NO329429B1 - Fremgangsmate for lagring av insulin i et vandig opplosningsmiddel. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for lagring av proteiner i et vandig oppløsningsmiddel. Tilsats av cystein forsinker reduksjon av den virksomme konsentrasjonen av proteinet. Fremgangsmåten egner seg for anvendelse ved produksjon av proteiner i mikroorganismer.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for lagring av insulin, et insulinderivat og/eller en forløper av det samme i et vandig oppløsningsmiddel.

Den kjemiske tilstanden SH-gruppene av proteiner eller andre oksidasjonsømfintlige strukturer har ofte innflytelse på identiteten, aktiviteten eller virksomme konsentrasjoner av proteiner. Identiteten betyr den respektive foldingen av et protein. Under aktivitet bør man forstå en enzymaktivitet. De virksomme konsentrasjoner av et protein bør være andelen av proteinet i en oppløsning som foldes korrekt med hensyn til den biologiske in vivo-funksjonen.

Fra litteraturen er det kjent at strukturforandrende oksidasjoner på proteiner kan undertrykkes ved anvendelse av tiolreagenser som for eksempel 2-merkaptoetanol eller cystein.

Det er for eksempel mulig å stabilisere D-amlinosyreoksidasen (DAO) ved hjelp av tioler. Flavoprotein DAO katalyserer den stereospesifikke deamineringen av D-aminosyrer til det tilsvarende cc-ketosyre og ammonium (P. Golini et al. Enzyme and Microbial Technology, 17,1995, 324-329). Riktignok kan tilsatsen av tioler som for eksempel cystein også redusere aktiviteten av proteiner. Også denne effekten kan forklares ved eksistensen av cysteinresten. Et eksempel på det er aminoacylasen. Aminoacylasen er et dimert enzym med et Zn<2+->atom pr. under-enhet. Hver under-enhet av enzymet inneholder 2 cystein SH-grupper og 2 disulfidbindinger. Den kjemiske modifiseringen av SH-gruppene som oppbrytning av disulfidbindingene, kan føre til en inaktivering av enzymet. Det var mulig å vise at aktiviteten til aminoacylasen reduseres ved tilsetning av 2-merkakptoetanol, men etter fjerning av 2-merkaptoetanolen ved hjelp av dialyse eller gelfiltrering kan man nesten fullstendig restituere den opprinnelige enzymaktiviteten (W. Kordel u.F. Schneider, Biochem. Biophys. Acta 445,1976,446-457).

For cystein og noen derivater var det mulig, for visse tilberedningsformer og spesielle anvendelser i et visst omfang, å vise en antibakteriell, antiviral eller antifungal aktivitet. Således kunne man for eksempel vise at tilsetningen av cystein i et visst omfang egner seg som beskyttelse for næringsmidler mot forderving (US 4.937.085 A).

Ved hjelp av genteknologiske fremgangsmåter kan rekombinante proteiner som insulin eller dets forløper så vel som insulinderivater som oppviser de fra den avledede gensekvensen (for eksempel menneskelig) avvikende aminosyresammensetninger, syntetiseres i genteknisk forandrende mikroorganismer som bakteriumet Escherichia coli.

Den rekombinante syntesen i mikroorganismer gjennomføres ved hjelp av ekspresjonsvektorer. Disse ekspresjonsvektorer består av et vektorplasmid som bør inneholde en kontrollsekvens for replikasjon av plasmidet så vel som et seleksjonsgen (antibiotikaresistensgen, stoffskiftemarkør, osv.), i hvilket det kodende området av genet for proteinet av interesse (for eksempel insulin) anvendes under kontroll av en i valgte mikroorganismer aktiverte promoter (for E. coli for eksempel lac-promoter).

En fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante proteiner (for eksempel insulin; insulinderivater og lignende) under medanvendelse av genteknisk forandrede mikroorganismer er sammensatt av en serie av fremgangsmåtetrinn, som griper inn i hverandre og må bli koordinert med hverandre.

Således kan for eksempel en fremgangsmåte for fremstilling av humaninsulin i E. coli, bygges opp av de følgende fremgangsmåtetrinn.

Fermentering av mikroorganismen, celleseparasjon-celleødeleggelse-isolering og mellomlagring av fusjonsproteinet med cystein-tilbakefolding i den naturlige

romstrukturen, inkludert korrekt dannelse av disulfidbroer med etterfølgende separasjon av fremmedproteiner uten verdi - enzymatisk spalting til arginylinsulin-basisrensing av den vandige proteinoppløsningen -1. kromatografiske rensing - enzymatisk spalting til humaninsulin - 2. kromatografiske rensing - høyopprensing ved hjelp av HPLC - omkrystallisering - tørking.

Et mangfold av gjennomførte enkelttiltak fører vanligvis til betydelige tap av totalutbyttet fordi tap, betinget av det spesifikke utbyttet av det valgte fremgangsmåtetrinnet, er unngåelig ved hvert trinn.

Ved optimalisering av mellomtrinn kan totalutbyttet forbedres. Det er en betydelig interesse for slike fremgangsmåter for å muliggjøre en bedre økonomisk anvendelse av de anvendte ressurser samt en reduksjon av miljøbelastningen.

I EP 0 906 918 beskrives for eksempel en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en forløper til insulin eller insulinderivater med korrekt bundne cysteinbroer i nærvær av cystein eller cysteinhydroklorid og et kaotropt hjelpestoff.

Diabetologia, 1980, vol. 19, side 1-9 fokuserer på insulinaggregering og hvilke faktorer som påvirker denne. Spesielt er det vist at insulin lagret i et løsningsmiddel tilsatt cystein oppviser redusert aggregering.

PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 1995, vol. 49, side 289-293 omtaler stabilisering av insulinotropin i dekstran formuleringer. Spesielt er det vist at tilsats av EDTA og cystein tilnærmet eliminerer degradering av insulinotropin under lagring.

Insulinderivater er derivater av naturlig forekommende insulin, nemlig humaninsulin eller animalsk insulin. Disse insulinderivater skiller seg fira det naturlig forekommende insulin ved sletting, substituering eller inkorporering av minst en kodbar aminosyrerest i det angjeldende naturlig forekommende insulin.

Ved lagring av proteiner skjer vanligvis en reduksjon av de virksomme konsentrasjoner.

Lagringen av produksjonsprodukter mellom de enkelte fremgangsmåtetrinn kan være nødvendig av forskjellige årsaker. Således kan det for eksempel skje at bearbeidelseskapasiteten av et etterfølgende teknisk viderebearbeidelsestrinn ikke er tilstrekkelig for å ta opp den totale produktmengden av det tidligere fremgangsmåtetrinnet.

Tidsbehovet for mellomlagring kan være av forskjellig lengde. Grunnet kapasiteten kan behovet for koordinering av industrielle enheter, nødvendige etterleveringer av kjemikalier eller anordninger eller på grunn av andre årsaker, den nødvendige mellomlagringen strekke seg over flere uker.

En effektiv måte for utbytteøkning er å redusere tap av aktivt protein som kan skje under den unngåelige mellomlagringen av produktene fra individuelle fremgangsmåtetrinn før deres videre bearbeidelse.

Til nå er anvendelsen av cystein og derivater for kontroll av potensielt tap av aktivt protein under mellomlagring av produksjonsprodukter ikke blitt beskrevet. Disse produkter kan være forskjellig med hensyn på sammensetning, så vel som i form, inkludert biologiske komponenter, for eksempel ved anvendelse av enzymkatalysatorer eller genteknisk forandrede mikroorganismer. Slike fremgangsmåter anvendes for eksempel ved fremstilling av insulin.

Produksjonsproduktene som skal mellomlagres, kan, avhengig av fremgangsmåtetrinn, bestå av mange forskjellige komplekst sammensatte makromolekyler av biologisk opprinnelse (proteiner, DNA, fett), mikroorganismer, buffersubstanser og utgangsprodukter og annet.

Produksjonsfremgangsmåten retter seg vanligvis på mest mulig enhetlig fremstilling av stoff, i tilfellet ved insulinproduksjon på insulin. Når produksjonsprodukter må mellomlagres, fører det i tilfelle ved fremstilling av et protein, som for eksempel insulin, regelmessig til tap av virksom konsentrasjon av dette proteinet.

Lagring av et protein bør forstås å bety enhver lagring av proteinet, uavhengig av volumetrisk mengde proteinet er tilstede i, tidsvarigheten for lagring, eller temperaturbetingelser under lagring. Lagringen av proteiner skjer vanligvis i vandige oppløsninger.

En vandig oppløsning av et protein kan inneholde bestanddeler av et næringsmedium for kultivering av mikroorganismer i definert form eller som et komplett medium inneholdende spesielt karbonkilder eller nitrogenkilder, aminosyre og uorganiske salter og sporelementer. Den vandige oppløsning kan også inneholde bufferkomponenter av forskjellige kjemiske buffertyper, så vel som makromolekyler av biologisk opprinnelse som DNA eller fett, ytterligere organiske eller uorganiske forbindelser som for eksempel natriumdodecylsulfat eller kaliumacetat og også andeler av oppløsningsmiddel med forskjellige prioriteter som metanol eller petroleter.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for lagring av et protein der den tidsmessige reduksjon av den virksomme konsentrasjonen av proteinet forsinkes i et vandig oppløsningsmiddel, kjennetegnet ved at ved cystein tilsettes det vandige oppløsningsmiddelet, konsentrasjonen av cystein i den vandige proteinoppløsningen ligger i området på fra 150 mM til 220 mM og proteinet som anvendes er insulin, et insulinderivat og/eller en forløper av det samme. Fremgangsmåten egner seg for stabilisering / forsinkelse av den tidsmessige reduksjonen av den virksomme konsentrasjonen av et protein under dets lagring i vandige oppløsninger. Fremgangsmåten kan anvendes for eksempel ved fremstilling av proteiner ved bruk av mikroorganismer. Som mikroorganisme nevnes blant annet bakterier, her spesielt Escherichia coli, gjærtype, foretrukket Saccharomyces cerevisiae eller Pichia pastoris, så vel som insektceller. Foretrukket kan disse mikroorganismer transformeres ved bruk av ekspresjonsvektor konstrukter for indusert eller konstitutiv ekspresjon av nevnte protein. Mikroorganismene dyrkes og ødelegges etter syntese av proteinet. Ødeleggelsesfremgangsmåten (Aufschluss) kan prinsipielt være alle fremgangsmåter som er egnet for frigjøring av proteinet fra bakteriene. Anvendbar som behandlingsrfemgangsmåte er for eksempel ultralyd, kjemiske fremgangsmåter under anvendelse av K-acetat, Na-dodecylsulfat eller lysozym, oppvarming av mikroorganismene eller French-pressen. Ødeleggelse av mikroorganismene kan unngås når proteinet som skal fremstilles utskilles direkte i mediet. Prinsipielt kan fremgangsmåten også anvendes for ekstruderte proteiner.

De komplekse proteinblandinger som oppstår når mikroorganismene ødelegges eller protein sekreteres direkte i mediumet, foreligger vanligvis i vandig oppløsning. Deri kan proteinene være oppløst eller foreligge i suspendert form. Oppbevaringen av disse proteinoppløsninger skjer fortrinnsvis mellom 0°C - 50°C eller mellom 5°C - 30°C eller ved 5°C. For forsinking av inaktiveringen gis cystein til denne proteinblandingen. Konsentrasjonen av cystein i proteinblandingen ligger i området 150 - 220 mM. Fortrinnsvis tilsettes 170 mM. Proteiner i komplekse molekyloppløsninger kan lagres på denne måten opptil flere uker med kun lav reduksjon av den virksomme proteinkonsentrasjonen. Fremgangsmåten kan anvendes for syntese av heterologe proteiner, spesielt i mikroorganismer, etter deres ødeleggelse med etterfølgende rensing og eventuelt renaturering, foretrukket for fremstilling av insulin og dets forløper.

Som proteiner for lagring i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, anvendes insulin eller insulinderivater og/eller en forløper av det samme.

Et andre aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt protein, kjennetegnet ved at den omfatter ekspresjon av det heterologe proteinet eller dets forløper i en transformert mikroorganisme, eventuelt ødeleggelse av mikroorganismen eller isolering av det heterologe proteinet eller dets forløper fra kulturmediet, etterfølgende lagring ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 15 og, eventuelt den etterfølgende renatureringen av det heterologe proteinet eller dets forløper, eventuelt avspaltning av ledersekvenser og av andre sekvenser som kun forekommer i forløperen til det heterologe proteinet og endelig rensing og isolering av det heterologe proteinet.

Eksempler:

I løpet av implementering av fremgangsmåten for fremstilling av insulin ble det funnet at tilsats av cystein til fusjonsproteinet fører til at produktet blir lagringsstabilt over flere måneder. Derimot taper det ikke-forbehandlede produktet allerede etter noen dager irreversibelt en del av sin aktivitet.

I de følgende eksempler anvendes forløpermolekylene til det humane insulin samt et insulinderivat. Struktur og aminosresekvensen vises i EP 906 918 med sekvensprotokoller. Forløperen av det humane insulinet har sekvensen av naturlig forekommende humant insulin. Forløperen av insulinderivatet inneholder på posisjon 21 av A-kjeden et glysin i stedet for et arginin og på den C-terminale enden til B-kjeden på posisjonene 31 og 32 to argininmolekyler.

Fusjonsproteiner av insulin kan fremstilles ved hjelp av fermentering av genetisk modifiserte E. coli-celler ifølge EP 0 489 780 og EP 0 906 918. Man utvinner derved en proteinsuspensjon som inneholder omtrent 20 til 25% tørrmasse og 40 til 50% foldbart insulin.

For den ønskede stabiliseringen av proteinet ved hjelp av cystein tilsettes til ca. 2500 kg av denne proteinsuspensjonen (som tilsvarer en fermenteringscharge) 75 kg cysteinhydroklorid<*>H20 i løpet av 20 minutter under sterk omrøring. pH-verdien faller derved fra 7,0 til 2,5. Suspensjonen blir i pH-området rundt 5 meget pastøs, og fra pH 4 igjen godt rørbar. Under disse forsøksbetingelser innstiller en cysteinhydrokloirdkonsentrasjon seg på 170 mM i proteinsuspensjonen. Proteinsuspensjonen etterrøres i 60 minutter, deretter kan man la den stå uten ytterligere omrøring til opparbeidelsen.

Eksempel 1:

For eksperimentelt bevis av den konserverende virkningen av cystein, gjennomførte man følgende laborforsøk: Fusjonsprotein av det humane insulin og fusjonsprotein av insulinderivatet fremstilt ifølge EP 906 918, ble lagret med og uten cystein ved 5°C og ved romtemperatur opp til 2 måneder. Alikvoter ble tatt fra prøvene i løpet forsøket. Fusjonsproteinet ble ved reduktiv folding overført til prepro-formen av det humane insulin henholdsvis prepro-formen av insulinderivatet (EP 906 918). Prøver som ble lagret uten cysteinhydroklorid-monohydrat fikk den for folding nødvendige mengden cystein omtrent 1 time før start av folding. Ved de andre prøver som inneholdt cysteinet i form av konserveringsmiddelet, var det ikke lenger nødvendig.

Omsetningen til prepro-formen av det humane insulin henholdsvis prepro-formen av insulinderivatet, ble bestemt ved hjelp av HPLC.

HPLC-analyse:

0,5 g protein ble oppløst i 40 ml av en oppløsning som består av 6 M guanidinhydroklorid, 50 mM Tris, pH 8,5 mM etylendiamintetraacetat (EDTA), 1% 2-merkaptoetanol, 10 mM ditiotreitol ved 95°C i 2 min. deretter sentrifugert ved 14 000 g i 20 min. Fra den klare supernatanten (Uberstand) overføres 0,02 ml på en høytrykksvæskekromatografisøyle.

Søyle: ©Nucleogel RP 300 - 5/46 (Macherey & Nagel, Aachen, Tyskland)

Gradient: Buffer A: 0,1 % trifluoreddiksyre (TFA)

Buffer B: 0,09% TFA i acetonitril

Temperatur: 55°C

Total løpetid: 40 min.

Gradienten er kjennetegnet ved den følgende mengden av buffer B ifølge de tilsvarende løpetider: 10 min. 25%, 12 min. 60%, 13 min. 90%, 15 min. 100%.

Strømning: 1 ml/min.

Detektering: 215 nm.

Resultat av forsøkene:

Ved tilsats av cystein eller cysteinhydroklorid muliggjøres lagringstider opp til 2 måneder uten signifikant aktivitetstap.

Claims (17)

1. Fremgangsmåte for lagring av et protein der den tidsmessige reduksjon av den virksomme konsentrasjonen av proteinet forsinkes i et vandig oppløsningsmiddel, karakterisert ved at ved cystein tilsettes det vandige oppløsningsmiddelet, konsentrasjonen av cystein i den vandige proteinoppløsningen ligger i området på fra 150 mM til 220 mM og proteinet som anvendes er insulin, et insulinderivat og/eller en forløper av det samme.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det heterologe proteinet fremstilles i en mikroorganisme.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at mikroorganismen som anvendes er en bakterie.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at bakterien som anvendes er Escherichia coli.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at mikroorganismen som anvendes er gjær.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man anvender Saccharomyces cerevisiae som gjær.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at gjæren som anvendes er Pichia pastoris.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at mikroorganismen som anvendes er insektceller.

9. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 2 til 8, karakterisert ved at mikroorganismen fremstiller proteinet ved hjelp av en ekspresjonsvektorkonstruksjon.

10. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 9, karakterisert ved at proteinet foreligger i oppløst form.

11. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 9, karakterisert ved at proteinet foreligger i suspensjon.

12. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 11, karakterisert ved at konsentrasjonen av cystein i den vandige proteinoppløsningen er 170 mM.

13. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 12, karakterisert ved at lagringen av proteinet skjer ved 0°C til 50°C.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at lagringen av proteinet skjer ved 5°C til 30°C.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at lagringen av proteinet skjer ved 5°C.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt protein, karakterisert ved at den omfatter ekspresjon av det heterologe proteinet eller dets forløper i en transformert mikroorganisme, eventuelt ødeleggelse av mikroorganismen eller isolering av det heterologe proteinet eller dets forløper fra kulturmediet, etterfølgende lagring ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 15 og, eventuelt den etterfølgende renatureringen av det heterologe proteinet eller dets forløper, eventuelt avspaltning av ledersekvenser og av andre sekvenser som kun forekommer i forløperen til det heterologe proteinet og endelig rensing og isolering av det heterologe proteinet.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at det heterologe proteinet er et animalsk insulin eller humant insulin.