JP2927927B2 - 分泌蛋白質のリフォールディング法 - Google Patents
分泌蛋白質のリフォールディング法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換えDNA技術により分泌生産される異種
蛋白質の生産系における、目的とする正しい構造を有す
る蛋白質を得るためのリフォールディングによる製法に
関するものである。
蛋白質の生産系における、目的とする正しい構造を有す
る蛋白質を得るためのリフォールディングによる製法に
関するものである。
今日、組換えDNA技術により微生物を宿主として異種
遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物を生産するこ
とが可能となった。
遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物を生産するこ
とが可能となった。
組換えによる蛋白質の生産法は、菌体内に蓄積させる
方法または培養液上清中に分泌させる方法の二つに大別
される。前者においては、異種遺伝子産物量の増加にと
もないそれらはインクルージョンボディと言われる封入
体の形で菌体内に蓄積する（参考文献１）。後者では、
菌体内で合成された蛋白質は菌体膜を通過し培養液中に
分泌され蓄積される。従って物質生産の観点からは、生
産された蛋白質の精製時における経済性から分泌系が有
利である。しかしながら両者とも、特に前者において、
蛋白合成時あるいは蛋白質合成後における目的蛋白の正
しい立体構造の構築がなされないことによる、蛋白質の
不活性化が大きな問題である（参考文献２）。この不活
性化の原因として最高も一般的で最大のものとして認め
られていることは、蛋白分子内でシステイン残基間にお
ける正しいＳ−Ｓ架橋（ジスルフィド結合）が形成され
ないために、アミノ酸配列は正常であるものの、立体構
造が望ましくない蛋白が生産されることである（参考文
献３）。
方法または培養液上清中に分泌させる方法の二つに大別
される。前者においては、異種遺伝子産物量の増加にと
もないそれらはインクルージョンボディと言われる封入
体の形で菌体内に蓄積する（参考文献１）。後者では、
菌体内で合成された蛋白質は菌体膜を通過し培養液中に
分泌され蓄積される。従って物質生産の観点からは、生
産された蛋白質の精製時における経済性から分泌系が有
利である。しかしながら両者とも、特に前者において、
蛋白合成時あるいは蛋白質合成後における目的蛋白の正
しい立体構造の構築がなされないことによる、蛋白質の
不活性化が大きな問題である（参考文献２）。この不活
性化の原因として最高も一般的で最大のものとして認め
られていることは、蛋白分子内でシステイン残基間にお
ける正しいＳ−Ｓ架橋（ジスルフィド結合）が形成され
ないために、アミノ酸配列は正常であるものの、立体構
造が望ましくない蛋白が生産されることである（参考文
献３）。
従来、このような不活性蛋白は精製時に不純物として
廃棄されるか、、もしくは煩雑で効率の悪い方法による
Ｓ−Ｓ結合の再構成処理、いわゆるリフォールディング
によって活性型に変換されていた。
廃棄されるか、、もしくは煩雑で効率の悪い方法による
Ｓ−Ｓ結合の再構成処理、いわゆるリフォールディング
によって活性型に変換されていた。
これまで行われていたリフォールディング方法を簡単
に述べると、まず不活性化した目的蛋白を精製もしくは
部分精製する。この操作は、異種遺伝子産物の菌体内生
産系では菌体の破砕処理ならびにインクルージョンボデ
ィーの可溶化を必要とするため、分泌生産系に比べてよ
り煩雑である。次に、変性剤および還元剤により蛋白質
分子内の誤ったＳ−Ｓ結合の開裂を行い、還元剤、酸化
剤および変成剤を組合せて添加し最適条件下にて正常な
蛋白質の生成に向けてＳ−Ｓ結合の再構成を行う。さら
に変性剤、還元剤および酸化剤を除去するためのカラム
クロマト等の処理がなされる（参考文献４）。
に述べると、まず不活性化した目的蛋白を精製もしくは
部分精製する。この操作は、異種遺伝子産物の菌体内生
産系では菌体の破砕処理ならびにインクルージョンボデ
ィーの可溶化を必要とするため、分泌生産系に比べてよ
り煩雑である。次に、変性剤および還元剤により蛋白質
分子内の誤ったＳ−Ｓ結合の開裂を行い、還元剤、酸化
剤および変成剤を組合せて添加し最適条件下にて正常な
蛋白質の生成に向けてＳ−Ｓ結合の再構成を行う。さら
に変性剤、還元剤および酸化剤を除去するためのカラム
クロマト等の処理がなされる（参考文献４）。
具体例を述べると、Anfinsenによる精製されたウシの
リボヌクレアーゼを用いたリフォールディング実験に代
表されるように、間違ったＳ−Ｓ結合をもつ精製した蛋
白質溶液にチオール化合物を添加することにより、正し
い製造を有する蛋白質が得られる。すなわちこれは、蛋
白質のＳ−Ｓ結合がチオール化合物により還元され、次
に空気酸化によりＳ−Ｓ結合の再構成が行われ、自由エ
ネルギー減少の法則に従って間違った構造が正しい安定
な構造にもどったと考えられる（参考文献６）。しかし
ながら、リフォールディングに要する時間が非常に長く
かかること、また精製蛋白質に対して処理を行うため処
理後に再度精製のための操作が必要であること等の理由
により、遺伝子組換えによる蛋白質の実際的な生産への
応用は難しいものであった。
リボヌクレアーゼを用いたリフォールディング実験に代
表されるように、間違ったＳ−Ｓ結合をもつ精製した蛋
白質溶液にチオール化合物を添加することにより、正し
い製造を有する蛋白質が得られる。すなわちこれは、蛋
白質のＳ−Ｓ結合がチオール化合物により還元され、次
に空気酸化によりＳ−Ｓ結合の再構成が行われ、自由エ
ネルギー減少の法則に従って間違った構造が正しい安定
な構造にもどったと考えられる（参考文献６）。しかし
ながら、リフォールディングに要する時間が非常に長く
かかること、また精製蛋白質に対して処理を行うため処
理後に再度精製のための操作が必要であること等の理由
により、遺伝子組換えによる蛋白質の実際的な生産への
応用は難しいものであった。
このように、従来の蛋白質のリフォールディングには
数段階にわたる煩雑な操作が必要とされ、そのために操
作途中における蛋白質の損失も多く、またリフォールデ
ィングの効率も条件により変動し、目的とする活性型蛋
白の収率はさほど高いとはいえない状況であった（参考
文献５）。
数段階にわたる煩雑な操作が必要とされ、そのために操
作途中における蛋白質の損失も多く、またリフォールデ
ィングの効率も条件により変動し、目的とする活性型蛋
白の収率はさほど高いとはいえない状況であった（参考
文献５）。
本発明は組換えDNA技術により分泌生産される異種蛋
白質における、目的とする正しい構造を有する蛋白質を
得るための極めて簡単なリフォールディング法を提供す
ることを目的とする。
白質における、目的とする正しい構造を有する蛋白質を
得るための極めて簡単なリフォールディング法を提供す
ることを目的とする。
以上のような点に鑑み本発明者らは検討を重ねた結
果、驚くべきことに異種蛋白質の分泌生産系においては
分泌されたタンパク質の精製もしくは部分精製をするこ
となしに、培養液もしくは培養液上清中のタンパク質を
直接還元、酸化することにより再架橋させ得ることを見
出し本発明に到達した。
果、驚くべきことに異種蛋白質の分泌生産系においては
分泌されたタンパク質の精製もしくは部分精製をするこ
となしに、培養液もしくは培養液上清中のタンパク質を
直接還元、酸化することにより再架橋させ得ることを見
出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は組換えDNA技術により分泌生産さ
れた異種蛋白質のＳ−Ｓ結合の誤った架橋を正しいＳ−
Ｓ結合に再架橋させる蛋白質のリフォールディング法に
おいて、該蛋白質を含む培養液もしくは培養液上清中
に、還元剤を添加し、誤った架橋を開裂させ、しかる後
に酸化させる一連の処理により正しいＳ−Ｓ結合に再架
橋させることを特徴とするリフォールディング法であ
る。
れた異種蛋白質のＳ−Ｓ結合の誤った架橋を正しいＳ−
Ｓ結合に再架橋させる蛋白質のリフォールディング法に
おいて、該蛋白質を含む培養液もしくは培養液上清中
に、還元剤を添加し、誤った架橋を開裂させ、しかる後
に酸化させる一連の処理により正しいＳ−Ｓ結合に再架
橋させることを特徴とするリフォールディング法であ
る。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の対象とする蛋白質は組換えDNA技術により分
泌生産された異種蛋白質である。このような蛋白質とし
ては、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、
インターフェロン、ヒルジン等がある。これらの中でも
ヒルジンのような比較的低分子量の蛋白質が好ましい。
泌生産された異種蛋白質である。このような蛋白質とし
ては、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、
インターフェロン、ヒルジン等がある。これらの中でも
ヒルジンのような比較的低分子量の蛋白質が好ましい。
本発明の使用する還元剤としては、たとえばメルカプ
トエタノール、ジチオスライトール、グルタチオン、シ
ステイン、チオグリコール酸、メルカプトエタノールア
ミン、ジチオエリスリトールが挙げられる。還元剤の使
用量はとくに制限はないが、通常１〜100mMである。還
元の条件も特に制限はないが、10〜50℃好ましくは20〜
40℃で数分ら１時間である。
トエタノール、ジチオスライトール、グルタチオン、シ
ステイン、チオグリコール酸、メルカプトエタノールア
ミン、ジチオエリスリトールが挙げられる。還元剤の使
用量はとくに制限はないが、通常１〜100mMである。還
元の条件も特に制限はないが、10〜50℃好ましくは20〜
40℃で数分ら１時間である。
還元剤の添加は培養上清を回収し、その回収した上清
へ添加してもよい。また、通気を停止した状態の培養中
の培養液へ直接行っても差し支えない。本発明における
酸化は、酸化型グルタチオン等の酸化剤を使用してもよ
いが、好ましくは培養上清または培養液に通気すること
により行われる。通気の条件は特に制限はないが、通常
は溶存酸素濃度が10％以上の条件にて10〜50℃好ましく
は20〜40℃で数分から１時間である。組換えDNA技術に
よる物質生産では、DNA配列に従って新しく合成された
ポリペプチド鎖が、正確に折りたたまれて天然型と同じ
機能を持つ三次構造をとることが必要である。そして、
ポリペプチド鎖が折りたたまれて三次構造を形づくるに
あたってアミノ酸配列によって規定される情報は蛋白質
内でのアミノ酸どうしの相互作用によって最終的に熱力
学的に安定な構造をとるための情報である。天然の蛋白
質内で熱力学的に安定な構造をとるためには、ファンデ
ルワールス力、ねじれ力、静電力、水素結合、疎水性結
合、そしてジスルフィド結合が関与し、これらのエネル
ギーの総和が最小になるようにα−ヘリックス、β−シ
ート、ターンなどの二次構造が三次元的に折りたたま
れ、最も安定な構造をもつ。そのためには分子内あるい
は分子間相互作用のうち唯一共有結合であるジスルフィ
ド結合すなわちＳ−Ｓ結合が重要であることは明らかで
ある。
へ添加してもよい。また、通気を停止した状態の培養中
の培養液へ直接行っても差し支えない。本発明における
酸化は、酸化型グルタチオン等の酸化剤を使用してもよ
いが、好ましくは培養上清または培養液に通気すること
により行われる。通気の条件は特に制限はないが、通常
は溶存酸素濃度が10％以上の条件にて10〜50℃好ましく
は20〜40℃で数分から１時間である。組換えDNA技術に
よる物質生産では、DNA配列に従って新しく合成された
ポリペプチド鎖が、正確に折りたたまれて天然型と同じ
機能を持つ三次構造をとることが必要である。そして、
ポリペプチド鎖が折りたたまれて三次構造を形づくるに
あたってアミノ酸配列によって規定される情報は蛋白質
内でのアミノ酸どうしの相互作用によって最終的に熱力
学的に安定な構造をとるための情報である。天然の蛋白
質内で熱力学的に安定な構造をとるためには、ファンデ
ルワールス力、ねじれ力、静電力、水素結合、疎水性結
合、そしてジスルフィド結合が関与し、これらのエネル
ギーの総和が最小になるようにα−ヘリックス、β−シ
ート、ターンなどの二次構造が三次元的に折りたたま
れ、最も安定な構造をもつ。そのためには分子内あるい
は分子間相互作用のうち唯一共有結合であるジスルフィ
ド結合すなわちＳ−Ｓ結合が重要であることは明らかで
ある。
遺伝子組換え操作による微生物に異種遺伝子由来の蛋
白質を生産させる場合、分泌生産系を利用することは、
目的産物の精製過程における処理操作および経済性から
有利であることは明らかである。しかしながら分泌生産
系を用いた異種蛋白の生産過程で発明者らは、高通気条
件下で菌体の蛋白質の合成および分泌量が増加すると、
アミノ酸配列やアミノ酸組成が活性を有する天然蛋白と
同様であるにもかかわらず活性を持たず、またHPLC分析
において活性型と異なる分離溶出のパターンを示す蛋白
質が多量に培養液中に蓄積することを発見した。さらに
本発明者らは、この活性を持たない蛋白質を分取し、チ
オール化合物を添加した後空気酸化を行い得られる蛋白
質について活性およびHPLC溶出パターンを調べた。その
結果、このものの活性回復が認められ、HPLC分離溶出パ
ターンも天然の活性型蛋白と同様となることを見いだし
た。これらの発見は、異種遺伝子産物の分泌生産時に、
正しい立体構造を有する蛋白質と同時に、一次構造は正
しいがＳ−Ｓ結合のかけ違いにより活性を持たない蛋白
質が生じ、さらにこれらの不活性型蛋白はチオール化合
物の添加および再酸化により容易に活性型へリフォール
ディングされることを示すものである。
白質を生産させる場合、分泌生産系を利用することは、
目的産物の精製過程における処理操作および経済性から
有利であることは明らかである。しかしながら分泌生産
系を用いた異種蛋白の生産過程で発明者らは、高通気条
件下で菌体の蛋白質の合成および分泌量が増加すると、
アミノ酸配列やアミノ酸組成が活性を有する天然蛋白と
同様であるにもかかわらず活性を持たず、またHPLC分析
において活性型と異なる分離溶出のパターンを示す蛋白
質が多量に培養液中に蓄積することを発見した。さらに
本発明者らは、この活性を持たない蛋白質を分取し、チ
オール化合物を添加した後空気酸化を行い得られる蛋白
質について活性およびHPLC溶出パターンを調べた。その
結果、このものの活性回復が認められ、HPLC分離溶出パ
ターンも天然の活性型蛋白と同様となることを見いだし
た。これらの発見は、異種遺伝子産物の分泌生産時に、
正しい立体構造を有する蛋白質と同時に、一次構造は正
しいがＳ−Ｓ結合のかけ違いにより活性を持たない蛋白
質が生じ、さらにこれらの不活性型蛋白はチオール化合
物の添加および再酸化により容易に活性型へリフォール
ディングされることを示すものである。
そこで本発明者らは、チオール化合物による蛋白質の
リフォールディング作用を、分泌生産系において生じる
Ｓ−Ｓ結合のかけ違いによる不活性型となった蛋白質の
リフォールディングに応用すべく、異種遺伝子産物の分
泌生産菌の培養中の培養液、あるいは培養上清中に直接
チオール化合物を添加するというこれまでにない蛋白質
のリフォールディング法の検討を行った。
リフォールディング作用を、分泌生産系において生じる
Ｓ−Ｓ結合のかけ違いによる不活性型となった蛋白質の
リフォールディングに応用すべく、異種遺伝子産物の分
泌生産菌の培養中の培養液、あるいは培養上清中に直接
チオール化合物を添加するというこれまでにない蛋白質
のリフォールディング法の検討を行った。
その結果、培養液あるいは培養上清への通気を実質上
停止し、チオール化合物が直ちに空気酸化を受けないよ
うな条件下にてチオール化合物を直接溶媒液あるいは培
養上清に添加し、蛋白質の誤ったＳ−Ｓ結合の開裂のた
めしばらくの間撹拌した後、通気を再開し空気酸化によ
りリフォールディングを行う一連の操作により、Ｓ−Ｓ
結合の再構成が行われ目的とする正しい立体構造を有す
る蛋白質を大量に得ることに成功した。本発明における
リフォールディング法は、従来行われていたリフォール
ディング法に比べ格段に簡単かつ効果的であり、そのた
め経済的でもある。
停止し、チオール化合物が直ちに空気酸化を受けないよ
うな条件下にてチオール化合物を直接溶媒液あるいは培
養上清に添加し、蛋白質の誤ったＳ−Ｓ結合の開裂のた
めしばらくの間撹拌した後、通気を再開し空気酸化によ
りリフォールディングを行う一連の操作により、Ｓ−Ｓ
結合の再構成が行われ目的とする正しい立体構造を有す
る蛋白質を大量に得ることに成功した。本発明における
リフォールディング法は、従来行われていたリフォール
ディング法に比べ格段に簡単かつ効果的であり、そのた
め経済的でもある。
また、分泌生産された蛋白質を対象としているため分
泌生産のための宿主菌株は、一般に利用されている大腸
菌、枯草菌、酵母を問わない。
泌生産のための宿主菌株は、一般に利用されている大腸
菌、枯草菌、酵母を問わない。
本発明者らは、すでにトロンビンの阻害剤であるヒル
ジン分泌プラスミドを構築し、このプラスミドにより形
質転換された枯草菌菌株を造成している（FERM P−1002
8）。本菌株にて分泌生産されるヒルジンは、分子内に
３組のＳ−Ｓ結合を有するものであるが、高通気条件下
の高率発現、分泌においては誤った架橋による不活性型
のヒルジンが分泌蓄積することが認められた。しかしこ
のような培養条件下においても、本発明のリフォールデ
ィング法を適用することにより目的とする活性型ヒルジ
ンの生産量を飛躍的に増大させることに成功した。また
増大した量は、本発明の処理以前に存在する不活性型の
ものと同量であり、本発明の再架橋法が定量的に行われ
ることが見いだされた。このことは本発明の再架橋法に
より不活性型のものが、ほぼ100％の転換率で活性型に
変換されることを示すものである。
ジン分泌プラスミドを構築し、このプラスミドにより形
質転換された枯草菌菌株を造成している（FERM P−1002
8）。本菌株にて分泌生産されるヒルジンは、分子内に
３組のＳ−Ｓ結合を有するものであるが、高通気条件下
の高率発現、分泌においては誤った架橋による不活性型
のヒルジンが分泌蓄積することが認められた。しかしこ
のような培養条件下においても、本発明のリフォールデ
ィング法を適用することにより目的とする活性型ヒルジ
ンの生産量を飛躍的に増大させることに成功した。また
増大した量は、本発明の処理以前に存在する不活性型の
ものと同量であり、本発明の再架橋法が定量的に行われ
ることが見いだされた。このことは本発明の再架橋法に
より不活性型のものが、ほぼ100％の転換率で活性型に
変換されることを示すものである。
以下本発明を具体例で説明するが、本発明はこの例に
より何ら限定されるものではない。
より何ら限定されるものではない。
実施例１ （培養上清への還元剤添加によりリフォールディング） ヒルジン分泌枯草菌株（FERM P−10028）を、２倍濃
度のLB培地（0.2％グルコース）を用い30℃で一夜振盪
培養し、OD660が５〜６の培養液を得る。この培養液か
ら高速遠心分離により菌体を除き、培養上清を回収す
る。本培養上清を均等に分注し、各々にメルカプトエタ
ノールを終濃度にして０〜50mMになるように直接添加
し、軽く撹拌した後室温にて10分間静置した。次に30℃
にて30分間撹拌し、空気酸化を行う。一連の処理を行っ
た後、トロンビン阻害活性としてヒルジン量を定量した
（参考文献７）。結果を第１表に示す。なお、コントロ
ールには無処理の培養上清を用いた。また、第１表に示
されたメルカプトエタノールの効果は、ジチオスライト
ール、グルタチオン等のチオール化合物にて濃度により
効果の差があるものの、まったく代替えすることが可能
であった。
度のLB培地（0.2％グルコース）を用い30℃で一夜振盪
培養し、OD660が５〜６の培養液を得る。この培養液か
ら高速遠心分離により菌体を除き、培養上清を回収す
る。本培養上清を均等に分注し、各々にメルカプトエタ
ノールを終濃度にして０〜50mMになるように直接添加
し、軽く撹拌した後室温にて10分間静置した。次に30℃
にて30分間撹拌し、空気酸化を行う。一連の処理を行っ
た後、トロンビン阻害活性としてヒルジン量を定量した
（参考文献７）。結果を第１表に示す。なお、コントロ
ールには無処理の培養上清を用いた。また、第１表に示
されたメルカプトエタノールの効果は、ジチオスライト
ール、グルタチオン等のチオール化合物にて濃度により
効果の差があるものの、まったく代替えすることが可能
であった。
実施例２ （培養液中への還元剤の直接添加によるリフォールディ
ング） 溶存酸素センサーを装備した30容ジャーファーメン
ター（丸菱バイオエンジ（株）社勢MSJ−U3W型）2LB培
地（0.4％グルコース）を20仕込み、前培養したヒル
ジン分泌枯草菌株（EFRM P−10028）を植菌し、空気量
４/min、回転数250rpmにて30℃で培養を行う。17〜18
時間培養後OD660が７〜８の時点で、通気を停止する。
しばらく後溶存酸素濃度が０になったところで直ちに終
濃度1.5mMまでメルカプトエタノールをジャー中に直接
添加する。５分間撹拌を行った後通気を再開し、培養を
継続する。さらに培養開始後22時間において同様の操作
を行った。第２表に各々の時間における、メルカプトエ
タノール添加直前と添加後のトロンビン阻害活性により
測定した培養上清中のヒルジン量を測定した結果を示し
た。
ング） 溶存酸素センサーを装備した30容ジャーファーメン
ター（丸菱バイオエンジ（株）社勢MSJ−U3W型）2LB培
地（0.4％グルコース）を20仕込み、前培養したヒル
ジン分泌枯草菌株（EFRM P−10028）を植菌し、空気量
４/min、回転数250rpmにて30℃で培養を行う。17〜18
時間培養後OD660が７〜８の時点で、通気を停止する。
しばらく後溶存酸素濃度が０になったところで直ちに終
濃度1.5mMまでメルカプトエタノールをジャー中に直接
添加する。５分間撹拌を行った後通気を再開し、培養を
継続する。さらに培養開始後22時間において同様の操作
を行った。第２表に各々の時間における、メルカプトエ
タノール添加直前と添加後のトロンビン阻害活性により
測定した培養上清中のヒルジン量を測定した結果を示し
た。
実施例３ （リフォールディング処理を行った培養液のHPLC検定） 実施例２で得られるメルカプトエタノール処理を行う
直前および処理直後の培養上清をそれぞれ塩酸を加える
ことによりpHを３に合わせ、生じる沈殿物を高速遠心分
離により除いた後、50mM酢酸アンモニウム−ギ酸緩衝液
（pH3.0）により平衡化したイオン交換樹脂SP−TRISACR
YL M（IBF社製）カラムに添加する。次に同緩衝液にて
カラムを洗浄した後、50mM酢酸アンモニウム−蟻酸緩衝
液（pH4.2）により溶出されるヒルジン活性画分を集め
部分精製を行う。このようにして得られたヒルジン画分
をHPLCに供試しその溶出パターンを調べた。用いたカラ
ムは、μBondasphere C−８（Waters社製）で、0.1％ト
リフルオロ酢酸と100％アセトニトリルの二液グラジエ
ント系により溶出を行った。メルカプトエタノール処理
を行う直前および処理直後の培養液中に含まれるヒルジ
ンの溶出パターンの比較を第１図に示す。ここで、双方
における29分のリテンションタイムのピークが活性型ヒ
ルジンのピークである。処理前に認められる40〜50分の
ピークは、それらを分取しアミノ酸組成分析およびＮ末
端アミノ酸配列の解析を行ったところ完全に活性型のヒ
ルジンと一致することからＳ−Ｓ結合のかけ違いにより
生じたヒルジンの不活性型分子種であることが判明し
た。さらにこれらの処理直前に見られた40〜50分のリテ
ンションタイムのピークは、処理後には完全に消失して
いることが認められた。さらに、処理後におけるヒルジ
ンの活性の増加分は、消失したピークの量と一致するも
のであった。
直前および処理直後の培養上清をそれぞれ塩酸を加える
ことによりpHを３に合わせ、生じる沈殿物を高速遠心分
離により除いた後、50mM酢酸アンモニウム−ギ酸緩衝液
（pH3.0）により平衡化したイオン交換樹脂SP−TRISACR
YL M（IBF社製）カラムに添加する。次に同緩衝液にて
カラムを洗浄した後、50mM酢酸アンモニウム−蟻酸緩衝
液（pH4.2）により溶出されるヒルジン活性画分を集め
部分精製を行う。このようにして得られたヒルジン画分
をHPLCに供試しその溶出パターンを調べた。用いたカラ
ムは、μBondasphere C−８（Waters社製）で、0.1％ト
リフルオロ酢酸と100％アセトニトリルの二液グラジエ
ント系により溶出を行った。メルカプトエタノール処理
を行う直前および処理直後の培養液中に含まれるヒルジ
ンの溶出パターンの比較を第１図に示す。ここで、双方
における29分のリテンションタイムのピークが活性型ヒ
ルジンのピークである。処理前に認められる40〜50分の
ピークは、それらを分取しアミノ酸組成分析およびＮ末
端アミノ酸配列の解析を行ったところ完全に活性型のヒ
ルジンと一致することからＳ−Ｓ結合のかけ違いにより
生じたヒルジンの不活性型分子種であることが判明し
た。さらにこれらの処理直前に見られた40〜50分のリテ
ンションタイムのピークは、処理後には完全に消失して
いることが認められた。さらに、処理後におけるヒルジ
ンの活性の増加分は、消失したピークの量と一致するも
のであった。
（参考文献一覧） 1.Mitraki,A Et al.（1989）Bio/Technology.,7,690 2.Tsuji,T.et al.（1987）Biochem.,2,3129 3.安藤鋭郎ら（1973）タンパク質化学3 433 共立出版 4.池原森男ら（1988）タンパク質工学実験マニュアル
83 講談社サイエンティフィク 5.特開昭62−501262 6.Anfinsen,C.B（1964）in‘New Perspectives in Biol
ogy'Sela,M.,ed.,42,American Elsevier 7.Ogasawara,N.（1985）Gene,40,145
83 講談社サイエンティフィク 5.特開昭62−501262 6.Anfinsen,C.B（1964）in‘New Perspectives in Biol
ogy'Sela,M.,ed.,42,American Elsevier 7.Ogasawara,N.（1985）Gene,40,145
第１図は、培養液中へのメルカプトエタノールの直接添
加によるリフォールディング処理を行った場合の、処理
直前と処理直後の培養上清のイオン交換カラムクロマト
グラフィーによる一段精製試料のHPLCの溶出パターンを
示したものである。図中の数字は、各ピークのリテンシ
ョンタイムを表わしている。記号Ａで示した不活性なピ
ークは、リフォールディング処理後には消失しており記
号Ｂで示される活性型のピークに変換されている。
加によるリフォールディング処理を行った場合の、処理
直前と処理直後の培養上清のイオン交換カラムクロマト
グラフィーによる一段精製試料のHPLCの溶出パターンを
示したものである。図中の数字は、各ピークのリテンシ
ョンタイムを表わしている。記号Ａで示した不活性なピ
ークは、リフォールディング処理後には消失しており記
号Ｂで示される活性型のピークに変換されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】組換えDNA技術により分泌生産された異種
蛋白質のＳ−Ｓ結合の誤った架橋を、該蛋白質を含む培
養液もしくは培養液上清中に、還元剤を添加し、誤った
架橋を開裂させしかる後に酸化させる一連の処理により
正しいＳ−Ｓ結合に再架橋させる蛋白質のリフォールデ
ィング法。 - 【請求項２】還元剤がメルカプトエタノール、ジチオス
ライトール、グルタチオン、システイン、チオグリコー
ル酸、メルカプトエタノールアミン、ジチオエリスリト
ールより任意に選ばれた一つもしくは任意に選んだ組合
せで用いられることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載する蛋白質のリフォールディング法。 - 【請求項３】還元剤の添加が、通気を停止した状態の培
養中の培養液へ直接行われることを特徴とする特許請求
の範囲第１項または第２項に記載の蛋白質のリフォール
ディング法。 - 【請求項４】還元剤により開裂されたＳ−Ｓ結合の酸化
および還元剤の酸化が、培養槽への通気により行われる
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項の
いずれか１項に記載の蛋白質のリフォールディング法。 - 【請求項５】分泌生産された異種蛋白質が、トロンビン
の阻害剤であるヒルジンであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の蛋
白質のリフォールディング法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26844690A JP2927927B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | 分泌蛋白質のリフォールディング法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26844690A JP2927927B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | 分泌蛋白質のリフォールディング法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04144695A JPH04144695A (ja) | 1992-05-19 |
| JP2927927B2 true JP2927927B2 (ja) | 1999-07-28 |
Family
ID=17458624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26844690A Expired - Fee Related JP2927927B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | 分泌蛋白質のリフォールディング法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2927927B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69432231T2 (de) * | 1993-09-22 | 2004-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide mit antithrombotischer aktivität und verfahren zu ihrer herstellung |
| WO2001046453A1 (en) | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Novo Nordisk A/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
-
1990
- 1990-10-08 JP JP26844690A patent/JP2927927B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04144695A (ja) | 1992-05-19 |
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