JPH09107954A - 細菌により可溶性蛋白質を生産する方法 - Google Patents
細菌により可溶性蛋白質を生産する方法Info
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- JPH09107954A JPH09107954A JP7291859A JP29185995A JPH09107954A JP H09107954 A JPH09107954 A JP H09107954A JP 7291859 A JP7291859 A JP 7291859A JP 29185995 A JP29185995 A JP 29185995A JP H09107954 A JPH09107954 A JP H09107954A
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】Ｔ７プロモーター等の制御下に発現するチ
オレドキシン遺伝子の発現ベクターとインターフェロン
等の目的遺伝子の発現ベクターにより形質転換されてな
る共形質転換細菌、および該共形質転換細菌を用いて、
目的遺伝子がコードする蛋白質を可溶性蛋白質として発
現させることを特徴とする可溶性蛋白質の生産方法。 【効果】本発明により、従来不溶性蛋白質としてしか細
菌中では発現されなかった真核生物の蛋白質を可溶性蛋
白質として発現させることが可能となった。また、一部
可溶性蛋白質として発現されていた真核生物蛋白質の可
溶性蛋白質の割合を増加させることが可能となった。
オレドキシン遺伝子の発現ベクターとインターフェロン
等の目的遺伝子の発現ベクターにより形質転換されてな
る共形質転換細菌、および該共形質転換細菌を用いて、
目的遺伝子がコードする蛋白質を可溶性蛋白質として発
現させることを特徴とする可溶性蛋白質の生産方法。 【効果】本発明により、従来不溶性蛋白質としてしか細
菌中では発現されなかった真核生物の蛋白質を可溶性蛋
白質として発現させることが可能となった。また、一部
可溶性蛋白質として発現されていた真核生物蛋白質の可
溶性蛋白質の割合を増加させることが可能となった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、チオレドキシン遺
伝子の発現ベクターと目的遺伝子の発現ベクターとによ
り共形質転換された細菌、および通常菌体内に不溶性蛋
白質、例えばいわゆる封入体（inclusion body) として
発現される遺伝子産物を前記の共形質転換細菌を用いて
可溶性蛋白質として発現させることによる可溶性蛋白質
の生産方法に関する。
伝子の発現ベクターと目的遺伝子の発現ベクターとによ
り共形質転換された細菌、および通常菌体内に不溶性蛋
白質、例えばいわゆる封入体（inclusion body) として
発現される遺伝子産物を前記の共形質転換細菌を用いて
可溶性蛋白質として発現させることによる可溶性蛋白質
の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌は容易に高密度に増殖し、しかも
宿主ベクター系の研究が最も進んでおり、多くの高発現
ベクターが開発されるなど、異種蛋白質を安価にかつ収
率よく生産するための宿主として最適であることから、
大腸菌の宿主ベクター系は異種遺伝子の発現系として最
も広く利用されている。しかし、多くの異種蛋白質、特
に真核生物蛋白質は大腸菌内で高発現させると、細胞質
内で会合し生物学的に不活性な不溶性の封入体と呼ばれ
るアグリゲートを形成する。封入体の形成は、発現蛋白
質を宿主菌体内の蛋白質分解酵素による分解から保護
し、また遠心分離により菌体から容易に分離することを
可能ならしめるという利点を持つが、目的である生物学
的に活性な蛋白質を得るためには、封入体を変性可溶化
した後、再生（リフォールディング）する必要がある。
この可溶化・再生の操作は、個々の蛋白質ごとに試行錯
誤を繰り返し経験的に行われているが、満足な回収率が
得られないことが多いばかりか、必ずしも再生できると
は限らず、この点が大きな課題となっている。 大腸菌
では、糖鎖の付加などの翻訳後修飾が困難であることと
あわせて、これらのことが蛋白質生産における大腸菌宿
主ベクター系のひとつの限界とされてきた。その後、生
物学的に活性な蛋白質の発現が可能な動物細胞を宿主と
する発現系が注目され急速に発展したが、安価に高収率
で蛋白質を大量生産させることが難しく、限られた種類
の蛋白質の生産に利用されるにとどまっているのが現状
である。したがって、大腸菌により生物学的に活性な可
溶性蛋白質として発現させる技術を確立することは、有
用蛋白質の大量生産という産業上の大きな課題であると
共に、蛋白質の構造研究といった研究の分野においても
克服すべき重要な課題となっている。
宿主ベクター系の研究が最も進んでおり、多くの高発現
ベクターが開発されるなど、異種蛋白質を安価にかつ収
率よく生産するための宿主として最適であることから、
大腸菌の宿主ベクター系は異種遺伝子の発現系として最
も広く利用されている。しかし、多くの異種蛋白質、特
に真核生物蛋白質は大腸菌内で高発現させると、細胞質
内で会合し生物学的に不活性な不溶性の封入体と呼ばれ
るアグリゲートを形成する。封入体の形成は、発現蛋白
質を宿主菌体内の蛋白質分解酵素による分解から保護
し、また遠心分離により菌体から容易に分離することを
可能ならしめるという利点を持つが、目的である生物学
的に活性な蛋白質を得るためには、封入体を変性可溶化
した後、再生（リフォールディング）する必要がある。
この可溶化・再生の操作は、個々の蛋白質ごとに試行錯
誤を繰り返し経験的に行われているが、満足な回収率が
得られないことが多いばかりか、必ずしも再生できると
は限らず、この点が大きな課題となっている。 大腸菌
では、糖鎖の付加などの翻訳後修飾が困難であることと
あわせて、これらのことが蛋白質生産における大腸菌宿
主ベクター系のひとつの限界とされてきた。その後、生
物学的に活性な蛋白質の発現が可能な動物細胞を宿主と
する発現系が注目され急速に発展したが、安価に高収率
で蛋白質を大量生産させることが難しく、限られた種類
の蛋白質の生産に利用されるにとどまっているのが現状
である。したがって、大腸菌により生物学的に活性な可
溶性蛋白質として発現させる技術を確立することは、有
用蛋白質の大量生産という産業上の大きな課題であると
共に、蛋白質の構造研究といった研究の分野においても
克服すべき重要な課題となっている。
【０００３】蛋白質が不溶化されるメカニズムは知られ
ていない。封入体の形成はポリペプチドの適切なフォー
ルディング（折り畳み）が欠如しているために起こる不
適当な蛋白質−蛋白質相互作用によると考えられる（Sc
hein, C. H. (1989) Bio/technology 7, 1141-1149、Mi
taki, A., and King, J. (1989) Bio/technology 7,690
-697 ) 。多くの真核生物蛋白質は大腸菌内で何故不溶
性のアグリゲートとして発現されるのであろうか？ こ
の点に関して、大腸菌内での真核生物蛋白質の可溶化に
影響を与える２つの因子があるように思われる。
ていない。封入体の形成はポリペプチドの適切なフォー
ルディング（折り畳み）が欠如しているために起こる不
適当な蛋白質−蛋白質相互作用によると考えられる（Sc
hein, C. H. (1989) Bio/technology 7, 1141-1149、Mi
taki, A., and King, J. (1989) Bio/technology 7,690
-697 ) 。多くの真核生物蛋白質は大腸菌内で何故不溶
性のアグリゲートとして発現されるのであろうか？ こ
の点に関して、大腸菌内での真核生物蛋白質の可溶化に
影響を与える２つの因子があるように思われる。
【０００４】第１の因子は大腸菌のヒートショックシャ
ペロン ＧｒｏＥＳＬ（ｇｒｏＥオペロンによってコー
ドされている）である。ＧｒｏＥＳＬコンプレックス
は、新たに合成されたポリペプチドが正確にフォールデ
ィングするのを触媒する役割を果たすことが最近明らか
にされてきた（Weissman, J. S., Kashi, Y., Fenton,
W. A., and Horwich, A. L. (1994) Cell 78, 693-702
、Schmidt, M., Rutkat,K., Rachel, R., Pfeifer,
G., Jaenicke, R., Viitanen, P. V., Lorimer, G.H.,
and Buchner, J. (1994) Science 265, 656-659、Azem,
A., Kessel, M.,and Goloubninoff, P. (1994) Scienc
e 265, 653-656、Martin, J., Mayhew, M., Langer,
T., and Hartl, F. U. (1994) Nature 366, 228-233 )
。大腸菌で真核生物蛋白質を発現させるために、Ｔ７
プロモーターのような強力なプロモーターがしばしば用
いられる。この場合、大腸菌シャペロンＧｒｏＥＳＬの
高レベル発現が必要である。例えば、λファージが大腸
菌に感染するときは、ＧｒｏＥＳＬの発現が誘導され
る。ＧｒｏＥＳＬの発現レベルが上昇しないときは、λ
ファージはλコート蛋白質のフォールディングが正確に
起こらないためファージ粒子を形成することができない
（Georgopoulos, C., Ang, D., Liberek, K., and Zyli
cz, M. (1990) ｉn Stress Proteins in Biology and M
edicine (Morimoto, R. I., Tissieres, A., and Georg
opoulos, C., eds) pp. 191-221, Cold SpringHarbor P
ress, Cold Spring Harbor, N. Y.) 。従って、外来蛋
白質の適切なフォールディングのためには、大腸菌シャ
ペロンの同等の誘導と高レべルの発現が要求されるよう
である。
ペロン ＧｒｏＥＳＬ（ｇｒｏＥオペロンによってコー
ドされている）である。ＧｒｏＥＳＬコンプレックス
は、新たに合成されたポリペプチドが正確にフォールデ
ィングするのを触媒する役割を果たすことが最近明らか
にされてきた（Weissman, J. S., Kashi, Y., Fenton,
W. A., and Horwich, A. L. (1994) Cell 78, 693-702
、Schmidt, M., Rutkat,K., Rachel, R., Pfeifer,
G., Jaenicke, R., Viitanen, P. V., Lorimer, G.H.,
and Buchner, J. (1994) Science 265, 656-659、Azem,
A., Kessel, M.,and Goloubninoff, P. (1994) Scienc
e 265, 653-656、Martin, J., Mayhew, M., Langer,
T., and Hartl, F. U. (1994) Nature 366, 228-233 )
。大腸菌で真核生物蛋白質を発現させるために、Ｔ７
プロモーターのような強力なプロモーターがしばしば用
いられる。この場合、大腸菌シャペロンＧｒｏＥＳＬの
高レベル発現が必要である。例えば、λファージが大腸
菌に感染するときは、ＧｒｏＥＳＬの発現が誘導され
る。ＧｒｏＥＳＬの発現レベルが上昇しないときは、λ
ファージはλコート蛋白質のフォールディングが正確に
起こらないためファージ粒子を形成することができない
（Georgopoulos, C., Ang, D., Liberek, K., and Zyli
cz, M. (1990) ｉn Stress Proteins in Biology and M
edicine (Morimoto, R. I., Tissieres, A., and Georg
opoulos, C., eds) pp. 191-221, Cold SpringHarbor P
ress, Cold Spring Harbor, N. Y.) 。従って、外来蛋
白質の適切なフォールディングのためには、大腸菌シャ
ペロンの同等の誘導と高レべルの発現が要求されるよう
である。
【０００５】大腸菌内での真核生物蛋白質の可溶化に影
響を与える第２の因子は、大腸菌と真核細胞の間の酸化
還元状態の相違であろう。本発明者らは、大腸菌内で発
現した種々の哺乳類蛋白質のＧＳＴ（グルタチオン Ｓ
トランスフェラーゼ）との融合蛋白質は、グルタチオ
ン−セファロースビーズに極めて効率的に結合するもの
が多いが、哺乳類細胞中で発現したＧＳＴ−融合蛋白質
はグルタチオンビーズに効率的に結合しないことを観察
した。この事実は、哺乳類細胞が大腸菌とは異なる酸化
還元的環境を有することを示唆する。この観察と一致し
て、哺乳類細胞には、極めて高濃度のグルタチオンが保
持されているという報告がある（Kondo,T., Yoshida,
K., Urata, Y., Goto, S., Gasa, S., and Taniguchi,
N., (1993) J. Biol. Chem. 268, 20366-20372) 。
響を与える第２の因子は、大腸菌と真核細胞の間の酸化
還元状態の相違であろう。本発明者らは、大腸菌内で発
現した種々の哺乳類蛋白質のＧＳＴ（グルタチオン Ｓ
トランスフェラーゼ）との融合蛋白質は、グルタチオ
ン−セファロースビーズに極めて効率的に結合するもの
が多いが、哺乳類細胞中で発現したＧＳＴ−融合蛋白質
はグルタチオンビーズに効率的に結合しないことを観察
した。この事実は、哺乳類細胞が大腸菌とは異なる酸化
還元的環境を有することを示唆する。この観察と一致し
て、哺乳類細胞には、極めて高濃度のグルタチオンが保
持されているという報告がある（Kondo,T., Yoshida,
K., Urata, Y., Goto, S., Gasa, S., and Taniguchi,
N., (1993) J. Biol. Chem. 268, 20366-20372) 。
【０００６】大腸菌において目的とする外来遺伝子が封
入体として発現されるのを回避するための手法として
は、従来は、第１に、上記のようなシャペロンあるいは
フォールダーゼ（foldase)を外来遺伝子と共発現させる
方法が知られている。かかるシャペロンは熱ショックプ
ロテインであり、大腸菌の場合は上記のＧｒｏＥＳＬ
（ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬ）がその代表的なもので
ある。一方、フォールダーゼとしては、蛋白質のジスル
フィド結合形成に関与するペリプラズム酵素であるＤｓ
ｂＡ、その酸化還元酵素であるＤｓｂＢやＸ−Ｐｒｏペ
プチド結合の異性化を触媒するペプチジル プロリル
ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ イソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）等
が知られている。
入体として発現されるのを回避するための手法として
は、従来は、第１に、上記のようなシャペロンあるいは
フォールダーゼ（foldase)を外来遺伝子と共発現させる
方法が知られている。かかるシャペロンは熱ショックプ
ロテインであり、大腸菌の場合は上記のＧｒｏＥＳＬ
（ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬ）がその代表的なもので
ある。一方、フォールダーゼとしては、蛋白質のジスル
フィド結合形成に関与するペリプラズム酵素であるＤｓ
ｂＡ、その酸化還元酵素であるＤｓｂＢやＸ−Ｐｒｏペ
プチド結合の異性化を触媒するペプチジル プロリル
ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ イソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）等
が知られている。
【０００７】これらのシャペロンあるいはフォールダー
ゼの過剰な共発現は、特定の場合には有用であるようで
ある。しかし、あらゆる蛋白質の封入体形成の問題への
普遍的解決とはなり難い。蛋白質が異なればフォールデ
ィングの経路も異なり、細胞内での蛋白質の正確なフォ
ールディングには、それぞれのシャペロンが独立に必須
となるからである（Hockney, R. C. (1994) Trends Bio
technol. 12, 456-463) 。
ゼの過剰な共発現は、特定の場合には有用であるようで
ある。しかし、あらゆる蛋白質の封入体形成の問題への
普遍的解決とはなり難い。蛋白質が異なればフォールデ
ィングの経路も異なり、細胞内での蛋白質の正確なフォ
ールディングには、それぞれのシャペロンが独立に必須
となるからである（Hockney, R. C. (1994) Trends Bio
technol. 12, 456-463) 。
【０００８】第２の手法としては、目的の外来遺伝子を
他の蛋白質との融合蛋白質として発現させる方法であ
る。他の蛋白質としては、グルタチオン Ｓ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith, D. B. and Johnson, K.
S. (1988) Gene 67, 31-40 )、マルトース−結合蛋白
質（ＭＰＢ）（Bedouelle, H. and Duplay, P. (1988)E
ur. J. Biochem. 171, 541-549)、プロテインＡ（Nilss
on, B., Holmgren, E.,Josephson, S., Gatenbeck, S.,
Philipson, L., and Uhlen, M. (1985) Nucleic Acids
Res. 13, 1151-1162 )、プロテインＡのイムノグロブ
リン結合Ｚ−ドメイン（Nilsson, B., et al. (1987) P
rot. Eng. 1, 107-113) 、またはプロテインＧ（Nygre
n, P-A., Eliasson, M., Abrahamsen, L. and Uhlen,
M. (1988) J.Mol. Recog. 1, 69-74 ) 等が用いられ、
通常、目的蛋白質をこれらの蛋白質のＣ−末端側に融合
した蛋白質として発現させる。元来、アフィニティーに
よる精製や定量を容易にするためこれら融合蛋白質とし
て発現させることが意図されたが、封入体を形成する蛋
白質でもこれらを融合蛋白質として発現させた場合、し
ばしば可溶性となることも大きな利点として挙げられ
る。融合蛋白質とすることにより可溶化することは、特
にＧＳＴとの融合蛋白質においてみられる現象である
が、その後の特筆すべき成果として、ＭｃＣｏｙらによ
るチオレドキシンとの融合蛋白質として発現させる方法
を挙げることができる。すなわち、彼らによるとチオレ
ドキシンと融合させ、低温で発現させることにより、１
１種類のリンホカインを可溶性でかつ高レベルに大腸菌
内に蓄積させることが可能になった（LaVallie, E. R.
et al.(1993) Bio/Technology 11, 187-193 ) 。
他の蛋白質との融合蛋白質として発現させる方法であ
る。他の蛋白質としては、グルタチオン Ｓ−トランス
フェラーゼ（ＧＳＴ）（Smith, D. B. and Johnson, K.
S. (1988) Gene 67, 31-40 )、マルトース−結合蛋白
質（ＭＰＢ）（Bedouelle, H. and Duplay, P. (1988)E
ur. J. Biochem. 171, 541-549)、プロテインＡ（Nilss
on, B., Holmgren, E.,Josephson, S., Gatenbeck, S.,
Philipson, L., and Uhlen, M. (1985) Nucleic Acids
Res. 13, 1151-1162 )、プロテインＡのイムノグロブ
リン結合Ｚ−ドメイン（Nilsson, B., et al. (1987) P
rot. Eng. 1, 107-113) 、またはプロテインＧ（Nygre
n, P-A., Eliasson, M., Abrahamsen, L. and Uhlen,
M. (1988) J.Mol. Recog. 1, 69-74 ) 等が用いられ、
通常、目的蛋白質をこれらの蛋白質のＣ−末端側に融合
した蛋白質として発現させる。元来、アフィニティーに
よる精製や定量を容易にするためこれら融合蛋白質とし
て発現させることが意図されたが、封入体を形成する蛋
白質でもこれらを融合蛋白質として発現させた場合、し
ばしば可溶性となることも大きな利点として挙げられ
る。融合蛋白質とすることにより可溶化することは、特
にＧＳＴとの融合蛋白質においてみられる現象である
が、その後の特筆すべき成果として、ＭｃＣｏｙらによ
るチオレドキシンとの融合蛋白質として発現させる方法
を挙げることができる。すなわち、彼らによるとチオレ
ドキシンと融合させ、低温で発現させることにより、１
１種類のリンホカインを可溶性でかつ高レベルに大腸菌
内に蓄積させることが可能になった（LaVallie, E. R.
et al.(1993) Bio/Technology 11, 187-193 ) 。
【０００９】しかしながら、融合蛋白質のままでは、多
くの蛋白質はその機能を発揮できないので、目的の蛋白
質を得るためには、アフィニティー精製した融合蛋白質
をペプチダーゼにより切断し、目的の蛋白質だけを分離
精製しなければならない。この切断と精製の効率が極め
て低い場合も少なくはなく、融合蛋白質として発現させ
る方法のひとつの欠点となっている。
くの蛋白質はその機能を発揮できないので、目的の蛋白
質を得るためには、アフィニティー精製した融合蛋白質
をペプチダーゼにより切断し、目的の蛋白質だけを分離
精製しなければならない。この切断と精製の効率が極め
て低い場合も少なくはなく、融合蛋白質として発現させ
る方法のひとつの欠点となっている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】上記の状況の下で、封
入体の生成を回避し目的の蛋白質を生物学的に活性な可
溶型として発現させる一般的な方法の開発が産業界およ
び研究の分野で切望されている。従って、本発明の第１
の目的は、チオレドキシン遺伝子の発現ベクターと外来
の目的遺伝子の発現ベクターとにより共形質転換された
細菌を提供することにある。また、本発明の第２の目的
は、かかる共形質転換細菌を用いて、大腸菌の菌体内で
封入体のような不溶性のアグリゲートとして産生される
主として真核生物の遺伝子産物を、他の蛋白質との融合
体としてではなく、それ本来の形で可溶型として生産す
る方法を提供することにある。
入体の生成を回避し目的の蛋白質を生物学的に活性な可
溶型として発現させる一般的な方法の開発が産業界およ
び研究の分野で切望されている。従って、本発明の第１
の目的は、チオレドキシン遺伝子の発現ベクターと外来
の目的遺伝子の発現ベクターとにより共形質転換された
細菌を提供することにある。また、本発明の第２の目的
は、かかる共形質転換細菌を用いて、大腸菌の菌体内で
封入体のような不溶性のアグリゲートとして産生される
主として真核生物の遺伝子産物を、他の蛋白質との融合
体としてではなく、それ本来の形で可溶型として生産す
る方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、大腸菌に
おいて不溶性アグリゲートとして菌体内に蓄積する真核
生物細胞蛋白質の可溶化について鋭意検討を行ったとこ
ろ、大腸菌における種々の真核生物細胞蛋白質の可溶化
がチオレドキシンを同時に産生させることにより劇的に
増大することを発見した。即ち、チオレドキシン遺伝子
を共発現させることにより、検討を加えた転写因子やオ
ンコジーン産物をふくむ８種の蛋白質の全てを可溶型と
して発現させることに成功した。一方、同時に行った大
腸菌シャペロンであるＧｒｏＥＳＬとの共発現では、検
討した８種の蛋白質のうち４種の可溶化を改善したにと
どまった。本発明はかかる発見に基づき、さらに研究を
重ねて完成するに至ったものである。
おいて不溶性アグリゲートとして菌体内に蓄積する真核
生物細胞蛋白質の可溶化について鋭意検討を行ったとこ
ろ、大腸菌における種々の真核生物細胞蛋白質の可溶化
がチオレドキシンを同時に産生させることにより劇的に
増大することを発見した。即ち、チオレドキシン遺伝子
を共発現させることにより、検討を加えた転写因子やオ
ンコジーン産物をふくむ８種の蛋白質の全てを可溶型と
して発現させることに成功した。一方、同時に行った大
腸菌シャペロンであるＧｒｏＥＳＬとの共発現では、検
討した８種の蛋白質のうち４種の可溶化を改善したにと
どまった。本発明はかかる発見に基づき、さらに研究を
重ねて完成するに至ったものである。
【００１２】即ち、本発明の要旨は、（１） チオレド
キシン遺伝子の発現ベクターと目的遺伝子の発現ベクタ
ーにより形質転換されてなる共形質転換細菌、（２）
チオレドキシンが、大腸菌のチオレドキシン、ヒトのチ
オレドキシン、グルタレドキシン、またはプロテインジ
スルフィドイソメラーゼのチオレドキシン様ドメインで
ある請求項１記載の共形質転換細菌、（３） チオレド
キシン遺伝子の発現ベクターが、Ｔ７ブロモーター、ｌ
ａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモ
ーター、ｔｒｐプロモーター、λＰL プロモーター、ａ
ｒａプロモーターのいずれかの制御下にチオレドキシン
遺伝子の発現を可能とするものである前記（１）または
（２）記載の共形質転換細菌、（４） 目的遺伝子が、
インターフェロン、インターロイキン、インターロイキ
ン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コ
ロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチ
ン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因
子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、イ
ンスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来
成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長
因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因
子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因
子、ニューロトロフィン、ウロキナーゼ、組織プラロミ
ノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテイン
Ｃ、グルコセレブロシダーゼ、スーバーオキシドディス
ムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシ
ン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビタ
ー、リポコルチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体
成分、血清アルブミン、ウイルス構成蛋白質、プロトオ
ンコジーン産物、および転写調節因子からなる群より選
択されるものである前記（１）〜（３）いずれかに記載
の共形質転換細菌、並びに（５） 前記（１）〜（４）
いずれかに記載の共形質転換細菌を用いて、目的遺伝子
がコードするタンパク質を可溶性蛋白質として発現させ
ることを特徴とする可溶性蛋白質の生産方法、に関す
る。
キシン遺伝子の発現ベクターと目的遺伝子の発現ベクタ
ーにより形質転換されてなる共形質転換細菌、（２）
チオレドキシンが、大腸菌のチオレドキシン、ヒトのチ
オレドキシン、グルタレドキシン、またはプロテインジ
スルフィドイソメラーゼのチオレドキシン様ドメインで
ある請求項１記載の共形質転換細菌、（３） チオレド
キシン遺伝子の発現ベクターが、Ｔ７ブロモーター、ｌ
ａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモ
ーター、ｔｒｐプロモーター、λＰL プロモーター、ａ
ｒａプロモーターのいずれかの制御下にチオレドキシン
遺伝子の発現を可能とするものである前記（１）または
（２）記載の共形質転換細菌、（４） 目的遺伝子が、
インターフェロン、インターロイキン、インターロイキ
ン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コ
ロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチ
ン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因
子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、イ
ンスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来
成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長
因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因
子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因
子、ニューロトロフィン、ウロキナーゼ、組織プラロミ
ノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテイン
Ｃ、グルコセレブロシダーゼ、スーバーオキシドディス
ムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシ
ン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビタ
ー、リポコルチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体
成分、血清アルブミン、ウイルス構成蛋白質、プロトオ
ンコジーン産物、および転写調節因子からなる群より選
択されるものである前記（１）〜（３）いずれかに記載
の共形質転換細菌、並びに（５） 前記（１）〜（４）
いずれかに記載の共形質転換細菌を用いて、目的遺伝子
がコードするタンパク質を可溶性蛋白質として発現させ
ることを特徴とする可溶性蛋白質の生産方法、に関す
る。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明の詳細について説明
する。 （１）プラスミドの構築 本発明の共形質転換細菌は、チオレドキシン遺伝子の発
現ベクターと目的遺伝子の発現ベクターの両者により形
質転換されており、細菌細胞内でチオレドキシンと目的
遺伝子産物の両者を同時に発現することができる形質転
換体を意味する。かかる形質転換細菌を作製するために
は、チオレドキシン遺伝子の発現ベクターと目的遺伝子
の発現ベクターとが必要である。通常、同一宿主に近縁
の２種のブラスミドは安定に共存できない（この現象を
不和合性という。）ので、両プラスミドが互いに不和合
性を示さないレプリコンを有するものであれば使用可能
であり、特に限定されるものではない。発現効率という
観点からは、プロモーターの選択も重要な要因となる
が、これも通常強力なプロモーターとして知られている
ものから選択が可能である。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼによって特異的にかつ強力に転写されるＴ７プロ
モーターや、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）で転写誘導が可能なｌａｃプロモー
ターもしくはｔａｃプロモーターあるいはｔｒｃプロモ
ーター、３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）で転写誘
導が可能なｔｒｐプロモーターのほか、高温（４２℃）
で誘導可能なλＰL プロモーター、さらにはアラビノー
スで誘導可能なａｒａプロモーター等が使用できる。
する。 （１）プラスミドの構築 本発明の共形質転換細菌は、チオレドキシン遺伝子の発
現ベクターと目的遺伝子の発現ベクターの両者により形
質転換されており、細菌細胞内でチオレドキシンと目的
遺伝子産物の両者を同時に発現することができる形質転
換体を意味する。かかる形質転換細菌を作製するために
は、チオレドキシン遺伝子の発現ベクターと目的遺伝子
の発現ベクターとが必要である。通常、同一宿主に近縁
の２種のブラスミドは安定に共存できない（この現象を
不和合性という。）ので、両プラスミドが互いに不和合
性を示さないレプリコンを有するものであれば使用可能
であり、特に限定されるものではない。発現効率という
観点からは、プロモーターの選択も重要な要因となる
が、これも通常強力なプロモーターとして知られている
ものから選択が可能である。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼによって特異的にかつ強力に転写されるＴ７プロ
モーターや、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）で転写誘導が可能なｌａｃプロモー
ターもしくはｔａｃプロモーターあるいはｔｒｃプロモ
ーター、３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）で転写誘
導が可能なｔｒｐプロモーターのほか、高温（４２℃）
で誘導可能なλＰL プロモーター、さらにはアラビノー
スで誘導可能なａｒａプロモーター等が使用できる。
【００１４】本発明に用いられるチオレドキシンは大腸
菌のチオレドキシン（Lunn, C. A.,Kathju, S., Wallac
e, B. J., Kushner, S. R., and Pigiet, V. (1984) J.
Biol. Chem. 259, 10469-10474）のみでなく、ヒトの
チオレドキシン（Wollman, E. E., d'Auriol, L., Rims
ky, L., Shaw, A., Jacquot, J. P., Wingfield, P.,Gr
aber, P., Dessarps, F., Robin, P., Galibert, F., e
t al.(1988) J. Biol. Chem. 263, 15506-15512) 、グ
ルタレドキシン（Hoog, J. O., von Bahr-Lindstrom,
H., Jornvall, H., and Holmgren, A. (1986) Gene 43,
13-21、 Fernando, M. R., Sumimoto, H., Nanri, H.,
Kawabata, S., Iwanaga, S., Minakami,S., Fukumaki,
Y., and Takashige, K. (1994) Biochim. Biophys. Act
a 1218,229-231)、プロテインジスルフィドイソメラー
ゼのチオレドキシン様ドメイン（Edman, J. C., Ellis,
L., Blacher, R. W., Roth, R. A., and Rutter, W.
J.(1985) Nature 317, 267-270、 Tachikawa, H., Miur
a, T., Katakura, Y., andMizunaga, T. (1991) J. Bio
chem. 110, 306-313) 等も使用可能である。本発明の特
徴は、チオレドキシンの共発現により宿主細胞内の酸化
還元電位をより還元型とし、真核生物細胞のそれに近づ
けることにあり、その意味では上記のチオレドキシンは
いずれも大腸菌チオレドキシンと同様の効果を発揮でき
るからである。以下には、大腸菌チオレドキシン（Ｔｒ
ｘ）を例にとり、プロモーターとしてＴ７プロモーター
を利用した場合の発現ベクターの構築について説明す
る。
菌のチオレドキシン（Lunn, C. A.,Kathju, S., Wallac
e, B. J., Kushner, S. R., and Pigiet, V. (1984) J.
Biol. Chem. 259, 10469-10474）のみでなく、ヒトの
チオレドキシン（Wollman, E. E., d'Auriol, L., Rims
ky, L., Shaw, A., Jacquot, J. P., Wingfield, P.,Gr
aber, P., Dessarps, F., Robin, P., Galibert, F., e
t al.(1988) J. Biol. Chem. 263, 15506-15512) 、グ
ルタレドキシン（Hoog, J. O., von Bahr-Lindstrom,
H., Jornvall, H., and Holmgren, A. (1986) Gene 43,
13-21、 Fernando, M. R., Sumimoto, H., Nanri, H.,
Kawabata, S., Iwanaga, S., Minakami,S., Fukumaki,
Y., and Takashige, K. (1994) Biochim. Biophys. Act
a 1218,229-231)、プロテインジスルフィドイソメラー
ゼのチオレドキシン様ドメイン（Edman, J. C., Ellis,
L., Blacher, R. W., Roth, R. A., and Rutter, W.
J.(1985) Nature 317, 267-270、 Tachikawa, H., Miur
a, T., Katakura, Y., andMizunaga, T. (1991) J. Bio
chem. 110, 306-313) 等も使用可能である。本発明の特
徴は、チオレドキシンの共発現により宿主細胞内の酸化
還元電位をより還元型とし、真核生物細胞のそれに近づ
けることにあり、その意味では上記のチオレドキシンは
いずれも大腸菌チオレドキシンと同様の効果を発揮でき
るからである。以下には、大腸菌チオレドキシン（Ｔｒ
ｘ）を例にとり、プロモーターとしてＴ７プロモーター
を利用した場合の発現ベクターの構築について説明す
る。
【００１５】目的遺伝子の発現ベクターとして、Ｔ７プ
ロモーターとｐＢＲ３２２由来のレプリコンとを含むｐ
ＥＴベクターを使用する場合、Ｔｒｘを目的の外来蛋白
質の発現レベルと同レベルで発現させるために、Ｔｒｘ
コード領域をＴ７プロモーターに連結し、ｐ１５Ａレプ
リコンおよびクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ）マーカ
ー遺伝子を含むｐＡＣＹＣベクター（Chang, A. C. Y.,
and Cohen, S. N. (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1
156 ) に挿入する。得られたプラスミド、ｐＴ−Ｔｒｘ
は、プラスミド和合性の範囲内で、種々の脊椎動物蛋白
質を発現するｐＥＴプラスミドと共形質転換を行うこと
が可能である。
ロモーターとｐＢＲ３２２由来のレプリコンとを含むｐ
ＥＴベクターを使用する場合、Ｔｒｘを目的の外来蛋白
質の発現レベルと同レベルで発現させるために、Ｔｒｘ
コード領域をＴ７プロモーターに連結し、ｐ１５Ａレプ
リコンおよびクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ）マーカ
ー遺伝子を含むｐＡＣＹＣベクター（Chang, A. C. Y.,
and Cohen, S. N. (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1
156 ) に挿入する。得られたプラスミド、ｐＴ−Ｔｒｘ
は、プラスミド和合性の範囲内で、種々の脊椎動物蛋白
質を発現するｐＥＴプラスミドと共形質転換を行うこと
が可能である。
【００１６】まず、Ｔ７プロモーターと例えばｐ１５Ａ
レプリコンとを含むプラスミド（ｐＡＣＹＣ−Ｔ７）を
作製するには、ｐ１５Ａレプリコンを有するプラスミド
ｐＡＣＹＣ１８４（Chang, A. C. Y., and Cohen, S.
N. (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1156 ) の０．５
ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片を、プラスミドｐＡ
Ｒ２１５６（Studier F. W., and Moffatt, B. A. (198
6) J. Mol. Biol. 189,113-130 、Rosenberg, A. H., L
ade, B. N., Chui, D.-S., Lin, S.-W., Dunn,J. J., a
nd Studier F. W. (1987) Gene 56, 125-135 )由来のＴ
７プロモーターを含む０．６ｋｂ ＨｉｎｄIII −Ｓｐ
ｈＩ断片で置換する方法が用いられる。
レプリコンとを含むプラスミド（ｐＡＣＹＣ−Ｔ７）を
作製するには、ｐ１５Ａレプリコンを有するプラスミド
ｐＡＣＹＣ１８４（Chang, A. C. Y., and Cohen, S.
N. (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1156 ) の０．５
ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片を、プラスミドｐＡ
Ｒ２１５６（Studier F. W., and Moffatt, B. A. (198
6) J. Mol. Biol. 189,113-130 、Rosenberg, A. H., L
ade, B. N., Chui, D.-S., Lin, S.-W., Dunn,J. J., a
nd Studier F. W. (1987) Gene 56, 125-135 )由来のＴ
７プロモーターを含む０．６ｋｂ ＨｉｎｄIII −Ｓｐ
ｈＩ断片で置換する方法が用いられる。
【００１７】ついで、Ｔｒｘをコードする領域にＴ７プ
ロモーターを連結させたプラスミド（ｐＴ−Ｔｒｘ）を
作製するには、例えばｐＴ−ＧｒｏＥのＮｄｅＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片を、米国 Invitrogen 社より販売されてい
るプラスミドｐＴｒｘ由来の大腸菌チオレドキシンのコ
ード領域とａｓｐＡ転写ターミネーターを含むＮｄｅＩ
−ＨｉｎｄIII 断片で置換する方法を用いることができ
る。このｐＴ−ＧｒｏＥ（Ｔ７プロモーターの制御下に
大腸菌ＧｒｏＥＳＬを発現するプラスミド）は、ｇｒｏ
Ｅプラスミド（ｐＫＶ１５６１）（Kanemori, M., Mor
i, H., and Yura, T. (1994) J. Bacteriol. 176, 4235
-4242) を鋳型としてポリメラーゼ チェイン リアク
ション（ＰＣＲ）により調製した、ＧｒｏＥＳＬ−コー
ド領域を含む２．１ｋｂのＮｄｅＩ−ＢｇｌII ＤＮＡ
断片を、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位
に挿入して作製することができる。
ロモーターを連結させたプラスミド（ｐＴ−Ｔｒｘ）を
作製するには、例えばｐＴ−ＧｒｏＥのＮｄｅＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片を、米国 Invitrogen 社より販売されてい
るプラスミドｐＴｒｘ由来の大腸菌チオレドキシンのコ
ード領域とａｓｐＡ転写ターミネーターを含むＮｄｅＩ
−ＨｉｎｄIII 断片で置換する方法を用いることができ
る。このｐＴ−ＧｒｏＥ（Ｔ７プロモーターの制御下に
大腸菌ＧｒｏＥＳＬを発現するプラスミド）は、ｇｒｏ
Ｅプラスミド（ｐＫＶ１５６１）（Kanemori, M., Mor
i, H., and Yura, T. (1994) J. Bacteriol. 176, 4235
-4242) を鋳型としてポリメラーゼ チェイン リアク
ション（ＰＣＲ）により調製した、ＧｒｏＥＳＬ−コー
ド領域を含む２．１ｋｂのＮｄｅＩ−ＢｇｌII ＤＮＡ
断片を、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位
に挿入して作製することができる。
【００１８】また、Ｔ７プロモーター以外のプロモータ
ーを用いる例として、３−インドールアクリル酸で誘導
可能なｔｒｐプロモーターを利用したＴｒｘ発現プラス
ミドは、例えば以下のようにして構築することができ
る。ｐＴｒｘ（米国 Invitrogen 社製）から調製したＴ
ｒｘのコード領域とａｓｐＡ転写ターミネーターを含む
ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片を、例えばｐＭ５９４（Mo
rishita, H., Yamakawa,T., Matsusue, T., Kusuyama,
T. et al., (1994) Thromb. Res. 73,193-204)をＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄIII 消化して得られるｔｒｐプロモータ
ー／オペレーターを含む断片と連結し、シャトルベクタ
ーｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社製）のＢｇｌII−Ａｃ
ｃＩ断片と結合させて、ｐＡＣＹＣ１７７由来のレプリ
コンとアンピシリン耐性遺伝子を持つｔｒｐプロモータ
ーによるＴｒｘ発現プラスミドが作製できる。さらに、
必要に応じて、アンピシリン耐性遺伝子上のＳｃａＩ部
位に、ｐＵＣ４Ｋ（スウェーデン Pharmacia Biotech社
製）から得られるカナマイシン耐性遺伝子を含むＳａｌ
Ｉ断片を挿入して、薬剤耐性マーカーを変換することも
できる。
ーを用いる例として、３−インドールアクリル酸で誘導
可能なｔｒｐプロモーターを利用したＴｒｘ発現プラス
ミドは、例えば以下のようにして構築することができ
る。ｐＴｒｘ（米国 Invitrogen 社製）から調製したＴ
ｒｘのコード領域とａｓｐＡ転写ターミネーターを含む
ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片を、例えばｐＭ５９４（Mo
rishita, H., Yamakawa,T., Matsusue, T., Kusuyama,
T. et al., (1994) Thromb. Res. 73,193-204)をＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄIII 消化して得られるｔｒｐプロモータ
ー／オペレーターを含む断片と連結し、シャトルベクタ
ーｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社製）のＢｇｌII−Ａｃ
ｃＩ断片と結合させて、ｐＡＣＹＣ１７７由来のレプリ
コンとアンピシリン耐性遺伝子を持つｔｒｐプロモータ
ーによるＴｒｘ発現プラスミドが作製できる。さらに、
必要に応じて、アンピシリン耐性遺伝子上のＳｃａＩ部
位に、ｐＵＣ４Ｋ（スウェーデン Pharmacia Biotech社
製）から得られるカナマイシン耐性遺伝子を含むＳａｌ
Ｉ断片を挿入して、薬剤耐性マーカーを変換することも
できる。
【００１９】本発明に用いられる目的遺伝子としては、
インターフェロン、インターロイキン、インターロイキ
ン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コ
ロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチ
ン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因
子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、イ
ンスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来
成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長
因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因
子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因
子、ニューロトロフィン、ウロキナーゼ、組織プラロミ
ノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテイン
Ｃ、グルコセレブロシダーゼ、スーバーオキシドディス
ムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシ
ン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビタ
ー、リポコルチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体
成分、血清アルブミン、ウイルス構成蛋白質、プロトオ
ンコジーン産物、および転写調節因子等が挙げられる
が、これらに限定されるものではなく、通常の遺伝子発
現方法により大腸菌等で発現させた場合に封入体のよう
な不溶性の蛋白質として発現される真核生物の遺伝子は
すべて使用できる。以下には、マウスｃ−Ｍｙｂ遺伝
子、ｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白質（ＣＲＥ−ＢＰ
１）遺伝子、ｐ５３癌抑制遺伝子、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｍ
ｏｓプロト−オンコジーン、ｌｃｋ遺伝子、ｓｋｉ−関
連遺伝子、ｍｙｃプロト−オンコジーン、アデノウイル
スオンコジーンの８種を目的遺伝子として使用した例で
説明する。
インターフェロン、インターロイキン、インターロイキ
ン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コ
ロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチ
ン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因
子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリン、イ
ンスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来
成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長
因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因
子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因
子、ニューロトロフィン、ウロキナーゼ、組織プラロミ
ノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテイン
Ｃ、グルコセレブロシダーゼ、スーバーオキシドディス
ムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシ
ン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビタ
ー、リポコルチン、免疫グロブリン、１本鎖抗体、補体
成分、血清アルブミン、ウイルス構成蛋白質、プロトオ
ンコジーン産物、および転写調節因子等が挙げられる
が、これらに限定されるものではなく、通常の遺伝子発
現方法により大腸菌等で発現させた場合に封入体のよう
な不溶性の蛋白質として発現される真核生物の遺伝子は
すべて使用できる。以下には、マウスｃ−Ｍｙｂ遺伝
子、ｃＡＭＰ応答エレメント結合蛋白質（ＣＲＥ−ＢＰ
１）遺伝子、ｐ５３癌抑制遺伝子、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｍ
ｏｓプロト−オンコジーン、ｌｃｋ遺伝子、ｓｋｉ−関
連遺伝子、ｍｙｃプロト−オンコジーン、アデノウイル
スオンコジーンの８種を目的遺伝子として使用した例で
説明する。
【００２０】各種の脊椎動物の目的蛋白質を発現するプ
ラスミドは、前記のように、例えばＴ７プロモーターお
よびｐＢＲ３２２由来のレプリコンを含む適当なｐＥＴ
発現ベクター（Studier F. W., and Moffatt, B. A. (1
986) J. Mol. Biol. 189, 113-130 、Rosenberg, A.
H., Lade, B. N., Chui, D.-S., Lin, S.-W., Dunn, J.
J., and Studier F. W. (1987) Gene 56, 125-135 )と
目的蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いて構築すること
ができる。
ラスミドは、前記のように、例えばＴ７プロモーターお
よびｐＢＲ３２２由来のレプリコンを含む適当なｐＥＴ
発現ベクター（Studier F. W., and Moffatt, B. A. (1
986) J. Mol. Biol. 189, 113-130 、Rosenberg, A.
H., Lade, B. N., Chui, D.-S., Lin, S.-W., Dunn, J.
J., and Studier F. W. (1987) Gene 56, 125-135 )と
目的蛋白質をコードするｃＤＮＡを用いて構築すること
ができる。
【００２１】（２）共形質転換細菌の作製 本発明に用いられる共形質転換細菌は、前記のように、
目的の外来遺伝子発現ベクターとチオレドキシン遺伝子
発現ベクターの両方で形質転換され、目的の遺伝子産物
とチオレドキシンとを同時に発現することができる細菌
である。本発明に用いられる宿主細胞は、真核生物遺伝
子を発現した場合に、発現産物を封入体のような不溶性
蛋白質として菌体内に蓄積する微生物細胞である。特
に、大腸菌のようなグラム陰性細菌が適当である。Ｔ７
プロモーターを利用した発現ベクターを用いる場合は、
例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλフ
ァージを溶原化した大腸菌等、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
を発現する細菌が用いられる。以下に大腸菌を宿主細胞
とした場合を例にとり説明する。
目的の外来遺伝子発現ベクターとチオレドキシン遺伝子
発現ベクターの両方で形質転換され、目的の遺伝子産物
とチオレドキシンとを同時に発現することができる細菌
である。本発明に用いられる宿主細胞は、真核生物遺伝
子を発現した場合に、発現産物を封入体のような不溶性
蛋白質として菌体内に蓄積する微生物細胞である。特
に、大腸菌のようなグラム陰性細菌が適当である。Ｔ７
プロモーターを利用した発現ベクターを用いる場合は、
例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλフ
ァージを溶原化した大腸菌等、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
を発現する細菌が用いられる。以下に大腸菌を宿主細胞
とした場合を例にとり説明する。
【００２２】次に、前記のようにして構築したｐＴ−Ｔ
ｒｘベクターおよびｐＥＴベクターを用いて、例えば大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier F. W., and Moffa
tt,B. A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130 、Rosen
berg, A. H., Lade, B. N.,Chui, D.-S., Lin, S.-W.,
Dunn, J. J., and Studier F. W. (1987) Gene 56,125-
135 )を形質転換し、両方のベクターを保持する形質転
換細菌を作製する。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、ｌ
ａｃＵＶ５プロモーター下流に結合させたＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子をもつλファージを染色体上に溶原化
しており、ＩＰＴＧで誘導することにより、大量のＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを菌体内に発現させることができ、
Ｔ７プロモーター支配下の遺伝子の大量発現に極めて好
適な宿主菌株である。
ｒｘベクターおよびｐＥＴベクターを用いて、例えば大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Studier F. W., and Moffa
tt,B. A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130 、Rosen
berg, A. H., Lade, B. N.,Chui, D.-S., Lin, S.-W.,
Dunn, J. J., and Studier F. W. (1987) Gene 56,125-
135 )を形質転換し、両方のベクターを保持する形質転
換細菌を作製する。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、ｌ
ａｃＵＶ５プロモーター下流に結合させたＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子をもつλファージを染色体上に溶原化
しており、ＩＰＴＧで誘導することにより、大量のＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを菌体内に発現させることができ、
Ｔ７プロモーター支配下の遺伝子の大量発現に極めて好
適な宿主菌株である。
【００２３】また、外来蛋白質とＴｒｘの両方を発現す
る細菌（共形質転換細菌）を作製するには、前記のよう
にして得られるｐＴ−Ｔｒｘを保持する大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株を、種々の哺乳類蛋白質をコードするｐＥ
Ｔベクターで形質転換することにより得られる。すなわ
ち、まず大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を対数増殖期中期
まで振盪培養し、遠心分離で菌体を集め、カルシウムイ
オンの存在下で低温処理しＤＮＡ取り込み能をもったコ
ンピテント細胞を調製する。コンピテント細胞は滅菌グ
リセロールを終濃度約１５％となるように添加すること
により、−７０℃で凍結保存できる。上記コンピテント
細胞の懸濁液にｐＴ−Ｔｒｘ溶液を加え、４２℃の熱処
理を行ったのち、液体培地を加え薬剤耐性遺伝子が発現
するまで回復培養し、適当な薬剤を含む寒天培地上に広
げて培養する。生じたコロニーを単離し、ｐＴ−Ｔｒｘ
で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得る。
次いで、ｐＴ−Ｔｒｘで形質転換された大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株のコンピテント細胞を同様に調製し、この
コンピテント細胞の懸濁液に種々の蛋白質をコードする
発現プラスミドｐＥＴの溶液を加え、同様に形質転換を
行い、ｐＴ−Ｔｒｘおよび種々の哺乳類蛋白質をコード
するｐＥＴの両方のプラスミドを保持する大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）株を得ることができる。
る細菌（共形質転換細菌）を作製するには、前記のよう
にして得られるｐＴ−Ｔｒｘを保持する大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株を、種々の哺乳類蛋白質をコードするｐＥ
Ｔベクターで形質転換することにより得られる。すなわ
ち、まず大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を対数増殖期中期
まで振盪培養し、遠心分離で菌体を集め、カルシウムイ
オンの存在下で低温処理しＤＮＡ取り込み能をもったコ
ンピテント細胞を調製する。コンピテント細胞は滅菌グ
リセロールを終濃度約１５％となるように添加すること
により、−７０℃で凍結保存できる。上記コンピテント
細胞の懸濁液にｐＴ−Ｔｒｘ溶液を加え、４２℃の熱処
理を行ったのち、液体培地を加え薬剤耐性遺伝子が発現
するまで回復培養し、適当な薬剤を含む寒天培地上に広
げて培養する。生じたコロニーを単離し、ｐＴ−Ｔｒｘ
で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得る。
次いで、ｐＴ−Ｔｒｘで形質転換された大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株のコンピテント細胞を同様に調製し、この
コンピテント細胞の懸濁液に種々の蛋白質をコードする
発現プラスミドｐＥＴの溶液を加え、同様に形質転換を
行い、ｐＴ−Ｔｒｘおよび種々の哺乳類蛋白質をコード
するｐＥＴの両方のプラスミドを保持する大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）株を得ることができる。
【００２４】コンピテント細胞の調製法には種々の変法
があるが、いずれの方法も利用できる。また、大腸菌の
形質転換法としては、大腸菌とＤＮＡの浮遊液に高電圧
パルスをかけることにより細胞にＤＮＡを取り込ませる
エレクトロポレーション法も知られており、この方法も
利用可能である。ｐＴ−Ｔｒｘおよび種々の哺乳類蛋白
質をコードするｐＥＴの両方のプラスミドを同時に大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入することも可能である
が、一旦ｐＴ−Ｔｒｘで形質転換した大腸菌株を作製し
ておき、この形質転換株にさらに目的に応じて種々の哺
乳類蛋白質をコードするｐＥＴプラスミドを導入すると
いう２段階で形質転換する方法をとるのが便利である。
このようにして得られた共形質転換細菌として、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／Ｔｒｘ−Ｍｙｂが工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５２３２）。
があるが、いずれの方法も利用できる。また、大腸菌の
形質転換法としては、大腸菌とＤＮＡの浮遊液に高電圧
パルスをかけることにより細胞にＤＮＡを取り込ませる
エレクトロポレーション法も知られており、この方法も
利用可能である。ｐＴ−Ｔｒｘおよび種々の哺乳類蛋白
質をコードするｐＥＴの両方のプラスミドを同時に大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入することも可能である
が、一旦ｐＴ−Ｔｒｘで形質転換した大腸菌株を作製し
ておき、この形質転換株にさらに目的に応じて種々の哺
乳類蛋白質をコードするｐＥＴプラスミドを導入すると
いう２段階で形質転換する方法をとるのが便利である。
このようにして得られた共形質転換細菌として、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／Ｔｒｘ−Ｍｙｂが工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５２３２）。
【００２５】（３）共形質転換細菌による真核生物遺伝
子の大腸菌による発現 得られた共形質転換細菌を適当な培地例えばスーパーブ
ロス（トリプトン３２ｇ、酵母エキス２０ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ、１Ｎ−ＮａＯＨ５ｍｌ／リットル）中でＡ550 が
約０．７になるまで培養し、次いでＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導をかけ
蛋白質を発現させる。細菌を遠心分離により集菌し、Ｐ
ＢＳ（１３０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１
０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．２）で洗
浄し、バッファーＡ（５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ
７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、
０．１ＭのＮａＣｌ）に懸濁し、超音波により破砕す
る。遠心分離後、上清を採取し目的の可溶性蛋白質を得
ることができる。
子の大腸菌による発現 得られた共形質転換細菌を適当な培地例えばスーパーブ
ロス（トリプトン３２ｇ、酵母エキス２０ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ、１Ｎ−ＮａＯＨ５ｍｌ／リットル）中でＡ550 が
約０．７になるまで培養し、次いでＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導をかけ
蛋白質を発現させる。細菌を遠心分離により集菌し、Ｐ
ＢＳ（１３０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１
０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．２）で洗
浄し、バッファーＡ（５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ
７．５、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、
０．１ＭのＮａＣｌ）に懸濁し、超音波により破砕す
る。遠心分離後、上清を採取し目的の可溶性蛋白質を得
ることができる。
【００２６】 目的蛋白質として、マウスｃ−Ｍｙｂ
（Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Nagase, T., Nakagos
hi, H., Gonda, T. J., and Ishii, S. (1989) Proc. N
atl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 5758-5762）、ｃＡＭＰ
応答エレメント結合蛋白（ＣＲＥ−ＢＰ１）（Maekawa,
T., Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Sudo, T., Fujisa
wa, J., Yoshida, M., and Ishii, S. (1989) EMBO J.
8, 2023-2028 )、ｐ５３癌抑制遺伝子産物（Vogelstei
n, B., and Kinzler, K. W. (1992) Cell 70, 523-526
)、Xenopus Mos プロト−オンコジーン産物（Ｍｏｓ）
（Sagata, N., Watanabe, N., Vande Woude, G. F., an
d Ikawa, Y. (1989) Nauture 342, 512-518）、ヒトｌ
ｃｋ遺伝子産物（Ｌｃｋ）（Marth, J. D., Peet, R.,
Krebs, E. G., and Perlmutter, R. M. (1985) Cell 4
3, 393-404 ）、ｓｋｉ−関連遺伝子産物（ＳｎｏＮ）
（Nagase, T., Nomura, N., and Ishii, S. (1993) J.
Biol. Chem. 268, 13710-13716）、ｍｙｃプロト−オン
コジーン産物（Ｍｙｃ）（Luescher, B., and Eisenma
n, R. N. (1990) Genes Dev. 4, 2025-2035）、および
アデノウイルスオンコジーン産物（Ｅ１Ａ）（Moran,
E., and Mathews, M. B. (1987) Cell 48, 177-178 ）
の８種の遺伝子産物を選択し、その溶解性に対するＴｒ
ｘの共発現の影響を調べる。
（Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Nagase, T., Nakagos
hi, H., Gonda, T. J., and Ishii, S. (1989) Proc. N
atl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 5758-5762）、ｃＡＭＰ
応答エレメント結合蛋白（ＣＲＥ−ＢＰ１）（Maekawa,
T., Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Sudo, T., Fujisa
wa, J., Yoshida, M., and Ishii, S. (1989) EMBO J.
8, 2023-2028 )、ｐ５３癌抑制遺伝子産物（Vogelstei
n, B., and Kinzler, K. W. (1992) Cell 70, 523-526
)、Xenopus Mos プロト−オンコジーン産物（Ｍｏｓ）
（Sagata, N., Watanabe, N., Vande Woude, G. F., an
d Ikawa, Y. (1989) Nauture 342, 512-518）、ヒトｌ
ｃｋ遺伝子産物（Ｌｃｋ）（Marth, J. D., Peet, R.,
Krebs, E. G., and Perlmutter, R. M. (1985) Cell 4
3, 393-404 ）、ｓｋｉ−関連遺伝子産物（ＳｎｏＮ）
（Nagase, T., Nomura, N., and Ishii, S. (1993) J.
Biol. Chem. 268, 13710-13716）、ｍｙｃプロト−オン
コジーン産物（Ｍｙｃ）（Luescher, B., and Eisenma
n, R. N. (1990) Genes Dev. 4, 2025-2035）、および
アデノウイルスオンコジーン産物（Ｅ１Ａ）（Moran,
E., and Mathews, M. B. (1987) Cell 48, 177-178 ）
の８種の遺伝子産物を選択し、その溶解性に対するＴｒ
ｘの共発現の影響を調べる。
【００２７】 その結果、実施例に示すように、Ｔｒ
ｘの共発現により、検討した８種の外来蛋白質すべての
溶解性を顕著に増加させることが分かる。一方、従来可
溶性因子として知られているＧｒｏＥＳＬの共発現の場
合は、検討した８種のうち４種の外来蛋白質の溶解性を
顕著に増加させたもののその程度はＴｒｘの共発現の場
合よりも小さく、また残りの４種については溶解性の増
加が認められない。これらの事実から、Ｔｒｘ共発現系
がＧｒｏＥ共発現系よりもはるかに有用性が高いと結論
することができる。
ｘの共発現により、検討した８種の外来蛋白質すべての
溶解性を顕著に増加させることが分かる。一方、従来可
溶性因子として知られているＧｒｏＥＳＬの共発現の場
合は、検討した８種のうち４種の外来蛋白質の溶解性を
顕著に増加させたもののその程度はＴｒｘの共発現の場
合よりも小さく、また残りの４種については溶解性の増
加が認められない。これらの事実から、Ｔｒｘ共発現系
がＧｒｏＥ共発現系よりもはるかに有用性が高いと結論
することができる。
【００２８】（４）共発現により得られる可溶型蛋白質
のコンフォーメーション 封入体のような不溶性蛋白質として発現したものを尿素
処理等で可溶化した場合は、得られた蛋白質はその蛋白
質本来のコンフォーメーションを持たないものが多いこ
とが知られている。そこで、Ｌｃｋの自己リン酸化活性
をメルクマールとして本発明の方法により可溶型として
発現された蛋白質が本来のコンフォーメーションを有す
るか否かについてしらべると、実施例に示すように、尿
素によって可溶化された蛋白質試料についてはその一部
分しか本来のコンフォーメーションを持っていないのに
対し、Ｔｒｘの共発現により可溶型として発現された蛋
白質は天然蛋白質のコンフォーメーションをもつと結論
できる。
のコンフォーメーション 封入体のような不溶性蛋白質として発現したものを尿素
処理等で可溶化した場合は、得られた蛋白質はその蛋白
質本来のコンフォーメーションを持たないものが多いこ
とが知られている。そこで、Ｌｃｋの自己リン酸化活性
をメルクマールとして本発明の方法により可溶型として
発現された蛋白質が本来のコンフォーメーションを有す
るか否かについてしらべると、実施例に示すように、尿
素によって可溶化された蛋白質試料についてはその一部
分しか本来のコンフォーメーションを持っていないのに
対し、Ｔｒｘの共発現により可溶型として発現された蛋
白質は天然蛋白質のコンフォーメーションをもつと結論
できる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。
【００３０】実施例１プラスミドの構築 Ｔ７プロモーターを含むプラスミド（ｐＡＣＹＣ−Ｔ
７）を作製するために、ｐＡＣＹＣ１８４（Chang, A.
C. Y., and Cohen, S. N. (1978) J. Bacteriol.134, 1
141-1156 ) の０．５ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ
ＤＮＡ断片をｐＡＲ２１５６ベクター（Studier F. W.,
and Moffatt, B. A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-
130 、Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D.-S.,
Lin, S.-W., Dunn, J. J., and Studier F. W. (1987)
Gene 56, 125-135 )由来のＴ７プロモーターを含む０．
６ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片で置換した。
７）を作製するために、ｐＡＣＹＣ１８４（Chang, A.
C. Y., and Cohen, S. N. (1978) J. Bacteriol.134, 1
141-1156 ) の０．５ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ
ＤＮＡ断片をｐＡＲ２１５６ベクター（Studier F. W.,
and Moffatt, B. A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-
130 、Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D.-S.,
Lin, S.-W., Dunn, J. J., and Studier F. W. (1987)
Gene 56, 125-135 )由来のＴ７プロモーターを含む０．
６ｋｂ ＨｉｎｄIII −ＳｐｈＩ断片で置換した。
【００３１】ＧｒｏＥＳＬ−コード領域( ２．１ｋｂ)
の５’末端にＮｄｅＩ部位を、３’末端にＢｇｌII部位
をもつＤＮＡ断片を、ｇｒｏＥプラスミド（ｐＫＶ１５
６１）（Kanemori, M., Mori, H., and Yura, T. (199
4) J. Bacteriol. 176, 4235-4242) を鋳型としたＰＣ
Ｒにより作製し、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７のＮｄｅＩ−Ｂａｍ
ＨＩ部位に挿入してＴ７プロモーターの制御下に大腸菌
ＧｒｏＥＳＬを発現するプラスミド（ｐＴ−ＧｒｏＥ）
を作製した（図１）。
の５’末端にＮｄｅＩ部位を、３’末端にＢｇｌII部位
をもつＤＮＡ断片を、ｇｒｏＥプラスミド（ｐＫＶ１５
６１）（Kanemori, M., Mori, H., and Yura, T. (199
4) J. Bacteriol. 176, 4235-4242) を鋳型としたＰＣ
Ｒにより作製し、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７のＮｄｅＩ−Ｂａｍ
ＨＩ部位に挿入してＴ７プロモーターの制御下に大腸菌
ＧｒｏＥＳＬを発現するプラスミド（ｐＴ−ＧｒｏＥ）
を作製した（図１）。
【００３２】Ｔｒｘをコードする領域にＴ７プロモータ
ーを連結させたプラスミド（ｐＴ−Ｔｒｘ）を作製する
ために、ｐＴ−ＧｒｏＥのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片
を、米国 Invitroｇen 社より販売されているプラスミ
ドｐＴｒｘ由来の大腸菌チオレドキシンのコード領域と
ａｓｐＡ転写ターミネーターを含むＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ
III 断片で置換した（図２）。
ーを連結させたプラスミド（ｐＴ−Ｔｒｘ）を作製する
ために、ｐＴ−ＧｒｏＥのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片
を、米国 Invitroｇen 社より販売されているプラスミ
ドｐＴｒｘ由来の大腸菌チオレドキシンのコード領域と
ａｓｐＡ転写ターミネーターを含むＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ
III 断片で置換した（図２）。
【００３３】目的の脊椎動物の蛋白質を発現するプラス
ミドは、Ｔ７プロモーターおよびｐＢＲ３２２由来のレ
プリコンを含む適当なｐＥＴ発現ベクター（Studier F.
W.,and Moffatt, B. A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 1
13-130 、Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D.-
S., Lin, S.-W., Dunn, J. J., and Studier F. W. (19
87) Gene 56, 125-135 )と目的の蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡを用いて構築した。すなわち、マウスｃ−Ｍｙｂ
cＤＮＡ（Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Nagase, T.,
Nakagoshi, H., Gonda, T. J., and Ishii, S. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5758-5762) 、ｃ
ＡＭＰ応答エレメント結合蛋白（ＣＲＥ−ＢＰ）ｃＤＮ
Ａ（Maekawa, T., Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Sud
o, T., Fujisawa, J., Yoshida, M., and Ishii, S. (1
989) EMBO J. 8, 2323-2328) 、ｐ５３癌抑制遺伝子産
物ｃＤＮＡ（Vogelstein, B. and Kinzler, K. W. (199
2) Cell 70, 523-526)、Xenopus Mos cDNA (Sagata,
N., Watanabe, N., Vande Woude,G. F., and Ikawa, Y.
(1989) Nature 342, 512-518) 、ヒトＳｎｏＮ cＤＮ
Ａ（Nagase, T., Nomura, N., and Ishii, S. (1993)
J. Biol. Chem. 268, 13710-13716) 、ヒトｃ−Ｍｙｃ
cＤＮＡ（Luscher, B. and Eisenman, R. N. (1990)Gen
es Dev. 4, 2025-2035) 、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子
（Moran, E. and Mathews, M. B. (1987) Cell 48, 177
-178) を用いて、ＰＣＲ法によりＮｄｅＩとＨｉｎｄII
I 部位をそれぞれ５’末端と３’末端に持つ各ＤＮＡ断
片をそれぞれ調製し、ｐＡＲ２１５６ベクター（Studie
r, P. W. and Moffatt, B. A. (1986)J. Mol. Biol. 18
9, 113-130 、Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui,
D. -S., Lin, S. -W., Dunn, J. J., and Studier, F.
W. (1987) Gene 56, 125-135)のＴ７プロモーター下流
のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片と置換した。
ミドは、Ｔ７プロモーターおよびｐＢＲ３２２由来のレ
プリコンを含む適当なｐＥＴ発現ベクター（Studier F.
W.,and Moffatt, B. A. (1986) J. Mol. Biol. 189, 1
13-130 、Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D.-
S., Lin, S.-W., Dunn, J. J., and Studier F. W. (19
87) Gene 56, 125-135 )と目的の蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡを用いて構築した。すなわち、マウスｃ−Ｍｙｂ
cＤＮＡ（Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Nagase, T.,
Nakagoshi, H., Gonda, T. J., and Ishii, S. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5758-5762) 、ｃ
ＡＭＰ応答エレメント結合蛋白（ＣＲＥ−ＢＰ）ｃＤＮ
Ａ（Maekawa, T., Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Sud
o, T., Fujisawa, J., Yoshida, M., and Ishii, S. (1
989) EMBO J. 8, 2323-2328) 、ｐ５３癌抑制遺伝子産
物ｃＤＮＡ（Vogelstein, B. and Kinzler, K. W. (199
2) Cell 70, 523-526)、Xenopus Mos cDNA (Sagata,
N., Watanabe, N., Vande Woude,G. F., and Ikawa, Y.
(1989) Nature 342, 512-518) 、ヒトＳｎｏＮ cＤＮ
Ａ（Nagase, T., Nomura, N., and Ishii, S. (1993)
J. Biol. Chem. 268, 13710-13716) 、ヒトｃ−Ｍｙｃ
cＤＮＡ（Luscher, B. and Eisenman, R. N. (1990)Gen
es Dev. 4, 2025-2035) 、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子
（Moran, E. and Mathews, M. B. (1987) Cell 48, 177
-178) を用いて、ＰＣＲ法によりＮｄｅＩとＨｉｎｄII
I 部位をそれぞれ５’末端と３’末端に持つ各ＤＮＡ断
片をそれぞれ調製し、ｐＡＲ２１５６ベクター（Studie
r, P. W. and Moffatt, B. A. (1986)J. Mol. Biol. 18
9, 113-130 、Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui,
D. -S., Lin, S. -W., Dunn, J. J., and Studier, F.
W. (1987) Gene 56, 125-135)のＴ７プロモーター下流
のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片と置換した。
【００３４】実施例２共形質転換体の作製 （１） 実施例１に示したように、外来の目的蛋白質を
発現するために、Ｔ７プロモーターとｐＢＲ３２２由来
のレプリコンとを含むｐＥＴベクターを使用した。Ｔｒ
ｘまたはＧｒｏＥＳＬを目的の外来蛋白質の発現レベル
と同レベルで発現させるために、Ｔｒｘコード領域また
はＧｒｏＥＳＬコード領域をＴ７プロモーターに連結
し、ｐ１５Ａレプリコンおよびクロラムフェニコール耐
性（Ｃｍ）マーカー遺伝子を含むｐＡＣＹＣベクター
（Chang, A. C. Y., and Cohen, S. N.(1978) J. Bacte
riol. 134, 1141-1156 ) に挿入した（図１および図
２）。得られたプラスミド、ｐＴ−ＴｒｘまたはｐＴ−
ＧｒｏＥは、プラスミド和合性の範囲内で、種々の脊椎
動物蛋白質を発現するｐＥＴプラスミドと共形質転換を
行うことが可能であった。
発現するために、Ｔ７プロモーターとｐＢＲ３２２由来
のレプリコンとを含むｐＥＴベクターを使用した。Ｔｒ
ｘまたはＧｒｏＥＳＬを目的の外来蛋白質の発現レベル
と同レベルで発現させるために、Ｔｒｘコード領域また
はＧｒｏＥＳＬコード領域をＴ７プロモーターに連結
し、ｐ１５Ａレプリコンおよびクロラムフェニコール耐
性（Ｃｍ）マーカー遺伝子を含むｐＡＣＹＣベクター
（Chang, A. C. Y., and Cohen, S. N.(1978) J. Bacte
riol. 134, 1141-1156 ) に挿入した（図１および図
２）。得られたプラスミド、ｐＴ−ＴｒｘまたはｐＴ−
ＧｒｏＥは、プラスミド和合性の範囲内で、種々の脊椎
動物蛋白質を発現するｐＥＴプラスミドと共形質転換を
行うことが可能であった。
【００３５】（２） これらのプラスミドからＴｒｘま
たはＧｒｏＥＳＬが発現したことを確認するため、大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴ−ＴｒｘまたはｐＴ−Ｇ
ｒｏＥプラスミドで形質転換し、ＩＰＴＧの存在下また
は非存在下に培養した。図３は各培養物の全蛋白質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後にクマジー染色したものを示す。ｐＴ
−ＴｒｘからＴｒｘが、またｐＴ−ＧｒｏＥからＧｒｏ
ＥＳとＧｒｏＥＬが過剰発現しており、ＴｒｘまたはＧ
ｒｏＥＳとＧｒｏＥＬは全細胞蛋白質の３０％を超えて
いることが分かった。
たはＧｒｏＥＳＬが発現したことを確認するため、大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴ−ＴｒｘまたはｐＴ−Ｇ
ｒｏＥプラスミドで形質転換し、ＩＰＴＧの存在下また
は非存在下に培養した。図３は各培養物の全蛋白質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後にクマジー染色したものを示す。ｐＴ
−ＴｒｘからＴｒｘが、またｐＴ−ＧｒｏＥからＧｒｏ
ＥＳとＧｒｏＥＬが過剰発現しており、ＴｒｘまたはＧ
ｒｏＥＳとＧｒｏＥＬは全細胞蛋白質の３０％を超えて
いることが分かった。
【００３６】（３） 外来蛋白質とＴｒｘまたは外来蛋
白質とＧｒｏＥの両方を発現する細菌を作製するため、
ｐＴ−ＴｒｘまたはｐＴ−ＧｒｏＥを保持する大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株を種々の哺乳類蛋白質をコードする
ｐＥＴベクターで形質転換した。すなわち、大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）株をＬＢ（トリプトン１０ｇ、酵母エキ
ス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ／リットル、ｐＨ７．
０）寒天培地上で３７℃にて１６〜２０時間培養し、生
育したシングルコロニーを１リットル容フラスコ中のＬ
Ｂ液体培地１００ｍｌに移してＯＤ600 が０．４〜０．
５に達するまで約３時間３７℃で振盪培養した。培養液
を氷上で１０分間冷却し、４０００ｒｐｍ、１０分間の
遠心分離により菌体を集めた。菌体を氷冷した２０ｍｌ
の０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し、氷水中に２０分間放置
した。４０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し菌体を集
め、再度氷冷した４ｍｌの０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を調製し
た。このコンピテント細胞の懸濁液２００μｌを滅菌し
た試験管にとり、これに上記のとおりに作製したｐＴ−
Ｔｒｘ溶液１０μｌ（ＤＮＡ量は１０ｎｇ以下）を加え
静かに混和して氷上に３０分間おいたのち、４２℃の恒
温槽に９０秒間浸し、直ちに氷冷した。８００μｌのＳ
ＯＣ（グルコース２０ｍＭ、トリプトン２０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、２５０ｍＭ ＫＣ
ｌの１０ｍｌ／リットル、ｐＨ７．０、使用直前に２Ｍ
のＭｇＣｌ2 ５ｍｌを添加）培地を加え、３７℃の恒温
槽に４５分間静置したのち、クロラムフェニコール（１
０μｇ／ｍｌ）を含むＳＯＢ（トリプトン２０ｇ、酵母
エキス５ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、２５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌの１０ｍｌ／リットル、ｐＨ７．０、使用直前に２
ＭのＭｇＣｌ2 ５ｍｌを添加）寒天培地上に広げ、３７
℃で１６時間培養し、ｐＴ−Ｔｒｘで形質転換された大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。ｐＴ−Ｔｒｘの代わ
りにｐＴ−ＧｒｏＥを用いて、同様にｐＴ−ＧｒｏＥで
形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。
白質とＧｒｏＥの両方を発現する細菌を作製するため、
ｐＴ−ＴｒｘまたはｐＴ−ＧｒｏＥを保持する大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株を種々の哺乳類蛋白質をコードする
ｐＥＴベクターで形質転換した。すなわち、大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）株をＬＢ（トリプトン１０ｇ、酵母エキ
ス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ／リットル、ｐＨ７．
０）寒天培地上で３７℃にて１６〜２０時間培養し、生
育したシングルコロニーを１リットル容フラスコ中のＬ
Ｂ液体培地１００ｍｌに移してＯＤ600 が０．４〜０．
５に達するまで約３時間３７℃で振盪培養した。培養液
を氷上で１０分間冷却し、４０００ｒｐｍ、１０分間の
遠心分離により菌体を集めた。菌体を氷冷した２０ｍｌ
の０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し、氷水中に２０分間放置
した。４０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し菌体を集
め、再度氷冷した４ｍｌの０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を調製し
た。このコンピテント細胞の懸濁液２００μｌを滅菌し
た試験管にとり、これに上記のとおりに作製したｐＴ−
Ｔｒｘ溶液１０μｌ（ＤＮＡ量は１０ｎｇ以下）を加え
静かに混和して氷上に３０分間おいたのち、４２℃の恒
温槽に９０秒間浸し、直ちに氷冷した。８００μｌのＳ
ＯＣ（グルコース２０ｍＭ、トリプトン２０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、２５０ｍＭ ＫＣ
ｌの１０ｍｌ／リットル、ｐＨ７．０、使用直前に２Ｍ
のＭｇＣｌ2 ５ｍｌを添加）培地を加え、３７℃の恒温
槽に４５分間静置したのち、クロラムフェニコール（１
０μｇ／ｍｌ）を含むＳＯＢ（トリプトン２０ｇ、酵母
エキス５ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、２５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌの１０ｍｌ／リットル、ｐＨ７．０、使用直前に２
ＭのＭｇＣｌ2 ５ｍｌを添加）寒天培地上に広げ、３７
℃で１６時間培養し、ｐＴ−Ｔｒｘで形質転換された大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。ｐＴ−Ｔｒｘの代わ
りにｐＴ−ＧｒｏＥを用いて、同様にｐＴ−ＧｒｏＥで
形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。
【００３７】次に、ｐＴ−Ｔｒｘで形質転換された大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をクロラムフェニコールを含む
ＬＢ寒天培地上で３７℃にて１６〜２０時間培養し、生
育したシングルコロニーを１リットル容フラスコ中のＬ
Ｂ液体培地１００ｍｌに移してＯＤ600 が０．４〜０．
５に達するまで約３時間３７℃で振盪培養した。培養液
を氷上で１０分間冷却し、４０００ｒｐｍ、１０分間の
遠心分離により菌体を集めた。菌体を氷冷した２０ｍｌ
の０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し、氷水中に２０分間放置
した。４０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し菌体を集
め、再度氷冷した４ｍｌの０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し
ｐＴ−Ｔｒｘを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コン
ピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞の懸濁
液２００μｌを滅菌した試験管にとり、これに上記のと
おりに作製した種々の脊椎動物蛋白質をコードするｐＥ
Ｔベクターの溶液１０μｌ（ＤＮＡ量は１０ｎｇ以下）
を加え静かに混和して氷上に３０分間おいたのち、４２
℃の恒温槽に９０秒間浸し、直ちに氷冷した。８００μ
ｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃の恒温槽に４５分間静置
したのち、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）、
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＳＯＢ寒天培地
上に広げ、３７℃で１６時間培養し、種々の脊椎動物蛋
白質をコードするｐＥＴ発現ベクターで形質転換された
ｐＴ−Ｔｒｘ保持大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。
同様にｐＴ−ＧｒｏＥで形質転換された大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株を用いて、種々の脊椎動物蛋白質をコード
するｐＥＴ発現ベクターで形質転換されたｐＴ−Ｇｒｏ
Ｅ保持大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をクロラムフェニコールを含む
ＬＢ寒天培地上で３７℃にて１６〜２０時間培養し、生
育したシングルコロニーを１リットル容フラスコ中のＬ
Ｂ液体培地１００ｍｌに移してＯＤ600 が０．４〜０．
５に達するまで約３時間３７℃で振盪培養した。培養液
を氷上で１０分間冷却し、４０００ｒｐｍ、１０分間の
遠心分離により菌体を集めた。菌体を氷冷した２０ｍｌ
の０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し、氷水中に２０分間放置
した。４０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し菌体を集
め、再度氷冷した４ｍｌの０．１ＭＣａＣｌ2 に懸濁し
ｐＴ−Ｔｒｘを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コン
ピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞の懸濁
液２００μｌを滅菌した試験管にとり、これに上記のと
おりに作製した種々の脊椎動物蛋白質をコードするｐＥ
Ｔベクターの溶液１０μｌ（ＤＮＡ量は１０ｎｇ以下）
を加え静かに混和して氷上に３０分間おいたのち、４２
℃の恒温槽に９０秒間浸し、直ちに氷冷した。８００μ
ｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃の恒温槽に４５分間静置
したのち、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）、
アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＳＯＢ寒天培地
上に広げ、３７℃で１６時間培養し、種々の脊椎動物蛋
白質をコードするｐＥＴ発現ベクターで形質転換された
ｐＴ−Ｔｒｘ保持大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。
同様にｐＴ−ＧｒｏＥで形質転換された大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株を用いて、種々の脊椎動物蛋白質をコード
するｐＥＴ発現ベクターで形質転換されたｐＴ−Ｇｒｏ
Ｅ保持大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。
【００３８】（４） 得られた細菌を、クロラムフェニ
コール（１０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／
ｍｌ）を含むスーパーブロス２．５ｍｌ中でＡ550 が
０．７になるまで培養し、ついで１ｍＭのＩＰＴＧで４
時間誘導をかけ蛋白質を発現させた。細菌を遠心分離に
より集菌し、ＰＢＳ（１３０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍ
ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐ
Ｈ７．２）で洗浄し、１５０μｌのバッファーＡ（５０
ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ）に
懸濁し、超音波により破砕した。遠心分離後、上清を採
取し可溶性画分とする。ペレットを２００μｌのＳＤＳ
サンプルバッファー中に懸濁し、３分間煮沸し、遠心分
離した。この上清を採取し不溶性画分とした。
コール（１０μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／
ｍｌ）を含むスーパーブロス２．５ｍｌ中でＡ550 が
０．７になるまで培養し、ついで１ｍＭのＩＰＴＧで４
時間誘導をかけ蛋白質を発現させた。細菌を遠心分離に
より集菌し、ＰＢＳ（１３０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍ
ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐ
Ｈ７．２）で洗浄し、１５０μｌのバッファーＡ（５０
ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ）に
懸濁し、超音波により破砕した。遠心分離後、上清を採
取し可溶性画分とする。ペレットを２００μｌのＳＤＳ
サンプルバッファー中に懸濁し、３分間煮沸し、遠心分
離した。この上清を採取し不溶性画分とした。
【００３９】実施例３大腸菌により発現された脊椎動物蛋白質の溶解性に対す
る大腸菌チオレドキシンまたは大腸菌シャペロンＧｒｏ
ＥＳＬの共発現の影響 （１） まず、脊椎動物蛋白質の溶解性に対するＴｒｘ
の共発現の影響を検討した（図４において、＋Ｔｒｘと
マークしたレーンを参照。）。各種の外来蛋白質を発現
させるために、ｐＥＴプラスミドのみを保持するＢＬ２
１（ＤＥ３）形質転換細菌およびｐＥＴプラスミドとｐ
Ｔ−Ｔｒｘプラスミドの両者を保持する形質転換細菌を
使用した。各蛋白質の発現と溶解性を評価するために、
これらの形質転換細菌をスーパーブロス中、３７℃でＡ
550 が０．７になるまで培養し、ＩＰＴＧで誘導の４時
間後に集菌し、超音波処理（超音波破砕装置（トミー精
工社製モデルＵＤ−２０Ｐ）、１０秒間×５回）を行
い、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）によ
り、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。両画分の蛋
白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマジー染色を行っ
た。
る大腸菌チオレドキシンまたは大腸菌シャペロンＧｒｏ
ＥＳＬの共発現の影響 （１） まず、脊椎動物蛋白質の溶解性に対するＴｒｘ
の共発現の影響を検討した（図４において、＋Ｔｒｘと
マークしたレーンを参照。）。各種の外来蛋白質を発現
させるために、ｐＥＴプラスミドのみを保持するＢＬ２
１（ＤＥ３）形質転換細菌およびｐＥＴプラスミドとｐ
Ｔ−Ｔｒｘプラスミドの両者を保持する形質転換細菌を
使用した。各蛋白質の発現と溶解性を評価するために、
これらの形質転換細菌をスーパーブロス中、３７℃でＡ
550 が０．７になるまで培養し、ＩＰＴＧで誘導の４時
間後に集菌し、超音波処理（超音波破砕装置（トミー精
工社製モデルＵＤ−２０Ｐ）、１０秒間×５回）を行
い、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）によ
り、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。両画分の蛋
白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマジー染色を行っ
た。
【００４０】ｐＥＴプラスミドのみで形質転換された
（ｐＴ−Ｔｒｘプラスミドを保持しない）大腸菌の場合
は、マウスｃ−Ｍｙｂは完全な不溶性アグリゲートとし
て発現された。しかし、Ｔｒｘの共発現によって、マウ
スｃ−Ｍｙｂ（Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Nagase,
T., Nakagoshi, H., Gonda, T. J., and Ishii, S. (1
989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 5758-576
2）の溶解性は劇的に増加し、培養物１リットル当たり
約３０ｍｇの可溶型ｃ−Ｍｙｂが産生された。
（ｐＴ−Ｔｒｘプラスミドを保持しない）大腸菌の場合
は、マウスｃ−Ｍｙｂは完全な不溶性アグリゲートとし
て発現された。しかし、Ｔｒｘの共発現によって、マウ
スｃ−Ｍｙｂ（Sakura, H., Kanei-Ishii, C., Nagase,
T., Nakagoshi, H., Gonda, T. J., and Ishii, S. (1
989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 5758-576
2）の溶解性は劇的に増加し、培養物１リットル当たり
約３０ｍｇの可溶型ｃ−Ｍｙｂが産生された。
【００４１】同様な溶解性の増加が、Ｔｒｘの共発現に
よって二つの他のヒト転写因子である、ｃＡＭＰ応答エ
レメント結合蛋白（ＣＲＥ−ＢＰ１）（Maekawa, T., S
akura, H., Kanei-Ishii, C., Sudo, T., Fujisawa,
J., Yoshida, M., and Ishii,S. (1989) EMBO J. 8, 20
23-2028 )およびｐ５３癌抑制遺伝子産物（Vogelstein,
B., and Kinzler, K. W. (1992) Cell 70, 523-526 )
についても観察され、培養物１リットル当たりＣＲＥ−
ＢＰ１については約６０ｍｇ、ｐ５３癌抑制遺伝子産物
については約１００ｍｇの可溶型蛋白質が産生された。
よって二つの他のヒト転写因子である、ｃＡＭＰ応答エ
レメント結合蛋白（ＣＲＥ−ＢＰ１）（Maekawa, T., S
akura, H., Kanei-Ishii, C., Sudo, T., Fujisawa,
J., Yoshida, M., and Ishii,S. (1989) EMBO J. 8, 20
23-2028 )およびｐ５３癌抑制遺伝子産物（Vogelstein,
B., and Kinzler, K. W. (1992) Cell 70, 523-526 )
についても観察され、培養物１リットル当たりＣＲＥ−
ＢＰ１については約６０ｍｇ、ｐ５３癌抑制遺伝子産物
については約１００ｍｇの可溶型蛋白質が産生された。
【００４２】脊椎動物のキナーゼの溶解性に対するＴｒ
ｘ共発現の影響についても検討した。Ｓｅｒ／Ｔｈｒキ
ナーゼの１種であるＸｅｎｏｐｕｓ Ｍｏｓプロト−オ
ンコジーン産物（Ｍｏｓ）（Sagata, N., Watanabe,
N., Vande Woude, G. F., andIkawa, Y. (1989) Nautur
e 342, 512-518 ）、およびｓｒｃジーンファミリーの
１員でありチロジンキナーゼの１種であるヒトｌｃｋ遺
伝子産物（Ｌｃｋ）（Marth, J. D., Peet, R., Krebs,
E. G., and Perlmutter, R. M. (1985) Cell 43, 393-
404 ）の溶解性も同様に、Ｔｒｘの共発現によって改善
され、培養物１リットル当たりＭｏｓについては約４０
ｍｇ、Ｌｃｋについては約３０ｍｇの可溶型蛋白質が産
生された。
ｘ共発現の影響についても検討した。Ｓｅｒ／Ｔｈｒキ
ナーゼの１種であるＸｅｎｏｐｕｓ Ｍｏｓプロト−オ
ンコジーン産物（Ｍｏｓ）（Sagata, N., Watanabe,
N., Vande Woude, G. F., andIkawa, Y. (1989) Nautur
e 342, 512-518 ）、およびｓｒｃジーンファミリーの
１員でありチロジンキナーゼの１種であるヒトｌｃｋ遺
伝子産物（Ｌｃｋ）（Marth, J. D., Peet, R., Krebs,
E. G., and Perlmutter, R. M. (1985) Cell 43, 393-
404 ）の溶解性も同様に、Ｔｒｘの共発現によって改善
され、培養物１リットル当たりＭｏｓについては約４０
ｍｇ、Ｌｃｋについては約３０ｍｇの可溶型蛋白質が産
生された。
【００４３】さらに、３種の他の核蛋白質である、ｓｋ
ｉ−関連遺伝子産物（ＳｎｏＮ）（Nagase, T., Nomur
a, N., and Ishii, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 13
710-13716）、ｍｙｃプロト−オンコジーン産物（Ｍｙ
ｃ）（Luescher, B., and Eisenman, R. N. (1990) Gen
es Dev. 4, 2025-2035）、およびアデノウイルスオンコ
ジーン産物（Ｅ１Ａ）（Moran, E., and Mathews, M.
B. (1987) Cell 48, 177-178 ）の溶解性に対するＴｒ
ｘの共発現の影響を調べたところ、培養物１リットル当
たりＭｙｃについては約２０ｍｇ、ＳｎｏＮについても
約２０ｍｇの可溶型蛋白質が産生された。Ｅ１ＡはＴｒ
ｘの非存在下でも約半分は可溶型として発現するが、Ｔ
ｒｘの存在下ではＥ１Ａのほとんど全量が可溶型として
発現し、培養物１リットル当たり約７０ｍｇの可溶型Ｅ
１Ａが発現した。
ｉ−関連遺伝子産物（ＳｎｏＮ）（Nagase, T., Nomur
a, N., and Ishii, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 13
710-13716）、ｍｙｃプロト−オンコジーン産物（Ｍｙ
ｃ）（Luescher, B., and Eisenman, R. N. (1990) Gen
es Dev. 4, 2025-2035）、およびアデノウイルスオンコ
ジーン産物（Ｅ１Ａ）（Moran, E., and Mathews, M.
B. (1987) Cell 48, 177-178 ）の溶解性に対するＴｒ
ｘの共発現の影響を調べたところ、培養物１リットル当
たりＭｙｃについては約２０ｍｇ、ＳｎｏＮについても
約２０ｍｇの可溶型蛋白質が産生された。Ｅ１ＡはＴｒ
ｘの非存在下でも約半分は可溶型として発現するが、Ｔ
ｒｘの存在下ではＥ１Ａのほとんど全量が可溶型として
発現し、培養物１リットル当たり約７０ｍｇの可溶型Ｅ
１Ａが発現した。
【００４４】従って、Ｔｒｘの共発現は、検討した８種
の外来蛋白質すべての溶解性を増加させたことが分か
る。
の外来蛋白質すべての溶解性を増加させたことが分か
る。
【００４５】（２） 次に、上記の８種の蛋白質の溶解
性に対するＧｒｏＥＳＬ共発現の影響を検討した（図４
において＋ＧｒｏＥとマークしたレーンを参照。）。各
種の外来蛋白質を発現させるために、ｐＥＴプラスミド
のみを保持するＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体またはｐ
ＥＴプラスミドとｐＴ−ＧｒｏＥプラスミドの両者を保
持する形質転換体を作製した。各蛋白質の発現と溶解性
を評価するために、これらの形質転換体をスーパーブロ
ス中、３７℃でＡ550 が０．７になるまで培養し、ＩＰ
ＴＧで誘導の４時間後に集菌し、超音波で溶菌し、得ら
れた溶解液を遠心分離により可溶性画分と不溶性画分と
に分画した。両画分の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
し、クマジー染色を行った。
性に対するＧｒｏＥＳＬ共発現の影響を検討した（図４
において＋ＧｒｏＥとマークしたレーンを参照。）。各
種の外来蛋白質を発現させるために、ｐＥＴプラスミド
のみを保持するＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体またはｐ
ＥＴプラスミドとｐＴ−ＧｒｏＥプラスミドの両者を保
持する形質転換体を作製した。各蛋白質の発現と溶解性
を評価するために、これらの形質転換体をスーパーブロ
ス中、３７℃でＡ550 が０．７になるまで培養し、ＩＰ
ＴＧで誘導の４時間後に集菌し、超音波で溶菌し、得ら
れた溶解液を遠心分離により可溶性画分と不溶性画分と
に分画した。両画分の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
し、クマジー染色を行った。
【００４６】ＧｒｏＥＳＬの共発現がない場合は、マウ
スｃ−Ｍｙｂは、完全な不溶性アグリゲートとして発現
された。しかし、ＧｒｏＥＳＬと共発現させるとＭｙｂ
の溶解性は顕著に増加し、ｃ−Ｍｙｂの約１０％が可溶
型として発現した。この結果は、培養液１リットル当た
り約２０ｍｇの可溶型ｃ−Ｍｙｂの発現レベルに相当す
る。同様な溶解性の増加がｃＡＭＰ応答要素結合蛋白
（ＣＲＥ−ＢＰ１）およびｐ５３腫瘍サプレッサージー
ン産物についても観察された。また、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキ
ナーゼの１種であるＭｏｓの溶解性を有意に増加した。
しかし、３種の他の核蛋白質である、ＳｎｏＮ、Ｍｙ
ｃ、およびＥ１Ａの溶解性は、ＧｒｏＥＳＬの共発現で
は増加しなかった。また、チロジンキナーゼの１種であ
るＬｃｋの溶解性は増加しなかった。以上まとめると、
検討した８種のうちの４種の外来蛋白質の溶解性がＧｒ
ｏＥＳＬの共発現によって改善されたことが分かる。上
記の事実は、Ｔｒｘ発現系がＧｒｏＥ系よりもはるかに
有用性が高いことを示すものである。
スｃ−Ｍｙｂは、完全な不溶性アグリゲートとして発現
された。しかし、ＧｒｏＥＳＬと共発現させるとＭｙｂ
の溶解性は顕著に増加し、ｃ−Ｍｙｂの約１０％が可溶
型として発現した。この結果は、培養液１リットル当た
り約２０ｍｇの可溶型ｃ−Ｍｙｂの発現レベルに相当す
る。同様な溶解性の増加がｃＡＭＰ応答要素結合蛋白
（ＣＲＥ−ＢＰ１）およびｐ５３腫瘍サプレッサージー
ン産物についても観察された。また、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキ
ナーゼの１種であるＭｏｓの溶解性を有意に増加した。
しかし、３種の他の核蛋白質である、ＳｎｏＮ、Ｍｙ
ｃ、およびＥ１Ａの溶解性は、ＧｒｏＥＳＬの共発現で
は増加しなかった。また、チロジンキナーゼの１種であ
るＬｃｋの溶解性は増加しなかった。以上まとめると、
検討した８種のうちの４種の外来蛋白質の溶解性がＧｒ
ｏＥＳＬの共発現によって改善されたことが分かる。上
記の事実は、Ｔｒｘ発現系がＧｒｏＥ系よりもはるかに
有用性が高いことを示すものである。
【００４７】実施例４Ｔｒｘの共発現によって可溶型として発現した外来蛋白
質のコンフォーメーション 封入体のような不溶性蛋白質として発現したものを尿素
処理等で可溶化した場合は、その蛋白質の本来のコンフ
ォーメーションを持たないものが多いことが知られてい
る。そこで、本発明の方法により可溶型として発現され
た蛋白質が本来のコンフォーメーションを有するか否か
について検討した。このため、Ｌｃｋの自己リン酸化活
性を分析した（図５）。
質のコンフォーメーション 封入体のような不溶性蛋白質として発現したものを尿素
処理等で可溶化した場合は、その蛋白質の本来のコンフ
ォーメーションを持たないものが多いことが知られてい
る。そこで、本発明の方法により可溶型として発現され
た蛋白質が本来のコンフォーメーションを有するか否か
について検討した。このため、Ｌｃｋの自己リン酸化活
性を分析した（図５）。
【００４８】Ｔｒｘ発現ベクターの存在下または非存在
下に、Ｌｃｋを発現するｐＥＴベクターを保持する大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を培養し、ＩＰＴＧによる誘導
後３時間Ｌｃｋを発現させた。集菌後、５種のプロテア
ーゼ（大豆トリプシンインヒビター、アンチパイン、ペ
プスタチンＡ、キモスタチン及びロイペプチン、各１０
μｇ／ｍｌ）を含むバッファーＬ（５０ｍＭのトリス−
塩酸、ｐＨ８．０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ：０．１２５ｍＭのＰＭＳ
Ｆ）の１／２５容量中に懸濁し、超音波で破砕した。遠
心分離後、Ｌｃｋの可溶型を含む上清を採取し貯蔵した
（可溶性Ｌｃｋ）。沈澱物（不溶性Ｌｃｋを含む不溶性
ペレット）を８Ｍ尿素を含むバッファーＬの１／５０容
量中に懸濁し、１時間氷冷した後遠心分離した。上清を
採取し、バッファーＬに対して透析し、そして貯蔵した
（尿素処理不溶性サンプル）。Ｌｃｋの自己リン酸化活
性はＬｃｋ−特異的抗体を用いて測定した（Yamanashi,
Y., Kikuchi, T., Mizuguchi, J., Yamamoto, T., and
Toyoshima, K. (1991) Science 251, 192-194) 。
下に、Ｌｃｋを発現するｐＥＴベクターを保持する大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を培養し、ＩＰＴＧによる誘導
後３時間Ｌｃｋを発現させた。集菌後、５種のプロテア
ーゼ（大豆トリプシンインヒビター、アンチパイン、ペ
プスタチンＡ、キモスタチン及びロイペプチン、各１０
μｇ／ｍｌ）を含むバッファーＬ（５０ｍＭのトリス−
塩酸、ｐＨ８．０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ：０．１２５ｍＭのＰＭＳ
Ｆ）の１／２５容量中に懸濁し、超音波で破砕した。遠
心分離後、Ｌｃｋの可溶型を含む上清を採取し貯蔵した
（可溶性Ｌｃｋ）。沈澱物（不溶性Ｌｃｋを含む不溶性
ペレット）を８Ｍ尿素を含むバッファーＬの１／５０容
量中に懸濁し、１時間氷冷した後遠心分離した。上清を
採取し、バッファーＬに対して透析し、そして貯蔵した
（尿素処理不溶性サンプル）。Ｌｃｋの自己リン酸化活
性はＬｃｋ−特異的抗体を用いて測定した（Yamanashi,
Y., Kikuchi, T., Mizuguchi, J., Yamamoto, T., and
Toyoshima, K. (1991) Science 251, 192-194) 。
【００４９】以上の処理により、ＬｃｋはＴｒｘ共発現
系を用いることにより可溶型で発現された（図５、レー
ン１−４）。他方、Ｔｒｘの共発現系無しに不溶型とし
て発現されたＬｃｋは尿素処理によって可溶化された
（図５、レーン５−８）。Ｌｃｋのこの二つの型はＬｃ
ｋ−特異的抗体を用いる免疫沈降反応に付した。また、
リン酸化活性を測定するためγ32Ｐ−ＡＴＰとインキュ
ベートした。その結果は、図３下部に示すように、可溶
性Ｌｃｋの比活性は尿素処理不溶性物質の比活性の１０
倍であった。この事実は、尿素によって可溶化された蛋
白質サンプルの一部分しか本来のコンフォーメーション
を持っていないことを示す。これに反し、Ｔｒｘの共発
現により可溶型として発現された蛋白質は天然蛋白質の
コンフォーメーションを持つといえる。
系を用いることにより可溶型で発現された（図５、レー
ン１−４）。他方、Ｔｒｘの共発現系無しに不溶型とし
て発現されたＬｃｋは尿素処理によって可溶化された
（図５、レーン５−８）。Ｌｃｋのこの二つの型はＬｃ
ｋ−特異的抗体を用いる免疫沈降反応に付した。また、
リン酸化活性を測定するためγ32Ｐ−ＡＴＰとインキュ
ベートした。その結果は、図３下部に示すように、可溶
性Ｌｃｋの比活性は尿素処理不溶性物質の比活性の１０
倍であった。この事実は、尿素によって可溶化された蛋
白質サンプルの一部分しか本来のコンフォーメーション
を持っていないことを示す。これに反し、Ｔｒｘの共発
現により可溶型として発現された蛋白質は天然蛋白質の
コンフォーメーションを持つといえる。
【００５０】
【発明の効果】本発明により、従来不溶性蛋白質として
しか細菌中では発現されなかった真核生物の蛋白質を可
溶性蛋白質として発現させることが可能となった。ま
た、一部可溶性蛋白質として発現されていた真核生物蛋
白質の可溶性蛋白質の割合を増加させることが可能とな
った。
しか細菌中では発現されなかった真核生物の蛋白質を可
溶性蛋白質として発現させることが可能となった。ま
た、一部可溶性蛋白質として発現されていた真核生物蛋
白質の可溶性蛋白質の割合を増加させることが可能とな
った。
【図１】図１は、大腸菌シャペロンＧｒｏＥＳＬの発現
ベクターを示す図である。
ベクターを示す図である。
【図２】図２は、大腸菌チオレドキシンの発現ベクター
を示す図である。
を示す図である。
【図３】図３は、ＧｒｏＥＳＬの発現ベクターまたは大
腸菌Ｔｒｘの発現ベクターを用いてＩＰＴＧによる誘導
発現で得られた蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけクマジ
ー染色して得られた発現蛋白質の電気泳動を示す写真で
ある。
腸菌Ｔｒｘの発現ベクターを用いてＩＰＴＧによる誘導
発現で得られた蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけクマジ
ー染色して得られた発現蛋白質の電気泳動を示す写真で
ある。
【図４】図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−クマジー染色によ
り得られたＧｒｏＥＳＬまたはＴｒｘの共発現により増
加した可溶性哺乳類蛋白質の電気泳動を示す写真であ
る。＋は共発現系を、−は単独発現系を示す。Ｓは可溶
性蛋白質を、Ｉは不溶性蛋白質を示す。
り得られたＧｒｏＥＳＬまたはＴｒｘの共発現により増
加した可溶性哺乳類蛋白質の電気泳動を示す写真であ
る。＋は共発現系を、−は単独発現系を示す。Ｓは可溶
性蛋白質を、Ｉは不溶性蛋白質を示す。
【図５】図５は大腸菌中で発現した可溶型Ｌｃｋと尿素
処理ＬｃｋのＬｃｋ特異抗体による免疫沈降およびＬｃ
ｋの自己リン酸化活性を表す電気泳動の写真である。上
部はＬｃｋ特異的免疫沈降反応物を電気泳動し、ウエス
タンブロッティング後にＬｃｋ特異抗体で可視化して得
られた写真である。下部はγ−32Ｐ−ＡＴＰとインキュ
ベートしたときの自己リン酸化活性を電気泳動ののちオ
ートラジオグラフィーで可視化して得られた写真であ
る。
処理ＬｃｋのＬｃｋ特異抗体による免疫沈降およびＬｃ
ｋの自己リン酸化活性を表す電気泳動の写真である。上
部はＬｃｋ特異的免疫沈降反応物を電気泳動し、ウエス
タンブロッティング後にＬｃｋ特異抗体で可視化して得
られた写真である。下部はγ−32Ｐ−ＡＴＰとインキュ
ベートしたときの自己リン酸化活性を電気泳動ののちオ
ートラジオグラフィーで可視化して得られた写真であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 チオレドキシン遺伝子の発現ベクターと
目的遺伝子の発現ベクターにより形質転換されてなる共
形質転換細菌。 - 【請求項２】 チオレドキシンが、大腸菌のチオレドキ
シン、ヒトのチオレドキシン、グルタレドキシン、また
はプロテインジスルフィドイソメラーゼのチオレドキシ
ン様ドメインである請求項１記載の共形質転換細菌。 - 【請求項３】 チオレドキシン遺伝子の発現ベクター
が、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプ
ロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、λＰL プロモーター、ａｒａプロモーターのいずれ
かの制御下にチオレドキシン遺伝子の発現を可能とする
ものである請求項１または請求項２記載の共形質転換細
菌。 - 【請求項４】 目的遺伝子が、インターフェロン、イン
ターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイ
キン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロ
ニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、
白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長
ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因子、繊
維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォ
ーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経
成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、
グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、ウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、免疫グ
ロブリン、１本鎖抗体、補体成分、血清アルブミン、ウ
イルス構成蛋白質、プロトオンコジーン産物、および転
写調節因子からなる群より選択されるものである請求項
１〜請求項３いずれか１項記載の共形質転換細菌。 - 【請求項５】 請求項１〜請求項４いずれか１項記載の
共形質転換細菌を用いて、目的遺伝子がコードする蛋白
質を可溶性蛋白質として発現させることを特徴とする可
溶性蛋白質の生産方法。
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| JP2008099669A (ja) * | 2006-09-19 | 2008-05-01 | Chisso Corp | 組換え蛋白質の可溶性蛋白質としての製造方法 |
| US8226976B2 (en) | 2007-11-05 | 2012-07-24 | Riken | Method of using cell-free protein synthesis to produce a membrane protein |
| US8445232B2 (en) | 2004-11-17 | 2013-05-21 | Riken | Cell-free system for synthesis of proteins derived from cultured mammalian cells |
| US8603774B2 (en) | 2002-11-28 | 2013-12-10 | National Food Research Institute | Extract of E. coli cells having mutation in ribosomal protein S12, and method for producing protein in cell-free system using the extract |
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| US8664355B2 (en) | 2004-11-19 | 2014-03-04 | Riken | Cell-free protein synthesis method with the use of linear template DNA and cell extract therefor |
| JP2016034259A (ja) * | 2014-08-04 | 2016-03-17 | 国立大学法人山口大学 | 耐熱性微生物の作製方法 |
| US9738692B2 (en) | 2006-09-19 | 2017-08-22 | Jnc Corporation | Process for production of recombinant proteins as a soluble form |
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|---|---|---|---|---|
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| US7655436B1 (en) | 1996-04-30 | 2010-02-02 | Schering Corporation | Expression of soluble heterologous proteins in bacteria utilizing a thioredoxin/protein expression vector |
| GB9703406D0 (en) * | 1997-02-19 | 1997-04-09 | Chiron Spa | Expression of heterologous proteins |
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| CN100406563C (zh) * | 2004-06-25 | 2008-07-30 | 私立逢甲大学 | 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法 |
| ES2354537B1 (es) * | 2008-06-27 | 2012-01-23 | Universidad Pública de Navarra | Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas. |
| CN113025601B (zh) * | 2019-12-25 | 2024-06-21 | 上海奥博生物医药股份有限公司 | 腈水解酶启动子优化表达及应用 |
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| US5292646A (en) * | 1991-02-06 | 1994-03-08 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
| US5270181A (en) * | 1991-02-06 | 1993-12-14 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
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-
1995
- 1995-10-13 JP JP07291859A patent/JP3092904B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-10-07 CA CA 2187250 patent/CA2187250C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-11 DE DE1996626917 patent/DE69626917T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-10-11 EP EP96116359A patent/EP0768382B1/en not_active Expired - Lifetime
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| EP0768382A2 (en) | 1997-04-16 |
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| DE69626917T2 (de) | 2003-11-13 |
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