CN110951723A - 一种纯dna双链缠结水凝胶及制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纯DNA双链缠结水凝胶及制备方法及应用，制备方法为：向EP管中加入带有可形成i‑motif结构的粘性末端的双链线性DNA前、后引物，目标DNA，和1╳DNA聚合酶，用去离子水补齐50μl，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到两端带有可形成i‑motif结构的粘性末端的长双链DNA。将制备的两端带有可形成i‑motif结构的粘性末端的长双链DNA浓缩至1μg/μl，并置于pH4.5‑6.5的缓冲液中，形成纯DNA双链缠结水凝胶。本发明制备的纯DNA双链缠结水凝胶可应用于生物纳米机器领域；通过引入基因序列，该水凝胶可应用于无细胞蛋白质生产。
Description
技术领域
本发明属于生物合成技术的DNA合成领域，涉及一种纯DNA双链缠结水凝胶及制备方法及通过设计使纯DNA双链缠结水凝胶用于无细胞蛋白质生产的应用。
背景技术
DNA是一种储存遗传信息的生物大分子，具有可编辑性。随着DNA纳米技术的发展，多种DNA材料逐渐被设计合成。DNA水凝胶作为一种基于DNA的功能性材料，不仅具有其他水凝胶的一般特性(高水量，机械强度等)，同时具备了DNA的可设计性，良好的生物相容性和可降解性等特性。另外，通过在DNA水凝胶中设计基因序列，可以赋予DNA水凝胶蛋白表达的生物功能。纯DNA水凝胶作为一种只有DNA形成的水凝胶，其可设计性和生物相容性更加优良，在生物医药领域和蛋白质工程领域均具有很大的应用价值。
目前，纯DNA水凝胶主要包括由寡核苷酸组装水凝胶和单链DNA缠结水凝胶。其中寡核苷酸组装水凝胶的制备方法是：化学合成的DNA寡聚链通过酶催化连接、自组装等方式合成，该方法需要大量的DNA寡聚链，成本较高。单链DNA缠结水凝胶的制备方法是：滚环扩增，即在phi29酶的催化作用下进行高效等温核酸扩增，得到单链DNA缠结形成的纯DNA水凝胶，该方法中使用的phi29酶成本高，且该水凝胶机械性能低。
开发新的经济的高机械性能的纯DNA双链缠结水凝胶及制备方法对拓展DNA水凝胶的应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
本发明的第二个目是提供一种带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物的制备方法。
本发明的第三个是提供一种带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
本发明的第四个目是提供一种带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物的制备方法。
本发明的第五个目的是提供一种两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
本发明的第六个目是提供制备两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的方法。
本发明的第七个目的是提供制备一种纯DNA双链缠结水凝胶的制备方法。
本发明的第八个目的是提供一种纯DNA双链缠结水凝胶。
本发明的第九个目的是提供纯DNA双链缠结水凝胶作为表达基因在无细胞蛋白质生产的应用。
本发明的技术方案概述如下：
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链，通过退火进行双链碱基互补配对；
第一条DNA单链由30-105个核苷酸组成，第二条DNA单链由21-86个核苷酸组成；每条DNA单链由第一部分和第二部分组成：
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的20-30个核苷酸，作为后续反应的前引物的粘性末端序列；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC用SEQ ID NO.14所示，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列的核苷酸数相等且反向互补配对；
(2)将步骤(1)获得的产物与补骨脂素按摩尔比为1：10-100的比例，混合，在照射能量为1～6J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
上述方法制备的带有粘可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链，通过退火进行双链碱基互补配对；
第一条DNA单链由30-105个核苷酸组成，第二条DNA单链由21-86个核苷酸组成；每条DNA单链由第一部分和第二部分组成：
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的20-30个核苷酸，作为后续反应的后引物的粘性末端序列；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC用SEQ ID NO.14所示，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列的核苷酸数相等且反向互补配对；
(2)将步骤(1)获得的产物与补骨脂素按摩尔比为1：10-100的比例，混合，在照射能量为1～6J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
上述方法制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的制备方法，包括如下步骤：
向EP管中加入带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物和带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物，使两者终浓度相等且为0.1-2.0μM，目标DNA序列，使终浓度为0.1-3ng/μl，和1╳DNA聚合酶，最后使用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
上述方法制备的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
纯DNA双链缠结水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
利用超滤的方法将上述制备的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA浓缩至1μg/μl，并将浓缩后的产物置于pH4.5-6.5的缓冲液中，形成纯DNA双链缠结水凝胶。
上述方法制备的纯DNA双链缠结水凝胶。
纯DNA双链缠结水凝胶作为表达基因在无细胞蛋白质生产的应用。
本发明的优点：
本发明的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前、后引物，热稳定性好，可承受90℃以上的高温而不被解链。
本发明制备的纯DNA双链缠结水凝胶具有pH相应性，作为一种生物相容性极好的材料，在生物纳米机器技术领域具有应用价值；另外，通过把基因序列引入纯DNA双链缠结水凝胶中，纯DNA双链缠结水凝胶可作为表达基因应用于无细胞蛋白质生产。
附图说明
图1为本发明的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的制备流程图；
图2为本发明带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物合成的电泳图，其中，M为DNA标准品；1为第一条DNA单链(SEQ ID NO.9)；2为第二条DNA单链(SEQ IDNO.10)；3为带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
图3为本发明的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA合成的电泳图，其中，M为DNA标准品；1为两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
图4为本发明的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物示意图。
图5为本发明的纯DNA双链缠结水凝胶的制备流程图。
图6为本发明的纯DNA双链缠结水凝胶的扫描电子显微镜下的微观形貌图。
图7为本发明的纯DNA双链缠结水凝胶作为无细胞蛋白表达系统目标蛋白表达基因的蛋白表达情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
下面各实施例中涉及的各个引物的具体序列的公开，是为了使本领域的技术人员能够更好的实施，但并不对本发明作任何限定。
实施例1
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物制备方法，包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链:
第一条DNA单链由30个核苷酸组成：
第二条DNA单链由21个核苷酸组成：
每条DNA单链由第一部分和第二部分组成；
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的20个核苷酸，作为后续反应的前引物的粘性末端序列(见SEQ ID NO.1中的波浪下划线序列)；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC(用SEQ ID NO.14所示)，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列(见SEQ ID NO.2中的双下划线序列)；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.1中的虚下划线)与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.2的虚下划线序列)的核苷酸数相等且反向互补配对。
(2)加入NaCl，使NaCl终浓度为50mM，混匀，置于PCR仪中，控制温度由90℃，在0.5小时内降温到25℃；
(3)将步骤(2)获得的产物与补骨脂素的摩尔比为1：10的比例，混合，在照射能量为1J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物，由2条DNA单链组成(见图4中的1和2)；第一条DNA单链由30个核苷酸组成，第二条DNA单链由21个核苷酸组成；每条DNA单链由第一部分和第二部分(图中分别用①和②表示)组成：
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的20个核苷酸，作为后续反应的前引物的粘性末端序列；第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列；第一条DNA单链的第二部分含有10个核苷酸，第二部分的核苷酸序列与第二条DNA单链的第二部分10个核苷酸序列反向互补配对。
实施例2
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物制备方法，包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链:
第一条DNA单链由30个核苷酸组成：
第二条DNA单链由21个核苷酸组成：
每条DNA单链由第一部分和第二部分组成；
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的20个核苷酸，作为后续反应的后引物的粘性末端序列(见SEQ ID NO.3中的波浪下划线序列)；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC(用SEQ ID NO.14所示)，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列(见SEQ ID NO.4中的双下划线序列)；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.3中的虚下划线)与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.4的虚下划线序列)的核苷酸数相等且反向互补配对。
(2)加入NaCl，使NaCl终浓度为50mM，混匀，置于PCR仪中，控制温度由90℃，在0.5小时内降温到25℃；
(3)将步骤(2)获得的产物与补骨脂素的摩尔比为1：10的比例，混合，在照射能量为1J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
实施例3
两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的制备方法，包括如下步骤：
向EP管中加入实施例1制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物和实施例2制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物，使两者终浓度相等且终浓度为0.1μM，目标DNA序列:5’TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAGCTTTTCACTGGCGTTGTTCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCTAACTCGAGTAGTAGAACTCTCTCAACGTGTACGCCATAGCTAGCTACAACTCTCTCAACGTAACGTACCTAACGCATCGAACTCTCTCAACGTTACTATACTAAACTACCTAACTCTCTCAACGTACTACTGGAAAACTACCTGAATTCGAAGCTTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAG GAGGAACTAT ATCCGGAT3’SEQ ID NO.13)，使SEQ ID NO.13所示核酸序列的终浓度为0.1ng/μl，和1╳DNA聚合酶，最后使用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
PCR程序如下：⑴95℃预热3min；⑵95℃变性30s；⑶55℃退火30s；⑷72℃延伸60s；(⑵～⑷重复30个循环)；⑸72℃最终延伸10min。如图1所示。
实施例4
纯DNA双链缠结水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
利用超滤的方法将实施例3制备的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长链DNA浓缩到浓度为1μg/μl，取20μl与200μl、pH4.5的MES缓冲液(MES 50mM,pH4.5,NaCl50mM)混合，形成纯DNA双链缠结水凝胶。
实施例5
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物制备方法，包括如下步骤：(1)取2条摩尔数相同的DNA单链:
第一条DNA单链由105个核苷酸组成：
第二条DNA单链由86个核苷酸组成：
每条DNA单链由第一部分和第二部分组成；
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的30个核苷酸，作为后续反应的前引物的粘性末端序列(见SEQ ID NO.5中的波浪下划线序列)；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC(用SEQ ID NO.14所示)，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列(见SEQ ID NO.6中的双下划线序列)；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.5中的虚下划线)与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.6的虚下划线序列)的核苷酸数相等且反向互补配对。
(2)加入NaCl，使NaCl终浓度为100mM，混匀，置于PCR仪中，控制温度由95℃，在2小时内降温到4℃；
(3)将步骤(2)获得的产物与补骨脂素的摩尔比为1：100的比例，混合，在照射能量为6J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
实施例6
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物制备方法，包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链:
第一条DNA单链由105个核苷酸组成：
第二条DNA单链由86个核苷酸组成：
每条DNA单链由第一部分和第二部分组成；
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的30个核苷酸，作为后续反应的后引物的粘性末端序列(见SEQ ID NO.7中的波浪下划线序列)；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC(用SEQ ID NO.14所示)，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列(见SEQ ID NO.8中的双下划线序列)；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.7中的虚下划线)与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.8的虚下划线序列)的核苷酸数相等且反向互补配对。
(2)加入NaCl，使NaCl终浓度为100mM，混匀，置于PCR仪中，控制温度由95℃，在2小时内降温到4℃；
(3)将步骤(2)获得的产物与补骨脂素的摩尔比为1：100的比例，混合，在照射能量为6J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
实施例7
两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的制备方法，包括如下步骤：
向EP管中加入实施例5制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物和实施例6制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物，使两者终浓度相等且终浓度为2.0μM，目标DNA序列(SEQ ID NO.13)，使SEQ ID NO.13所示核酸序列的终浓度为3ng/μl，和1╳DNA聚合酶，最后使用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
PCR程序如下：⑴95℃预热3min；⑵95℃变性30s；⑶55℃退火30s；⑷72℃延伸60s；(⑵～⑷重复30个循环)；⑸72℃最终延伸10min。
实施例8
纯DNA双链缠结水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
利用超滤的方法将实施例7制备的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长链DNA浓缩到浓度为1μg/μl，取20μl与150μl、pH6.5的MES缓冲液(MES 50mM,pH6.5,NaCl50mM)混合，形成纯DNA双链缠结水凝胶。
实施例9
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物制备方法(见图2)，包括如下步骤：
(1)取2种摩尔数相同的DNA单链:
第一条DNA单链由61个核苷酸组成：
第二条DNA单链由49个核苷酸组成：
每条DNA单链由第一部分和第二部分组成；
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的23个核苷酸，作为后续反应的前引物的粘性末端序列(见SEQ ID NO.9中的波浪下划线序列)；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC(用SEQ ID NO.14所示)，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列(见SEQ ID NO.10中的双下划线序列)；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.9中的虚下划线)与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.10的虚下划线序列)的核苷酸数相等且反向互补配对。
(2)加入NaCl，使NaCl终浓度为80mM，混匀，置于PCR仪中，控制温度由94℃，在1小时内降温到25℃；
(3)将步骤(2)获得的产物与补骨脂素的摩尔比为1：50的比例，混合，在照射能量为4J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
实施例10
带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物制备方法，包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链:
第一条DNA单链由62个核苷酸组成：
第二条DNA单链由49个核苷酸组成：
每条DNA单链由第一部分和第二部分组成；
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的24个核苷酸，作为后续反应的后引物的粘性末端序列(见SEQ ID NO.11中的波浪下划线序列)；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC(用SEQ ID NO.14所示)，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列(见SEQ ID NO.12中的双下划线序列)；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.11中的虚下划线)与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列(SEQ ID NO.12的虚下划线序列)的核苷酸数相等且反向互补配对。
(2)加入NaCl，使NaCl终浓度为80mM，混匀，置于PCR仪中，控制温度由94℃，在1小时内降温到25℃；
(3)将步骤(2)获得的产物与补骨脂素的摩尔比为1：50的比例，混合，在照射能量为4J的条件下紫外照射，获得可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
实施例11
两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的制备方法，包括如下步骤：
向EP管中加入实施例9制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物和实施例10制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物，使两者终浓度相等且终浓度为0.125μM，目标DNA序列(SEQ ID NO.13)，使SEQ ID NO.13所示核酸序列的终浓度为0.2ng/μl，和1╳DNA聚合酶，最后使用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA，图3。图3中1产物出现2条条带的原因是两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的粘性末端序列可能形成了一种i-motif的结构，造成两条两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA首尾相连。
PCR程序如下：⑴95℃预热3min；⑵95℃变性30s；⑶55℃退火30s；⑷72℃延伸60s；(⑵～⑷重复30个循环)；⑸72℃最终延伸10min
实施例12
纯DNA双链缠结水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
利用超滤的方法将实施例11制备的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长链DNA浓缩到浓度为1μg/μl，取20μl与100μl、pH5.0的MES缓冲液(MES 50mM,pH5.0,NaCl50mM)混合，形成纯DNA双链缠结水凝胶。图5和图6。
实施例13：缓冲溶液1的组成:
10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，60mmol/L谷氨酸钾，14mmol/L谷氨酸镁，1mmol/L二硫苏糖醇，7mmol/L2-巯基乙醇；溶剂是去离子水补足至1L。
实施例14：缓冲溶液2的组成:
10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，60mmol/L谷氨酸钾，14mmol/L谷氨酸镁，1mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水补足至1L。
实施例15
细胞破碎产物的制备：
将培养后的大肠杆菌收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。
实施例16
细胞提取物的配方：1g:0.06ml:2ml的细胞破碎产物(实施例15制备)、缓冲溶液1(实施例13)和缓冲溶液2(实施例14)组成。
实施例17
氨基酸混合液组成：
每种氨基酸的浓度均为10mmol/L的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；溶剂为去离子水补足至1L。
实施例18
反应缓冲液的组成：
50mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、90mmol/L谷氨酸钾、15mmol/L谷氨酸镁、20mmol/L3-磷酸甘油酸、7.5mmol/L环磷酸腺苷、3.3mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2.6mmol/L辅酶A、0.6mmol/L亚叶酸、2mg/mL转运核糖核酸、0.6mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水补足至1L；
实施例19
能量补充液的组成：
2mmol/L三磷酸尿苷，2mmol/L三磷酸胞苷，2mmol/L三磷酸腺苷，6mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水补足至1L。
实施例20
补充缓冲液的组成：(体积比，单位为mL)
由按体积比为5:24:3:1的氨基酸混合液(实施例17制备)、反应缓冲液(实施例18制备)、能量补充液(实施例19制备)和浓度为50g/ml的核糖核酸聚合酶水溶液组成。
实施例21
纯DNA双链缠结水凝胶作为表达基因在无细胞蛋白质生产的应用，包括如下步骤：
将细胞提取物(实施例16制备)，补充缓冲液(实施例20制备)，纯DNA双链缠结水凝胶(实施例12制备)按体积比为10:15:1的比例混合，将混合体系置于恒温反应容器中，在30℃放置12h，表达目标蛋白。(图7)
结果如图7所示，含有目的基因的纯DNA双链缠结水凝胶作为无细胞蛋白合成系统的基因时，目标蛋白可正常表达。
用实施例4或8制备的纯DNA双链缠结水凝胶替代本实施例的纯DNA双链缠结水凝胶(实施例12制备)，其它同本实施例，分别表达出目标蛋白。
本发明提出通过热稳定性带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链DNA为引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。电泳验证得到利用热稳定性带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链DNA为引物，成功扩增出两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。并在pH4.5-6.5的条件下，不同的、两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链DNA通过粘性末端的序列形成i-motif结构而尾首相连，聚合、缠绕形成纯DNA双链缠结水凝胶。并通过扫描电子显微镜表征了纯DNA双链缠结水凝胶的微观形貌。通过在两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链DNA中设计目标蛋白基因序列，纯DNA双链缠结水凝胶成功在无细胞蛋白表达系统中表达了目标蛋白。该方法已通过实施例进行描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种纯DNA双链缠结水凝胶及制备方法及应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtacatgag taaccgtatt accgcctttg 30
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcatgtact cccctaaccc c 21
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtacatgag ctcgccggac acgctgaact 30
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcatgtact cccctaaccc c 21
<210> 5
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcatatcg ctacacatgg accgatatca tatgtacatt actatagtac ctgagaccga 60
taggcatatg ctagttaacc gtattaccgc ctttgagtga gctga 105
<210> 6
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actagcatat gcctatcggt ctcaggtact atagtaatgt acatatgata tcggtccatg 60
tgtagcgata tgcatcccct aacccc 86
<210> 7
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcatatcg ctacacatgg accgatatca tatgtacatt actatagtac ctgagaccga 60
taggcatatg ctagtctcgc cggacacgct gaacttgtgg ccgtt 105
<210> 8
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actagcatat gcctatcggt ctcaggtact atagtaatgt acatatgata tcggtccatg 60
tgtagcgata tgcatcccct aacccc 86
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggaccgata tcatatgtac attactatag tacctgagta accgtattac cgcctttgag 60
t 61
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcaggtact atagtaatgt acatatgata tcggtccacc cctaacccc 49
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggaccgata tcatatgtac attactatag tacctgagct cgccggacac gctgaacttg 60
tg 62
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcaggtact atagtaatgt acatatgata tcggtccacc cctaacccc 49
<210> 13
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac 60
tttaagaagg agatatacca tggagctttt cactggcgtt gttcccatcc tggtcgagct 120
ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 180
ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 240
caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 300
gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 360
cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 420
cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 480
gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 540
gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 600
cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 660
ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 720
ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatctaactc gagtagtaga actctctcaa 780
cgtgtacgcc atagctagct acaactctct caacgtaacg tacctaacgc atcgaactct 840
ctcaacgtta ctatactaaa ctacctaact ctctcaacgt actactggaa aactacctga 900
attcgaagct tgatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 960
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 1020
tgctgaaagg aggaactata tccggat 1047
<210> 14
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccctaaccc c 11
Claims (9)
1.带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链，通过退火进行双链碱基互补配对；
第一条DNA单链由30-105个核苷酸组成，第二条DNA单链由21-86个核苷酸组成；每条DNA单链由第一部分和第二部分组成：
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的20-30个核苷酸，作为后续反应的前引物的粘性末端序列；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC用SEQID NO.14所示，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列的核苷酸数相等且反向互补配对；
(2)将步骤(1)获得的产物与补骨脂素按摩尔比为1：10-100的比例，混合，在照射能量为1～6J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
2.权利要求1的方法制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物。
3.带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)取2条摩尔数相同的DNA单链，通过退火进行双链碱基互补配对；
第一条DNA单链由30-105个核苷酸组成，第二条DNA单链由21-86个核苷酸组成；每条DNA单链由第一部分和第二部分组成：
第一条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的20-30个核苷酸，作为后续反应的后引物的粘性末端序列；
第二条DNA单链的第一部分为DNA单链3’端的11个核苷酸，序列为CCCCTAACCCC用SEQID NO.14所示，作为可形成i-motif结构的粘性末端序列；
第一条DNA单链的第二部分核苷酸序列与第二条DNA单链的第二部分核苷酸序列的核苷酸数相等且反向互补配对；
(2)将步骤(1)获得的产物与补骨脂素按摩尔比为1：10-100的比例，混合，在照射能量为1～6J的条件下紫外照射，获得带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
4.权利要求3的方法制备的带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物。
5.两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA的制备方法，其特征是包括如下步骤：
向EP管中加入权利要求2所述带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA前引物和权利要求4所述带有可形成i-motif结构的粘性末端的双链线性DNA后引物，使两者终浓度相等且为0.1-2.0μM，目标DNA序列，使终浓度为0.1-3ng/μl，和1╳DNA聚合酶，最后使用去离子水补齐50μl体系，置于PCR仪中，进行PCR扩增，得到两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
6.权利要求5的方法制备的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA。
7.纯DNA双链缠结水凝胶的制备方法，其特征是包括如下步骤：
将权利要求6所述的两端带有可形成i-motif结构的粘性末端的长双链DNA浓缩至1μg/μl，并将浓缩后的产物置于pH4.5-6.5的缓冲液中，形成纯DNA双链缠结水凝胶。
8.权利要求7的方法制备的纯DNA双链缠结水凝胶。
9.权利要求8的纯DNA双链缠结水凝胶作为表达基因在无细胞蛋白质生产的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN107250361A (zh) * | 2015-01-30 | 2017-10-13 | 艾思蒂生物传感器有限公司 | 与互补碱基序列或包含错配碱基的互补碱基序列相连接的聚合酶链式反应引物及利用其的核酸扩增方法 |
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