KR100505744B1 - 단백질의 수용성 형태로의 생산을 위한 무세포단백질생산방법 - Google Patents
단백질의 수용성 형태로의 생산을 위한 무세포단백질생산방법Info
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Abstract
본 발명은 인위적으로 조작된 세포추출물을 이용해 구축한 무세포단백질생산 시스템에 의해, 치료용, 연구용 및 산업용 목적의 단백질을 수용성 형태로 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 무세포단백질생산 시스템의 구성성분 중 단백질생산관련 세포내 기구를 포함하는 세포추출물을 제조하는 과정에서, 단백질의 접힘에 관련되는 단백질 인자들이 세포추출물에 함유되도록, 접힘관련 단백질 인자가 다량 함유된 세포추출물을 제조하여, 이를 무세포단백질생산 시스템에 사용함으로써, 목적 단백질을 수용성의 형태로 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 무세포단백질생산 시스템에 있어서 수용성 단백질 생산능이 향상된 무세포단백질생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 단백질의 접힘에 관련되는 단백질 인자(이하, "접힘관련 단백질 인자"로 약칭하기도 함)들의 유전정보를 코딩하고 있는 유전자를, 무세포단백질생산 시스템의 구성성분 중 단백질생산관련 세포내 기구를 포함하는 세포추출물 제조의 재료로 사용될 숙주세포에 도입한 뒤, 접힘관련 단백질 인자를 세포배양 중에 과발현시켜, 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물을 제조하고, 이렇게 제조된 세포추출물을 사용하여, 무세포단백질생산 시스템에 의해 높은 수율로 수용성 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 종래의 세포배양법에 의해 세포내에서 난용성으로 생산되는 단백질을 무세포단백질생산법에 의해 단시간내에 수용성으로 생산할 수 있으며, 또한 종래의 무세포단백질생산법을 이용한 경우에 비하여 저렴하면서도 목적 단백질의 수용성 형태의 분율을 향상시켜, 결과적으로 수용성 단백질 생산에 효율적인 방법을 제공함으로써, 치료용, 연구용 및 산업용 단백질의 수용성 형태로의 생산, 및 이러한 수용성 단백질을 이용한 단백질의 구조분석과 이를 바탕으로 새로운 의약품을 탐색하는 신약개발 관련 연구와 관련 연구도구 개발에 적용할 수 있다.
인간유전체사업(Human genome project)의 결과로부터 인간의 유전체에 대한 많은 정보를 얻을 수 있었다. 아직은 완벽한 염기서열을 확보했다고 할 수는 없지만, 2003년 이내에 염기 만 개당 1 개의 실수(error)를 가지는 양질의 서열 (high quality sequence)을 얻고자 하는 노력이 계속되고 있다. 따라서, 이제는 유전자 및 그것으로부터 발현되는 단백질의 구조와 기능에 대해 연구를 해야하는 포스트제놈(post-genome) 시대에 들어서게 되었다.
이러한 시대적 요구에 부응하기 위하여, 최근에는 유전자 정보를 바탕으로 특정 유전자로부터 발현될 단백질의 구조와 기능을 컴퓨터프로그램을 이용해 예측하려는 생물정보학(Bioinformatics)이 각광을 받고 있다. 유전정보를 컴퓨터를 이용하여 체계적으로 집대성하고, 또한 다양한 분석프로그램을 이용하여 종합적으로 비교분석하는 것이 가능하게 되었다. 이러한 접근은 시간적으로 매우 빠른 예측을 가능하게 하지만, 이를 통해 단백질의 구조나 기능을 완전히 만족스럽게 예측하는 것은 근본적으로 불가능하다.
이와 관련하여, 현재 시점에서 시도되어질 수 있는 가장 확실한 방법은 직접 생산한 단백질을 시료로 하여 구조를 분석하고, 이 구조를 근간으로 하여 기능을 유추한 후, 여러 생물학적 기능분석법으로 각 단백질의 기능을 직접 분석하는 것이다(본 명세서에서는 이렇게 단백질을 직접 발현시키는 방법을 "직접발현법"으로 칭함). 이러한 단백질의 직접발현법에 생물정보학을 결합시키는 방법을 통해 단백질을 분석한다면, 그 효용성이 더욱 높아질 수 있을 것이다. 즉, 생물정보학에서 일차적으로 찾아낸 유용 단백질 유전자들 중에서 가능성이 높은 유전자의 단백질을 직접발현법으로 생산하여 예측된 기능을 검증해 보는 것이다.
그러나, 이러한 세포배양을 통한 직접발현은 여러 가지 문제점을 갖고 있다. 우선, 구조분석에 사용할 단백질은 수용성(soluble form)이어야 한다. 가장 널리 사용되어지는 단백질 직접발현법은 대장균과 같은 미생물을 이용하여 원하는 단백질을 생산하는 것이다. 그러나, 많은 단백질들은 대장균에서 불용성의 형태(insoluble form) 또는 봉입체(inclusion bodies)로 발현된다. 비록 이러한 단백질들을 가용화시키고 수용성의 형태로 재접힘(refolding)하는 방법이 알려져 있기는 하지만, 이 과정은 비효율적일 뿐만 아니라 각 단백질마다 단백질의 특성에 맞는 최적의 방법을 찾아야 하기 때문에, 모든 단백질에 대하여 일반화할 수는 없다.
세포배양법에서 외래 단백질 생산시 불용성화가 발생하는 이유는, 목적 단백질의 생성속도와 접힘속도 사이의 불균형으로 인하여, 목적 단백질의 접힘 중간체의 외부로 노출되어있는 소수성 부위들 간의 상호결합에 의해 침전이 형성되기 때문이다.
단백질의 올바른 3차 구조의 형성을 유도하기 위해서 단백질 생산과 동시에 수용성 형태로 유도하는 시도로서, 세포배양법에서는, 아미노산의 변형 등을 통해 단백질을 가용화하는 단백질 공학적 접근법; 온도, pH 및 첨가물 등의 조절을 통한 발효 공학적 접근법; 용해도가 좋은 단백질을 목적 단백질에 융합시켜 생산하는 방법; DsbA 또는 PPIase 등의 폴데이즈 (foldase)의 동시발현 (co-expression)법 등을 이용해 왔다. 이밖에 널리 사용되는 방법으로는, GroEL/GroES의 조합, DnaK/DnaJ/GrpE의 조합 등의 샤페론(Chaperone) 패밀리를 동시 발현하는 방법 등이 있다. 이들 방법의 적용으로, 경우에 따라서는, 상당히 개선된 예도 보고되고 있으나, 살아있는 세포를 이용함에 따른 근본적인 제약을 피할 수는 없었다. 샤페론은 새로 만들어진 단백질 또는 변성된 단백질의 침전을 막아주는 보조 단백질군으로, GroEL/GroES의 조합, DnaK/DnaJ/GrpE의 조합 등이 포함되며, 각 조합에서 각각의 샤페론은 상호작용을 통해 함께 기능을 수행한다.
따라서, 단백질의 직접발현법과 관련한 상기 문제점을 해결하면서 단시간내에 수용성 단백질을 생산할 수 있는 방법이 필요한 바, 이러한 관점에서 세포를 이용하지 않는 무세포단백질생산법(cell-free protein synthesis)이 하나의 대안으로서 고려될 수 있다.
최근의 생물산업 관련 연구에서 가장 중요한 요소 중의 하나는 속도라고 할 수 있으며, 적어도 24 시간내에 유전자로부터 단백질을 충분히 제조할 수 있는 무세포단백질생산법은 이에 부합하는 기술들 중의 하나이다. 이 기술이 신약개발에 이용되어진다면 현재 구조유전체학을 이용한 신약개발의 율속단계인 단백질 시료의 준비 단계가 획기적으로 단축될 수 있으므로, 신속한 신약 탐색 및 개발에 많은 도움을 줄 수 있다. 무세포단백질생산법은 처음에는 분자생물학의 연구 도구 또는 숙주세포에 대한 독성으로 세포내에서 생산하기 어려운 단백질의 생산에 이용되어 왔다. 그런데, 최근 반응조건의 최적화 및 반응기의 개발 등으로 상업적으로 유용한 단백질의 새로운 생산방법으로 대두되고 있다(Kim, D.M. et al., Eur. J. Biochem. 239:881-886 (1996); Kigawa, T. et al., FEBS Lett. 442:15-19 (1999)).
무세포단백질생산법에서는 단백질 생산에 관여하는 성분 및 인자들을 인위적으로 조절함으로써, 상대적으로 조절이 용이하지 않은 세포배양법에 의한 단백질 생산시 발생하던 생산된 단백질의 난용성화가 상당히 극복되어질 수 있을 것으로 예상된다. 즉, 무세포단백질생산법에서는 목적 단백질을 수용성 형태로 발현시킴으로써 재접힘 과정을 거치지 않고도 수용성 단백질을 얻을 수 있을 것으로 보이며, 본 발명은 그에 근간을 두고 있다.
이와 관련하여, 종래의 무세포단백질생산에서는 반응액내에 산화/환원 분위기 등 인위적 환경요소를 도입함으로써, 세포내의 정해진 환경에 비해 단백질의 가용화를 향상시킬 수는 있으나, 이 방법은 단백질의 발현자체에 영향을 주지 않는 범위내에서만 적용이 가능하다는 제약을 가지고 있다.
종래의 기술 중에는, 무세포단백질생산 시스템(cell-free protein synthesis system)에 별도의 과정을 거쳐 미리 분리했거나 상업적으로 구입한 접힘관련 단백질 인자를 외부로부터 무세포단백질생산 반응액에 첨가해 줌으로써, 목적 단백질의 발현과 동시에, 첨가된 접힘관련 단백질 인자가 생산된 단백질에 작용되도록 하여, 수용성의 단백질의 생산을 증가시키는 방법이 알려져 있다. 또한, 단백질의 생산 후에 분리/정제 단계에서 접힘관련 단백질 인자를 추가로 첨가하여 단백질의 비활성(specific activity)을 높이는 방법이 있는데, 이는 무세포단백질생산법뿐만 아니라 세포배양법 등의 재조합 단백질 생산에 있어 통상의 방법으로 받아들여지고 있다. 그러나, 이들 방법은 모두 접힘관련 단백질 인자들을 분리된 별도의 공정에 의해 생산한 후 분리/정제하여 이용해야하는 번거로운 과정을 필요로 하기 때문에, 시간 및 비용적 측면에서 바람직하지 못하다.
한편, 이런 문제를 개선하기 위해, 무세포단백질생산 시스템의 구축에 필요한 단백질 생산관련 기구를 포함하고 있는 세포추출물의 제조공정 중 세포배양 과정에서 열적자극을 주어, 세포내부에 이미 존재하는 접힘관련 단백질 인자의 유전자 발현을 자극함으로써, 결과적으로 접힘관련 단백질 인자가 정상배양 세포추출물에 비해 더 많이 포함되도록 생산하는 방법이 알려져 있다(일본특허 특개평 7-194374). 그러나, 이 방법은 비용적 측면에서는 유리하지만, 접힘관련 단백질 인자의 발현 유도를 위한 열적 자극으로 인해, 무세포단백질생산에서 매우 중요한 단백질 생산관련 기구들의 불활성화를 초래할 수 있고, 세포 자체에 이미 존재하고 있던 제한된 종류의 접힘관련 인자의 유전자만을 이용할 수 밖에 없기 때문에, 이 방법으로 이용가능한 접힘관련 단백질 인자의 종류는 제한될 수 밖에 없다. 또한, 이 접힘관련 단백질 인자의 발현을 위해 사용되는 발현 시스템(즉, 프로모터)이 세포자체의 것에만 의존해야 하기 때문에, 최근 발전한 분자생물학에서 새로이 개발된 높은 단백질 발현능을 보이는 강력한 프로모터들을 사용할 수 없다. 결과적으로, 접힘관련 단백질 인자의 발현정도가 미약하게 된다는 문제점을 가지고 있다. 더불어, 접힘관련 단백질 인자의 발현 유도를 위한 열적자극을 주는 단계에서 열적자극을 일정한 수준으로 주기가 어렵다는 실험적 단점 때문에, 실제 적용에는 어려움이 있다.
따라서, 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 즉, 무세포단백질생산 시스템의 구성성분 중 단백질생산관련 세포내 기구를 포함하는 세포추출물을 제공하는 미생물내에, 접힘관련 단백질 인자의 유전자를 유전자조작법으로 외부에서 인위적으로 세포내에 도입시켜 형질전환된 세포(본 명세서에서는, "형질전환 세포" 또는 "형질전환체" 등으로 칭하기도 함)를 제작하고, 이러한 형질전환 세포를 배양할 때 접힘관련 단백질 인자의 과발현을 유도하여 접힘관련 단백질 인자가 세포내에 과량 포함되도록 한 후, 이로부터 무세포단백질생산 시스템을 위한 세포추출물을 제조하는 방법과, 이러한 세포추출물을 이용하여 구축한 무세포단백질생산 시스템에 의해 수용성의 단백질을 고생산능으로 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
따라서, 본 발명자들은, 외부에서 접힘관련 인자인 단백질을 무세포단백질생산 시스템에 직접 넣어 주던 종래의 무세포단백질생산법과는 달리, 유전자조작으로 개발된 세포로부터 접힘관련 단백질 인자가 다량 포함된 세포추출물을 용이하게 제조하는 방법을 개발하고, 이 세포추출물을 이용하여 구축된 개선된 무세포단백질생산법을 통하여 수용성의 단백질을 생산하면, 단백질이 생성될 때 세포추출물에 이미 포함되어 있던 접힘관련 단백질 인자가 작동하여, 생산되는 목적 단백질의 수용성 분율을 향상시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 이상의 방법으로 제조된 접힘관련 단백질 인자가 다량 포함된 세포추출물을 이용하는 무세포단백질 발현 키트(kit)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 수용성 단백질의 생산 또는 그것의 생산능이 향상된 무세포단백질생산 방법은,
(A) 무세포단백질생산 시스템용 세포추출물을 제공하는 세포에, 접힘관련 단백질 인자의 유전정보를 갖고 있는 유전자 전달체를 도입하여, 형질전환 세포를 제조하는 단계;
(B) 상기 형질전환 세포에서 단백질 발현유도법에 의해 상기 접힘관련 단백질 인자의 과발현을 유도한 후, 무세포단백질 시스템용 세포추출물을 제조하는 단계; 및
(C) 상기 세포추출물을 포함하는 무세포단백질생산 시스템에서 목적 단백질을 높은 수율의 수용성 형태로 생산하는 단계;
를 포함하는 것으로 구성되어있다.
따라서, 본 발명은 수용성 단백질을 생산하기 위하여 또는 수용성 단백질의 생산량을 증진시키기 위하여, 접힘관련 단백질 인자가 다량 포함된 세포추출물의 제조와 이를 이용한 무세포단백질생산 시스템의 적절한 구축을 주요 구성으로 한다. 이와 같이, 외부유래의 접힘관련 단백질 인자의 유전자를 이용한 형질전환 세포로부터 제조된, 접힘관련 단백질 인자가 다량 함유된 세포추출물을 제조하여, 이를 무세포단백질생산 시스템에 사용하는 방법은, 이제껏 시도된 바 없는 전혀 새로운 기술로서, 특히, 수용성의 단백질의 대량 생산에 매우 적합하다.
상기 무세포단백질생산 시스템에 관한 내용은 앞서의 설명과 같이 이미 공지되어있으며, 대표적으로는 김 등의 논문(Kim, D.M. et al., Eur. J. Biochem. 239:881-886 (1996))에 개시된 것을 들 수 있으며, 이는 참조로서 본 발명에 합체되지만, 본 발명에 사용되는 무세포단백질생산 시스템이 그것으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용한 조건은 본 명세서의 실시예 1에 개시되어있다. 일반적으로 무세포단백질생산에서는 목적단백질을 생산하기 위하여 단백질생산 반응기에 목적단백질의 유전정보를 갖고 있는 DNA(DNA를 사용한 경우는 이 DNA로부터 RNA가 생성될 수 있도록 RNA 중합효소와 RNA의 재료가 될 수 있는 핵산을 RNA를 사용한 경우에 비해 추가로 첨가해 주어야 함) 또는 RNA, 단백질 생산에 필요한 세포성분들을 포함한 세포추출물, 단백질 생산에 필요한 에너지를 제공하는 에너지원, 단백질생산 반응에 필요한 여러 이온을 제공하기 위한 여러 종류의 염을 포함한 완충액 및 기타 반응 첨가물을 넣고 섞은 후, 적절한 온도(보통 25℃ 내지 37℃의 범위에서 행하나 이는 세포추출물이 유래된 세포의 종류에 따라 달라짐)를 유지해 주어 단백질 생산을 유도한다. 단백질 생산 시간은 통상 1 시간이나 그 시간은 실험자의 목적에 따라 늘리는 것이 가능하여 몇 일까지 계속 유지시킬 수도 있다.
상기 세포추출물은 무세포단백질생산 시스템을 구성하는데 필요한 세포내 기구들로서, 단백질 생산의 공장 역할을 하는 라이보좀, 단백질 생산시에 필요한 효소들, 및 단백질로 구성된 전사나 번역에 관련된 여러 인자들(개시인자, 종결인자 등) 등을 포함하고 있다. 일반적으로는, 세포를 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상등액을 의미한다. 이들 세포추출물들은 일반적으로 대장균, 효모, 적혈구, 밀배아, 개구리 알, 사람세포 및 곤충세포 등의 세포로부터 얻어지는데, 이들 세포들을 대량 배양하여 정제 및 파쇄한 후 원심분리 등을 행하여, 무세포단백질생산 시스템에 필요한 성분들을 포함한 세포추출물들만을 얻게 된다. 이들 방법은 이미 공지되어있으므로 이에 대한 더욱 자세한 설명은 생략하며, 하나의 예시적인 방법이 본 명세서의 실시예 1에 개시되어있다.
상기 접힘관련 단백질 인자는 여러 종류가 알려져 있으며, 이러한 예로는, 펩티딜-프로릴 시스-트란스 이성화효소(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase), 단백질 이황화 이성화효소(disulfide isomerase) 등의 효소류와, hsp10, hsp60, hsp70 계열 (classes)의 단백질, 대장균 유래의 GroEL, GroES, DnaK 등을 포함하는 분자 샤페론류(molecular chaperones), 및 폴리펩타이드 쇄 결합 단백질(polypeptide chain binding protein) 등이 포함된다. 그 중 대표적인 것으로 샤페론류를 들 수 있다. 본 발명이 이하의 내용으로 한정되는 것은 아니지만, 샤페론류의 예를 들면, GroES, GroEL, GrpE, DnaK, DnaJ, 및 열-자극 단백질 (heat-shock protein) 등이 있다. 그 중에서도, GroES/GroEL의 조합과 DnaK/DnaJ/GrpE의 조합이 이에 관련된 유전 정보 및 이들의 단백질 재접힘에서의 효과 등이 잘 알려져 있고 또한 효과가 매우 우수하기 때문에 특히 바람직하다. 참고로, GroES, GroEL, DnaK, DnaJ, 및 GrpE 의 아미노산 서열을 도 5 내지 9에 개시한다.
접힘관련 단백질 인자의 유전자는 통상의 유전자 조작법에 의해 세포내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 제한효소(restriction enzyme)와 연결효소(ligase) 등을 사용하여 당해 유전자를 플라스미드에 도입함으로써 발현벡터를 제조한 후, 상기 세포(숙주세포)내에 주입하는 경우를 들 수 있다. 참고로, 이러한 발현벡터의 예들을 본 명세서의 도 10 내지 13에 개시한다.
상기 형질전환 세포의 과발현과 세포추출물의 획득 과정은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자("당업자")가 용이하게 실시할 수 있으므로 이에 대한 자세한 설명은 생략한다.
세포추출물 중의 접힘관련 단백질 인자의 함량은 대략 전체단백질의 1 내지 10% 정도의 양인 것이 바람직하다. 그러나, 목적 단백질의 특성 등 다양한 요소들에 의해 상기 함량 범위는 달라질 수 있다. 실제로 세포추출물을 제조할 때, 접힘관련 단백질 인자의 세포추출물 내의 함량은 다음과 같이 조절 가능하다. 예를 들어, 함량을 높이려면 발현 유도 후의 세포의 배양시간을 증가시킴으로 이룰 수 있고, 함량을 낮추려면 접힘관련 단백질 인자가 포함되어 있지 않은 통상의 세포추출물을 세포추출물에 일부분 혼합해 줌으로써 가능하다.
본 발명에 따라 제조될 수 있는 목적 단백질의 예로는, 알파, 베타, 감마 인터페론(α-, β-, γ-interferon), 리파아제(lipase), 에리뜨로포이에틴(Erythropoietin; EPO) 등을 포함하는 사이토카인류(cytokines), 즉, 인터루킨류(interleukins), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor; G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor; GM-CSF), 종양 증식 인자류(transforming growth factors; TGFs), 혈소판 생성 자극 인자들(thrombopoietin 및 tissue plasminogen activator) 등이 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 특히 종래의 무세포단백질생산 시스템에서는 수용성으로 제조하기 어렵거나, 그것의 생산능이 낮은 수용성 단백질의 생산에 바람직하다. 참고로, 본 발명에서 개시하고 있는 방법으로 준비한 세포추출물을 이용한 무세포단백질생산에서는, 접힘관련 단백질 인자를 발현하기 위해 도입한 플라스미드가 세포추출물 제조 단계에서 제거되기 때문에, 실제 무세포단백질생산 반응에서는 목적한 단백질만 생산되어, 결과적으로 무세포단백질 생산 반응액에 첨가해 준 에너지원 및 아미노산 등이 오직 목적 단백질 생산에만 사용되어진다.
하나의 예로서, 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 이를 이용한 수용성 단백질의 생산에 관한 내용이 실시예 1에 상세히 설명되어 있고, 혼합세포배양법에 의한 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 이를 이용한 수용성 단백질의 생산에 관한 내용이 실시예 2에 상세히 설명되어 있다. 여기서 "혼합세포배양법"이란 두 종류 이상의 세포를 같은 배양기에서 동시에 배양하는 것을 의미한다. 또한, 각기 별도로 준비된 세포추출물들을 혼합한 혼합세포추출물을 이용한 수용성 단백질의 생산에 관한 내용이 실시예 3에 상세히 설명되어 있다. 실시예 1에서 3에서는 모델 단백질로 에리뜨로포이에틴(Erythropoietin; EPO)을 사용하였다. EPO는 폴리펩타이드에 소수성의 아미노산을 많이 포함하고 있어 쉽게 응집(aggregation)되기 때문에, 종래의 세포배양법에서는 수용성으로 얻어지지 않고 통상의 무세포단백질생산 시스템에서도 일반적으로 수용성의 형태로 얻어지기 어렵다.
본 발명은 의약용, 산업용, 및 연구용 단백질의 수용성 형태로의 생산에 응용 가능하다. 또한, 본 발명은 수용성 단백질의 생산 그 자체뿐만 아니라 최근 새롭게 밝혀진 많은 유전자의 기능 규명을 위한 수용성 형태의 단백질 발현용 연구 도구로도 사용 가능하다. 따라서, 본 발명은 또한 수용성 단백질 발현 및 생산 키트(kit)에 관한 것이다. 상기 키트는, 무세포단백질생산 반응을 위한 키트 사용자가, 간단히 반응 성분들을 혼합하고 목적하는 단백질의 유전자만 첨가한 후 항온조에서 반응을 시킴으로써, 목적단백질을 생산할 수 있게 세포추출물 등의 반응 성분을 용기에 담아 포장한 것을 의미한다. 즉, 상기 키트는 무세포단백질생산에 필요한 모든 반응 성분을 포함하고 있다. 본 발명의 당업자라면 본 발명에 따른 무세포단백질생산 방법으로부터 용이하게 제조할 수 있으므로, 이에 대한 자세한 설명은 생략한다. 본 발명의 기술을 이용한 단백질의 발현 키트를 이용하면, 좀더 경제적인 수용성 단백질 시료의 준비가 가능하고, 시간 및 노동을 줄일 수 있으며, 특히, 방대한 양의 유전자를 짧은 시간에 발현할 수 있으므로 다량의 유전자의 기능분석에 매우 바람직하게 사용될 수 있다.
이하 실시예에서는, 수용성으로 생산된 단백질의 구체적인 예로서 EPO를 본 발명의 방법을 이용하여 수용성의 단백질의 형태로 생산하는 것에 대하여 상세히 설명한다. 하지만, EPO는 단지 응용 가능한 단백질의 한 실례로서 제시된 것에 불과하며, 본 발명이 EPO에만 한정되는 것은 아니다. 또한 실시예에서는 GroES/GroEL의 조합 및 DnaK/DnaJ/GrpE의 조합에 대해서만 제시하고 있지만, 이는 다른 접힘관련 단백질 인자를 대표하는 것으로 본 발명은 이에 한정하지 않고 모든 접힘관련 단백질 인자를 포함한다.
실시예 1: 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 이를 이용한 수용성 단백질의 생산
[형질전환체의 제조]
접힘관련 단백질 인자의 유전자가 도입된 형질전환체는 통상의 형질전환 방법을 사용하여 제작하였다. 본 실시예에 이용되어진 형질전환 대상이 된 미생물은 대장균 BL21(DE3)이고, 접힘관련 단백질 인자의 유전자는 Olivier fayet로부터 제공받은 것이다(Analytical Biochemistry 254:150-152 (1997)). 참고로, 이러한 샤페론의 발현을 위한 벡터는 이미 상용화된 것의 사용을 고려할 수도 있다(예를 들어, Takara사 제품으로 제품의 code 번호는 3340임). 본 실시예에서 사용된 접힘관련 단백질 인자인 GroES, GroEL, DnaK, DnaJ 및 GrpE의 아미노산의 서열이 도 5 내지 9에 개시되어있다.
도 10에는 접힘관련 단백질 인자 GroES와 GroEL의 유전자를 플라스미드에 도입한 발현벡터(T7-SL3 플라스미드: Analytical Biochemistry 254:150-152 (1997) 참조)의 벡터 지도가 도시되어있다. 이렇게 접힘관련 단백질 인자 GroES와 GroEL의 유전자를 가진 T7-SL3 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체로부터 제조된 세포추출물을 "S30GroE1"으로 임의로 칭한다.
도 11에는 접힘관련 단백질 인자 DnaK, DnaJ와 GrpE의 유전자를 플라스미드에 도입한 발현벡터(T7-KJE3 플라스미드: Analytical Biochemistry 254:150-152 (1997) 참조)의 벡터 지도가 도시되어있다. 이렇게 접힘관련 단백질 인자 DnaK, DnaJ와 GrpE의 유전자를 가진 T7-KJE3 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체로부터 제조된 세포추출물을 "S30Dna1"으로 임의로 칭한다.
도 12에는 접힘관련 단백질 인자 GroES와 GroEL의 유전자를 플라스미드에 도입한 발현벡터(bad-SL1 플라스미드: Analytical Biochemistry 254:150-152 (1997) 참조)의 벡터 지도가 도시되어있다. 이렇게 접힘관련 단백질 인자 GroES와 GroEL의 유전자를 가진 bad-SL1 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체로부터 제조된 세포추출물을 "S30GroE2"로 임의로 칭한다.
도 13에는 접힘관련 단백질 인자 DnaK, DnaJ 와 GrpE의 유전자를 플라스미드에 도입한 발현벡터(bad-KJE1 플라스미드: Analytical Biochemistry 254:150-152 (1997) 참조)의 벡터 지도가 도시되어있다. 이렇게 접힘관련 단백질 인자 DnaK, DnaJ 와 GrpE의 유전자를 가진 bad-KJE1 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체로부터 제조된 세포추출물을 "S30Dna2"로 임의로 칭한다.
상기 형질전환체들은 상기 내용을 바탕으로 당업자에 의해 용이하게 재현될 수 있으므로, 별도로 기탁하지는 않는다.
[세포추출물의 제조]
접힘관련 단백질 인자와 단백질생산 관련 기구가 함께 포함된 세포추출물은 다음과 같이 제조하였다. 접힘관련 단백질 인자의 유전자의 도입이 없는 통상의 세포추출물의 제조시에는, 본 발명과 비교할 때, 플라스미드가 없는 세포를 이용하기 때문에 플라스미드 유지에 필요한 항생제를 배양 배지에 사용하지 않는다는 점과, 접힘관련 단백질 인자의 발현유도가 필요 없으므로 접힘관련 단백질 인자의 발현 유도과정이 필요없다는 점이 다르다.
접힘관련 단백질 인자의 유전자가 도입된 형질전환체를 각각의 플라스미드에 적합한 항생제(T7-SL3와 T7-KJE3의 경우는 스펙티노마이신이고, bad-SL1와 bad-KJE1의 경우는 카나마이신이다)가 포함된 5 ㎖의 LB 배지를 이용해 37℃에서 7-8 시간 전배양을 한 후, 이를 상기 항생제가 포함된 100 ㎖ 의 LB 배지로 옮긴 후 하룻밤 더 배양하였다. 이후, 상기 100 ㎖의 배양액을 이용하여 앞의 항생제가 포함된 2 L의 2 ×TB(박토-트립톤, 16 g/ℓ; 효모 추출물, 10 g/ℓ; 염화나트륨, 5 g/ℓ) 배지가 있는 배양기에 접종하였다. 배양온도를 37℃로 하고 850 rpm으로 진탕 배양해 주었다.
배양 시작 후 600 ㎚에서 흡광도가 0.6에 이를 시점에서 T7 RNA 중합효소와 접힘관련 단백질 인자의 발현을 유도하였다. 이 때, T7 프로모터가 있는 플라스미드(T7-SL3와 T7-KJE3의 경우)를 가진 형질전환체들은 최종농도가 1 mM이 되도록 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)만을 첨가하여, T7 RNA 중합효소와 접힘관련 단백질 인자의 발현을 동시에 유도하였다. 반면에, bad 프로모터가 있는 플라스미드(bad-SL1와 bad-KJE1의 경우)를 가진 형질전환체들은 최종농도가 1 mM이 되도록 IPTG(이는 T7 RNA 중합효소의 발현을 유도함)와 함께 추가로 최종농도가 0.2%(w/v)가 되도록 아라비노즈(이는 접힘관련 단백질 인자의 발현을 유도함)를 첨가하여, T7 RNA 중합효소와 접힘관련 단백질 인자의 발현을 동시에 유도하였다.
발현 유도 후, 600 ㎚에서 흡광도가 4-5 정도가 될 때까지 배양을 계속한 뒤, 6,000 rpm으로 4℃에서 12 분간 원심분리하여 세포를 수집하였고, 이를 세척완충액(10 mM 트리스초산염, 14 mM 초산마그네슘, 60 mM 초산칼륨, 10 mM 2-머켑토에탄올, pH 8.2)을 사용하여 재부유와 원심분리를 반복하여, 3 번 세척하였다. 마지막 원심분리 후, 최종 세포 침전물에 30 ㎖의 부유완충액(10 mM 트리스초산염, 14 mM 초산마그네슘, 60 mM 초산칼륨, 6 mM 2-머켑토에탄올, pH 8.2)을 가하여, 다시 재부유시켰다. 이를 16,000 g로 4℃에서 30 분간 원심분리하여 세포를 수집하였고, 침전된 세포 1 g 당 1.27 ㎖의 비로 침전된 세포에 S30 완충액(10 mM 트리스초산염, 14 mM 초산마그네슘, 60 mM 초산칼륨, 10 mM 2-머켑토에탄올, pH 8.2)을 가하여, 세포를 재부유시켰다.
이 세포 재부유액을 프렌치 프레서를 이용하여 압력 (770 psi)을 가하여 재부유액 속에 있는 세포를 파쇄하였다. 이 세포 파쇄물을 30,000 g로 4℃에서 30 분간 원심분리하여 상등액을 모은 후 다시 한번 같은 조건으로 원심분리한 후 상등액 중 맨 위의 지질층 밑의 액체부분을 조심스럽게 회수하였다. 이렇게 회수된 상등액 10 ㎖당 3 ㎖의 전배양혼합액(293 mM 트리스초산염, 2 mM 초산마그네슘, 10.5 mM ATP, 84 mM 크레아틴 포스페이트, 44 mM 2-머켑토에탄올, 0.04 mM 각 아미노산, 7 유니트/㎖ 크레아틴 키나아제, pH 8.2)을 첨가하여, 항온조에서 37℃로 80 분간 전배양을 하여, 세포추출물 제조용 세포 내에 처음부터 존재하기 때문에 제조된 세포추출물에도 섞여 있던 RNA를 분해시켰다. 전배양 후 S30 완충액 500 ㎖에 대하여 4℃에서 45 분간씩 투석막을 이용하여 투석을 4 회 수행하여, 작은 분자량을 가진 단백질 생산을 저해하거나 불필요한 성분(RNA 분해 산물 및 무기 인산염 등)들을 제거하였다. 투석 후, 투석액을 회수하여 4,000 g로 4℃에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 이를 분취한 후 액체질소에 보관하였다. 이를 이하의 무세포단백질생산 반응에서 세포추출물로 사용하였다.
[무세포단백질생산 반응]
무세포단백질생산 반응은 기본적으로 김 등(Kim, DM. et al., Eur. J. Biochem. 239:881-886 (1996))의 방법을 따랐으며, 약간의 변형된 방법을 사용하였다. 변형된 주된 점은, 사용한 대장균의 종류가 A19 종에서 BL21(DE3)로 바뀌었고 T7 RNA 중합효소를 외부에서 첨가해 주던 불편함을 없애기 위해 세포추출물 제조시에 세포추출물 제조용 세포(BL21(DE3))의 배양시에 T7 RNA 중합효소의 발현을 유도해 주어 세포추출물에 포함될 수 있도록 하였다. 참고로, A19 종은 T7 RNA 중합효소의 발현을 유도할 수 없다. 또한, 무세포단백질생산 반응의 이온들의 농도를 수용성 단백질 생산에 적합하다고 실험적으로 결정된 농도로 변경시켰다. 또한, 첨가물 중 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)은 수용성 단백질 생산에 부적합하여 제외시켰다.
무세포단백질생산 반응액의 조성은 다음과 같다: 57 mM Hepes/KOH pH 8.2, 1.2 mM ATP, 각 0.85 mM의 GTP, UTP와 CTP, 150 mM 칼륨글루타메이트, 80 mM 초산암모늄, 18 mM 초산마그네슘, 0.17 ㎎/㎖ 대장균 tRNA 혼합물(대장균 MRE 600 종에서 분리된 것을 구입해 사용함), 34 ㎎/㎖ l-5-포르밀-5,6,7,8-테트라히드로폴산, 6.7 g/㎖ 환형의 플라스미드(이 환형의 플라스미드로는 EPO의 유전자를 가지고 있으면서 T7 프로모터가 포함되어 있으면 어떤 종류의 것도 가능하고, 플라스미드 대신 EPO의 유전정보를 가진 RNA를 첨가해도 됨), 100 mM 크레아틴 포스페이트, 33% (v/v) 세포추출액. 상기 반응액을 30℃에서 3 시간 및 24 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액 중 5 ㎕를 취하여 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의한 분석시의 전체단백질(불용성과 수용성 단백질의 총합) 분석용 시료(sample)로 사용하였고, 나머지의 반응액을 11,000 g로 10 분간 원심분리하여 상등액에서부터 5 ㎕를 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의한 분석시의 수용성 단백질 분석용 시료로 취했다.
[합성단백질 분석]
형광사진분석법(fluorescent scanning)을 위해 무세포단백질생산시 프로메가사의 FluorpTectTMGreenLys
in vitro labeling System을 제작자의 지시대로 사용하였다 (이 원리는 단백질의 폴리펩타이드의 구성성분으로 참여하는 아미노산 중 라이신의 말단(side chain)에 형광물질이 붙어 있게 제조된 특수 아미노산을 사용하여 생산되는 단백질을 형광물질로 표지하는 방법임). SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법 및 형광사진분석법에 의한 수용성 단백질 생산에 대한 분석은 EPO를 모델 단백질로 하여 수행하였고, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1의 (a)와 (b)에는 상기와 같은 방법에 따라 3 시간의 반응으로 생산된 EPO를 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진들이 개시되어있다.
- (a) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 3번 레인: S30GroE1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 4번 레인: S30GroE1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 5번 레인: S30GroE2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 6번 레인은 S30GroE2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 3번 레인: S30Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 4번 레인: S30Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 5번 레인: S30Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 6번 레인: S30Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
이의 결과에서 알 수 있듯이, 전체단백질에 대한 수용성 단백질의 비율이 접힘관련 단백질 인자가 도입된 세포로부터 제조한 세포추출물을 사용한 경우가 현저히 높다. 3 시간 반응에서는 전체 생산 단백질 중 수용성 단백질이 상당량 포함되어 있지만, 그 수용성의 함량은 S30Dna1을 세포추출물로 사용한 경우가 가장 우수하였다.
도 2의 (a)와 (b)에는 상기와 같은 방법에 따라 24 시간의 반응으로 생산된 EPO를 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진들이 개시되어있다.
- (a) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 3번 레인: S30GroE1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 4번 레인: S30GroE1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 5번 레인: S30GroE2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 6번 레인: S30GroE2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 3번 레인: S30Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 4번 레인: S30Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 5번 레인: S30Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 6번 레인: S30Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
전체단백질에 대한 수용성 단백질의 비율이 접힘관련 단백질 인자가 도입된 세포로부터 제조한 세포추출물을 사용한 경우가 역시 수용성 단백질의 분율이 높았다. 또한, 도 1의 3 시간 반응에 비하여 도 2의 24 시간 반응에서 전체적으로 수용성 단백질의 함량이 줄어들었다. 그럼에도 불구하고, S30Dna1을 세포추출물로 사용한 경우는 24 시간의 반응에서도 여전히 접힘관련 단백질 인자의 도입에 따른 수용성 단백질 생산 증진의 효과를 확인할 수 있다.
실시예 2: 혼합세포배양법에 의한 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 이를 이용한 수용성 단백질의 생산
무세포단백질생산법에 사용한 세포추출물의 종류만을 달리하여 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 행하였다. 본 실시예에서 사용한 세포추출물은 실시예 1에서 제시한 방법과 동일하게 제조하였으나, 세포추출물 제조시 사용한 세포는, 각각의 접힘관련 단백질 인자가 도입된 세포들을 같은 배양기에 같은 양 접종하여 동시에 혼합배양한 세포 배양액을 세포추출물 제조용 세포재료로 사용하였다.
접힘관련 단백질 인자 GroES와 GroEL의 유전자를 가진 T7-SL3 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체와, 접힘관련 단백질 인자 DnaK, DnaJ 와 GrpE의 유전자를 가진 T7-KJE3 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체를, 동시에 혼합배양한 배양액으로부터 제조된 세포추출물을 "S30Hybrid GroE1-Dna1"으로 임의로 칭한다. 또한, 접힘관련 단백질 인자 GroES와 GroEL의 유전자를 가진 bad-SL1 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체와, 접힘관련 단백질 인자 DnaK, DnaJ 와 GrpE의 유전자를 가진 bad-KJE1 플라스미드가 도입된 BL21(DE3)의 형질전환체를, 동시에 혼합배양한 배양액으로부터 제조된 세포추출물을 "S30Hybrid GroE2-Dna2"로 임의로 칭한다. 무세포단백질생산 후의 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법 및 형광사진분석법에 의한 분석 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에는 상기와 같은 방법에 따라 3 시간(a) 및 24 시간(b)의 반응으로 생산된 EPO를 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진들이 개시되어있다.
- (a) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 3번 레인: S30Hybrid GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 4번 레인: S30Hybrid GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 5번 레인: S30Hybrid GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 6번 레인: S30Hybrid GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 3번 레인: S30Hybrid GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 4번 레인: S30Hybrid GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 5번 레인: S30Hybrid GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 6번 레인: S30Hybrid GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
이 경우에도 전체단백질에 대한 수용성 단백질의 비율이 접힘관련 단백질 인자가 도입된 세포로부터 제조한 세포추출물을 사용한 경우가 역시 높았다. 특히 실시예 1에서 효과가 우수하였던 세포추출물 S30Dna1이 포함된 S30Hybrid GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용한 경우에서 전체단백질의 생산 및 수용성 단백질의 생산능이 가장 높았다.
실시예 3: 각기 별도로 준비된 세포추출물을 혼합한 혼합세포추출물을 이용한 수용성 단백질의 생산
무세포단백질생산법에 사용한 세포추출물의 종류만을 달리하여 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 행하였다. 본 실시예에서 사용한 세포추출물은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조한 후 세포추출물들을 부피비 1 : 1로 섞어 혼합한 혼합세포추출물을 무세포단백질생산시의 세포추출물로 사용하였다.
본 실시예에서 세포추출물 S30GroE1과 세포추출물 S30Dna1을 1 : 1로 섞은 혼합세포추출물을 "S30Mixed GroE1-Dna1"으로 임의로 칭한다. 또한, 세포추출물 S30GroE2와 세포추출물 S30Dna2를 1 : 1로 섞은 혼합세포추출물을 "S30Mixed GroE2-Dna2"로 임의로 칭한다. 무세포단백질 생산 후의 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법 및 형광사진분석법의 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에는 상기와 같은 방법에 따라 3 시간(a) 및 24 시간(b)의 반응으로 생산된 EPO를 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진들이 개시되어 있다.
- (a) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 3번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 4번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (a) 5번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (a) 6번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 1번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 2번 레인: 통상의 세포추출물 제조법에 따라 제조한 세포추출물을 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 3번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 4번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
- (b) 5번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 전체단백질을 포함한 반응액.
- (b) 6번 레인: 혼합세포추출물 S30Mixed GroE2-Dna2을 세포추출물로 사용하여 EPO를 생산한 후 원심분리하여 얻은 상등액 부분인 수용성 단백질을 포함한 반응액.
전체단백질에 대한 수용성 단백질의 비율이 접힘관련 단백질 인자가 도입된 세포로부터 제조한 세포추출물을 혼합한 혼합세포추출물을 무세포단백질생산에서 세포추출물로 사용한 경우가 역시 높았다. 또한, 실시예 1에서 효과가 우수하였던 세포추출물 S30Dna1이 포함된 혼합세포추출물 S30Mixed GroE1-Dna1을 세포추출물로 사용한 경우가 가장 수용성 단백질의 생산능이 높았다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
본 발명은, 종래의 무세포단백질생산법에서는 수용성의 단백질의 생산을 증진시키기 위해서 무세포단백질생산 반응의 전이나 후에 접힘관련 단백질 인자를 첨가해 주었다. 이 때 사용하는 접힘관련 단백질 인자는 통상 별도의 공정을 통해 많은 시간과 노동을 투여하여 생산한 후 분리 정제하거나 또는 상용화되어 있는 고가의 접힘관련 단백질 인자를 구매하여야 한다. 이러한 시도는 소기의 목적은 달성할 수 있지만, 결과적으로 수용성의 단백질 생산에 많은 노동, 시간, 비용을 소요하게 된다. 이와는 달리, 본 발명에 따르면, 무세포단백질생산법에 필수적으로 준비되어야 하는 세포추출물 제조 단계에서 접힘관련 단백질 인자의 발현유도를 도입함으로써, 접힘관련 단백질 인자를 다량 함유한 세포추출물을 제조할 수 있고, 이를 이용하여 무세포단백질생산 반응을 수행함으로써 외부에서 따로 준비된 접힘관련 단백질 인자의 첨가없이 수용성의 단백질을 저렴하게 생산할 수 있다. 이렇게 함으로써, 세포배양을 이용한 단백질 생산시 불용성의 문제를 갖고 있던 단백질을 상당히 높은 생산능으로 저렴하고 간단히 수용성으로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 무세포단백질생산법에 비하여 저렴하게 수용성 단백질을 생산할 수 있다. 그런 이유로, 본 발명은 통상의 세포배양법이나 무세포단백질생산법에 비하여 간편하고 저렴하면서도 고수율로 수용성의 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
통상의 세포배양에서 자주 발생되는 불용성 형태의 단백질은 생물학적으로 활성이 없거나 매우 낮기 때문에 구조 및 기능 관련 연구, 더 나아가 이를 이용한 신약개발 등의 목적으로 사용하기에는 적합하지 않다. 이러한 불용성의 단백질을 수용성 형태로 생산하는데 있어서, 세포배양법에 비해 유리한 위치에 있는 종래의 무세포단백질생산법을 이용하더라도 외부에서 접힘관련 단백질 인자의 첨가가 필요하기 때문에, 노동 및 시간을 많이 투여해야 되거나, 또는 많은 비용의 투여를 필요로 했다. 이에 반하여, 본 발명을 이용한 개선된 무세포단백질생산법을 이용하면 여러 용도의 수용성 단백질 시료를 저렴하게 대량생산할 수 있으며, 수용성 단백질 생산이 증진된 새로운 유전자의 기능 규명 관련 연구 및 이에 필요한 연구 도구 개발에 적용할 수 있다.
본 발명에서 개시하고 있는 목적을 이루기 위해 무세포단백질 생산시 반응액에 접힘관련 단백질 인자의 유전자를 첨가하여 목적단백질과 동시발현 시키는 방법도 생각할 수 있으나, 이 방법은 무세포단백질 생산시 두 가지 이상의 단백질의 생산이 되게 하므로 목적 단백질의 생산 측면에서는 비효율적이 측면이 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 하나의 실시예에서 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물을 이용하여 구축한 무세포단백질생산 시스템에 의해 3 시간동안 생산한 EPO와, 통상의 무세포단백질생산법으로 3 시간동안 생산한 EPO를, SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진이고;
도 2a 및 2b는 본 발명에 따른 하나의 실시예에서 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물을 이용하여 구축한 무세포단백질생산 시스템에 의해 24 시간동안 생산한 EPO와, 통상의 무세포단백질생산법으로 24 시간동안 생산한 EPO를 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진이고;
도 3a 및 3b는 본 발명에 따른 하나의 실시예에서 하나의 배양기에서 동시에 배양한 두종류 이상의 형질전환 세포들로부터 제조한, 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물을 이용하여 구축한, 무세포단백질생산 시스템에 의해, 3 시간 및 24 시간동안 생산한 EPO와, 통상의 무세포단백질생산법으로 3 시간 및 24 시간동안 생산한 EPO를, SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진이고;
도 4a 및 4b는 본 발명에 따른 하나의 실시예에서 각각 분리된 방법으로 준비한 접힘관련 단백질 인자가 포함된 세포추출물을 서로 혼합하여 새로이 제조한 혼합세포추출물을 이용하여 구축한 무세포단백질생산 시스템에 의해, 3 시간 및 24 시간동안 생산한 EPO와, 통상의 무세포단백질생산법으로 3 시간 및 24 시간동안 생산한 EPO를, SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 분리하여 형광사진분석법으로 촬영한 사진이고;
도 5는 접힘관련 단백질 인자인 GroEL의 아미노산서열이고;
도 6은 접힘관련 단백질 인자인 GroES의 아미노산서열이고;
도 7은 접힘관련 단백질 인자인 DnaK의 아미노산서열이고;
도 8은 접힘관련 단백질 인자인 DnaJ의 아미노산서열이고;
도 9는 접힘관련 단백질 인자인 GrpE의 아미노산서열이고;
도 10은 접힘관련 단백질 인자인 GroEL/GroES의 조합의 발현벡터인 T7-SL3의 벡터 지도이고;
도 11은 접힘관련 단백질 인자인 DnaK/DnaJ/GrpE의 조합의 발현벡터인 T7-KJE3의 벡터 지도이고;
도 12는 접힘관련 단백질 인자인 GroEL/GroES의 조합의 발현벡터인 bad-SL1의 벡터 지도이고;
도 13은 접힘관련 단백질 인자인 DnaK/DnaJ/GrpE의 조합의 발현벡터인 bad-KJE1의 벡터 지도이다.
<110> Dreambiogen Co., Ltd
<120> Method of preparing protein as a soluble form in a cell-free
protein synthesis system
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 148
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(148)
<223> GroEL
<400> 1
Met Glu Leu Glu Lys Ala Thr Leu Glu Asp Leu Gly Gln Ala Lys Arg
1 5 10 15
Val Val Ile Asn Lys Asp Thr Thr Thr Ile Ile Asp Gly Val Gly Glu
20 25 30
Glu Ala Ala Ile Arg Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Gln Ile Glu
35 40 45
Glu Ala Thr Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Val Ala
50 55 60
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala Thr Glu
65 70 75 80
Val Glu Met Lys Glu Lys Lys Ala Arg Val Glu Asp Ala Leu His Ala
85 90 95
Thr Arg Ala Ala Val Glu Gly Val Val Ala Gly Gly Gly Val Ala Leu
100 105 110
Ile Arg Val Ala Leu Asn Trp Leu Thr Cys Val Val Arg Thr Lys Thr
115 120 125
Arg Thr Trp Val Ser Lys Leu His Cys Val Gln Trp Lys Leu Arg Cys
130 135 140
Val Arg Ser Tyr
145
<210> 2
<211> 97
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(97)
<223> GroES
<400> 2
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn Gly Arg Ile
35 40 45
Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu Asp Val Lys Val Gly Asp Ile
50 55 60
Val Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Gly Val Lys Ser Glu Lys Ile Asp Asn
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Ile Met Ser Glu Asn Asp Ile Leu Ala Ile Val Glu
85 90 95
Ala
<210> 3
<211> 638
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(638)
<223> DnaK
<400> 3
Met Gly Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val
1 5 10 15
Ala Ile Met Asp Gly Thr Thr Pro Arg Val Leu Glu Asn Ala Glu Gly
20 25 30
Asp Arg Thr Thr Pro Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Gln Asp Gly Glu Thr
35 40 45
Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Gln Asn
50 55 60
Thr Leu Phe Ala Ile Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Gln Asp Glu
65 70 75 80
Glu Val Gln Arg Asp Val Ser Ile Met Pro Phe Lys Ile Ile Ala Ala
85 90 95
Asp Asn Gly Asp Ala Trp Val Glu Val Lys Gly Gln Lys Met Ala Pro
100 105 110
Pro Gln Ile Ser Ala Glu Val Leu Lys Lys Met Lys Lys Thr Ala Glu
115 120 125
Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Val Thr Glu Ala Val Ile Thr Val Pro Ala
130 135 140
Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Arg Ile
145 150 155 160
Ala Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala
165 170 175
Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Arg Thr Ile Ala Val
180 185 190
Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Ile Glu Ile Asp
195 200 205
Glu Val Asp Gly Glu Lys Thr Phe Glu Val Leu Ala Thr Asn Gly Asp
210 215 220
Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Ser Arg Leu Ile Asn Tyr Leu
225 230 235 240
Val Glu Glu Phe Lys Lys Asp Gln Gly Ile Asp Leu Arg Asn Asp Pro
245 250 255
Leu Ala Met Gln Arg Leu Lys Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu
260 265 270
Leu Ser Ser Ala Gln Gln Thr Asp Val Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Ala
275 280 285
Asp Ala Thr Gly Pro Lys His Met Asn Ile Lys Val Thr Arg Ala Lys
290 295 300
Leu Glu Ser Leu Val Glu Asp Leu Val Asn Arg Ser Ile Glu Pro Leu
305 310 315 320
Lys Val Ala Leu Gln Asp Ala Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Asp Asp
325 330 335
Val Ile Leu Val Gly Gly Gln Thr Arg Met Pro Met Val Gln Lys Lys
340 345 350
Val Ala Glu Phe Phe Gly Lys Glu Pro Arg Lys Asp Val Asn Pro Asp
355 360 365
Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Val Gln Gly Gly Val Leu Thr Gly
370 375 380
Asp Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly
385 390 395 400
Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Thr
405 410 415
Thr Ile Pro Thr Lys His Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Glu Asp Asn
420 425 430
Gln Ser Ala Val Thr Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Lys Arg Ala
435 440 445
Ala Asp Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe Asn Leu Asp Gly Ile Asn Pro
450 455 460
Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala
465 470 475 480
Asp Gly Ile Leu His Val Ser Ala Lys Asp Lys Asn Ser Gly Lys Glu
485 490 495
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500 505 510
Gln Lys Met Val Arg Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp Arg Lys
515 520 525
Phe Glu Glu Leu Val Gln Thr Arg Asn Gln Gly Asp His Leu Leu His
530 535 540
Ser Thr Arg Lys Gln Val Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Pro Ala Asp
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Asp Lys Thr Ala Ile Glu Ser Ala Leu Thr Ala Leu Glu Thr Ala Leu
565 570 575
Lys Gly Glu Asp Lys Ala Ala Ile Glu Ala Lys Met Gln Glu Leu Ala
580 585 590
Gln Val Ser Gln Lys Leu Met Glu Ile Ala Gln Gln Gln His Ala Gln
595 600 605
Gln Gln Thr Ala Gly Ala Asp Ala Ser Ala Asn Asn Ala Lys Asp Asp
610 615 620
Asp Val Val Asp Ala Glu Phe Glu Glu Val Lys Asp Lys Lys
625 630 635
<210> 4
<211> 376
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(376)
<223> DnaJ
<400> 4
Met Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala
1 5 10 15
Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr
20 25 30
His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys
35 40 45
Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala
50 55 60
Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp
85 90 95
Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala
100 105 110
Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala
115 120 125
Val Arg Gly Val Thr Lys Glu Ile Arg Ile Pro Thr Leu Glu Glu Cys
130 135 140
Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr
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Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln Val Gln Met Arg Gln Gly Phe
165 170 175
Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu
180 185 190
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195 200 205
Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp
210 215 220
Arg Ile Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Gly Glu His Gly Ala Pro
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Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro Ile Phe
245 250 255
Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala
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Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg
275 280 285
Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg
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Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp
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Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr
340 345 350
Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys
355 360 365
Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg
370 375
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(197)
<223> GrpE
<400> 5
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165 170 175
Gly Tyr Thr Leu Asn Gly Arg Thr Ile Arg Ala Ala Met Val Thr Val
180 185 190
Ala Lys Ala Lys Ala
195
Claims (7)
- 무세포단백질생산 시스템을 이용하여 단백질을 생산함에 있어서,(a) 무세포단백질생산 시스템용 세포추출물을 제공하는 세포에, 샤페론류, 열-자극 단백질, 이성화효소, 및 폴리펩타이드 쇄 결합 단백질로 이루어진 군에서 선택된 접힘관련 단백질 인자의 유전정보를 갖고 있는 유전자 전달체를 도입하여, 형질전환 세포를 제조하는 단계;(B) 상기 형질전환 세포에서 단백질 발현유도법에 의해 상기 접힘관련 단백질 인자의 과발현을 유도한 후, 무세포단백질생산 시스템용 세포추출물을 제조하는 단계; 및(C) 상기 세포추출물을 포함하는 무세포단백질생산 시스템에서 목적 단백질을 높은 수율의 수용성 형태로 생산하는 단계;를 포함하는 것으로 구성되어있는, 수용성 단백질의 생산 또는 그것의 생산능이 향상된 무세포단백질생산 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 접힘관련 단백질 인자가 샤페론류인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 접힘관련 단백질 인자가 GroES/GroEL 조합 또는 DnaK/DnaJ/GrpE 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 세포추출물은 2 또는 그 이상의 형질전환 세포들로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
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