JP4555525B2 - 水性溶媒中での貯蔵中の複合混合物のタンパク質の安定化法 - Google Patents
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Description
本発明は、水性溶媒中でのタンパク質の貯蔵方法に関する。
タンパク質のSH基またはその他の酸化−感受性構造の化学的状態は、しばしば、タンパク質の、同一性、活性または有効濃度に影響を及ぼす。同一性は、タンパク質の各々の折りたたみ(folding)を意味する。活性は、酵素活性を意味するものとして理解されるべきである。タンパク質の有効濃度は、生物学的生体内機能に関して正しく折りたたまれている溶液中のそのタンパク質の比率であるべきである。
【0002】
タンパク質の構造−改変性酸化を、例えば2−メルカプトエタノールまたはシステインのようなチオール試薬の使用によって抑制することができることは、文献から公知である。
【0003】
例えば、D−アミノ酸オキシダーゼ(DAO)は、チオールによって安定化させることができる。黄色タンパクDAOは、D−アミノ酸の相当するα−ケト酸およびアンモニウムへの立体特異的脱アミノ化を触媒する(P. Golini外、Enzyme and Microbial Technology、17、1995、324-329)。しかしながら、例えばシステインのようなチオールの添加はまた、タンパク質の活性を低下させることもできる。この効果もまた、システイン基の存在によって説明することができる。これの例は、アミノアシラーゼである。アミノアシラーゼは、サブユニット当たり1つのZn2+原子を有する二量体酵素である。この酵素の各サブユニットは、2つのシステインSH基および2つのジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合の切断のようなSH基の化学的改変は、酵素の失活を起こすことができる。2−メルカプトエタノールの添加によってアミノアシラーゼの活性は、低下し、一方、透析またはゲル濾過による2−メルカプトエタノールの除去後に、元の酵素活性がほとんど完全に復活し得ることを示すことは、可能であった(W. Koerdel および F.Schneider、Biochem.Biophys.Acta 445、1976、446-457)。
【0004】
システインおよびいくつかの誘導体については、ある程度まで抗菌、抗ウイルスまたは抗真菌活性を証明することは、特定の製造形および特定の適用については可能であった。こうして例えば、システインの添加がある程度まで食物の腐敗に対する保護として適当であることを示すことが可能であった(US 4937085 A)。
【0005】
遺伝子工学法の助けにより、細菌性大腸菌のような遺伝子改変微生物において、誘導された遺伝子配列(例えばヒト)とは異なるアミノ酸組成を有するインスリンまたはその前駆体、およびまたインスリン誘導体、のような組換えタンパク質を合成することが可能である。
【0006】
微生物中での組換え体合成は、発現ベクターの助けによって行われる。これらの発現ベクターは、ベクタープラスミドより成り、このベクタープラスミドは、このプラスミドの複製のための制御配列、ならびに、興味のあるタンパク質(例えばインスリン)に対する遺伝子のコード領域が選択された微生物中で活性であるプロモーター(大腸菌については例えばラクトースプロモーター)の制御下でその中に挿入された選択遺伝子(なかんずく抗生物質耐性遺伝子、代謝マーカー)を包含しなくてはならない。
【0007】
遺伝子改変微生物の協力による組換えタンパク質(例えばインスリン;なかんずくインスリン誘導体)の生成法は、相互に整合し、相互に統合されなくてはならない一連の工程より成る。
こうして例えば、大腸菌におけるヒトインスリンの生成法は、以下の工程から構成されることができる。
【0008】
微生物の発酵−細胞分離−細胞破砕(disruption)−ジスルフィド架橋の暴露による天然の空間構造へのシステイン再生とそれに続く有用な物質を含有しない異種タンパクの分離による融合タンパク質の単離および中間貯蔵−アルギニルインスリンへの酵素切断−タンパク質水溶液の塩基精製−第1クロマトグラフィー精製−ヒトインスリンへの酵素切断−第2クロマトグラフィー精製−HPLCによる高度精製−再結晶−乾燥。
【0009】
各工程においてその選択された工程に特有の収率ロスは不可避であるので、実施される多数の個々の処置は一般に、全収率にかなりの損失をもたらす。
中間工程の最適化によって、全収率を改善することができる。使用する物資のより良好な経済的利用および環境汚染の減少を可能にするために、このような方法にはかなりの利益がある。
【0010】
例えばEP 0906918には、システインまたはシステイン塩酸塩およびカオトロピック助剤の存在における、正しく連結されたシステイン架橋を有するインスリンの前駆体またはインスリン誘導体の生成のための改良法が記載されている。
【0011】
インスリン誘導体は、天然に生じるインスリン、すなわちヒトインスリンまたは動物インスリンの誘導体である。これらのインスリン誘導体は、別の遺伝子的にコード化できるアミノ酸残基および/または少なくとも1個の遺伝子的にコード化できるアミノ酸残基の付加が関係する、天然に生じるインスリンにおいて生じる少なくとも1個のアミノ酸残基の不在および/または置き換えによって、他の点では同一の天然に生じるインスリンとは異なる。
タンパク質の貯蔵の間に、有効濃度の低下が通常起こる。
【0012】
個々の工程間の生産物の貯蔵は、種々の理由で必要であり得る。すなわちそれは、例えば、次に続くさらに別の工業的加工工程の加工能力が、先の工程の生成物の全量を受容するためには適当でない場合であろう。
中間貯蔵のために必要とされる時間は、異なる長さであることができる。収容能力、同等の工業単位に対する必要性、要求されるより多くの化学物質の送達または設備のためまたはその他の理由のために、必要な中間貯蔵は、数週間にわたることができる。
【0013】
収率を増大させる有効な方法は、それらのさらに別の加工前の個々の工程からの生成物の不可避の中間貯蔵中に生じる活性タンパク質の損失を、できるだけ少ない限度内に保つことができるときである。
生物学的成分を包含する、例えば酵素触媒または遺伝子改変された微生物の関与による、工業的生成法の個々の工程からの異なる組成および状態形の生産物の中間貯蔵中の活性タンパク質の収率損失の制御のためにシステインまたは誘導体を使用することは、これまで記載されていない。このような方法は、例えばインスリンの製造において使用される。
【0014】
工程に依って、中間で貯蔵されるべき生産物は、異なる量の生物学的性質の複合高分子(タンパク質、DNA、脂肪)、微生物、緩衝物質およびなかんずく出発物質、より成ることができる。
生成法は一般に、できるだけ均一である物質の製造を、インスリン生成の場合にはインスリンを、目指す。もし、例えばインスリンのようなタンパク質の製造の場合において生産物が中間で貯蔵されなくてはならないならば、このタンパク質の有効濃度の損失は、規則的に起こる。
【0015】
タンパク質の貯蔵は、そのタンパク質が存在する容量およびその貯蔵が実施される期間、またはそれが行われる温度条件にかかわらず、そのタンパク質のいずれかの貯蔵を意味するものとして理解されるべきである。タンパク質の貯蔵は、通常、水溶液で行われる。
【0016】
定義された形でのまたは、特に炭素源または窒素源、アミノ酸および無機塩および微量元素、また異なる化学緩衝型の緩衝剤成分、ならびにDNAまたは脂肪のような生物由来の高分子を含有する完全培地としての、微生物の培養のための栄養培地の成分に加えて、タンパク質の水溶液は、付加的に、例えばドデシル硫酸ナトリウムまたは酢酸カリウムのような有機または無機化合物およびまたメタノールまたは石油エーテルのような優先性の異なる比率の溶媒を含有することができる。
【0017】
本発明は、水性溶媒中でのタンパク質の貯蔵方法に関し、この方法は、水性溶媒にシステインを添加することによってタンパク質の有効濃度の時間的低下を遅延させることより成る。
【0018】
本方法は、水溶液でのその貯蔵の間、タンパク質の有効濃度の時間的低下の遅延の安定化のために適している。本方法は、例えば、微生物によるタンパク質の生成において使用することができる。適当な微生物の例は、なかんずく、特に細菌、この場合には特に大腸菌、特にサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)のような酵母、そしてまた昆虫細胞である。好ましい態様においては、これらの微生物は、上記タンパク質の誘発または構成性発現のための発現ベクターコンストラクトを使用して形質転換させることができる。この微生物を培養し、タンパク質の合成後に破砕する。適当な破砕法は、主に、細菌からのタンパク質の解放のために適当であるすべての方法である。適用できる破砕法は、例えば超音波、酢酸カリウム、ドデシル硫酸ナトリウムまたはリゾチームを使用する化学的方法、微生物の加熱またはフレンチプレスである。微生物の破砕は、もし製造されるべきタンパク質が培地中に直接分泌されるならば省略することができる。原則として、この方法はまた、抽出されたタンパク質にも適用することができる。
【0019】
微生物が破砕されるかまたはタンパク質を直接培地中に抽出するとき得られる複合タンパク混合物は、通常、水溶液である。このタンパク質は、それに溶解させることができるかまたは懸濁した形で存在することができる。これらのタンパク質溶液は、好ましくは0℃〜50℃または5℃〜30℃でまたは5℃で貯蔵される。失活を遅延させるために、システインをこのタンパク質混合物に加える。タンパク質混合物中のシステインの濃度は、100〜500mMまたは150〜220mMであることができる。170mMが好ましく加えられる。こうして、複合分子溶液中のタンパク質は、有効タンパク質濃度をやや低下させるだけで数週間まで貯蔵することができる。本方法は、特に微生物における、異種タンパクの合成に、好ましくはインスリンおよびその前駆体の製造のためのその破砕とその後の精製および可能な再生の後で、適用することができる。
【0020】
本発明の方法における貯蔵のために使用するタンパク質は、好ましくはインスリンまたはインスリン誘導体である。
本発明はさらに、異種タンパクの製造法に関し、この方法は、形質転換微生物における異種タンパクまたはその前駆体の発現より成り、この異種タンパクを次に本発明に従う方法によって貯蔵する。この異種タンパクまたはその前駆体を場合によりその後、再生させ、リーダー配列を使用して精製するかまたは他に加工し、そして最後に精製および単離後に所望の生成物を得るように製造してもよい。適当な異種タンパクは、好ましくはインスリンまたはインスリン誘導体およびインスリンの前駆体である。
【0021】
【実施例】
インスリンの製造方法の実施中に、融合タンパク質へのシステインの添加によって生成物は、数ヶ月間貯蔵したとき安定なままであることがわかった。これに比較して、未処置の生成物は、ちょうど数日後に不可逆的にその活性の一部を失う。
【0022】
ヒトインスリンの前駆体分子およびインスリン誘導体の前駆体分子を下記の実施例において使用する。その構造およびアミノ酸配列は、EP 906918に配列プロトコルによって開示されている。ヒトインスリンの前駆体は、天然に生じるヒトインスリンの配列を有している。インスリン誘導体の前駆体は、A鎖の21位のアルギニンの代わりにグリシンをそしてB鎖のC−末端の31および32位に2つのアルギニン分子を包含する。
【0023】
インスリンの融合タンパク質は、EP 0489780およびEP 0906918に従って遺伝子改変した大腸菌の発酵によって製造することができる。タンパク質懸濁液がここで得られ、これは、ほぼ20〜25%の乾燥物質および40〜50%の折りたたみ可能なインスリンを含有する。
【0024】
探求されているシステインによるタンパク質の安定化のために、75kgのシステイン塩酸塩×H2Oを、激しく攪拌しながら20分のうちに約2500kgのこのタンパク質懸濁液(1つの発酵バッチに相当する)中に導入する。この間にpHは、7.0から2.5に落ちる。この懸濁液は、5の周辺のpH領域で非常にペースト状になって、pH4の周辺から再び容易に攪拌することができるようになる。これらの実験条件下で、システイン塩酸塩濃度170mMがタンパク質懸濁液において確立される。このタンパク質懸濁液をその後60分間攪拌し、その後それを処理までそれ以上攪拌しないままにしておくことができる。
【0025】
実施例1
システインの保存作用を実験的に確証するために、下記の研究室実験を実施した:
EP 906918に従って製造したヒトインスリンの融合タンパク質およびインスリン誘導体の融合タンパク質を、5℃および室温でシステインとともにおよびシステイン無しで2ヶ月までの間貯蔵した。この実験中に、バッチからアリコートを取り除いた。この融合タンパク質を還元的折りたたみによってヒトインスリンのプレプロ形またはインスリン誘導体のプレプロ形に変換した(EP 906918)。折りたたみのために必要な量のシステインを、折りたたみの開始の約1時間前にシステイン塩酸塩一水和物を使用しないで貯蔵したバッチに加えた。保存料の形でシステインを含有するその他のバッチにおいては、これは、もはや必要ではなかった。
ヒトインスリンのプレプロ形またはインスリン誘導体のプレプロ形を与えるための反応は、HPLCによって決定された。
【0026】
HPLC分析:
0.5gのタンパク質を95℃で2分間、6Mグアニジン塩酸塩、50mMトリス(tris)、pH8.5、mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1%2−メルカプトエタノールおよび10mMジチオトレイトールの溶液40mlに溶解させた後、14,000gで20分間遠心分離した。0.02mlの透明な上澄みを高速液体クロマトグラフィーカラムにかけた。
カラム:(登録商標)ヌクレオゲル(Nucleogel)RP300−5/46(Macherey & Nagel、Aachen、ドイツ)
勾配:緩衝剤A:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)
緩衝剤B:アセトニトリル中の0.09%TFA
温度:55℃
全運転時間:40分
【0027】
勾配は、以下の相当する運転時間後の緩衝剤Bの量によって定義した:10分25%、12分60%、13分90%、15分100%。
流量:1ml/分
検出:215nm
【0028】
実験の結果
【表1】
【0029】
【表2】
【0030】
【表3】
【0031】
【表4】
【0032】
システインまたはシステイン塩酸塩の添加によって、2ヶ月までの貯蔵時間が、活性の有意の損失無しに可能になった。
Claims (17)
- タンパク質の組換え合成時の水性溶媒中でのタンパク質の貯蔵方法であって、タンパク質の有効濃度の時間的低下を、水性溶媒にシステインを添加することによって遅延させ、タンパク質水溶液中のシステインの濃度が150mM〜220mMの範囲であり、タンパク質がインスリン、インスリン誘導体および/またはその前駆体である、貯蔵方法。
- タンパク質が微生物中で製造される異種タンパクである、請求項1に記載の方法。
- 使用する微生物が細菌である、請求項2に記載の方法。
- 使用する細菌が大腸菌である、請求項3に記載の方法。
- 使用する微生物が酵母である、請求項2に記載の方法。
- 使用する酵母がサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項5に記載の方法。
- 使用する酵母がピチア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項5に記載の方法。
- 使用する微生物が昆虫細胞である、請求項2に記載の方法。
- 微生物が発現ベクターコンストラクトによってタンパク質を製造する、請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質が溶解した形で存在する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質が懸濁液で存在する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質水溶液中のシステインの濃度が170mMである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質の貯蔵が0℃〜50℃で行われる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質の貯蔵が5℃〜30℃で行われる、請求項13に記載の方法。
- タンパク質の貯蔵が5℃で行われる、請求項14に記載の方法。
- 異種タンパクの製造方法であって、形質転換微生物における異種タンパクまたはその前駆体の発現、適宜の、微生物の破砕(disruption)または異種タンパクまたはその前駆体の培地からの単離、それに続く請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法による貯蔵、および、適宜の、それに続く異種タンパクまたはその前駆体の再生、適宜の、リーダー配列および異種タンパクの前駆体においてのみ生じるその他の配列の除去、および最後に異種タンパクの精製および単離を含む製造方法。
- 異種タンパクが動物インスリンまたはヒトインスリンである、請求項16に記載の方法。
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