KR20020026515A - 수성 용매에 저장하는 동안 복합 혼합물중 단백질을안정화시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수성 용매중에 단백질을 저장하는 방법에 관한 것이다. 시스테인의 첨가는 단백질의 유효 농도의 감소를 지연시킨다. 당해 방법은 미생물내에서의 단백질의 제조에 사용하는데 적합하다.

Description

수성 용매에 저장하는 동안 복합 혼합물중 단백질을 안정화시키는 방법{Method for stabilising proteins in complex mixtures during their storage in aqueous solvents}
본 발명은 수성 용매중에서 단백질을 저장하는 방법에 관한 것이다.
단백질의 SH 그룹 또는 다른 산화-민감성 구조체의 화학적 상태는 단백질의 독자성, 활성 또는 유효 농도에 영향을 준다. 독자성은 단백질 각자의 폴딩을 의미한다. 활성은 효소 활성을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 단백질의 유효 농도는 생체내 생물학적 기능과 관련하여 정확하게 폴딩된 용액중의 단백질의 비율이다.
단백질의 구조를 변형시키는 산화는, 예를 들면 2-머캅토에탄올 또는 시스테인과 같은 티올 시약을 사용함으로써 억제될 수 있다는 것이 문헌에 공지되어 있다.
예를 들면, D-아미노산 옥시다제(DAO)는 티올에 의해 안정화될 수 있다. 플라보단백질 DAO는 D-아미노산을 상응하는 α-케토산 및 암모늄으로 입체특이적으로 탈아민화하는 반응을 촉매한다[참조 문헌: P. Golini et al., Enzyme and Microbial Technology, 17, 1995, 324-329]. 그러나, 예를 들면 시스테인과 같은 티올을 첨가하여, 단백질의 활성을 감소시킬 수 있다. 또한, 이러한 효과는 시스테인 라디칼의 존재에 의해 설명될 수 있다. 이의 예는 아미노아실라제이다. 아미노아실라제는 아단위당 하나의 Zn2+원자를 갖는 이량체 효소이다. 당해 효소의 각각의 아단위는 2개의 시스테인 SH 그룹과 2개의 디설파이드 결합을 갖는다. 디설파이드 결합의 절단과 같은 SH 그룹의 화학적 변형은 효소의 불활성화를 유도할 수 있다. 2-머캅토에탄올을 첨가함으로써 아미노아실라제의 활성이 감소되는 반면, 투석 또는 겔 여과에 의해 2-머캅토에탄올을 제거한 후 본래의 효소 활성이 거의 완전히 회복될 수 있다는 것을 보여줄 수 있다[참조 문헌: W. Kordel and F. Schneider, Biochem, Biophys. Acta 445, 1976, 446-457].
시스테인 및 몇몇 유도체의 경우, 특정 제조형 및 구체적 적용물이 항세균, 항바이러스 또는 항진균 활성을 어느 정도 가짐을 입증할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 시스테인을 첨가하는 것이 식품을 부패로 부터 어느 정도 보호하는데 적합하다는 것을 보여줄 수 있다[참조 문헌: 미국 특허 제4937085 A호].
유전공학 공법에 의해, 재조합 단백질, 예를 들면 인슐린 또는 이의 전구체, 및 유래된 유전자 서열(예: 사람)과 상이한 아미노산 조성을 갖는 인슐린 유도체를 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 세균과 같은 유전적으로 변형된 미생물내에서 합성할 수 있다.
미생물내에서의 재조합 합성은 발현 벡터를 이용하여 수행한다. 이들 발현 벡터는 플라스미드 벡터로 이루어지고, 이들 벡터는 플라스미드 복제를 제어하는 서열 및 선별 유전자(특히, 항생제 내성 유전자, 대사분해 마커)를 함유하여야 하며, 당해 벡터속으로 목적 단백질(예: 인슐린)의 유전자의 암호화 영역이 선택된 미생물내에서 활성인 프로모터(예: 이. 콜라이의 경우, lac 프로모터)의 제어하에 삽입되어진다.
유전적으로 변형된 미생물을 함께 이용하여 수행되는 재조합 단백질(예: 인슐린, 특히 인슐린 유도체)의 제조 방법은 서로 상호간에 맞으며 서로 정합되어야 하는 일련의 공정 단계로 이루어진다.
따라서, 이. 콜라이내에서의 사람 인슐린의 제조 방법은 후술되는 공정 단계로 구성된다.
미생물의 발효 - 세포 분리 - 세포 파쇄 - 디설파이드 브릿지를 재현하는 고유 공간 구조로 재폴딩하는 시스테인을 지닌 융합 단백질의 단리 및 중간 저장 후, 유용한 물질을 함유하지 않은 외래 단백질의 분리 - 효소에 의한 아기닐인슐린으로의 절단 - 단백질 수용액의 기본적 정제 - 1차 크로마토그래피 정제 - 효소에 의한 사람 인슐린으로의 절단 - 2차 크로마토그래피 정제 - HPLC에 의한 고성능 정제 - 재결정 - 건조.
일반적으로 수행된 다수의 각 수단은 총 수율면에서 상당한 손실을 가져오는데, 이는 각 단계에서, 선택된 공정 단계의 특정 수율로 인한 손실을 피할 수 없기 때문이다.
중간 단계를 최적화함으로써, 총 수율이 개선될 수 있다. 사용된 자원의 보다 나은 경제적 이용 및 환경 오염의 감소를 가능하게 하기 위해, 이러한 공정에 상당한 관심이 있다.
예를 들면, EP 0906918은, 시스테인 또는 시스테인 염산염 및 카오트로픽(chaotropic) 보조제의 존재하에 인슐린의 전구체, 또는 정확하게 연결된 시스테인 브릿지를 갖는 인슐린 유도체를 제조하는 개선된 방법을 기술한다.
인슐린 유도체는 천연 인슐린, 즉 사람 인슐린 또는 동물 인슐린의 유도체이다. 이들 인슐린 유도체는, 천연 인슐린에 존재하는 관심있는 하나 이상의 아미노산 라디칼의 부재 및/또는 또 다른 유전공학적으로 암호화가능한 아미노산 잔기로의 치환 및/또는 하나 이상의 유전공학적으로 암호화가능한 아미노산 잔기의 첨가에 의해 그 밖에 면에서 동일한 천연 인슐린과 상이하다.
단백질의 저장 동안, 유효 농도의 감소가 통상적으로 일어난다.
각각의 공정 단계사이에 제조 생성물을 저장하는 것은 다양한 이유로 필수적이다. 따라서, 예컨대, 선행 공정 단계의 생성물의 총량을 수용하기 위하여는, 후속적인 추가의 공업적 처리 단계의 처리 용량이 부적당함에 틀림없다.
중간 저장에 필요한 시간은 상이할 수 있다. 용량, 공업 단위를 조정할 필요성, 보다 많은 화학약품 또는 장비의 운반 필요성, 또는 기타 이유 때문에, 필수적인 중간 저장이 수 주에 이를 수 있다.
수율을 증가시키는 효과적인 방법은, 추가 처리공정 전의 개개의 공정 단계로 부터의 생성물을 불가피하게 중간 저장하는 동안에 일어나는 활성 단백질의 손실을 가능한한 좁은 범위내로 유지할 수 있다면, 달성될 수 있다.
지금까지, 산업적 제조 공정의 개개의 공정 단계로 부터의 상이한 조성 및 상태 형을 갖는 제조 생성물(생물학적 성분을 포함)의 중간 저장 동안 활성 단백질의 수율 손실을 제어하기 위하여, 예를 들면 효소 촉매 또는 유전학적으로 변형된 미생물을 이용하면서, 시스테인 또는 이의 유도체를 사용하는 것이 기술된 바 없다. 이러한 공정이 예를 들면 인슐린 제조에 사용된다.
공정 단계에 따라, 중간에 저장되어질 제조 생성물은 특히, 상이한 양의 생물학적 특성을 갖는 복합 고분자(단백질, DNA, 지방), 미생물, 완충제 물질, 및 출발 물질로 이루어질 수 있다.
일반적으로, 인슐린을 제조하는 경우에, 제조 공정은 가능한 한 균일한 물질을 제조하는 것을 목표로 한다. 단백질, 예를 들면 인슐린을 제조하는 경우에, 제조 생성물이 중간에 저장되어야 한다면, 이 단백질의 유효 농도의 손실이 규칙적으로 일어난다.
단백질의 저장은, 단백질이 존재하는 부피량, 저장이 수행되는 소요기간, 또는 저장이 수행되는 온도 조건과 무관하게, 단백질의 임의의 저장을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 단백질의 저장은 통상적으로 수용액에서 수행된다.
규정된 형, 또는 특히 탄소원, 질소원, 아미노산, 무기 염, 미량 원소, 상이한 화학적 완충제 유형의 완충제 성분, 및 생물학적 기원의 고분자(예: DNA 또는 지방)을 함유하는 완전 배지로서의 미생물의 배양을 위한 영양 배지의 구성분에 부가하여, 단백질의 수용액은 예를 들면 Na 도데실설페이트 또는 K 아세테이트와 같은 유기 또는 무기 화합물, 및 메탄올 또는 석유 에테르와 같은 우선순위가 상이한 일정 비율의 용매를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명은, 수성 용매에 시스테인을 첨가하여 단백질의 유효 농도의 일시적감소를 지연시킴을 특징으로 하여, 수성 용매중에서 단백질을 저장하는 방법에 관한 것이다.
당해 방법은 수용액중에서 단백질을 저장하는 동안 단백질의 유효 농도의 일시적 감소의 저속화를 안정화하는데 적합하다. 당해 방법은, 예를 들면 미생물에 의한 단백질 제조에 사용될 수 있다. 적합한 미생물의 예로는 특히, 세균, 바람직하게는 에스체리키아 콜라이; 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris); 및 곤충 세포가 있다. 바람직한 태양에서, 이들 미생물은, 상기 단백질의 유도된 발현 또는 구성적(constitutive) 발현을 위한 발현 벡터 작제물을 사용하여, 형질전환시킬 수 있다. 이들 미생물을 배양하여, 단백질 합성 후 파쇄시킨다. 적합한 파쇄 방법은 세균으로 부터 단백질을 방출시키는데 적합한 거의 모든 방법이 해당된다. 적용될 수 있는 파쇄 방법의 예로는, 초음파 방법, K 아세테이트, Na 도데실설페이트 또는 리소자임을 사용하는 화학적 방법, 미생물의 가열, 또는 프렌치(French) 압축법이 있다. 제조될 단백질이 직접 배지로 분비되는 경우, 미생물의 파쇄는 생략될 수 있다. 원칙적으로, 당해 방법은 또한 배출된 단백질에 적용될 수 있다.
미생물이 파쇄되거나 단백질이 직접 배지로 배출될 때 생성되는 복합 단백질 혼합물은 통상적으로 수용액중에 존재한다. 당해 단백질은 이속에서 용해되거나 현탁된 형으로 존재할 수 있다. 이들 단백질 용액은 바람직하게는 0℃ 내지 50℃, 또는 5℃ 내지 30℃, 또는 5℃에서 저장될 수 있다. 불활성화를 지연시키기 위하여, 이 단백질 혼합물에 시스테인을 첨가한다. 단백질 혼합물중 시스테인의 농도는 100 내지 500mM 또는 150 내지 220mM 일 수 있다. 바람직하게는, 170mM을 첨가한다. 이러한 방법에서, 복합 분자 용액중의 단백질은 유효 단백질 농도가 단지 조금 감소된채 최대 수 주까지 저장될 수 있다. 당해 방법은 특히 미생물내에서의 이종 단백질의 합성에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 인슐린 및 이의 전구체의 제조를 위해 미생물을 파쇄하고 정제하고 가능하면 탈변성(renaturation)한 후에 적용될 수 있다.
본 발명의 저장 방법에 사용된 단백질은 바람직하게는 인슐린 또는 인슐린 유도체이다.
또한, 본 발명은, 형질전환된 미생물내에서 이종성 단백질 또는 이의 전구체를 발현시킴을 특징으로 하는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이며, 이때에 발현된 이종성 단백질은 본 발명에 따른 방법에 의해 저장된다. 이어서, 이러한 이종성 단백질 또는 이의 전구체는 임의로 탈변성되고, 리더 서열이 정제되거나 달리 프로세싱되고, 정제 및 분리된 후 최종적으로 목적하는 생성물로서 제조되어 수득된다. 적합한 이종성 단백질은 바람직하게는 인슐린 또는 인슐린 유도체 및 인슐린 전구체이다.
인슐린의 제조 방법을 수행하는 동안에, 융합 단백질에 시스테인을 첨가함으로써, 생성물이 수 개월간의 저장 동안 안정하게 유지된다. 비교하면, 미처리된생성물은 단지 몇일 후만에 이의 활성의 일부를 비가역적으로 상실한다.
사람 인슐린 또는 인슐린 유도체의 전구체 분자를 아래 실시예에서 사용한다. 구조 및 아미노산 서열은 서열 프로토콜에 의해 EP 906 918에 개시되어 있다. 사람 인슐린의 전구체는 천연 사람 인슐린의 서열을 갖는다. 인슐린 유도체의 전구체는 A쇄의 위치 21에 아기닌 대신 글리신을 함유하며, B쇄의 C-말단의 위치 31 및 32에 두 개의 아기닌 분자를 함유한다.
인슐린 융합 단백질은, EP 0 489 780 및 EP 0 906 918에 따라 유전학적으로 변형된 이. 콜라이 세포를 발효시킴으로써 제조될 수 있다. 이 경우에, 무수 물질 약 20 내지 25% 및 폴딩가능한 인슐린 40 내지 50%을 함유하는 단백질 현탁액이 수득된다.
시스테인을 이용한 단백질의 안정화를 위해, 75kg의 시스테인 염산염 x H2O를 격렬히 교반하면서 20분에 걸쳐 (하나의 발효 배취에 해당하는) 상기 단백질 현탁액 약 2500kg에 도입한다. 이 과정에서 pH가 7.0에서 2.5로 낮아진다. 당해 현탁액은 약 pH 5 정도에서 매우 반죽같이 되며, 약 pH 4 부터 다시 용이하게 교반할수 있게 된다. 이러한 실험 조건하에서, 170mM의 시스테인 염산염 농도가 당해 단백질 현탁액에서 확립된다. 이어서, 당해 단백질 현탁액을 60분간 교반한 후, 이를 후처리할 때 까지 추가로 교반하지 않고 방치할 수 있다.
실시예 1
시스테인의 보존 작용을 실험적으로 확인하기 위하여, 아래의 실험 작업을 수행한다:
EP 906 918에 따라 제조된 사람 인슐린의 융합 단백질 및 인슐린 유도체의 융합 단백질을 5℃ 및 실온에서 최대 2개월간 시스테인의 존재 또는 부재하에 저장한다. 실험중에 분액을 당해 배취로 부터 제거한다. 당해 융합 단백질은 환원적 폴딩에 의해 사람 인슐린의 프리프로(prepro) 형으로 또는 인슐린 유도체의 프리프로 형으로 전환된다[참조: EP 906 918]. 폴딩에 필요한 양의 시스테인을, 폴딩 시작하기 전에 약 1시간 동안 시스테인 염산염 일수화물의 부재하에 저장된 배취에 첨가한다. 보존제의 형태로 시스테인을 함유한 다른 배취에서는, 이는 더 이상 필요없다.
사람 인슐린의 프리프로 형 또는 인슐린 유도체의 프리프로 형을 형성하는 반응을 HPLC를 이용하여 측정한다.
HPLC 분석:
단백질 0.5g을, 6M 구아니딘 염산염, 50mM tris, pH 8.5, mM 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 1% 2-머캅토에탄올 및 10mM 디티오트레이톨의 용액 40ml에 95℃에서 2분간 용해시킨 후, 14,000g로 20분간 원심분리한다. 투명한 상청액 0.02ml를 고압 액체 크로마토그래피 칼럼에 적용한다.
칼럼:RNucleogel RP 300 - 5/46 (Macherey & Nagel, Aachen, Germany)
구배: 완충제 A: 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)
완충제 B: 아세토니트릴중의 0.09% TFA
온도: 55℃
총 수행 시간: 40분
구배는 상응하는 수행 시간 후의 완충제 B의 아래의 양으로 정의된다: 10분 25%, 12분 60%, 13분 90%, 15분 100%.
유속: 1ml/분
검출: 215nm
실험의 결과
5℃에서의 사람 인슐린의 융합 단백질의 저장[폴딩 후 유용한 물질(mg/l)(유용한 물질은 폴딩된 사람 인슐린을 의미한다)]
제1일 1주 2주 4주 8주
시스테인 존재 850 831 867 845 825
시스테인 부재 879 827 790 712 625
실온에서의 사람 인슐린의 융합 단백질의 저장[폴딩 후 유용한 물질(mg/l)]
제1일 1주 2주 4주 8주
시스테인 존재 792 817 800 785 790
시스테인 부재 812 654 312 %* %*
*심한 부패 과정 때문에 적용이 불가능함
5℃에서의 인슐린 유도체의 융합 단백질의 저장[폴딩 후 유용한 물질(mg/l)(유용한 물질은 폴딩된 인슐린 유도체를 의미한다)]
제1일 1주 2주 4주 8주
시스테인 존재 590 553 540 573 552
시스테인 부재 612 580 549 518 404
실온에서의 인슐린 유도체의 융합 단백질의 저장[폴딩 후 유용한 물질(mg/l)]
제1일 1주 2주 4주 8주
시스테인 존재 643 667 680 649 653
시스테인 부재 597 547 420 271 %*
*심한 부패 과정 때문에 적용이 불가능함
시스테인 또는 시스테인 염산염을 첨가함으로써, 현저한 활성 손실 없이 최대 2개월간 저장할 수 있다.

Claims (20)

  1. 수성 용매에 시스테인을 첨가함으로써 단백질의 유효 농도의 일시적 감소를 지연시킴을 특징으로 하는, 수성 용매중에 단백질을 저장하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 미생물에서 제조된 이종성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 사용된 미생물이 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 사용된 세균이 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 사용된 미생물이 효모인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 사용된 효모가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 사용된 효모가 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 사용된 미생물이 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2항 내지 제8항중의 어느 한항에 있어서, 미생물이 발현 벡터 작제물에 의해 단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중의 어느 한항에 있어서, 단백질이 용해된 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제9항중의 어느 한항에 있어서, 단백질이 현탁액으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항중의 어느 한항에 있어서, 단백질 수용액중의 시스테인 농도가 100 내지 500mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단백질 수용액중의 시스테인 농도가 150 내지 220mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단백질 수용액중의 시스테인 농도가 170mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항중의 어느 한항에 있어서, 단백질의 저장이 0℃ 내지 50℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단백질의 저장이 5℃ 내지 30℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단백질의 저장이 5℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항중의 어느 한항에 있어서, 사용된 단백질이 인슐린, 인슐린 유도체 및/또는 이의 전구체인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 형질전환된 미생물내에서의 이종성 단백질 또는 이의 전구체의 발현, 경우에 따라 미생물의 파쇄 또는 배양 배지로 부터의 이종성 단백질 또는 이의 전구체의 단리, 후속적으로 제1항 내지 제20항중의 어느 한항에 따른 방법에 의한 저장, 및 경우에 따라 이종성 단백질 또는 이의 전구체의 후속적인 탈변성, 경우에 따라 리더 서열 및 이종성 단백질의 전구체에만 존재하는 다른 서열의 제거, 및 최종적으로 이종성 단백질의 정제 및 단리를 포함하는, 이종성 단백질의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 이종성 단백질이 동물 인슐린 또는 사람 인슐린인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020027000032A 1999-07-02 2000-06-20 수성 용매에 저장하는 동안 복합 혼합물중 단백질을안정화시키는 방법 KR100754235B1 (ko)

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