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MÉTODO PARA ESTABILIZAR PROTEÍNAS EN MEZCLAS COMPLEJAS DURANTE SU ALMACENAMIENTO EN SOLVENTES ACUOSOS La presente invención se refiere a un proceso para el almacenamiento de proteinas en un solvente acuoso. El estado químico de los grupos SH de proteinas u otras estructuras sensibles a la oxidación tiene frecuentemente un efecto sobre la identidad, actividad o concentración efectiva de proteinas. La identidad significa el doblado respectivo de una proteina. La actividad debe entenderse como significando actividad enzimática. La concentración efectiva de una proteína debe ser la proporción de la proteína en una solución que es doblada correctamente con relación a la función biológica in vivo. Se sabe a partir de la literatura que oxidaciones que modifican las estructuras de proteínas pueden ser suprimidas mediante el uso de reactivos tioles tales como, por ejemplo, 2-nercaptoetanol o cisteína. Por ejemplo, la D-aminoácido oxidasa (DAO) puede ser estabilizada por tioles. La flavoproteína DAO cataliza la desaminación estereoespecifica de D-ammoácidos en los a-tpietoácidos correspondientes y amonio (P. Golini et al. Enzyiae and Microbial Technology, 1/7, 1995, 324-329) . Sin embargo, la adición de tioles como por ejemplo, cisteína puede también reducir la actividad de proteínas. Este efecto puede también ser explicado por la presencia de radicales cisteína. Un ejemplo de esta situación en la a inoaciclasa. ? La aminoaciclasa es una enzima dimérica que tiene un átomo Zn2+ por subunidad. Cada subunidad de la enzima contiene 2 grupos cisteína SH y 2 enlaces disulfuro. La modificación 5 química de los grupos SH tales como la ruptura de los enlaces disulfuro puede provocar la desactivación de la enzima. Fue posible mostrar que mediante la adición de 2-mercaptoetanol, se reduce la actividad de la aminoaciclasa, mientras que después de la remoción de 2-mercaptoetanol por diálisis o
10 filtración en gel, la actividad enzimática original puede ser casi totalmente restaurada (W. Kordel y F. Schneider, Biochem. Byophys. Acta 445, 1976, 446-457). Para la cisteina y algunos derivados, fue posible para ciertas formas de preparación y aplicaciones específicas
15 demostrar una actividad antibacteriana, antiviral o antifungal hasta cierto punto. Así, por ejemplo, fue posible mostrar que la adición de cisteina es adecuada hasta cierto punto como protección contra la descomposición de los alimentos (US4937085A) . 20 Con la ayuda de procesos de manipulación genética, es posible sintetizar proteínas recombinantes tales como insulina o sus precursores, y también derivados de insulina que tienen composiciones de aminoácidos diferentes de la secuencia de gen derivada (por ejemplo humana) , en
25 microorganismos modificados genéticamente tales como la
* bacteria Escherichia coli. La síntesis recombinante en microorganismos se efectúa con la ayuda de vectores de expresión. Estos vectores de expresión consisten de un plásmido vector que debe contener una secuencia de control para la replicación del plásmido así como un gen de selección (gen de resistencia a los antibióticos, marcador metabólico, ínter alia) en donde la región codificadora del gen para la proteína de interés (por ejemplo insulina) fue insertada bajo el control de un promotor que es activo en el microorganismo seleccionado (para E. coli, por ejemplo, el promotor lac) . Un proceso para la producción de proteínas recombinantes (por ejemplo, insulina; derivados de insulina, inter alia) con la cooperación de microorganismos genéticamente modificados consiste de una serie de pasos de proceso que se intercalan entre ellos y deben ser coordinados entre ellos. Así, por ejemplo, un proceso para la producción de insulina humana en E. coli puede ser construido a partir de las siguientes etapas de proceso. Fermentación de los microorganismos - separación celular - desorganización celular - aislamiento y almacenamiento intermedio de la proteína de fusión con redoblado de cisteína en la estructura espacial nativa con revelación de los puentes disulfuro con separación subsecuente de proteínas foráneas que no contienen material de valor - disociación
ítsk .? ¡k*á..Í ?iá.i.i.í ., ÁS?U.» enzimática en la arginilinsulina - purificación básica de la solución acuosa de proteína - lera, purificación cromatográfica - disociación enzimática en insulina humana - 2*. Purificación cromatográfica - alta purificación a través de HPLC - recristalización - secado. El gran número de medidas individuales llevadas a cabo en general provoca pérdidas considerables en cuanto al rendimiento total puesto que en cada etapa pérdidas provocadas por el rendimiento específico de la etapa de procesos seleccionada son inevitables. Mediante la optimización de las etapas intermedias, se puede mejorar el rendimiento total. Existe un interés considerable en procesos de este tipo con el objeto de lograr una mejor utilización económica de los recursos empleados y una disminución de la contaminación ambiental. Por ejemplo, el documento EP 0906918 describe un proceso mejorado para la producción de un precursor de insulina o derivado de insulina que tienen puentes de cístina correctamente enlazados en presencia de císteina o hidrocloruro de cisteína y un auxiliar caotrópico. Los derivados de insulina son derivados de insulinas que ocurren naturalmente, específicamente insulina humana o insulinas animales. Estos derivados de insulina difieren de la insulina que ocurre naturalmente, por otra parte idéntica, por la ausencia y/o el reemplazo de por lo menos un radical
ocurre en la insulina que ocurre naturalmente en cuest n por otro residuo aminoácido genéticamente codificable y/o la adición de por lo menos un residuo aminoácido genéticamente codificable. Durante el almacenamiento de las proteínas, ocurre habitualmente una disminución de las concentraciones efectivas . El almacenamiento de productos de producción entre las etapas individuales del proceso puede ser necesario por varias razones. Por consiguiente puede ocurrir, por ejemplo, que la capacidad de procesamiento de una etapa de procesamiento industrial adicional subsecuente no sea adecuada para aceptar la cantidad total de producto de la etapa de procesamiento previa. El tiempo requerido para almacenamiento intermedio puede ser de duración diferente. Debido a la capacidad, la necesidad de coordinas unidades industriales, la entrega requerida de más agentes químicos o dispositivos o por otras razones, el almacenamiento intermedio necesario puede durar varias semanas. Una forma efectiva de incrementar el rendimiento se abre cuando las pérdidas de proteína activa que ocurren durante el almacenamiento intermedio inevitable de productos provenientes de etapas de procesamiento individuales antes de su procesamiento posterior pueden ser mantenidas dentro de
t iLa. uáArik» 1*1. ilifc, ' " "g a "' ,.-> -!...... ^-.» .i K límites que son lo más estrechos posibles. Lo que no se ha descrito hasta ahora es el uso de cisteína o derivados para el control de pérdidas de rendimiento de proteína activa durante el almacenamiento intermedio de productos de producción de composición diferente y forma de estado diferente de las etapas individuales del procesamiento de procesos de producción industrial e incluyen componentes biológicos, por ejemplo, con participación de catalizadores de enzima o bien microorganismos genéticamente modificados. Tales procesos se emplean, por ejemplo, en la preparación de la insulina. Según la etapa del proceso, los productos de producción a almacenar de forma intermedia pueden consistir de varias cantidades de macromoléculas complejas de una naturaleza biológica (proteínas, ADN, grasas) , microorganismos, sustancias de amortiguación y materiales iniciales, ínter alia. El proceso de producción, en general, tiene el propósito de preparar una sustancia que es lo más uniforme posible, en el caso de la producción de insulina. Si productos de producción deben ser almacenados de manera intermedia, en el caso de la preparación de una proteína, como por ejemplo insulina, ocurre una pérdida de concentración efectiva de esta proteína. El almacenamiento de una proteína debe entenderse
-»k*i.~ ^-J-'-ifllÍ! >-,-J---~*L-|t-| f-w », ?? i -rt, ,t? i ,.n ^*¿ 'A* ?n?^^s&,.Jr.. .. .„. f ? .„ ^..jjjJLt significando cualquier almacenamiento de la proteína, independientemente de la cantidad volumétrica en la cual la proteína está presente en el período durante el cual se efectúa el almacenamiento, o independientemente de las condiciones de temperatura en las cuales se efectúa dicho almacenamiento. El almacenamiento de proteinas se efectúa normalmente en soluciones acuosas. Además de constituyentes de medio nutriente para el cultivo de microorganismos en forma definida o bien como medio completo que contiene, particularmente fuentes de carbono o fuentes de nitrógeno, aminoácidos y sales inorgánicas y elementos menores, también componentes de amortiguación de diferentes tipos de amortiguadores químicos, así como macromoléculas de origen biológico tales como ADN o grasas, una solución acuosa de una proteina puede contener además compuestos orgánicos o inorgánicos como por ejemplo dodecilsulfato de Na o bien acetato de K y también proporciones de solventes de prioridad diferente, como por ejemplo metanol o éter de petróleo. La presente invención se refiere a un proceso para el almacenamiento de una proteína en un solvente acuoso, que comprende el hecho de retardar la disminución temporal de la concentración efectiva de la proteína por adición de cisteina al solvente acuoso. El proceso es adecuado para estabilizar [laguna] haciendo más
lenta la disminución temporal en la concentración efectiva de una proteína durante su almacenamiento en soluciones acuosas. El proceso puede emplearse, por ejemplo, en la producción de proteínas por microorganismos. Ejemplos de microorganismos apropiados son inter alia, especialmente bacterias, en este caso particularmente Escherichia coli, levaduras como por ejeuplo, especialmente, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, así como células de insecto. En la modalidad preferida, estos microorganismos pueden ser transformados utilizando constructo de vector de expresión para expresión inducida o constitutiva de dicha proteína. Los microorganismos son cultivados y desorganizados después de la síntesis de la proteína. Métodos adecuados de desorganización son especialmente todos los procesos adecuados para la liberación de la proteina a partir de la bacteria. Los procesos de desorganización que son aplicables son, por ejemplo, ultrasonido, métodos químicos empleando acetato de K, dodecilsulfato de Na, o bien lisozima, calentamiento de los microorganismos o bien prensado French. La desorganización de los microorganismos puede ser omita si la proteína a preparar es secretada directamente en el medio. En principio, el proceso puede aplicarse también a proteínas extrudidas . Las mezclas de proteínas complejas que resultan cuando los microorganismos son desorganizados o proteinas extrudidas
directamente en el medio se encuentran habitualmente en forma de soluciones acuosas. Las proteínas pueden estar disueltas ahí o presentes en forma suspendida. Estas soluciones de proteína se almacenan de preferencia a una temperatura comprendida entre 0o y 50° C o bien entre 5o C y 30° C o bien a una temperatura de 5o C. Para retardar la desactivación, se agrega cisteína a esta mezcla de proteínas. La concentración de cisteína en la mezcla de proteínas puede encontrarse entre 100 y 500 mM o entre 150 y 220 mM. Se agrega de preferencia 170 mM. De esta forma, proteínas en soluciones de moléculas complejas pueden almacenarse durante hasta varias semanas solamente con una pequeña disminución de la concentración efectiva de proteínas. El proceso puede aplicarse a la síntesis de proteínas heterólogas, particularmente en microorganismos, después de su desorganización con purificación subsecuente y renaturalización posible, de preferencia para la preparación de insulina y su precursor. Proteínas utilizadas para almacenamiento en un proceso de la presente invenció son de preferencia insulina o derivados de insulina. La presente invención se refiere además a un proceso para la preparación de una proteína heteróloga, que comprende la expresión de la proteína heteóloga o su precursor en un microorganismo transformado, dicha proteína heteróloga es después almacenada a través de un proceso de conformidad con
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la presente invención. Esta proteína heteróloga o un precursor de la misma es opcionalmente posteriormente renaturalizada, purificada de secuencias líderes o bien procesada de otra forma y finalmente preparada para obtener el producto deseado después de purificación y aislamiento. Proteínas heterólogas adecuadas son de preferencia insulina o derivados de insulina y precursores de insulina. Ejemplos: Durante la implementación de los procesos para la preparación de insulina, se encontró que mediante la adición de cisteína a la proteína de fusión, el producto permanece estable durante el almacenamiento durante meses. En comparación, el producto no tratado pierde una cierta parte de su actividad de manera irreversible después de solamente unos dias. Las moléculas precursoras de insulina humana y de un derivado de insulina se utilizan en los siguientes ejemplos. La estructura y secuencia de aminoácidos se divulgan en EP 906918 a través de protocolos de secuencias. El precursor de la insulina humana tiene la secuencia de insulina humana que ocurre naturalmente. El precursor del derivado de insulina contiene una glicina en lugar de una arginina en la posición 21 de la cadena A y 2 moléculas de arginina en las posiciones 31 y 32 en el extremo de terminal C de la cadena B. Proteínas de fusión de las insulinas pueden ser preparadas
mediante la fermentación de células de E. coli genéticamente modificadas de conformidad con EP 0489 780 y EP 0 903 918. Una suspensión de proteína se obtiene aquí la cual contiene aproximadamente de 20 a 25% de materia seca y de 40 a 50% de insulina doblable. Para la estabilización buscada de la proteina a través de cisteína, se introducen 75 kg de hidrocloruro de cisteína x H20 en aproximadamente 2500 kg de esta suspensión de proteína (que corresponde a un lote de fermentación) en el transcurso de 20 minutos con agitación vigorosa. El pH cae de 7.0 a 205 en el transcurso de esta operación. La suspensión se vuelve muy pastosa en el rango de pH alrededor de 5 para volverse fácilmente agitable otra vez a un pH de aproximadamente 4. En estas condiciones experimentales, una concentración de hidrocloruro de cisteína de 170 mM es establecida en la suspensión de proteína. La suspensión de proteína es subsecuentemente agitada durante 60 minutos después de lo cual puede permanecer sin agitación adicional durante el tratamiento. Ejemplo 1: Para la confirmación experimental de la acción de conservación de cisteína, se efectuaron los siguientes experimentos de laboratorio: Proteína de fusión de insulina humana y proteina de fusión del derivado de insulina preparadas de conformidad con el
Í ?x documento EP 906 918 fueron almacenadas con o sin cisteína a una temperatura de 5o C y a temperatura ambiente durante hasta 2 veces. Durante el experimento, alícuotas fueron removidas de los lotes. La proteína de fusión fue convertida en la forma prepro de insulina humana o en la forma prepro del derivado de insulina mediante doblado reductor (EP 906 918) . La cantidad de cisteína que se requiere para el doblado fue agregada a los lotes que fueron almacenados sin monohidrato de hidrocloruro de cisteína aproximadamente 1 hora antes del inicio del doblado. En los demás lotes, que contenían la cisteína en forma del conservador, esto ya no era necesario. La reacción para proporcionar la forma prepro de insulina humana o la forma prepro del derivado de insulina fue determinada a través de HPLC. Análisis HPLC: 0.5 g de proteina se disuelve en 40 ml de una solución de hidrocloruro de guanidina 6 M, 50 mM tris, pH 8.5 [laguna] mM etilendiamintetraacetato (EDTA) , 2-mercaptoetanol al 1% y 10 mM de ditiotreitol a una temperatura de 95° C durante 2 minutos y después se centrifuga a 14,000 g durante 20 minutos. Se aplica 0.02 ml del sobrenadante claro a una columna de cromatografía de líquido de alta presión. Columna: ® Nucleogel RP 300 - 5/46 (Macherey & Nagel, Aachen, Alemania)
Gradiente: amortiguador A: ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA) amortiguador B: TFA al 0.09% en acetonitrilo Temperatura: 55° C Tiempo total de experimento: 40 minutos. El gradiente es definido a través de la siguiente cantidad de amortiguador B después de los tiempos de experimento correspondientes: 10 minutos 25%, 12 minutos 60%, 13 minutos 90%, 15 minutos 100%. Flujo: 1 ml/min Detección 215 nm Resultados de los experimentos Tabla 1: Almacenamiento de proteína de fusión de insulina humana a una temperatura de 5o C, sustancia valiosa (mg/1) después de doblado (la sustancia valiosa se refiere a la insulina humana doblada) 1er. 1 2 4 8 día semana semanas semanas semanas Con cisteína 850 831 867 845 825 Sin cisteína 879 827 790 712 625 Tabla 2: Almacenamiento de proteína de fusión de insulina humana a temperatura ambiente, sustancia valiosa (mg/1) después de doblado ler. 1 2 4 8 día semana semanas semanas semanas
Con cisteína 792 817 800 785 790 Sin cisteína 812 654 312 %* %* * Aplicación imposible debido a procesos de putrefacción severos Tabla 3: Almacenamiento de proteína de fusión del derivado de insulina a 5o C, sustancia valiosa (mg/1) después de doblado (la sustancia valiosa se refiere a derivado de insulina doblado) ler. 1 2 4 8 día semana semanas semanas semanas
Con cisteína 590 553 540 573 552 Sin cisteína 612 580 549 518 404 Tabla 4: Almacenamiento de proteína de fusión del derivado de insulina a temperatura ambiente, sustancia valiosa (mg/1) después de doblado ler. 1 2 4 8 día semana semanas semanas semanas Con cisteína 643 667 680 649 653 Sin cisteína 597 547 420 271 %* * Aplicación imposible debido a procesos de putrefacción severos Por medio de la adición de cisteína o hidrocloruro de cisteína, tiempos de almacenamiento de hasta 2 meses son posibles sin una pérdida significativa de la actividad.