HU228936B1 - Method for stabilising proteins in complex mixtures during their storage in aqueous solvents - Google Patents
Method for stabilising proteins in complex mixtures during their storage in aqueous solvents Download PDFInfo
- Publication number
- HU228936B1 HU228936B1 HU0202264A HUP0202264A HU228936B1 HU 228936 B1 HU228936 B1 HU 228936B1 HU 0202264 A HU0202264 A HU 0202264A HU P0202264 A HUP0202264 A HU P0202264A HU 228936 B1 HU228936 B1 HU 228936B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- microorganism
- process according
- precursor
- insulin
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 title claims description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 title description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 10
- 230000003019 stabilising effect Effects 0.000 title 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 62
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 23
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 19
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 13
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000077 insect repellent Substances 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 22
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 21
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 21
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 238000012432 intermediate storage Methods 0.000 description 3
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 3
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 7-[(6,8-dichloro-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino]-n-[2-(1h-indol-3-yl)ethyl]heptanamide Chemical compound C1CCCC2=NC3=CC(Cl)=CC(Cl)=C3C(NCCCCCCC(=O)NCCC=3C4=CC=CC=C4NC=3)=C21 ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101001026869 Mus musculus F-box/LRR-repeat protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 108010003977 aminoacylase I Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- -1 cysteine Chemical class 0.000 description 2
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RIPZAYPXOPSKEE-DKWTVANSSA-N (2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoic acid;hydrate Chemical compound O.SC[C@H](N)C(O)=O RIPZAYPXOPSKEE-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- QRIPJHVJKXPQBX-UHFFFAOYSA-N 1-dodecylsulfanyldodecane;sodium Chemical compound [Na].CCCCCCCCCCCCSCCCCCCCCCCCC QRIPJHVJKXPQBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101100258233 Caenorhabditis elegans sun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000013590 bulk material Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgyát képezi eljárás fehérjék vizes oldószerben történő tárolására ciszterit hozzáadásával, továbbá rekombináns fehérjék előállítása, amely során a találmány szerinti tárolási eljárást alkalmazzuk.
A fehérjék vagy más, oxidációra érzékeny szerkezetek SH-csoportjainak kémiai állapota gyakran befolyásolja a fehérjék azonosságát, aktivitását vagy hatékony koncentrációját. Az azonosság egy fehérje mindenkori felgombolyodott állapotát jelenti. Az aktivitás kifejezései; enzimaktivitást értőnk. A hatékony koncentráció kifejezésen az oldatban lévő fehérjének azt a részét értjük, amely az in vivő biológiai funkciót illetően helyesen van felgombolyodva,
A technika állása szerint ismert, hogy fehérjék szerkezetet megváltoztató oxidációi tioi-reagensek, .például 2-raerkaptostanol vagy cisztein beépítésével csökkenthetők, ily módon például D-aminosavosidáz (DAO) tsollal stabilizálható, A DAO flavoprotein Daminosavak sztereospecííifcus dezaminálását végzi, amely a ísregfefelö ketosavakat és ammóniumot eredményezi {Goiini, P. és mtsai., Enzyme and Microbial Technology 17, 324-329 (1995)1. Tíolok, például cisztein, hozzáadása azonban a fehérjék aktivitását Is csökkentheti. Ez a itatás is megmagyarázható a ciszteíngyökök jelenlétével. Az aminoaciláz egy példa me. Az antinoaciláz egy dimer enzim, alegységenként egy Z.u?.* atommal. Az twist; mindkét alegysége kés cisztein SH-csopo«ot és két áiszaiSá-kŐtést tartalmaz, Az SH-esoportok kémiai módosítása, például a áiszulfid-kőtések bontása az enzim inaktiváiódásához vezethet. Kimutatható, hogy 2roerkaploeteucl hozzáadása csökkenti az aminoaciláz aktivitását, míg a 2-merkaptoetanol dialízissel vagy géíszüréssel történő eltávolítása csaknem teljesen helyreállítja az eredeti enzimatóivitást [Kőrdel, W, és Schneider, Biochem, Biophys. Acta 445,446-457 (1976)].
Cisztein és egyes származékai esetében egyes előalakokná! és speciális alkalmazásoknál bizonyos mértékű aniibakteriális, antíviráits vagy antifuagáíis aktivitást lehetett kimutatni. Kimutatható volt például, hogy cisztein hozzáadása bizonyos mértékben élelmiszerek megromlásának megakadályozására alkalmazható (US 49370SSA),
Géntechnológiai eljárások alkalmazásával rekombináns fehésjék, például inzulin vagy ennek előanyagaí, például olyan inzulinszárihazékok, amelyek az eredeti (példáéi humán) génszefcvenciától eltérő amínosavősszetételüek, géntechnológiai úton megváltoztatott nnkroorganiamusokhan, például Escherichia coli baktériumban szintetizáltathatók.
A mikroorganizmusokban a rekombináns szintézisek expnsssziós vektorokkal valósíthatók meg. Ezek az expressziós vektorok egy vektorplazmidból állnak, amelynek a piazmid replikációjához szükséges szabályozó szekvenciát, valamint szelekciós gént (antibiotikum-rezisztenciagén, anyagcseremarker·, stb,) kell taxtahnaznia, amelyben az érdeklődés tárgyát képező fehérje (például Inzulin) génjének kódoló szakasza egy, a kiválasztod. ntifcroorganizmushan aktív promóter ellenőrzése alatt áll (E. coliban például lac-promóter).
Rekombináns fehérjék (például inzulin, inzulinszármatekok, stb.) géntechnológiai úton megváltoztatott mikroorganizmusok alkalmazásával történő előállítására szolgáló eljárás egymással kapcsolatban álló és egymással összehangolt, eljárási lépések sorozatából áll,
Például, humán inzulin B. coliban történő elöálöfesára szolgáló eljárás a kővetkező eljárási lépésekből állhat. A mikroorganizmusok fermentációja, sejtelváiasziás, sejtfeltárás, izolálás, és a císzteint tartalmazó
BEGÍBÁS ALAPJAUL SZOLÚÓ VÁLTOiíf φ « φ
fúziós fehérjék köztes állapotban történő tárolása, az eredeti térszerkezetbe történő visszagombolyodás a diszuífid-kőtések kifejeződése révén, majd ezt követően a hatékony anyagot msb tartalmazó, idegen fehérjék elválasztása, enzimes emésztés arginll-inzulirmá, a vizes íehérjeoldat alaptisztítása, első kromatográfiás tisztítás. enzimes hasítás humán inzulinná, második kromatográfiás tisztítás, fmom&bfe tisztítás HPLC-vei, átkristályositás, szárítás.
Az elvégzett egyedi lépések nagy szánta rendszerint jelentős veszteséget okoz az össrisozamban, mivel minden egyes lépésnél a kiválasztott eljárási lépés konkrét hozamától függő veszteségek elkerülhetetlenek.
A köztes lépések optimalizálásával az ősszhozam javítható. Ilyen eljárás érdeklődésre tart számot, mivel a befektetett források jobb gazdasági kihasználása, valamint a környezetszennyezés csökkentése érhető el,
Áz EPQ9ÖŐ918 számú európai közzétételi iratban jobb eljárást Ismertetnek megfelelően kialakított ciszteinhidakkal bitó inzulin vagy mzulinszátmazékok «főanyagának előállítására cisztein v&gy ciszteinhldroklorid vagy egy kaoiróp segédanyag alkalmazásával.
Az inzulinszármazékok természetesen előforduló inzulinok, nevezetesen humán inzulin vagy állati eredetű inzulinok származékai. Ezek az inzultnszármazékok a különben egyforma, természetesen előforduló inzulintól hibákban, és/vagy legalább egy, az érintett, természetesen előforduló inzulinban meglévő anslnosavnsk egy másik, genetikailag kódolható ammosavra történő kicserélésében, és/vagy legalább egy, genetikailag kódolható aminosav hozzáadásában különbőznek.
A fehérjék tárolása során a aktív molekulák koncentrációja („wirksaraen Konzentration”) rendszerint.
csökken.
Az egyes eljárási lépések közötti köztes termékek tárolása különböző okokból válhat szükségessé. Előfordulhat például, hogy egy utána kővetkező technikai feldolgozási lépés feldolgozási kapacitása nem elegendő az előző eljárási lépés teljes terméktömegének felvételéhez.
A köztes tárolás ideje különböző hosszúságú lehet. A technikai gépcsoportok kapacitásától, összehangolást szükségletétől, a vegyszerek vagy berendezések szükséges uíánszállitásátói vagy más okoktól függően az időközi tárolás több hétre is tótetjedhet.
Á hozamnövelés egy hatékony módja, ha siketül az egyes eljárási lépések termékeinek elkerülhetetlen, időközt tárolása során az aktív fehérjék tekintetében a további feldolgozás előtt fellépő veszteség lehető legszűkebb keretek között tartása.
Ez Idáig nem számoltak be cisztein vagy származékai alkalmazásáról olyan hozamveszteségének csökkentésére, amelyek aktív fehérje különböző összetételű - a termelési folyamat során keletkező - termékeinek időközi tárolása során lépnek fel vagy biológiai komponensek - például estzimkataiizátorök vagy géntechnológiai úton megváltoztatott mikroorganizmusok - alkalmazásával végzett, ipari termelési eljárás egyes eljárási lépéseiből származó állapotváltozásából erednek. Ilyen eljárások például inzulin előállítására alkalmazhatók.
Áz időközi tárolásra szoruló, a termelési folyamat során keletkező termék, az eljárási fok szerint különböző mennyiségű, komplex összetételű, biológiai természetű makromolekulából (fehérjék, DNS, zsírok), mikroorganizmusokból, pufferanyagokből, végtermékekből és másokból állhat.
A termelési eljárás rendszerint egy anyag lehetőség szerint egységes előállítását tűzi célul, az inzulinterinelés esetében az inzulin előállítását.. Amennyiben a termelési folyamat során keletkező termékeket időközben raktározni kell, egy fehérje, mint például az inzulin előállítása esetében a fehérje aktív formája koncentrációjának csökkenésével keü számolni.
Egy fehérje tárolása során & fehérje mintlen egyes tárolási pontját figyelembe kell venni függetlenül a térfogattól, amelyben a fehérje előfordul, az időtartamtól, ameddig a tárolás szükséges, vagy a .hőmérsékleti körülményektől, amelyek között a tárolás történik, A fehérjék tárolása normál esetben vizes oldatokban történik.
Egy fehérje vizes oldata mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló, meghatározott formában lévő, vagy elsősorban szénfotrásokból vagy nittogénlbrrásoklsői, mmos&vakból és szervetlen sókból és nyomelemekből siló teljes értékű tápoldatok alkotórészei mellett különböző kémiai puffertfpusok pufferelemeit is, valamint biológiai eredetű makromolekulákat, mint DNS-t vagy zsírokat, továbbá szerves vagy szervetlen vegyük·;·· tőket, például nátrium-dodecilszulfátot vagy kálíum-acetátot és különböző prioritású oldószerek elemeit, például metanolt vagy petrolétert tartalmazhat.
Lougheed, W.D. és mtsai {Diabetológia, 19(1} 1-9 (Í9§ö)'j leírják az iuzuiinaggregásiőt egy mesterséges bejuttató rendszerben, továbbá ismertetnek egy eljárást, amely során inzulint eisztein jelenlétében 30 napon keresztül tárolták.
A találmány tárgyát képezi eljárás fehérje vizes oldószerben történő tárolására, amely során a fehérje aktív koncentrációjának időbeli csökkenését lassítjuk, vizes oldószerben, ciszteinnek a vizes oldószerhez történő hozzáadásával, és a eisztein koncentrációja a vizes fehé^eoldafbaa 1 0Ö-5SŐ mM.
Az, eljárás egy fehérje vizes oldószerekben történő tárolása során a fehérje hatékony koncentrációjában bekövetkező, időbeli csökkenés lassítására alkalmazható. Az eljárás például fehérjéknek mikroorganizmusokkal történő előállítására alkalmazható. Mikroorganizmusként többek között elsősorban baktériumok alkalmasak, előnyösen Escherichía coli, élesztők, elsősorban Saccharomyces cerevisiae- vagy Piehia pastoris, valamint rovarsejtek. Ezek a mikroorganizmusok az előnyös megvalósítási módok szerint a fehérje indukált vagy konstitutív exprsssziójára szolgáló expressziósvektor-készítmény^kkel transzformálhatók. A mikroorganizmusokat szaporítjuk, és a fehérje szintézise után feltárjuk. Feltárási eljárásként minden olyan eljárás alkalmazható, amely a fehérjének a baktériumból történő felszabadítására alkalmas. Feltárási eljárásként alkalmasak például az ultin· hangosás, kémiai eljárások kálium-acetát, nátriiun-dodectlszulíái vagy lizozim alkalmazásával, a mikroorganizmusok hevítése vagy a francia prés. A mikroorganizmusok feltárása elmaradhat, ha az előállítandó fehérje közvetlenül a tápközeghe választódik ki. Elméletileg az eljárás a kiválasztott fehérjékre is alkalmazható.
Az összetett fehérjekeverékek, amelyek a mikroorganizmusok feltárásakor keletkeznek, vagy amikor a feltétje közvetlenül a tápközegbe választódik ki, általában vizes oldatban fordulnak elő, Ebben az oldatban a fehérje oldott állapotban lehet, vagy sznszpenzió formájában állhat elő. Az ilyen fehérjeoldatok tárolása előnyösen Ö°C és 5ö°C között vagy 5eC és 3Ö*£ között vagy S°C-«áI törtérsík. Az ínaktiválódás lassítása érdekében az ilyen fehérjekeverékhez ciszteínt adunk. A ciszteinnek a fehérjekeverékben lévő koncentrációja IÜÖ-500 mM vagy 150-220 mM koncentrációt is elérheti. Előnyösen 170 mM koncentrációban adjuk hozzá. Összetett molekulaoldatokban lévő fehérjék ilyen módon több héten keresztül tárolhatók az aktív fehérje koncentrációja csekély mértékű csökkenése mellett. Az eljárás heterológ .fehérjék szintézisénél, előnyőse» mikroorganizmusokban történő szintézisénél alkalmazható, a feltárásukat kővető tisztítással és adott esetben renaturálással, előnyösen inzulin és elöanyaga előállításától;,
A találmány szerinti. egyik eljárásban a tároláshoz előnyősén inzulint vagy inzulinszármazékokat alkalmazunk.
Tágabb értelemben a találmány tárgyát képezi heterológ fehérje előállítására szolgáló eljárás, beleértve & heterológ fehérje vagy elöanyaga expressziójál egy transzformált mikroorganizmusban, és a heterológ fehérje ezután s találmány szerinti egyik eljárás alkalmazásával tárolható. A heterológ fehérje vagy egy előanyaga adón esetben ezután «maturálható, vezetöszekvenciáktól megtisztítható vagy egyéb módon feldolgozható, és végül tisztítás és izísiálás «tán a kívánt termékké alaki tható. Heterológ fehérjeként előnyőse» inzulin vagy inzutmaánnazékok, valamint az inzulin előanyaga alkalmazható.
Az eljárásnak inzulin előállítására történő alkalmazása során kiderült, hogy ciszteinnek a fúziós feltétjéhez történő hozzáadásával a tennék a tárolás során hónapokon keresztül stabil marad. Az· előzetesen nem kezelt termék ezzel szemben már néhány nap múlva irreverzibilisen elveszti aktivitásának egy részét.
A következő példákban humán inzulin előanyag-rnolekaláit valamint egy inzulinszárrnazékei alkalmazunk. A szerkezetét és aminosavszekveneiáját az EP90691S számú európai közzétételi iratban, szekvencialistában nyilvánosságra hozták. A humán inzulin előanyagának szekvenciája megegyezik a természetesen előforduló, humán inzulin szekvenciájával. Az inzalinszármazék előanyaga az A-lánchan a 21. helyseiben glieiaí. tartalmaz .argirün helyén, és a B-Iánc C-tertninális végé» a 31. és 32, helyzetekben egy-egy arginin molekula található.
Az inzulin fúziós fehétjéi genetikailag módosítón E. coli sejtek fermentációjával állíthatók elő az EP48978Ö és EP906918 számú európai közzétételi iratok szerint, ilyen módon körülbelül 20-25% szárazanyagtartalmú és 40-50%-ban felgombolyodott inzulint tartalmazó fehérjeszuszpenztó nyerhető.
A fehérje kívánt, cisztein alkalmazásával történő stabilizálásához a fehérjeszuszpenzió körülbelül 2500 kg-jóhoz. (egy fermentációs sarasnak felel meg) 75 kg cisztem-hídroklorid * H2O-ot adagolunk 20 percen belül, erős keverés mellett. A pH~érték ezen közben 7,0-rÖl 2,5-re váltósak, A szuszpenzió 5-ős pHtartományhan erősen pasztaszerü, pH 4-íőI azonban újra jól keverhető. Ezen eljárási körülmények között a fehérjeszuszpenzióban a cisztein-indroklorid-konGentráció 170 mM. A fehérjeszuszpenzióí ezután 60 percig kevertetjük, majd további keverés nélkül a feldolgozásig eltartható.
1, példa
Ciszíeis5 tartósító hatásának kísérletes bizonyítására a kővetkező laboratóriumi kísérleteket végeztük;
Az EP 90Ő9.18 számú európai közzétételi irat. szerint előállított, humán inzulin fúziós fehérjéjét és inzulinszáftnazék fúziós fehérjéjét ciszteinnel és cisztein nélkül tároltuk 5*C-on és szobahőmérsékleten, 2 hónapon keresztül. As alapanyag-keverékből a kísérlet során mintákat vertünk. A fúziós fehérjét reduktív felgombolyodással humán inzulin prepro-fonnájává, illetve az mzuliuszármazéfc prepro-fonnájává alakítottuk (EP906918). A ciszteín-monohídrát nélkül tárolt keverékekhez a íélgombolyodáshoz szükséges mennyiségben adtunk ciszteínt a 1 órával a felgomholyodás elölt. A többi keveréknél, amelyek a clszteint a konzerválóanyag formájában tartalmazták, ez nem volt szükséges.
A humán inzulin prepro-formájává, illetőleg az iuzulmszánnazék prepro-fonnájává történő átalakulást HPLC-vel határoztuk meg.
HPLC'-vízsgálat
A fehérjéből 0,5 g-ot 40 ml, 6 M gnamdin-hidrokloridot, 50 mM Tris-t, píf 8,5, nsM ettléndiamintetraecetsavat (EDTA), 1% 2-merkaptoetanolt, 10 mM ditioíreitök tartalmazó oldatban 95°C-oo, 2 perce» keresztül oldottunk, majd 14000 g fordulatszámmal 20 percen keresztül centrifugáltuk. A tiszta feiülúszóhól 0,02 ml-t viszünk: nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopra.
Oszlop: Wucleogel RP 300-5/46 (Macherey & Nagel, Aachen, Deutschlaad) φ**
Gradiens: A-pnffer: Ο,I % trifluoreeetsav (TFA)
B-puffer: 0,09% TFA aeetouiüilbess
Hőmérséklet: 5S*C Teljes mérési idő: 4ö pere
A gradiens a megfelelő mérési időben a kővetkező mennyiségű R-pufferrei jellemezhető: 10 perc 25% 12 perc- 60%, 13 perc §0%, 15 pere 10054.
Áramlási sebesség: l mVpere Detektálás: 215 nm.
A kísérlet eredménye
1, táhiázst
Humán inzulin fúziós fehérjéjének tárolása 5cC-on, hatásos anyag (n)g/i) a felgoraboíyodás utón (hatásos anyag a felgombolyodott humán inzulint jelenti)
| 1, na p | I hét | 2 hét | 4 hét | 8 hét | |
| Ciszieinnel | 850 | 831 | 867 | 845 | 825 |
| Cisztein nélkül | 879 | 827 | 790 | 712 | 62.5 |
2, táblázat
Humán inzulin föskls fehérjéjének tárolása szobahőmérsékleten, hatásos anyag (rng/i) a felgombolyodás után
| 1. nap | 1 hét | 2 hét | 4 Mi | 8 hét | |
| Cis2teianel | 792 | 817 | 800 | 785 | 790 |
| Cisztein nélkül | 812 | 654 | 312 | %* | 59* |
* Az erős rothadási folyamat miatt meghatározás nem lehetséges
3, táblázat
Inzulinszármazék fúziós fehérjéjének tárolása 5*C-oa, hatásos anyag (mg/l) a felgombolyodás «tán (hatásos anyag a felgombolyodott inzulinszármazekot jelenti)
| I . nap | 1 hét | 2 hét | 4 hét | S hét | |
| Ciszteínnel | 590 | 553 | 540 | 573 | 552 |
| Ciszieiu nélkül | 612 | 580 | 549 | 518 | 404 |
4., táblázat lazulmszármazék fúziós fehétjéjének tárolása szobahőmérsékleten, hatásos anyag (mg/1) a felgombolyodás «tón
| 1. nap | 1 hét | 2 hét | 4 héi | 8 lsét | |
| Ciszteínnel | 643 | 66? | 680 | 649 | 653 |
| Cisztein nélkül | 597 | 547 | 420 | 271. | %* |
* .Az erős rothadási folyamat miatt meghatározás nem lehetséges
Ciszfetn vagy císztein-hidrokloriá hozzáadásával a tárolási idő szignifikáns akdvitósveszteség nélkül 2 hónapra növelhető.
fcfc -fc
Claims (17)
1. Eljárás fehérie vizes oldószerben történő tárolására, amely során s fehágernolekulák aktív koncentrációját vizes oldószerben csökkenjük, azzal jefltnnezve, hogy ciszterit adnnk a vizes oldószerhez, sfeol a risztéin koncentrációja a vizes fekésjeoláribsu 1.50-220 mM ás azzal jellemezve, hogy a fehérjeként inzulint, inzulinszáramékot és/vagy egek bármelyikének prekutzorát alkalmazzuk.
2. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fehérjeként mikroorgaoiznmsbtm előállított, hsteológ fehérjét alkalmazunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként baktériumot aíkalmazsmk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumként kschcriehri colit alkalmazunk.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként élesztőt alkalmazunk.
6. Az 5 . igénypont szerinti eljárás, mi jellemezve, hogy élesztőként Saccharornyces eerevissaet alkalmazunk.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztőként Piehla pastorisí alkalmazunk.
8. A 2. igénypont szerriti eljárás, azzal jellemezve, hogy nákroergenizmusként rovarsojfeket alkataazunfc.
9, A 2*8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmusban a fehérjéi egy expresszié» vektorkonstrakrió alkalmazásával állítják elő.
10, Az 1 -9, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, masai jellemezve, hogy a fehérjét oldott formában állítják elő.
11, Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve^ hogy a fehérjét szoszpenzió forrnájáfean állítjuk elő.
12.. Az 1-1 í. igénypontok közöl egy vagy több szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a risztéin koncentrációját a vizes fehérfeokfetban 17Ö mM-ra álthjuk.
13. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét Q*C és 50®C között tároljuk.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hegy a fehérjéi 5°C és 31AC között tároljuk.
15. A 14, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét 5*C«ou tároljuk, lé.
Eljárás heterolög fehérje előállítására, amely során a heferológ fehérjét vagy prekurzorát egy transzformált mikroorganizmusban expresszáltatjuk, aáotí esetben a mikroorganizmust feltárjuk vagy a heterológ fehérjéi vagy prekurzorát a fápközegböí izoláljak, majd ezt köveiben az 1*15. igénypontok szerinti eljárások bármelyike szerint tároljuk, és adott esetben ezt kővetően a heterolög fehérjét vagy pretetzorát rmatimáljnk, adott esetben a ^^szekvenciákat és a feetetofog fehérje prekuíwéban lévő egyéb szekvenciákat iehashjnk, majd végül a heteroíóg fehérjét tisztítjukés izoláljuk..
17, A 16. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterolög fehérjekéof állati eredete inzulint vagy humán inzulint alkalmazunk..
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19930676A DE19930676B4 (de) | 1999-07-02 | 1999-07-02 | Verfahren zur Stabilisierung von Insulin, Insulinderivaten und/oder deren Vorläufer in komplexen Mischungen bei deren Lagerung in wäßrigen Lösungsmitteln |
| PCT/EP2000/005666 WO2001002435A1 (de) | 1999-07-02 | 2000-06-20 | Verfahren zur stabilisierung von proteinen in komplexen mischungen bei deren lagerung in wässrigen lösungsmitteln |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0202264A2 HUP0202264A2 (en) | 2002-10-28 |
| HUP0202264A3 HUP0202264A3 (en) | 2005-01-28 |
| HU228936B1 true HU228936B1 (en) | 2013-06-28 |
Family
ID=7913515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0202264A HU228936B1 (en) | 1999-07-02 | 2000-06-20 | Method for stabilising proteins in complex mixtures during their storage in aqueous solvents |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6339061B1 (hu) |
| EP (1) | EP1196447B1 (hu) |
| JP (1) | JP4555525B2 (hu) |
| KR (1) | KR100754235B1 (hu) |
| CN (1) | CN1220703C (hu) |
| AR (1) | AR024621A1 (hu) |
| AT (1) | ATE423137T1 (hu) |
| AU (1) | AU768443B2 (hu) |
| BR (1) | BRPI0012150B8 (hu) |
| CA (1) | CA2377794C (hu) |
| CY (1) | CY1109050T1 (hu) |
| DE (2) | DE19930676B4 (hu) |
| DK (1) | DK1196447T3 (hu) |
| ES (1) | ES2321373T3 (hu) |
| HK (1) | HK1047115B (hu) |
| HU (1) | HU228936B1 (hu) |
| IL (2) | IL147250A0 (hu) |
| MX (1) | MXPA01012836A (hu) |
| NO (1) | NO329429B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ516372A (hu) |
| PL (1) | PL200145B1 (hu) |
| PT (1) | PT1196447E (hu) |
| SI (1) | SI1196447T1 (hu) |
| WO (1) | WO2001002435A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA200110507B (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10224111A1 (de) * | 2002-05-29 | 2003-12-18 | November Ag Molekulare Medizin | Verfahren zum Assemblieren von Untereinheiten zu Kapsoiden |
| US20060201877A1 (en) * | 2005-03-10 | 2006-09-14 | Baldridge John W | Septic system cleaning |
| US8116073B2 (en) * | 2010-01-26 | 2012-02-14 | Amtek System Co., Ltd. | Display structure of slip-cover-hinge electronic device |
| CN108404194A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-08-17 | 朱清 | 一种快速止血纱布的制备方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4371523A (en) * | 1980-12-29 | 1983-02-01 | The Regents Of The University Of California | Reducing the aggregation of insulin in solution |
| FI78616C (fi) * | 1982-02-05 | 1989-09-11 | Novo Industri As | Foerfarande foer framstaellning av en foer infusionsaendamaol avsedd stabiliserad insulinloesning, som har en foerhoejd zinkhalt. |
| DE3583880D1 (de) * | 1984-04-09 | 1991-10-02 | Takeda Chemical Industries Ltd | Stabile interleukin-2-zusammensetzung. |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| US4937085A (en) * | 1986-08-15 | 1990-06-26 | Agra-Research, Inc. | Discoloration preventing food preservative and method |
| GB8806893D0 (en) * | 1988-03-23 | 1988-04-27 | Unilever Plc | Cosmetic composition |
| KR900003362A (ko) * | 1988-08-24 | 1990-03-26 | 전학제 | 유전공학기법을 이용한 인체 인슈린 유사체의 제조방법 |
| JPH0341033A (ja) * | 1989-07-07 | 1991-02-21 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 安定なモチリン類含有製剤 |
| US5227293A (en) | 1989-08-29 | 1993-07-13 | The General Hospital Corporation | Fusion proteins, their preparation and use |
| GR1005153B (el) | 1989-08-29 | 2006-03-13 | The General Hospital Corporation | Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους. |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| IL139335A (en) * | 1994-01-03 | 2005-08-31 | Genentech Inc | Mpl ligand polypeptides, nucleic acids encoding them, vectors and host cells comprising such nucleic acids, processes for producing such polypeptides pharmaceutical compositions containing them and use thereof in the preparation of medicaments for treating thrombocytopenia |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| US6165981A (en) * | 1995-03-07 | 2000-12-26 | Dade Behring Inc. | Stabilizing solutions for proteins and peptides |
| US5780431A (en) * | 1996-09-20 | 1998-07-14 | Neurobiological Technologies, Inc. | Pharmaceutical formulations of corticotropin releasing factor having improved stability in liquid form |
| DE19735711C2 (de) * | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
-
1999
- 1999-07-02 DE DE19930676A patent/DE19930676B4/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-06-20 WO PCT/EP2000/005666 patent/WO2001002435A1/de active Application Filing
- 2000-06-20 MX MXPA01012836A patent/MXPA01012836A/es active IP Right Grant
- 2000-06-20 KR KR1020027000032A patent/KR100754235B1/ko active IP Right Grant
- 2000-06-20 HU HU0202264A patent/HU228936B1/hu unknown
- 2000-06-20 AU AU58164/00A patent/AU768443B2/en not_active Expired
- 2000-06-20 CA CA2377794A patent/CA2377794C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-20 BR BRPI0012150A patent/BRPI0012150B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-06-20 PT PT00943838T patent/PT1196447E/pt unknown
- 2000-06-20 SI SI200031027T patent/SI1196447T1/sl unknown
- 2000-06-20 NZ NZ516372A patent/NZ516372A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-06-20 CN CNB008091773A patent/CN1220703C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-20 JP JP2001508222A patent/JP4555525B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-20 IL IL14725000A patent/IL147250A0/xx unknown
- 2000-06-20 ES ES00943838T patent/ES2321373T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-20 AT AT00943838T patent/ATE423137T1/de active
- 2000-06-20 DE DE50015562T patent/DE50015562D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-20 PL PL353160A patent/PL200145B1/pl unknown
- 2000-06-20 EP EP00943838A patent/EP1196447B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-20 DK DK00943838T patent/DK1196447T3/da active
- 2000-06-29 AR ARP000103312A patent/AR024621A1/es active IP Right Grant
- 2000-06-30 US US09/608,297 patent/US6339061B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-11-26 US US09/991,964 patent/US6734164B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-12-12 NO NO20016071A patent/NO329429B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-12-21 ZA ZA200110507A patent/ZA200110507B/xx unknown
- 2001-12-23 IL IL147250A patent/IL147250A/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-11-29 HK HK02108639.8A patent/HK1047115B/zh not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-03-10 US US10/796,160 patent/US7514403B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-05-11 CY CY20091100502T patent/CY1109050T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3785864T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Epidermalwachstumsfaktor und dessen Analogen. | |
| FI102843B (fi) | Menetelmä oleellisesti puhdistettujen insuliinijohdannaisten valmistam iseksi | |
| CN111334512A (zh) | 含羟脯氨酸与羟赖氨酸的重组类人胶原蛋白及其生产方法 | |
| EP0510658B1 (de) | Verbesserung der Ausbeute bei der Sekretion von disulfidverbrückten Proteinen | |
| CN102015762A (zh) | 获得纯化的生物活性异源蛋白的方法 | |
| DE102004058306A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Carboxy-terminal amidierten Peptiden | |
| Pink et al. | Regulation of S-layer protein synthesis of Bacillus stearothermophilus PV72 through variation of continuous cultivation conditions | |
| CA2906593A1 (en) | Method of protein purification | |
| KR100218853B1 (ko) | 인체 혈청 알부민의 제조방법 | |
| HU228936B1 (en) | Method for stabilising proteins in complex mixtures during their storage in aqueous solvents | |
| CN108192853B (zh) | 一种促进微生物细胞转运葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的方法及其在生物基产品发酵中的应用 | |
| DE3853743T2 (de) | Rekombinanter menschlicher ADF. | |
| DE69005451T2 (de) | Somatotropinanaloge. | |
| CS271191A3 (en) | Enzymatic process of pre-proinsulins to insulins conversion | |
| US6034224A (en) | Method for solubilization and naturation of somatotropins | |
| RU2122581C1 (ru) | Штамм escherichia coli xli-blue/pinsr - продуцент препроинсулина | |
| EA013263B1 (ru) | Способ получения интерферона-бета | |
| AU2011306653B2 (en) | Improved process for production of recombinant human growth hormone | |
| AT389890B (de) | Verfahren zur herstellung von humaninsulin | |
| KR100254806B1 (ko) | 재조합 조피볼낙 성장호르몬의 대량 정제 방법 및 이를 이용한 어류성장 및 사료 효율의 증대방법 | |
| DE19948408A1 (de) | Neue immobilisierbare Amylosucrase und dessen Verwendung sowie Verfahren zur Herstellung von Poly(1,4-alpha-glucan) |