (sacB) como
marcadores de selección para recombinación. El gen diana en primer
lugar se clona y se mutageniza, preferiblemente mediante la
supresión de una parte significativa del gen. A continuación, se
inserta este gen mediante unión en un vector diseñado para facilitar
la sustitución del gen cromosómico. A continuación, las células de
E. coli se transforman con estos vectores. Se seleccionan
las células que han incorporado el plásmido en el cromosoma en el
sitio del gen diana, a continuación se fuerza el plásmido a salir
del cromosoma mediante el crecimiento de las células en sacarosa. La
sacarosa es tóxica cuando el gen de sacB reside en el cromosoma. Se
selecciona la cepa correctamente mutada en base a su fenotipo de
sensibilidad a la tetraciclina y resistencia a la sacarosa. A
continuación, el análisis de PCR o la secuenciación del ADN
confirman el cambio genético deseado.
La enzima puede eliminarse del extracto celular
después de la destrucción celular y antes del uso. Puede utilizarse
cualquiera de los diversos medios conocidos en la técnica de la
purificación proteica, incluyendo técnicas de purificación por
afinidad, tales como el uso de anticuerpos o los fragmentos de
anticuerpos con afinidad específica por las enzimas diana; el uso
de etiquetas de afinidad expresadas como parte de las enzimas diana
para facilitar su eliminación del extracto celular; y los métodos de
purificación convencionales.
Por ejemplo, se selecciona un anticuerpo o un
fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab o scFv) por la afinidad
específica por la enzima diana utilizando la expresión en fagos u
otras técnicas bien desarrolladas. A continuación, se inmoviliza
este anticuerpo o fragmento de anticuerpo en cualquiera de las
diversas esferas o resinas o membranas de purificación utilizando
cualquiera de las diversas técnicas de inmovilización. El
anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con el extracto celular
para unirse a la enzima diana, y a continuación se elimina el
complejo anticuerpo/enzima mediante filtración o centrifugación
suave.
En otro ejemplo, puede modificarse la secuencia
codificante de la proteína dirigida para incluir una etiqueta, tal
como la extensión Flag® (desarrollada por Immunex Corp. y
comercializada por Stratagene), o una cola de
poli-histidina. Se han publicado muchos otros
ejemplos y son conocidos por los expertos en la materia. A
continuación, se eliminan las proteínas marcadas mediante el paso
por la matriz o la columna de afinidad apropiada. Se eligen la
extensión de aminoácido y la pareja de unión de manera que la unión
específica sólo suceda bajo condiciones compatibles con la
estabilidad del extracto celular, y sin alterar significativamente
la composición química del extracto celular.
En otro ejemplo, se separan la enzima o las
enzimas diana mediante cualquiera de los diversos métodos
utilizados habitualmente para la purificación proteica, tal como
cromatografía de afinidad de substrato, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica,
separación electroforética, u otros métodos realizados en la técnica
de la purificación proteica.
Adición de enzimas de plegamiento. La
mezcla de reacción de la presente invención se puede modificar
además mediante la inclusión de una o más enzimas que aumentan el
plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, es decir,
foldasas, chaperoninas, etc. En una realización de la presente
invención, se añade una enzima foldasa bacteriana a la mezcla de
reacción. Se han caracterizado en E. coli un conjunto de
cisteína oxidorreductasas que catalizan la formación de enlaces
disulfuro, por ejemplo. Entre las enzimas o chaperoninas de interés
se incluyen DsbA, DsbC, PDI, GroEL, DnaK, DnaJ, GroEL/ES, GrpE, BIP,
PPI u otras ciclofilinas, etc. Se añaden enzima o enzimas de
plegamiento a una concentración eficaz para mejorar la actividad
global de la proteína diana de interés, que se puede determinar
empíricamente mediante la valoración de la actividad biológica del
producto proteico expresado.
De particular interés es la inclusión de DsbC,
una enzima soluble con actividad oxidasa e isomerasa que cataliza
la redisposición, o isomerización, de enlaces disulfuro incorrectos.
El emparejamiento incorrecto de residuos de cisteína aparece
fácilmente cuando una cadena polipeptídica no plegada se oxida en
primer lugar. DsbC facilita la destrucción de enlaces disulfuro
incorrectos y la posterior formación de los que aparecen en el
estado nativo. También de interés es el uso de la enzima soluble
DsbA, que es un catalizador principal de la formación de enlaces
disulfuro.
La identificación del gen de DsbC es descrita
por Missiakas et al. (1994) EMBO J 13:
2013-2020, donde se muestra que tiene una actividad
similar a la de DsbA en la reducción dependiente de ditiotreitol de
insulina in vitro. Véase también Chen et al. (1999)
J. Biol. Chem. 274: 19601-19605. El uso de DsbA o
DsbC para aumentar el plegamiento periplásmico se describe en Joly
et al. (1998) P.N.A.S. 95: 2773-2777.
Como alternativa a enzimas bacterianas, se
pueden utilizar enzimas eucariotas. Por ejemplo, la PDI eucariota
no es sólo un catalizador eficaz de la oxidación de cisteínas de
proteínas e isomerización de enlaces disulfuro, sino que también
exhibe la actividad chaperonas. La coexpresión de PCI puede incluso
facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples
enlaces disulfuro. La razón por la que la PDI es tan eficaz en el
aumento del plegamiento de proteínas recombinantes en bacterias es
presumiblemente debido a que contiene un subdominio de unión a
péptido que permite la interacción con proteínas heterólogas más
fácilmente que las enzimas bacterianas. La inclusión de PDI de
mamífero proporciona un excelente catalizador de isomerización de
enlaces disulfuro in vitro.
Los términos "proteína deseada" o
"proteína seleccionada" se utilizan indistintamente y se
refiere en general a cualquier péptido o proteína que tiene más de
aproximadamente 5 aminoácidos. Los polipéptidos pueden ser
homólogos, o preferiblemente, pueden ser exógenos, lo que significa
que son heterólogos, es decir, extraños, a las bacterias de las que
se deriva el extracto bacteriano libre de células, tal como una
proteína humana o una proteína de levadura producida en el extracto
bacteriano libre de células. Preferiblemente, se utilizan
polipéptidos de mamífero, es decir, polipéptidos codificados en un
genoma de mamífero.
Ejemplos de polipéptidos de mamífero incluyen,
pero sin limitación, moléculas, tales como renina; hormonas de
crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humano; hormona de
crecimiento bovino; factor de liberación de la hormona de
crecimiento; hormona paratiroides; hormona estimulante de la
tiroides; lipoproteínas;
alfa-1-antitripsina; cadena a de
insulina; insulina, proinsulina; hormona estimulante de folículos;
calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores coagulantes,
tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular, y factor de von
Willebrands; factores anticoagulantes, tales como la Proteína C,
factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador
plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador de
plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina;
trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis
tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES y otras quimioquinas;
proteína inflamatoria de macrófagos humana (MIP-1a);
una albúmina de suero, tal como, tal como albúmina de suero humana;
sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de
relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón;
una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa;
DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento;
integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor
neurotrópico, tal como factor neurotrópico derivado de hueso
(BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ó -6
(NT-3, NT-4, NT-4,
NT-5 o NT-6), o un factor de
crecimiento nervioso, tal como NGF-\beta; factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento
de fibroblastos, tal como \alphaFGF y \betaFGF; factor de
crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante
(TGF), tal como TGF-\alpha y
TGF-\beta, incluyendo
TGF-\beta1, TGF-\beta32,
TGF-\beta3, TGF-\beta4 o
TGF-\beta5; factor de crecimiento I y II de tipo
insulina (IGF-I e IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I de cerebro), proteínas de unión al factor de
crecimiento de tipo insulina; proteínas CD, tales como
CD-3, CD-4, CD-8 y
CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos;
inmunotoxinas; una proteína morfogenéticas ósea (BMP); un
interferón, tal como interferón-\alpha, -\beta,
y -\gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), por ejemplo,
M-CSF, GM-CSF y
G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo,
IL-1 a IL-18; superóxido dismutasa;
receptores de células T; proteínas de superficie de membrana; factor
acelerante de la descomposición; antígeno viral, tal como, por
ejemplo, una parte de la cubierta del SIDA; proteínas de transporte;
receptores "homing"; adresinas; proteínas reguladoras;
anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos
indicados
anteriormente.
anteriormente.
El sistema objeto es útil para la síntesis de
proteínas in vitro de proteínas biológicamente activas,
particularmente proteínas que requieren la formación correcta de uno
o más enlaces disulfuro para la actividad biológica. Las reacciones
de síntesis pueden incluir la transcripción de ARN a partir de
moldes de ADN o ARN. Las reacciones pueden utilizar un reactor a
gran escala, pequeña escala, o se pueden multiplicar para realizar
un conjunto de síntesis simultáneas. Las reacciones continuas
utilizarán un mecanismo de alimentación para introducir un flujo de
reactivos, y pueden aislar el producto final como parte del proceso.
Los sistemas discontinuos también son de interés, donde se pueden
introducir reactivos adicionales para prolongar el periodo de tiempo
para la síntesis activa. Se puede desarrollar el reactor en
cualquier modo, tal como discontinuo, discontinuo prolongado,
semidiscontinuo, semicontinuo, alimentación discontinua y continuo y
se seleccionará según la aplicación objetivo.
De particular interés es la traducción de ARNm
para producir proteínas, cuya traducción se puede acoplar a la
síntesis in vitro de ARN a partir del molde de ADN. Dicho
sistema libre de células contendrá todos los factores requeridos
para la traducción de ARNm, por ejemplo ribosomas, aminoácidos,
ARNts, aminoacil sintetasas, factores de elongación y factores de
iniciación. Los sistemas libres de células conocidos en la técnica
incluyen extractos de germen de trigo (Roberts et al. (1973)
P.N.A.S. 70: 2330), extractos de reticulocitos (Pelham et
al. (1976) Eur. J. Biochem. 67: 247), extractos de E.
coli, etc., que se pueden tratar con una nucleasa adecuada para
eliminar el ARNm endógeno activo.
Además de los componentes anteriores, tales como
el extracto libre de células, el molde genético, aminoácidos y
fuentes de energía, se pueden añadir a la reacción materiales
específicamente requeridos para la síntesis de proteínas. Estos
materiales incluyen sal, compuestos poliméricos, AMP cíclico,
inhibidores para enzimas degradadotas de proteínas o ácidos
nucleicos, inhibidor o regulador de síntesis de proteínas, ajustador
de oxidación/reducción, tensoactivo no desnaturalizante, componente
tampón, espermina, espermidina, etc.
Las sales incluyen preferiblemente sales de
potasio, magnesio, amonio y manganeso de ácido acético o ácido
sulfúrico, y algunos de éstos pueden tener aminoácidos como
contrapones. El compuesto polimérico puede ser polietilenglicol,
dextrano, dietil aminoetil, aminoetil cuaternario y aminoetil. El
ajustador de oxidación/reducción puede ser ditiotreitol, ácido
ascórbico, glutatión y/o sus óxidos. Además, se puede utilizar un
tensoactivo no desanaturalizante, tal como Triton
X-100, en una concentración de 0-0,5
M. La espermina y espermidina se pueden utilizar para mejorar la
capacidad sintética de proteínas y se puede utilizar AMPc como
regulador de la expresión génica.
Cuando se cambia la concentración de un
componente concreto del medio de reacción, se puede cambiar la de
otro componente de forma correspondiente. Por ejemplo, las
concentraciones de diversos componentes, tales como nucleótidos y
compuestos como fuentes de energía, se pueden controlar
simultáneamente según el cambio en las concentraciones de otros
componentes. Además, los niveles de concentración de componentes en
el reactor se pueden variar a lo largo del tiempo.
Preferiblemente, la reacción se mantiene en el
intervalo de pH 5-10 y una temperatura de 20º-50ºC.,
y más preferiblemente, en el intervalo de pH 6-9 y
una temperatura de 25º-40ºC.
Cuando se utiliza un medio aislante de proteínas
en un modo de operación continua, la salida del producto del
reactor fluye a través de una membrana en el medio aislante de
proteína. En un modo de operación semicontinua, la superficie
exterior o externa de la membrana se pone en contacto con soluciones
predeterminadas que se cambian cíclicamente en un orden
predeterminado. Estas soluciones contienen sustratos, tales como
aminoácidos y nucleótidos. En este momento, el reactor opera en
diálisis, diafiltración discontinua o modo de alimentación
discontinua. Se puede suministrar una solución de alimentación al
reactor a través de la misma membrana o una unidad de inyección
separada. La proteína sintetizada se acumula en el reactor y, a
continuación, se aísla y purifica según el método habitual para la
purificación de proteínas después de completar la operación del
sistema.
Cuando existe un flujo de reactivos, la
dirección del flujo de líquido puede ser perpendicular y/o
tangencial a la membrana. El flujo tangencial es eficaz para
reciclar ATP y para evitar que la membrana se tapone y se pueda
superponer sobre el flujo perpendicular. El flujo perpendicular a la
membrana puede estar causado o realizado por una bomba de presión
positiva o una bomba de succión al vacío. La solución en contacto
con la superficie externa de la membrana puede cambiar cíclicamente
y puede estar en un flujo tangencial estacionario con respecto a la
membrana. El reactor se puede agitar interna o externamente mediante
medios de agitación adecuados.
Durante la síntesis de proteínas en el reactor,
entre los medios de aislamiento de proteínas para aislar
selectivamente la proteína deseada se pueden incluir una unidad
rellena con partículas recubiertas con moléculas de anticuerpos u
otras moléculas inmovilizadas con un componente para adsorber la
proteína sintetizada deseada y una membrana con poros de tamaños
adecuados. Preferiblemente, el medio de aislamiento de proteínas
comprende dos columnas para su uso alternado. Alternativamente, el
producto proteico se puede absorber utilizando una cromatografía en
lecho expandido, en cuyo caso se puede utilizar o no una
membrana.
La cantidad de proteína producida en una
reacción de traducción se puede medir de varias maneras. Un método
depende de la disponibilidad de un ensayo que mide la actividad de
la proteína concreta a traducir. Un ejemplo de un ensayo para medir
la actividad de proteína es un sistema de ensayo de luciferasa o un
sistema de ensayo de acetil transferasa cloramfenical. Estos
ensayos miden la cantidad de proteína funcionalmente activa
producida a partir de la reacción de traducción. Los ensayos de
actividad no medirán la proteína de longitud completa que es
desactiva debido al plegamiento incorrecto de proteína o a la falta
de otras modificaciones post-traduccionales
necesarias para la actividad de proteína.
Otro método de medir la cantidad de proteína
producida en las reacciones de transcripción y traducción in
vitro acoplada es realizar las reacciones utilizando una
cantidad conocida de aminoácido radiomarcado, tal como
^{35}S-metionina o
^{3}H-leucina, y posteriormente medir la cantidad
de aminoácido radiomarcado incorporado en la proteína recién
traducida. Los ensayos de incorporación medirán la cantidad de
aminoácidos radiomarcados en todas las proteínas producidas en una
reacción de traducción in vitro, incluyendo productos de
proteínas truncadas. La proteína radiomarcada se puede separar
además en un gel de proteína y mediante autorradiografía se puede
confirmar que el producto tiene el tamaño adecuado y que no se han
producido productos de proteínas secundarios.
En realizaciones que utilizan molde de ADN para
impulsar la transcripción/traducción in vitro, algunos
componentes del sistema de transcripción y/o traducción en el
extracto bacteriano se pueden complementar de manera ventajosa para
aumentar la disponibilidad de dichos componentes en la mezcla de
reacción. En una realización preferida, la mezcla de reacción
contiene uno o más de los siguientes: (1) una concentración inicial
de GTP, UTP y CTP de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,0
mM, y preferiblemente aproximadamente 0,85 mM; (2) una
concentración inicial de ATP de aproximadamente 0,5 mM a
aproximadamente 2,5 mM, y preferiblemente aproximadamente 1,22 mM;
(3) una concentración inicial de PEP de aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 50 mM, y preferiblemente aproximadamente 27,0 mM;
(4) una concentración de piruvato quinasa de aproximadamente 0,05
unidades/ml a aproximadamente 0,5 unidades/mL, y preferiblemente
aproximadamente 0,2 unidades/mL; (5) una concentración inicial de
ARNts de aproximadamente 0,05 mg/mL a aproximadamente 0,3 mg/mL, y
preferiblemente aproximadamente 0,17 mg/mL; (6) una concentración
inicial de los 19 aminoácidos (todos los aminoácidos menos
metionina) de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 0,6 mM, y
preferiblemente aproximadamente 0,35 mM; y (7) una concentración
inicial de metionina de aproximadamente 0,6 micromoles/litro
(\muM) a aproximadamente 2,0 mM, y preferiblemente de
aproximadamente 4,3 \muM a aproximadamente 2,0 mM, y más
preferiblemente de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2,0 mM,
y lo más preferiblemente de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente
2,0 mM.
Debe entenderse que la presente invención no se
limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o
géneros de animales, construcciones y reactivos concretos descritos,
ya que éstos, naturalmente, pueden variar. También debe entenderse
que la terminología utilizada en la presente invención tiene el
objetivo de describir sólo realizaciones particulares y no pretende
limitar el alcance de la presente invención que estará limitada
únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención
tienen el mismo significado que entendería normalmente un experto en
la materia a la que pertenece la invención. Aunque se pueden
utilizar en la práctica o ensayo de la presente invención cualquier
método, dispositivo y material similar o equivalente a los
descritos en la presente invención, a continuación se describen los
métodos, dispositivos y materiales preferidos.
Todas las publicaciones mencionadas en la
presente invención tienen el objetivo de describir y dar a conocer,
por ejemplo, las líneas celulares, construcciones y metodologías que
se describen en las publicaciones que se podrían utilizar en
relación con la invención aquí descrita. Las publicaciones indicadas
anteriormente y a lo largo del texto se proporcionan únicamente por
su conocimiento antes de la fecha de solicitud de la presente
solicitud.
Los siguientes ejemplos se proponen para
proporcionar a los expertos en la materia una descripción completa
de cómo fabricar y utilizar la presente invención y no pretende
limitar el alcance de lo que se considera como la invención. Se han
realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los
números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas,
concentraciones, etc.), pero deben tenerse en cuenta ciertos errores
y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario,
las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso
molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados, y la
presión es a presión atmosférica o próxima a ella.
La mezcla de reacción estándar para la síntesis
de proteínas libre de células consiste en los siguientes
componentes: 57 mM Hepes-KOH (pH 8,2), 1,2 mM ATP,
0,85 mM de cada uno de GTP, UTP y CTP, 0,64 mM AMPc, 200 mM de
glutamato de potasio, 80 mM NH_{4}(OAc), 15 mM
Mg(OAc)_{2}, 34 \mug/ml ácido folínico, 6,7
\mug/ml plásmido, 33 \mug/ml T7ARN polimerasa, 500 \muM de
cada uno de 20 aminoácidos no marcados y [^{3}H] leucina (0,27
GBq/mmol), 2% PEG 8000, 33 mM PEP(fosfoenolpiruvato), 1 mM de
glutatión reducido (GSH), 4 mM de glutatión oxidado (GSSG) y 0,24
volúmenes de extracto S30. Para la expresión del dominio serina
proteasa de uroquinasa murina, se utilizó el plásmido pK7UK que
contiene la secuencia codificante bajo el promotor T7.
En ciertos experimentos, las proteínas dsbC de
E. coli o PDI humana se añaden en diferentes concentraciones.
La PDI se adquirió de Pierce, Inc. y dsbC se purificó a partir del
cultivo de la cepa BL21DE3 de E. coli (pETdsbChisC). La T7
ARN polimerasa se preparó a partir del cultivo de la cepa BL21 de
E. coli (pAR1219) según los procedimientos ligeramente
modificados de Davanloo et al. (1984) P.N.A.S. 81:
2035-2039. También se utiliza la cepa FA113 de E.
coli que porta mutaciones en trxB y gor.
El extracto S30 se prepare a partir de E.
coli K12 (cepa A19) según los procedimientos indicados en Pratt
(1984) Coupled Transcription-Translation in
Prokaryotic Cell-free Systems, p.
179-209. En Hames, B. D. y Higgins, S. J. (ed.),
Transcription and Translation: a Practical Approach. IRL Press, New
York. Para un tratamiento posterior del extracto S30, el extracto
se mezcló con 0,1 volúmenes de yodoacetamida (IAA) 20 mM y se
incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar la
IAA o sulfito de sodio residual, el extracto se dializó frente a
200 volúmenes de tampón de S30 (10 mM Tris-Cl, pH
7,8, 14 mM Mg(OAc)_{2}, 60 mM K(OAc)) a 4ºC
durante 4 horas.
Para la expresión de proteína en el sistema
semicontinuo, se incubaron 210 \mul de mezcla de reacción
estándar en una cámara de diálisis
(Slide-A-Lyzer, corte de peso
molecular de 10.000, Pierce, IL) que se colocaron en un tampón de
reserva de 6,0 mL (igual que en la mezcla de reacción a excepción de
la ausencia de extracto S30, ADN y T7 ARN polimerasa).
Todas las reacciones de síntesis se realizaron a
37ºC para los periodos de tiempo determinados.
Determinación del rendimiento de la síntesis de
proteínas. La cantidad de proteína sintetizada se estimó a partir
de la radioactividad insoluble en TCA medida en un contador de
centelleo líquido (LS3801, Beckman) tal como se describe por Kim,
et al. (1996) Eur. J. Biochem. 239:
881-886.
Actividad enzimática de dominio proteasa de
uroquinasa sintetizado libre de células. Se tomaron muestras de 20
\muL durante periodos de incubación para medir la actividad
enzimática de proteína sintetizada. Después de centrifugar las
muestras, se tomaron 10 ml de sobrenadante y se añadieron a una
microplaca que contenía 80 \muL de tampón de ensayo (38 mM NaCl,
50 mM Tris-Cl, pH 8,8) y 10 \muL de solución de
sustrato (2 mM Chromozyme U, Roche Molecular Biochemicals, CA). El
cambio en la absorbancia a 405 nm se midió en un lector de
microplaca (SpectraMax 190, Molecular Devices, CA).
Análisis de la concentración de glutatión
reducido. La concentración de glutatión reducido se midió
utilizando ácido ditionitrobenzoico (DTNB). Se preparó una solución
de DTNB 4,0 mg/mL en una solución Tris-Cl 1 M (pH
7,8). Se mezclaron muestras de 10 \muL con el mismo volumen de TCA
al 10% para detener la reducción enzimática y se centrifugaron.
Para determinar la concentración de glutatión reducido, se añadieron
10 \muL de sobrenadante y 10 \muL de solución de DTNB a 80
\muL de solución Tris-Cl 1 M en una microplaca.
Después de 3 minutos, se midieron las absorbancias a 412 nm y se
determinó la concentración de glutatión a partir de la curva
estándar.
Construcción de cepas mutantes. Las mutaciones
como insertos en trxB o gor en la cepa FA113 (Bessette et
al. (1999) P.N.A.S. 96(24): 13703-8) se
trasladaron a la cepa A19 mediante la transducción P1 siguiendo los
procedimientos estándar (Miller (1992) A Short Course in Bacterial
Genetics. p. 263-364. Cold Spring Harbor Press,
NY.)
Se prepararon 210 \muL de mezcla de reacción y
se incubaron en el reactor semicontinuo representado en la figura
1. Se extrajeron muestras de 10 \muL durante la incubación para
determinar la cantidad de proteína sintetizada (mostrada en la
figura 2, círculos blancos). A la vez, se tomaron muestras de 20
\muL para la medición de la actividad de serina proteasa
(cuadrados blancos, reacción sin plásmido; cuadrados negros,
reacción con el plásmido pK7UK).
Para monitorizar el cambio en el potencial
redox, se tomaron muestras de 10 \muL de la mezcla de reacción y
la solución de reserva. Las concentraciones de glutatión reducido se
midieron tal como se describe en materiales y métodos. Las
concentraciones de glutatión oxidado se estimaron en base a las
concentraciones iniciales y las cantidades medidas de glutatión
reducido. Los resultados se muestran en la figura 3. Las
concentraciones iniciales de glutatión reducido y oxidado fueron 1
mM y 4 mM, respectivamente.
Para monitorizar la evolución con el tiempo del
glutatión reducido en una reacción discontinua, durante la
incubación de una reacción discontinua con 150 \muL, se tomaron
muestras de 10 \muL en puntos de tiempo determinados, se trataron
con una solución de TCA, y se determinaron las concentraciones. Las
concentraciones de glutatión reducido se midieron tal como se
describe en materiales y métodos. Las concentraciones de glutatión
oxidado se estimaron en base a las concentraciones iniciales y las
cantidades medidas de glutatión reducido. Los resultados se
muestras en la figura 4. Las concentraciones iniciales de glutatión
reducido y oxidado fueron 1 mM y 4 mM, respectivamente.
Para determinar los efectos de diferentes cepas
en la reducción de glutatión, se prepararon extractos celulares a
partir de las cepas mutantes indicadas en la figura 5, y se
incubaron con la mezcla de reacción. Se tomaron muestras de 10
\muL en puntos de tiempo determinados, se trataron con una
solución de TCA, y se determinaron las concentraciones de GSH tal
como se ha descrito anteriormente. Los extractos celulares se
prepararon mediante sonicación breve de pasta celular resuspendida
en tampón S30. Las concentraciones totales de proteínas celulares
en las mezclas de reacción fueron 6,8 (A19); 5,2 (A19 trxB); 5,5
(A19 gor); y 5,4 (FA113) mg/mL, respectivamente. En experimentos
con el extracto celular A19 utilizado para la síntesis de proteínas,
la concentración de proteína celular fue 10,8 mg/mL.
La expresión de uroquinasa se determinó a partir
del extracto tratado con IAA, tal como se muestra en la figura 6.
El plásmido pK7UK se trató en las mezclas de reacción estándar que
contenía extracto celular normal o tratado con IAA. Después de 1
hora de incubación, se midió la cantidad de radioactividad insoluble
en TCA tal como se describe en los métodos experimentales.
En la figura 7 se muestra la evolución con el
tiempo de la reducción de glutatión y la actividad enzimática de la
proteína expresada en una reacción discontinua. Se expresó el
plásmido pK7UK en una mezcla de reacción de 450 \muL que contenía
extracto S30 sin tratar o tratado con IAA y tampón de glutatión 5 mM
(1mM de forma reducida y 4 mM de forma oxidada). En los puntos de
tiempo indicados, se extrajeron muestras de 40 \muL y se analizó
la concentración de GSH (cuadro A) y la actividad enzimática (cuadro
B) tal como se describe en Materiales y Métodos. Círculos blancos,
reacción con extracto celular normal; círculos negros, reacción con
extracto celular tratado con IAA.
En la figura 8, se muestra el efecto de PDI o
dsbC en la velocidad de síntesis de proteínas activas. A una
reacción con extracto celular tratado con IAA, se añadieron 133
\mug/mL de dsbC o 27 \mug/mL de PDI. Se tomaron muestras de 20
\muL durante la incubación y se midieron las actividades
enzimáticas tal como se ha descrito. Círculos blancos (reacción de
control sin foldasa); círculos negros (adición de PDI); cuadrados
negros (adición de DsbC).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
\bulletRichardson et al. Trends
Biochem. Sci., 1998, vol. 23, 138-143
[0007]
\bulletBukau et al. Cell,
1998, vol. 92, 351-366 [0007]
\bulletKim; Swartz. Biotechnol.
Bioeng., 1999, vol. 66, 180-188
[0011]
\bulletKim; Swartz. Biotechnol.
Prog., 2000, vol. 16, 385-390 [0011]
\bulletNoren et al. Science,
1989, vol. 244, 182-188 [0011]
\bulletMerk et al. J. Biochem.,
1999, vol. 125, 328-333 [0012]
\bulletQu; Green. DNA and Cell
Biology, 1995, vol. 14 (9), 741-751
[0013]
\bulletRyabova et al. Nature
Biotech., 1997, vol. 15, 79-84 [0014]
\bullet Coupled
transcription-translation in prokaryotic
cell-free systems. Pratt. Transcription and
Translation: A Practical Approach. IRL Press, 1984,
179-209 [0036]
\bulletKudlicki et al. Anal
Biochem, 1992, vol. 206 (2), 389-93
[0036]
\bulletArigoni et al. Nat
Biotechnol, 1998, vol. 16 (9), 851-6
[0041]
\bulletHoang et al. Gene,
1998, vol. 212, 77-86 [0042]
\bulletMissiakas et al. EMBO J,
1994, vol. 13, 2013-2020 [0049]
\bulletChen et al. J. Biol.
Chem., 1999, vol. 274, 19601-19605
[0049]
\bulletJoly et al. P.N.A.S.,
1998, vol. 95, 2773-2777 [0049]
\bulletRoberts et al. P.N.A.S.,
1973, vol. 70, 2330 [0054]
\bulletPelham et al. Eur. J.
Biochem., 1976, vol. 67, 247 [0054]
\bulletDavanloo et al.
P.N.A.S., 1984, vol. 81, 2035-2039
[0070]
\bullet Coupled
Transcription-Translation in Prokaryotic
Cell-free Systems. Pratt.
\bullet Transcription and Translation: a
Practical Approach. IRL Press, 1984,
179-209 [0071]
\bulletKim et al. Eur. J.
Biochem., 1996, vol. 239, 881-886
[0074]
\bulletBessette et al.
P.N.A.S., 1999, vol. 96 (24), 13703-8
[0077]
\bulletMiller. A Short Course in
Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Press, 1992,
263-364 [0077]
Claims (12)
1. Método para la síntesis in vitro
mejorada de polipéptidos plegados correctamente que comprenden uno o
más enlaces disulfuro, comprendiendo la mejora:
sintetizar dicho polipéptido en una mezcla de
reacción que comprende un extracto biológico que ha sido tratado
previamente con un agente desactivante de sulfhidrilo que alquila o
acetila los grupos sulfhidrilo libres; y un tampón redox comprende
uno o más de glutatión, ditiotreitol, ditioeritritol,
\beta-mercaptoetanol, tioglicolato y cisteína.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho agente desactivante de sulfhidrilo se selecciona del grupo que
consiste en yodoacetamida, N-etil maleimida,
yodoacetato, y
N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico-1-naftil)etilen
diamina.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho agente desactivante de sulfhidrilo es yodoacetamida.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho tampón redox comprende una mezcla de glutatión oxidado y
reducido.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
dicha mezcla se encuentra en una proporción de 4:1 de oxidado con
respecto a reducido.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho extracto biológico
deriva de una célula bacteriana que ha sido modificada genéticamente
para desactivar una o más enzimas reductoras.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
dicha una o más enzimas incluyen tioredoxin reductasa y glutatión
reductasa.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha mezcla de reacción
comprende además una o más enzimas que mejoran el plegamiento de
polipéptidos o la generación de enlaces disulfuro.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
dicha una o más enzimas que mejoran el plegamiento de polipéptidos o
la generación de enlaces di sulfuro son enzimas foldasas.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha enzima foldasa se selecciona del grupo que consiste en DsbA,
B, C, D, PDI, GroEL/ES, DnaK, DnaJ, GrpE, BIP y ciclofilinas, tales
como PPI.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dicha foldasa es DsbC.
12. Método según la reivindicación 10, en el que
dicha foldasa es PDI.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US23038100P | 2000-09-06 | 2000-09-06 | |
US230381P | 2000-09-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2334887T3 true ES2334887T3 (es) | 2010-03-17 |
Family
ID=22865001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES01968701T Expired - Lifetime ES2334887T3 (es) | 2000-09-06 | 2001-09-06 | Sintesis in vitro mejorada de proteinas activas que contienen enlaces disulfuro. |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6548276B2 (es) |
EP (1) | EP1315826B1 (es) |
JP (1) | JP4889185B2 (es) |
AT (1) | ATE448322T1 (es) |
AU (2) | AU2001288931B2 (es) |
CA (1) | CA2419996C (es) |
DE (1) | DE60140458D1 (es) |
DK (1) | DK1315826T3 (es) |
ES (1) | ES2334887T3 (es) |
PT (1) | PT1315826E (es) |
WO (1) | WO2002020818A1 (es) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7041479B2 (en) * | 2000-09-06 | 2006-05-09 | The Board Of Trustess Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds |
WO2003054517A2 (en) * | 2001-12-19 | 2003-07-03 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods for detecting half-antibodies using chip-based gel electrophoresis |
US7273615B2 (en) * | 2002-02-28 | 2007-09-25 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Reaction solution for cell-free protein synthesis, method of preparing the same, and protein synthesis method using the same |
CA2496437C (en) | 2002-08-19 | 2013-01-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Improved methods of in vitro protein synthesis |
KR100505744B1 (ko) * | 2003-02-15 | 2005-08-03 | 드림바이오젠 주식회사 | 단백질의 수용성 형태로의 생산을 위한 무세포단백질생산방법 |
US9410170B2 (en) | 2003-11-20 | 2016-08-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of in vitro protein synthesis |
US20070275481A1 (en) * | 2003-11-24 | 2007-11-29 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods For Detecting Half-Antibodies Using Chip Based Gel Electophoresis |
CN1997739A (zh) * | 2004-04-30 | 2007-07-11 | 株式会社后基因组研究所 | 通过二硫化物交联进行体外蛋白质合成的方法 |
DE102004032460B3 (de) * | 2004-06-30 | 2005-08-18 | Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh | Verfahren zur präparativen in vitro Proteinbiosynthese |
US20070117179A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-24 | Invitrogen Corporation | In vitro protein synthesis systems for membrane proteins that include adolipoproteins and phospholipid-adolipoprotein particles |
AU2008205479A1 (en) * | 2007-01-18 | 2008-07-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced cell-free synthesis of active proteins containing disulfide bonds |
EP2118129A4 (en) * | 2007-03-01 | 2010-04-28 | Life Technologies Corp | ISOLATED PHOSPHOLIPID PROTEIN PARTICLES |
SI3597659T1 (sl) | 2007-07-09 | 2023-04-28 | Genentech, Inc. | Preprečevanje redukcije disulfidne vezi med rekombinantno proizvodnjo polipeptidov |
EP2376619A4 (en) | 2008-12-15 | 2012-07-04 | Greenlight Biosciences Inc | METHODS FOR CONTROLLING FLOWS IN METABOLIC PATHWAYS |
CN105132387A (zh) * | 2008-12-22 | 2015-12-09 | 绿光生物科学公司 | 用于制造化合物的组合物和方法 |
CN102051406A (zh) * | 2009-11-03 | 2011-05-11 | 凯熙医药(武汉)有限公司 | 一种用于预报人体发生异常增殖或肿瘤发生风险的检测方法 |
WO2011140516A2 (en) | 2010-05-07 | 2011-11-10 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through enzyme relocation |
US8916358B2 (en) | 2010-08-31 | 2014-12-23 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
WO2013036787A2 (en) | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free preparation of carbapenems |
RU2015129774A (ru) | 2012-12-21 | 2017-02-01 | Гринлайт Байосайенсиз, Инк. | Бесклеточная система для преобразования метана в топливо, пируват или изобутанол |
CA2936092A1 (en) | 2013-01-23 | 2014-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Stabilized hepatitis b core polypeptide |
BR112016002494A2 (pt) | 2013-08-05 | 2017-09-05 | Greenlight Biosciences Inc | Proteí-nas construídas com um sítio de clivagem de protease, ácido nucléico, vetor, célula e processo de engenharia de uma proteína recombinante e de um grande número de variantes de ácidos nucleicos que codificam proteínas recombinantes |
MX2017012665A (es) | 2015-03-30 | 2018-04-24 | Greenlight Biosciences Inc | Produccion de acido ribonucleico libre de celulas. |
EP4293104A3 (en) | 2016-04-06 | 2024-04-24 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
JP7186167B2 (ja) | 2017-01-06 | 2022-12-08 | グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド | 糖の無細胞的生産 |
US11898187B2 (en) | 2017-08-15 | 2024-02-13 | Northwestern University | Protein glycosylation sites by rapid expression and characterization of N-glycosyltransferases |
AU2018347405B2 (en) | 2017-10-11 | 2022-02-03 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nucleoside triphosphate and ribonucleic acid production |
WO2019094859A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | Northwestern University | Cell-free protein synthesis platform derived from cellular extracts of vibrio natriegens |
WO2019204346A1 (en) | 2018-04-16 | 2019-10-24 | Northwestern University | METHODS FOR CO-ACTIVATING IN VITRO NON-STANDARD AMINO ACID (nsAA) INCORPORATION AND GLYCOSYLATION IN CRUDE CELLLYSATES |
US11814621B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-11-14 | Northwestern University | Expanding the chemical substrates for genetic code reprogramming |
US20220213139A1 (en) * | 2019-04-16 | 2022-07-07 | Bachem Holding Ag | Manufacture of disulfide bonded peptides |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2660397A (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
-
2001
- 2001-09-05 US US09/948,052 patent/US6548276B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-06 DE DE60140458T patent/DE60140458D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-06 DK DK01968701.1T patent/DK1315826T3/da active
- 2001-09-06 PT PT01968701T patent/PT1315826E/pt unknown
- 2001-09-06 EP EP01968701A patent/EP1315826B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-06 AT AT01968701T patent/ATE448322T1/de active
- 2001-09-06 AU AU2001288931A patent/AU2001288931B2/en not_active Expired
- 2001-09-06 AU AU8893101A patent/AU8893101A/xx active Pending
- 2001-09-06 CA CA2419996A patent/CA2419996C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-06 ES ES01968701T patent/ES2334887T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-06 JP JP2002525824A patent/JP4889185B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-06 WO PCT/US2001/028159 patent/WO2002020818A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE448322T1 (de) | 2009-11-15 |
WO2002020818A1 (en) | 2002-03-14 |
PT1315826E (pt) | 2010-02-19 |
CA2419996A1 (en) | 2002-03-14 |
EP1315826B1 (en) | 2009-11-11 |
EP1315826A1 (en) | 2003-06-04 |
AU8893101A (en) | 2002-03-22 |
CA2419996C (en) | 2012-11-06 |
DE60140458D1 (de) | 2009-12-24 |
US6548276B2 (en) | 2003-04-15 |
DK1315826T3 (da) | 2010-03-22 |
EP1315826A4 (en) | 2004-08-04 |
US20020058303A1 (en) | 2002-05-16 |
JP4889185B2 (ja) | 2012-03-07 |
JP2004508050A (ja) | 2004-03-18 |
AU2001288931B2 (en) | 2006-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2334887T3 (es) | Sintesis in vitro mejorada de proteinas activas que contienen enlaces disulfuro. | |
US7041479B2 (en) | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds | |
Fahnert et al. | Inclusion bodies: formation and utilisation | |
ES2415635T3 (es) | Síntesis acelular de proteínas que contienen aminoácidos no naturales | |
AU2001288931A1 (en) | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds | |
Singh et al. | Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins | |
ES2334126T3 (es) | Procedimientos mejorados de sintesis de proteinas in vitro. | |
Yin et al. | Enhancing multiple disulfide bonded protein folding in a cell‐free system | |
ES2694683T3 (es) | Inactivación proteolítica de proteínas seleccionadas en extractos bacterianos para mejorar la expresión | |
US7871794B2 (en) | Enhanced cell-free synthesis of active proteins containing disulfide bonds | |
ES2280857T3 (es) | Replegado de polipeptidos. | |
CN102348807B (zh) | 利用体外蛋白合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的单装载体系 | |
JPH05268983A (ja) | 原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方法 | |
Nakano et al. | Cell-free protein synthesis systems | |
JP4945239B2 (ja) | ジスルフィド架橋形成型インビトロタンパク質合成方法 | |
Spirin et al. | Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods | |
Shingaki et al. | Improvement of translation efficiency in an Escherichia coli cell-free protein system using cysteine | |
KR20020026515A (ko) | 수성 용매에 저장하는 동안 복합 혼합물중 단백질을안정화시키는 방법 | |
US10196666B2 (en) | Protein production | |
MADIN et al. | SERGEY V. BIRYUKOV, ALEXANDER S. SPIRIN | |
Phue et al. | Improved refolding of recombinant human proinsulin from Escherichia coli in a two-stage reactor system | |
Hober et al. | Enhanced recovery and folding of recombinant proteins using fusion protein strategies | |
Strainienė | Studies of the refolding processes of recombinant growth hormones |