BRPI0012150B1 - processo para estabilizar proteínas em misturas complexas na armazenagem em solventes aquosos, bem como de preparação de uma proteína heteróloga - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "processo para estabilizar proteínas em misturas complexas na armazenagem em solventes aquosos". a presente invenção refere-se a um processo para o armazenamento de proteínas em um solvente aquoso. a adição de cisteína retarda a redução da concentração eficaz da proteína. o processo presta-se para a aplicação na produção de proteínas em microorganismos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA ESTABILIZAR PROTEÍNAS EM MISTURAS COMPLEXAS NA ARMAZENAGEM EM SOLVENTES AQUOSOS, BEM COMO DE PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA". A presente invenção refere-se a um processo para a armazenagem de proteínas em um solvente aquoso. O estado químico dos grupos SH de proteínas ou de outras estruturas sensíveis à oxidação tem frequentemente influência sobre a identidade, atividade ou concentração eficiente de proteínas. Identidade significa a respectiva dobra de uma proteína. Por atividade deve ser compreendida uma atividade da enzima. A concentração eficaz de uma proteína deve ser a fração da proteína em uma solução, que é corretamente dobrada com respeito à função in vivo biológica.

Da literatura sabe-se que oxidações que modificam a estrutura de proteínas impedidas pela utilização de reagentes tiol tal como por exemplo, 2-mercaptoetanol ou cisteína.

Por exemplo, a D-aminoácido oxidase (DAO) pode ser estabilizada por tióis. A flavoproteína DAO catalisa a desaminação estereoespecífi-ca de D-aminoácidos nos alfa-cetoácidos correspondentes e amônio (P. Go-lini e colaboradores. Enzyme and Microbial Technology, 17, 1995, 324 -329). Todavia, a adição de tióis tais como por exemplo, cisteína, também pode reduzir a atividade de proteínas. Também este efeito pode ser esclarecido com a presença de radicais cisteína. Um exemplo para isso é a amino-acilase. A aminoacilase é uma enzima dimérica com um átomo Zn2+ por su-bunidade. Cada subunidade da enzima contém dois grupos SH de cisteína e duas ligações dissulfeto. A modificação química dos grupos SH tal como a quebra das ligações dissulfeto podem conduzir a uma inativação da enzima. Pôde demonstrar-se, que pela adição de 2-mercaptoetanol a atividade da aminoacilase é reduzida, ao contrário do que após a remoção do 2-mercaptoetanol por diálise ou filtração em gel a atividade enzimática original pode ser quase completamente restaurada (W. Kõrdel e F. Schneider, Bio-chem. Biophys. Acta 445, 1976, 446-457).

Para cisteína e alguns derivados pode detectar-se para determinadas formas de preparo e aplicações especiais em determinados ambientes atividade antibacteriana, antiviral ou antifúngica. Assim, por exemplo, pôde ser mostrado, que a adição de cisteína se presta em determinados ambientes à proteção antes da deterioração de alimentos (US 4937085 A).

Com auxílio de processos tecnológicos genéticos as proteínas recombinantes tal como insulina ou seus precursores bem como derivados de insulina, que apresentam composições de aminoácidos desviadas da sequência de gene derivada (por exemplo, humano), são sintetizadas em mi-crooganismos geneticamente alterados como a bactéria Escherichia coli. A síntese recombinante em microorganismos é efetuada com auxílio de vetores de expressão. Estes vetores de expressão constituem-se de um plasmídio de vetor, que deve conter uma sequência de controle para a replicação do plasmídio bem como um gene de seleção (gene resistente ao antibiótico, marcador de metabolismo e similar), no qual a região codifi-cadora do gene para a proteína de interesse (por exemplo, insulina) foi aplicada sob controle de um promotor ativo no microorganismo escolhido (para E. coli, por exemplo, promotor lac).

Um processo para a obtenção de proteínas recombinantes (por exemplo, insulina; derivados de insulina e outros) com o co-efeito de microo-ganismos alterados geneticamente compõe-se de uma série de etapas de processo, dependentes um dos outros e que devem ser coordenados.

Assim, por exemplo, um processo para a obtenção de insulina humana em E. coli tem que ser constituído das seguintes etapas do processo.

Fermentação dos microorganismos, separação desintegração eisolamento de células e armazenamento intermediário da proteína de fusão com cisteína; recuperação da estrutura espacial nativa sob manifestação das pontes de dissulfeto com subsequente separação de proteínas estranhas não contendo material; Dissociação enzimática na arginilinsulina; Purificação básica da solução de proteína aquosa; 1a purificação cromatográfica — Dissociação enzimática na insulina humana; 2a purificação cromatográfica; Alta purificação por meio de HPLC; Recristalização; Secagem.

Inúmeras das medidas individuais efetuadas conduz em toda a regra a consideráveis perdas no rendimento total, pois em cada etapa são inevitáveis prejuízos, condicionados pelo rendimento específico da etapa do processo desejada.

Pela otimização de etapas intermediárias o rendimento total pode ser aperfeiçoado. Nestes processos há um interesse considerável, para que seja possibilitada um melhor aproveitamento econômico dos recursos aplicados, bem como uma redução das cargas ambientais.

Por exemplo, na EP 0906918 é descrito um processo aperfeiçoado para a obtenção de um precursor de insulina ou de derivados de insulina com pontes de cistina ligadas corretamente na presença de cisteína ou clori-drato de cisteína e de uma substância auxiliar caotrópica.

Derivados de insulina são derivados de insulinas de origem natural, a saber, insulina humana ou insulinas animais. Estes derivados de insulina diferenciam-se da insulina de origem natural pela falta e/ou troca de pelo menos um dos radicais aminoácidos que aparecem na respectiva insulina de origem natural por um outro radical aminoácido codificável geneticamente e/ou pela adição de pelo menos um radical aminoácido codificável geneticamente.

No armazenamento de proteínas ocorre usualmente a redução das concentrações eficientes. O armazenamento de resultados de produção entre etapas de processo individuais pode ser necessária por diferentes motivos. Assim, por exemplo, pode acontecer, que a capacidade de processamento de uma etapa técnica de processamento posterior ligada em série não seja suficiente, para absorver toda a quantidade de produto da etapa do processo precedente. A necessidade de tempo para um armazenamento intermediário pode ser diferentemente longo. Dependendo da capacidade, necessidade de coordenação dos agregados técnicos, fornecimento posterior de produtos químicos ou dispositivos ou de outros motivos, o armazenamento intermediário necessário pode estender-se durante várias semanas.

Um caminho eficaz para o aumento do rendimento abre-se, quando se consegue manter perdas de proteína ativa que aparecem inevitavelmente no armazenamento intermediária de produtos de algumas etapas do processo antes de sua ulterior elaboração em limites os mais estreitos possíveis.

Até agora não foi descrito o emprego de cisteína ou de derivados para a repressão de perdas de rendimento de proteína eficaz na armazenagem intermediária de resultados de produção de diferente composição e estado de etapas individuais do processo dos processos de produção industriais sob inclusão de componentes biológicos, por exemplo, com participação de catalisadores enzimáticos ou microorganismos modificados geneticamente. Tais processos são aplicados, por exemplo, na preparação de insulina.

Os resultados de produção a serem intermediariamente armazenados podem constituir-se dependendo da etapa do processo de muitas, complexas, macromoléculas compostas de natureza biológica (proteínas, DNA, graxas), microorganismos, substâncias tampão e produtos de partida e outros. O processo de produção aponta em todas as regras a uma preparação a mais uniforme possível de uma substância, no caso da produção de insulina, a insulina. Quando resultados de produção tem que ser armazenados intermediariamente, ocorre no caso da preparação da proteína, tal como por exemplo, insulina, regularmente a perdas da concentração eficaz desta proteína.

Por armazenamento de uma proteína deve ser compreendida toda a guarda da proteína, apesar da quantidade de volume, na qual se a-presenta a proteína, da duração de tempo, sobre a qual a guarda é efetuada ou das condições de temperatura, sob as quais ela é efetuada. O armazenamento de proteínas é efetuado normalmente em soluções aquosas.

Uma solução aquosa de uma proteína pode conter além de componentes de meios nutritivos para o cultivo de microorganismos em forma definida ou como meio total, especiaímente com fontes de carbono ou fontes de nitrogênio, aminoácidos e sais inorgânicos e elementos de vestí- gio, também frações tampão de diferentes tipos de tampões químicos, bem como macromoléculas de origem biológica tal como DNA ou graxas, além disso, compostos orgânicos ou inorgânicos tais como por exemplo, dodecil-sulfato de sódio ou acetato de potássio e também frações de solventes de diferente prioridade tal como metanol ou éter de petróleo. A presente invenção refere-se a um processo para o armazenamento de uma proteína em um solvente aquoso, que é caracterizado pelo fato de que a diminuição temporal da concentração eficaz da proteína é protelada pela adição de cisteína no solvente aquoso. O processo presta-se para a estabilização do retardamento da diminuição temporal da concentração eficaz de uma proteína durante seu armazenamento em soluções aquosas. O processo pode ser aplicado, por exemplo, na produção de proteínas por microorganismos. Como microorganismos oferecem-se entre outros principalmente bactérias, neste caso especialmente Escherichia coli, leveduras, tais como principalmente Saccha-romyces cerevisiae ou Pichia pastoris, bem como células de insetos. Estes microorganismos podem ser transformados na forma de execução preferida com construtores de vetores de expressão na expressão induzida ou constitutiva da proteína citada. Os microorganismos são cultivados e após a síntese da proteína são desintegrados. Como método de desintegração que podem ser tomados em consideração principalmente todos os processos, que são adequados para a liberação da proteína a partir das bactérias. Como processos de desintegração aplicáveis por exemplo, ultra-som, métodos químicos com a aplicação de acetato de K, dodecilsulfato de Na ou lisosima, aquecimento dos microorganismos ou a French press. A desintegração dos microorganismos pode não se realizar, quando a proteína a ser preparada é diretamente separada no meio. Em princípio, o processo também é aplicável em proteínas centrifugadas.

As misturas de proteína complexas, que se originam, quando os microorganismos são desintegrados ou centrifugam proteína diretamente no meio, apresentam-se usualmente em solução aquosa. Nesta as proteínas podem ser dissolvidas ou estar presentes em forma suspensa. A retirada destas soluções de proteína é efetuada, de preferência, entre 0°C — 50°C ou entre 5°C - 30°C ou a 5°C. Para retardar a inativação a cisteína é colocada nesta mistura de proteína. A concentração de cisteína na mistura de proteína pode importar entre 100 - 500 mM ou 150 - 220 mM. De preferência, acres-centam-se 170 mM. Proteínas em soluções de moléculas complexas podem ser armazenadas, desta maneira até várias semanas com somente pequena redução da concentração de proteína eficaz. O processo é aplicável para a síntese de proteínas heterólogas, especialmente em microorganismos, após sua desintegração com purificação subsequente e eventual renaturação pre-ferentemente para a preparação de insulina e seus precursores.

Como proteínas para o armazenamento em um processo da invenção, aplicam-se de preferência, insulina ou derivados de insulina. A presente invenção refere-se além disso, a um processo para a preparação de uma proteína heteróloga, compreendendo a expressão da proteína heteróloga ou sua pré-etapa em um microorganismo transformado, cuja proteína heteróloga é armazenada, depois, por meio de um processo de acordo com a presente invenção. Esta proteína heteróloga ou um precursor da mesma é eventualmente, em seguida, renaturada, purificada por sequências de líderes ou processada de outra maneira e finalmente após purificação e isolamento preparada no produto desejado. Como proteínas heterólogas podem ser consideradas de preferência insulina ou derivados de insulina, bem como precursores de insulina.

Exemplos: Durante a implementação dos processos para a preparação de insulina verificou-se, que pela adição de cisteína à proteína de fusão o produto permanece estável ao armazenamento durante meses. Ao contrário, o produto não pré-tratado já perde após poucos dias irreversivelmente uma parte de sua atividade.

Nos exemplos abaixo são utilizadas as moléculas dos precursores da insulina humana bem como de um derivado de insulina. Estrutura e sequência de aminoácidos são publicados na EP 906 918 com protocolos de sequência. O precursor da insulina humana tem a sequência de insulina hu- mana de origem natural. O precursor do derivado de insulina contém na posição 21 da cadeia A uma glicina no lugar de uma arginina e na extremidade C-terminal da cadeia B nas posições 31 e 32 duas moléculas de arginina.

Proteínas de fusão das insulinas podem ser preparadas por fermentação de células de E. coli geneticamente modificadas de acordo com a EP 0 489 780 e EP 0 906 918. Com isso, obtém-se uma suspensão de proteína, que contém cerca de 20 até 25 % de massa seca e 40 até 50 % de insulina dobrável.

Para a estabilização visada da proteína por meio de cisteína introduzem-se em aproximadamente 2500 kg desta suspensão de proteína (correspondendo a uma carga de fermentação) 75 kg de cloridrato de cisteí-na*H20 dentro de 20 minutos sob forte agitação. O valor do pH cai, com isso, de 7,0 para 2,5. A suspensão torna-se muito pastosa na faixa de pH em torno de 5, voltando a ficar novamente bem agitável em pH 4. Sob estas condições de ensaio ajusta-se uma concentração de cloridrato de cisteína de 170 mM na suspensão da proteína. A suspensão de proteína é então agitada durante 60 minutos, depois ela pode ficar em repouso até o recondicio-namento.

Exemplo 1: Para a documentação experimental do efeito conservador de cisteína foram efetuados os seguintes ensaios de laboratório: Proteína de fusão da insulina humana e proteína de fusão do derivado de insulina preparadas de acordo com a EP 906 918 foram armazenadas com e sem cisteína a 5°C e à temperatura ambiente até 2 meses. Dos preparados foram retiradas alíquotas durante o ensaio. A proteína de fusão foi transferida por dobragem redutora para a forma pré-pró da insulina humana ou para a forma pré-pró do derivado de insulina (EP 906 918). Aos preparados, que foram armazenados sem cloridrato de cisteína monohidra-tada, foi acrescentada a quantidade de cisteína necessária para a dobragem cerca de 1 hora antes do início da dobragem. Nos outros preparados, que continham a cisteína na forma do agente de conservação, isto não foi mais necessário. A reação para a forma pré-pró da insulina humana ou forma pré-pró do derivado de insulina foi determinada por meio de HPLC.

Análise HPLC: 0,5 g de proteína são dissolvidos em 40 ml de uma solução de cloridrato de guanidina 6 M, 50 mM de tris, pH 8,5 Mm tetraacetato de etile-nodiamina (EDTA), 1 % de 2-mercaptoetanol, 10 mM de ditiotreitol a 95°C durante 2 minutos e depois a 14 000 g é centrifugada durante 20 minutos. Do sobrenadante límpido aplicam-se 0,02 ml sobre uma coluna de cromato-grafia líquida de alta pressão.

Coluna: ©Nucleogel RP 300 - 5/46 (Macherey & Nagel, Aachen, Alemanha) Gradiente: tampão A: 0,1 % de ácido trifluoracético (TFA) Tampão B: 0,09 % de TFA em acetonitrila Temperatura: 55°C

Tempo de execução total: 40 minutos. O gradiente é caracterizado pela seguinte quantidade de tampão B após os tempos de execução correspondentes: 10 minutos 25 %, 12 minutos 60 %, 13 minutos 90 %, 15 minutos 100 %.

Fluxo: 1 ml/minuto Detecção: 215 mn Resultado dos ensaios Tabela 1: Armazenamento da proteína de fusão da insulina humana a 5°C, material (mq/l) após a dobraqem (material significa insulina humana dobrada) Tabela 2: Armazenamento de proteína de fusão da insulina humana à temperatura ambiente, material (mg/l) após a dobraqem *Não é possível produção devido a fortes processos de decomposição Tabela 3: Armazenamento de proteína de fusão do derivado de insulina a 5°C, material (mq/l) após a dobragem (material significa derivado de insulina dobrado) Tabela 4: Armazenamento de proteína de fusão do derivado de insulina à temperatura ambiente, material (mg/l) após dobragem *Não é possível produção devido a fortes processos de decomposição Pela adição de cisteína ou cloridrato de cisteína são possíveis tempos de armazenagem de até 2 meses sem perda significativa de atividade.

Claims (16)

1. Processo para o armazenamento de uma proteína, em que a redução temporal da concentração eficaz da proteína é retardada, em um solvente aquoso, caracterizado pelo fato de que a cisteína é adicionada no solvente aquoso, sendo que a concentração de cisteína na solução de proteína aquosa está na faixa de 150 a 220 mM e a proteína utilizada é insulina, um derivado de insulina e/ou um precursor da mesma.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína heteróloga preparada em um microorganismo.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o microorganismo utilizado é uma bactéria.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria utilizada é Escherichia coli.

5. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o microorganismo utilizado é uma levedura.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a levedura utilizada é Saccharomyces cerevisiae.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a levedura utilizada é Pichia pastoris.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que o microorganismo prepara a proteína por meio de um construto de vetor de expressão.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína está presente na forma dissolvida.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína está presente em suspensão.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a concentração de cisteína na solução protéica aquosa é 170 M.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o armazenamento da proteína acontece a 0°C a 50°C.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o armazenamento da proteína acontece a 5°C a 30°C.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o armazenamento da proteína acontece a 5°C.

15. Processo para a preparação de uma proteína heteróloga, caracterizado pelo fato de que compreende a expressão da proteína heteróloga ou seu precursor em um microorganismo transformado, eventualmente a desintegração do microorganismo ou isolamento da proteína heteróloga ou seu precursor do meio de cultura, em seguida, armazenamento por meio de um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e, e-ventualmente, a subsequente renaturação da proteína heteróloga ou seu precursor, eventualmente, remoção das sequências líder e das outras sequências que aparecem somente no precursor da proteína heteróloga e, finalmente, a purificação e isolamento da proteína heteróloga.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a proteína heteróloga é uma insulina animal ou insulina humana.