CN114262718B - 一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于哺乳动物细胞重组蛋白分泌表达技术领域，尤其涉及一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用。本申请发明人针对人源Ly6d重组蛋白设计了3个信号肽和5种标签的组合搭配，最终在信号肽B和AVI‑C‑6His标签、信号肽B和rabbit FC标签以及信号肽C和C‑Mouse FC‑6His的共同存在的条件下实现了蛋白的分泌表达，其中信号肽B和rabbit FC标签组合搭配蛋白表达量更佳，经过WB验证及亲和纯化成功获取了Ly6d重组蛋白，表达量约为255.67mg/1000mL Cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。

Description

一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用

技术领域

本发明属于哺乳动物细胞重组蛋白分泌表达技术领域，尤其涉及一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用。

背景技术

淋巴细胞抗原-6(LY6)复合物是一组同种异体抗原，于40年前首次在小鼠的淋巴细胞中被发现，其主要成员有LY6A/D/E/K/H，LY6家族成员的进化十分保守。据报道，LY6家族成员在癌症中发挥着重要左右，LY6K可以导致乳腺癌细胞转移，临床分析表明，LY6K与非小细胞肺癌患者的肿瘤分化、淋巴结转移和TNM分期有关。LY6D作为LY6家族成员中最为重要的成员之一，常用于开发多种癌症类型的新型治疗剂。

LY6D基因在多种类型的癌症中表达增加，并与细胞的粘附有关，且发现其可以作为晚期前列腺癌的预后因素，与患者生存的不良结果呈正相关，这表明LY6D将被作为不良预后的标志物。

LY6D不仅在癌症中至关重要，相关研究显示，LY6D在B淋巴细胞分化的表型和转录组异质性方面做出了重要贡献，在B淋巴细胞的增殖分化过程中占据着举足轻重的地位。但是，目前关于LY6D蛋白分泌表达的研究很少。而膜蛋白的表达是体外表达技术的难点，因为会发生不表达或表达出来的蛋白不可溶的问题，也会存在表达在细胞内不分泌的困难，或者仅能得到极少量的蛋白，无法满足后续实验需求，较难发挥其生物学功能。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法，包括以下步骤：将与信号肽连接的目的基因序列构建到哺乳动物表达载体中，构建表达质粒，使用293哺乳动物细胞真核系统表达蛋白；目的基因序列C端添加标签；信号肽、目的基因和标签选自以下组合中的任一种：

a):信号肽为B，目的基因序列为21-98aa，标签为AVI-C-6His；

b):信号肽为B，目的基因序列为21-98aa，标签为rabbit FC；

c):信号肽为C，目的基因序列为1-97aa，标签为C-Mouse FC-6His；

其中，信号肽为B序列为METDTLLLWVLLLWVPGSTG；信号肽C序列为MRTALLLLAALAVATGPALT，21-98aa序列如SEQ ID NO.5所示，1-97aa序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，MouseFc序列如SEQ ID NO.3所示；rabbitFc序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，表达质粒转染293哺乳动物细胞的转染方式为瞬时转染。

进一步地，哺乳动物细胞为HEK293F细胞或EXPI293F细胞。

进一步地，细胞转染步骤中，细胞密度为2.6E6/mL。

进一步地，细胞转染步骤中，质粒用Opti-MEM稀释。

进一步地，采用同源重组的方式将目的片段与表达载体连接。

进一步地，目的片段与表达载体比例为3:1～10:1。

本发明还提供了上述的一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法在制备Ly6d重组蛋白中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明同时提供多种蛋白和抗体的信号肽搭配不同的人源、鼠源和兔源免疫球蛋白FC区域，从而实现该蛋白的分泌表达。针对本发明实现的分泌蛋白的获取，从而在进行其他同类分泌蛋白的表达时提供了信号肽和标签使用的参考依据。本申请发明人在同一物种中分析氨基酸序列的特异性，便于发现该蛋白产生的抗体能否会识别其他蛋白。在Homosapiens中，分析基因的特异性，发现该基因的特异性一般。在不同物种中分析氨基酸序列的保守性，便于发现该蛋白产生的抗体能否交叉反应其他物种。目的蛋白在Homo sapiens和Rattus norvegicus中同源性较高。

本申请发明人针对人源Ly6d重组蛋白设计了3个信号肽和5种标签的组合搭配，最终在信号肽B和AVI-C-6His标签、信号肽B和rabbit FC标签以及信号肽C和C-Mouse FC-6His的共同存在的条件下实现了蛋白的分泌表达，其中信号肽B和rabbit FC标签组合搭配蛋白表达量更佳，经过WB验证及亲和纯化成功获取了Ly6d重组蛋白，表达量约为255.67mg/1000mL Cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。

附图说明

图1是质粒1-5的目的片段扩增效果图；

图2是细胞转染后相关效果数据；

图3是质粒1-5WB检测结果；

图4是蛋白纯化效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1质粒构建

1、基因Ly6D相关序列

(1)序列信息：SEQ ID NO.1

ATGAGGACAGCATTGCTGCTCCTTGCAGCCCTGGCTGTGGCTACAGGGCCAGCCCTTACCCTGCGCTGCCACGTGTGCACCAGCTCCAGCAACTGCAAGCATTCTGTGGTCTGCCCGGCCAGCTCTCGCTTCTGCAAGACCACGAACACAGTGGAGCCTCTGAGGGGGAATCTGGTGAAGAAGGACTGTGCGGAGTCGTGCACACCCAGCTACACCCTGCAAGGCCAGGTCAGCAGCGGCACCAGCTCCACCCAGTGCTGCCAGGAGGACCTGTGCAATGAGAAGCTGCACAACGCTGCACCCACCCGCACCGCCCTCGCCCACAGTGCCCTCAGCCTGGGGCTGGCCCTGAGCCTCCTGGCCGTCATCTTAGCCCCCAGCCTGTGA

(2)氨基酸序列：SEQ ID NO.2

MRTALLLLAALAVATGPALTLRCHVCTSSSNCKHSVVCPASSRFCKTTNTVEPLRGNLVKKDCAESCTPSYTLQGQVSSGTSSTQCCQEDLCNEKLHNAAPTRTALAHSALSLGLALSLLAVILAPSL

2、基因克隆构建

该全长蛋白1-20为信号肽，21-98aa为最终稳定形式，构建到哺乳动物表达载体，使用293哺乳动物细胞真核系统表达蛋白。构建如下表达质粒且都测序验证正确：

(1)目的序列如下：

21-98aa:SEQ ID NO.5

CTGCGCTGCCACGTGTGCACCAGCTCCAGCAACTGCAAGCATTCTGTGGTCTGCCCGGCCAGCTCTCGCTTCTGCAAGACCACGAACACAGTGGAGCCTCTGAGGGGGAATCTGGTGAAGAAGGACTGTGCGGAGTCGTGCACACCCAGCTACACCCTGCAAGGCCAGGTCAGCAGCGGCACCAGCTCCACCCAGTGCTGCCAGGAGGACCTGTGCAATGAGAAGCTGCACAAC

1-97aa:SEQ ID NO.6

ATGAGGACAGCATTGCTGCTCCTTGCAGCCCTGGCTGTGGCTACAGGGCCAGCCCTTACCCTGCGCTGCCACGTGTGCACCAGCTCCAGCAACTGCAAGCATTCTGTGGTCTGCCCGGCCAGCTCTCGCTTCTGCAAGACCACGAACACAGTGGAGCCTCTGAGGGGGAATCTGGTGAAGAAGGACTGTGCGGAGTCGTGCACACCCAGCTACACCCTGCAAGGCCAGGTCAGCAGCGGCACCAGCTCCACCCAGTGCTGCCAGGAGGACCTGTGCAATGAGAAGCTGCAC

由于后续考虑到蛋白需要纯化，故在目的基因序列C端添加6his标签，使用Primer5进行引物设计，序列为：

Primer name	Sequence5′-3′
		Plasmid 1-F	CttgtgactaactctgaattcCTGCGCTGCCACGTGT
Plasmid 1-R	tcattactaaccggtctcgagTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTTGTGCAGCTTCTCATTGCACAGG
		Plasmid 2-F	GCACTTGTGACTAACTCTCTGCGCTGCCACGTGT
Plasmid 2-R	ACCAGTGTGCCTGGTCCCCAGTTGTGCAGCTTCTCATTGCACAGG
		Plasmid 3-F	ggttcccggtagcaccggtgctagcCTGCGCTGCCACGTGT
Plasmid 3-R	cgttcaggccagagccgctagcGTTGTGCAGCTTCTCATTGCACAGG
		Plasmid 4-F	ggttcccggtagcaccggtgctagcCTGCGCTGCCACGTGT
Plasmid 4-R	gctacaggtgcttggtgcgctagcGTTGTGCAGCTTCTCATTGCACAGG
		Plasmid 5-F	AtccagcctccggacGCCACCATGAGGACAGCATTGCTGCTCCTT
Plasmid 5-R	TTATCATCGTCGTCGGCGTGCAGCTTCTCATTGCACAGGTCC

(2)目的片段的扩增

1)PCR体系(50ul)(RK20705:武汉爱博泰克生物科技有限公司):

PCR扩增反应程序：

PCR电泳效果图如图1所示。PCR产物回收参照康为世纪琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作。

(3)同源重组和转化

1)同源重组(货号：RM20523武汉爱博泰克生物科技有限公司)

标签在载体中的插入位点为NheI，可通过常规现有技术或委托第三方公司制备。

载体酶切50uL体系:(酶切位点：EcoRI/XhoI)

目的片段 20uL

ddH2O 20uL

Buffer 5uL

EcoRI 2.5uL

XhoI 2.5uL

反应条件 37℃3h。

注：目的片段与载体比例根据回收后的浓度决定，摩尔比范围:3:1～10:1

2)转化感受态细胞

a.取预冷好的1.5mlEP管，放在冰盒上，每管分装100uL-120uLDH5ɑ感受态(感受态在-80℃冰箱中取，放在冰中融化)，加入10uL重组产物(预冷效果更佳)并轻柔的吸打搅拌，加好后冰上放置30min。(此过程在超净台中进行)

b.42℃热水浴90S(严格控制时间)

c.冰上5min

d.加入800uL无抗LB/SOB培养基(此过程在超净台中进行)

e.37℃，220rmp摇床中复苏45min(严格控制时间)

f.5000rmp离心3min,集菌。

g.倒掉上清液，留大概200uL菌液，用移液器吸打混匀后加入相应抗性的平板中，倒入4-6颗玻璃珠，轻晃平板将菌液涂布均匀，倒掉玻璃珠，将平板倒置放在37℃培养箱过夜培养。(此过程在超净台中进行)。

(4)菌液PCR鉴定

1)菌落PCR鉴定:20uL体系(RK20604，武汉爱博泰克生物科技有限公司)

F:GACCTCCATAGAAGACACCG

R:aaaggagcaacatagttaag

PCR仪扩增反应程序：95℃/5min,(95℃/30S,58℃/30S,68℃/1min)35cycle,68℃/5min→4℃∞。

(5)测序

挑选正确的阳性克隆采用载体通用引物进行测序验证，测序正确后的表达质粒进行后续的蛋白表达。

实施例2蛋白表达

真核细胞HEK293F分为瞬时转染和稳定转染，瞬时转染质粒DNA进入细胞后不被整合到染色体中，以游离状态表达外源基因。瞬时转染周期短，能够快速获得目的蛋白，能够应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。EXPI293F(人肾胚上皮细胞)作为哺乳动物细胞高密度表达系统，被广泛应用于表达重组DNA蛋白等生物制品的研究开发和规模化生产。

一、瞬时转染

1、质粒DNA列表

编号	基因名	信号肽	区域	标签	质粒浓度(ng/ul)
						质粒1	Ly6d	A	21-98aa	C-6His	1230
质粒2	Ly6d	A	21-98aa	rabbit FC-C-6His	1100
						质粒3	Ly6d	B	21-98aa	AVI-C-6His	1253
质粒4	Ly6d	B	21-98aa	rabbit FC	1510
						质粒5	Ly6d	C	1-97aa	C-Mouse FC-6His	1146

2、细胞转染

(1)在培养基中转染前一天以1.3E6细胞/ml分离细胞,细胞体积27mL；

(2)在转染之前，将所有试剂置于室温下；

(3)转染前，将细胞密度调节到2.6E6/mL；

(4)在无菌试管中用1.5mL Opti-MEM稀释总质粒DNA(ug)30ug；

(5)将90uL PEI(1mg/ml，pH7.1)加入稀释的1.5mL Opti-MEM中，混匀静置5min；

(6)将PEI的混合溶液加入到DNA的混合溶液中，翻转或移液混合(混匀的过程要求缓慢进行)；

(7)在室温下孵育20分钟(不要超过)；

(8)将DNA/PEI混合物加入细胞中，通过轻轻旋转将它们充分混合,混合后细胞总体积30Ml；

(9)转染后16-20小时第一次补料1.5mL，96小时后测活率及密度；

(10)收获转染后的细胞，收集上清液添加10mM AEBSF进行亲和纯化。

二、WB验证表达

1、样品制备：

(1)取HEK293F转染后细胞100ul 3000r/min离心10min；

(2)离心后取上清20ul加20ul 2*loading buffer制样，97℃加热10min，命名为上清(supernatant)；

(3)沉淀使用100uL PBS进行悬浮后20ul加20ul 2*loading buffer制样，97℃加热10min，命名为细胞(cell)；

2、WB检测

(1)取上样5ul进行SDS-PAGE电泳：根据目的蛋白的分子量的大小选择合适的分离胶浓度。电泳采用恒压模式，5％浓缩胶80V，当marker开始分离大约25min，调至120V，溴酚蓝至分离胶底部终止电泳；

(2)转膜：组装顺序：转膜夹黑色面(负极)－海绵垫－3层滤纸－胶－膜－3层滤纸－海绵垫－红色面(正极)。转膜时间：200mA、90-180min；

(3)封闭：转膜完成后标记并洗去转膜液(TBST、5minX2次)；清洗干净的膜放入盛有3％脱脂牛奶(TBST配制)的容器中，室温封闭60-90min；

(4)6His-tag一抗孵育：封闭完成后，倒掉封闭液。加入用3％脱脂牛奶(TBST配制)1:7000稀释的一抗溶液，摇床上平缓摇动，室温孵育2h或4℃孵育过夜(4℃孵育后需室温再孵育15-30min)。一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

(5)二抗孵育：一抗孵育完成前，将对应一抗种属的酶标二抗1：5000稀释到实验需要的量(TBST稀释)。将清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，摇床上缓慢摇动，于室温孵育60-80min。二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

(6)曝光：用镊子将膜从TBST中取出，适当控干，置于凝胶托盘。用ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ等体积混合，均匀加至膜上，完全覆盖。底物与膜反应约30s，置于化学发光成像系统仪。设置的曝光时间为3S；10S；30S；60S；120S。

WB检测目的包括：蛋白表达大小是否正确；与高表达样本比较，获取蛋白表达量高/低信息；对于WB中无条带的项目，通过强曝光，如果可以出来条带判定为低表达，无条带的判断为无表达。

细胞转染后分析结果如图2所示。WB验证结果如下表及图3。

编号	基因名	信号肽	区域	标签	WB验证结果
						质粒1	Ly6d	A	21-98aa	C-6His	蛋白无表达
质粒2	Ly6d	A	21-98aa	rabbit FC-C-6His	蛋白胞内表达
						质粒3	Ly6d	B	21-98aa	AVI-C-6His	蛋白在胞内外均有表达
质粒4	Ly6d	B	21-98aa	rabbit FC	蛋白在胞内外均有表达
						质粒5	Ly6d	C	1-97aa	C-Mouse FC-6His	蛋白在胞内外均有表达

三、细胞上清纯化

将WB验证质粒3、质粒4、质粒5有分泌表达的细胞上清进行亲和纯化

(一)His纯化流程

1、实验材料

纯化柱Polv-Prep@ChromatographyColumns：BIO-RAD731-1550

Ni Bestarose FF(上海博格隆)

2、操作流程

(1)孵育

取出灭菌的10ml纯化柱管，用无内毒素水冲洗柱管1-2次。从4℃冰箱取出Ni-IDA亲和纯化基质，用移液器吸取0.5ml基质加入纯化柱管中，待乙醇流完后(商品化基质用20％乙醇保存)，用无内毒素水清洗6个柱体积。柱体积是指纯化柱中基质的体积，而非柱管的体积。用Binding Buffer平衡填料6个柱体积。将平衡好的基质加入上清管中，用封口膜封口，置于旋转培养器上，20rpm，4℃，4hr-过夜。

(2)流穿

孵育结束后，将离心管配平离心，600rpm，10min，4℃。将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿。同时留约5ml的上清用于悬浮基质，将基质转移至纯化柱管中，待流穿流完(此次流穿不用收集)。

(3)洗脱与洗杂

a.向纯化柱管中加入3ml Washing Buffer洗柱，洗下基质中的杂蛋白。重力流，流出液用灭菌的5ml EP管收集，EP管需要插在冰上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续加入3ml WashingBuffer洗柱，直到G250不变蓝，结束Washing Buffer预洗脱。

b.加入0.5ml Elution Buffer 1洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 1预洗脱。

c.加入0.5ml Elution Buffer 2洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

d.加入0.5ml Elution Buffer3洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

e.加入0.5ml Elution Buffer4洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

f.将上面收集的流穿与洗脱液制样，一般为6*制样，即20ul蛋白+5ul 6*loading，进行SDS-PAGE电泳。

(4)His-Tag标签纯化用缓冲液

缓冲液名称	成分
		Binding Buffer	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,10mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
Elution Buffer1	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,40mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
		Elution Buffer2	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,80mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
Elution Buffer3	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,250mM Imidazole,10％glycero pH 8.0
		Elution Buffer4	20mM Tris-HCL,250mM NaCl,500mM Imidazole,10％glycero pH 8.0

(二)proteinA纯化流程

1、实验材料

纯化柱Polv-Prep@ChromatographyColumns：BIO-RAD731-1550

AT Protein A Diamond(上海博格隆)

2、操作流程

(1)孵育

取出灭菌的10ml纯化柱管，用无内毒素水冲洗柱管1-2次。从4℃冰箱取出ProteinA基质，用移液器吸取0.5ml基质加入纯化柱管中，待乙醇流完后(商品化基质用20％乙醇保存)，用无内毒素水清洗6个柱体积。柱体积是指纯化柱中基质的体积，而非柱管的体积。用Binding Buffer平衡填料6个柱体积。将平衡好的基质加入上清管中，用封口膜封口，置于旋转培养器上，20rpm，4℃，4hr-过夜。

(2)流穿

孵育结束后，将离心管配平离心，600rpm，10min，4℃。

将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿。同时留约5ml的上清用于悬浮基质，将基质转移至纯化柱管中，待流穿流完(此次流穿不用收集)。

(3)洗杂与洗脱

a、向纯化柱管中加入3ml Washing Buffer洗柱，洗下基质中的杂蛋白。重力流，流出液用灭菌的5ml EP管收集，EP管需要插在冰上保持低温。流完后用G250检测(取100ulG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续加入3ml WashingBuffer洗柱，直到G250不变蓝，结束Washing Buffer预洗脱。

b、加入0.5ml Elution Buffer 1洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5ml的1M Tris(pH8.0)用于调节蛋白溶液的pH。流完后用G250检测(取100ul G250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer1预洗脱。

加入0.5ml Elution Buffer 2洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5ml的1M Tris(pH8.0)用于调节蛋白溶液的pH。流完后用G250检测(取100ul G250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

d.加入0.5ml Elution Buffer3洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5ml无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，并预先加入0.5ml的1M Tris(pH8.0)用于调节蛋白溶液的pH。流完后用G250检测(取100ul G250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。

e.将上面收集的流穿与洗脱液制样，一般为2*制样，即20ul蛋白+20ul 2*loading，进行SDS-PAGE电泳。

(4)Fc-Tag标签纯化用缓冲液

缓冲液名称	成分
		Binding Buffer	PBS,pH7.4
Washing Buffer	PBS,pH7.4
		Elution Buffer 1	0.1M甘氨酸，150mM NaCl,pH4.0
Elution Buffer 2	0.1M甘氨酸，150mM NaCl,pH3.0
		Elution Buffer 3	0.1M甘氨酸，150mM NaCl,pH2.2

结果如图4。

质粒3Ly6d B 21-98aa AVI-C-6His纯化到蛋白浓度较低，表达量约为38mg/1000mL Cells；

质粒4Ly6d B 21-98aa rabbit FC纯化到蛋白，蛋白纯度高，表达量约为255.67mg/1000mL Cells；

质粒5Ly6d C 1-97aa C-Mouse FC-6His纯化到蛋白，蛋白纯度高，表达量约为34.67mg/1000mL Cells。

人源Ly6d重组蛋白设计了3个信号肽和5种标签的组合搭配，最终在信号肽B和AVI-C-6His标签、信号肽B和rabbit FC标签以及信号肽C和C-Mouse FC-6His的共同存在的条件下实现了蛋白的分泌表达，其中信号肽B和rabbit FC标签组合搭配蛋白表达量更佳，经过WB验证及亲和纯化成功获取了Ly6d重组蛋白，表达量约为255.67mg/1000mL Cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉爱博泰克生物科技有限公司

<120> 一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法及应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 387

<212> DNA

<213> Ly6d

<400> 1

atgaggacag cattgctgct ccttgcagcc ctggctgtgg ctacagggcc agcccttacc 60

ctgcgctgcc acgtgtgcac cagctccagc aactgcaagc attctgtggt ctgcccggcc 120

agctctcgct tctgcaagac cacgaacaca gtggagcctc tgagggggaa tctggtgaag 180

aaggactgtg cggagtcgtg cacacccagc tacaccctgc aaggccaggt cagcagcggc 240

accagctcca cccagtgctg ccaggaggac ctgtgcaatg agaagctgca caacgctgca 300

cccacccgca ccgccctcgc ccacagtgcc ctcagcctgg ggctggccct gagcctcctg 360

gccgtcatct tagcccccag cctgtga 387

<210> 2

<211> 128

<212> PRT

<213> Ly6d

<400> 2

Met Arg Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Thr Gly

1 5 10 15

Pro Ala Leu Thr Leu Arg Cys His Val Cys Thr Ser Ser Ser Asn Cys

20 25 30

Lys His Ser Val Val Cys Pro Ala Ser Ser Arg Phe Cys Lys Thr Thr

35 40 45

Asn Thr Val Glu Pro Leu Arg Gly Asn Leu Val Lys Lys Asp Cys Ala

50 55 60

Glu Ser Cys Thr Pro Ser Tyr Thr Leu Gln Gly Gln Val Ser Ser Gly

65 70 75 80

Thr Ser Ser Thr Gln Cys Cys Gln Glu Asp Leu Cys Asn Glu Lys Leu

85 90 95

His Asn Ala Ala Pro Thr Arg Thr Ala Leu Ala His Ser Ala Leu Ser

100 105 110

Leu Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Val Ile Leu Ala Pro Ser Leu

115 120 125

<210> 3

<211> 228

<212> PRT

<213> MouseFc

<400> 3

Ala Val Pro Arg Asp Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

1 5 10 15

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

20 25 30

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

35 40 45

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

50 55 60

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

145 150 155 160

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

165 170 175

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

180 185 190

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

195 200 205

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

210 215 220

Ser Pro Gly Lys

225

<210> 4

<211> 228

<212> PRT

<213> rabbitFc

<400> 4

Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro

1 5 10 15

Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln

50 55 60

Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg

85 90 95

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys

115 120 125

Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser

180 185 190

Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg

210 215 220

Ser Pro Gly Lys

225

<210> 5

<211> 234

<212> DNA

<213> Ly6d

<400> 5

ctgcgctgcc acgtgtgcac cagctccagc aactgcaagc attctgtggt ctgcccggcc 60

agctctcgct tctgcaagac cacgaacaca gtggagcctc tgagggggaa tctggtgaag 120

aaggactgtg cggagtcgtg cacacccagc tacaccctgc aaggccaggt cagcagcggc 180

accagctcca cccagtgctg ccaggaggac ctgtgcaatg agaagctgca caac 234

<210> 6

<211> 291

<212> DNA

<213> Ly6d

<400> 6

atgaggacag cattgctgct ccttgcagcc ctggctgtgg ctacagggcc agcccttacc 60

ctgcgctgcc acgtgtgcac cagctccagc aactgcaagc attctgtggt ctgcccggcc 120

agctctcgct tctgcaagac cacgaacaca gtggagcctc tgagggggaa tctggtgaag 180

aaggactgtg cggagtcgtg cacacccagc tacaccctgc aaggccaggt cagcagcggc 240

accagctcca cccagtgctg ccaggaggac ctgtgcaatg agaagctgca c 291

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtatagaa tgcagctgct tagttgtatc gcacttagtc tcgcacttgt gactaactct 60

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggaaaccg acacactgct gctgtgggtg ctgttgttgt gggtgccagg ctctaccggc 60

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Arg Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Thr Gly

1 5 10 15

Pro Ala Leu Thr

20

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaggacag cattgctgct ccttgcagcc ctggctgtgg ctacagggcc agcccttacc 60

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccgtgccta gagatagcgg ctgcaagccc tgcatctgca ccgtgcctga agtgtccagc 60

gtgttcatct tcccacctaa gcctaaggac gtgctgacca tcacactgac ccctaaagtg 120

acctgcgtgg tggtggacat cagcaaggac gatcccgagg tgcagttcag ttggttcgtg 180

gacgacgtgg aagtgcacac agcccagaca cagcctagag aggaacagtt caacagcacc 240

ttcagaagcg tgtccgagct gcccatcatg caccaggatt ggctgaacgg caaagaattc 300

aagtgcagag tgaacagcgc cgcctttcct gctcctatcg agaaaaccat ctccaagacc 360

aagggcagac ccaaggctcc ccaggtgtac acaatccctc cacctaaaga acagatggcc 420

aaggacaagg tgtccctgac ctgcatgatc accgatttct tcccagagga catcaccgtg 480

gaatggcagt ggaatggaca gcccgccgag aactacaaga acacccagcc tatcatggac 540

accgacggca gctacttcgt gtacagcaag ctgaacgtgc agaagtccaa ctgggaggcc 600

ggcaacacct tcacctgttc tgtgctgcac gagggcctgc acaaccacca cacagagaag 660

tccctgagcc actctcctgg caag 684

<210> 14

<211> 683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcaccaagca cctgtagcaa gcccatgtgc cccccccccg agctgcccgg cggccccagc 60

gtgttcatct tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagccgcac ccccgaggtg 120

acctgcgtgg tggtggacgt gagccaggac gaccccgagg tgcagttcac ctggtacatc 180

aacaacgagc aggtgcgcac cgcccgcccc cccctgcgcg agcagcagtt caacagcacc 240

atccgcgtgg tgagcaccct gcccatcgcc caccaggact ggctgcgcgg caaggagttc 300

aagtgcaagg tgcacaacaa ggccctgccc gcccccatcg agaagaccat cagcaaggcc 360

cgcggccagc ccctggagcc caaggtgtac accatgggcc ccccccgcga ggagctgagc 420

agccgcagcg tgagcctgac ctgcatgatc aacggcttct accccagcga catcagcgtg 480

gagtgggaga agaacggcaa ggccgaggac aactacaaga ccacccccac cgtgctggac 540

agcgacggca gctacttcct gtacagcaag ctgagcgtgc ccaccagcga gtggcagcgc 600

ggcgacgtgt tcacctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 660

agcatcagcc gcagccccgg caa 683

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His

1 5 10 15

Glu

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggctctggcc tgaacgacat cttcgaggcc cagaagatcg agtggcacga g 51

Claims (2)

1.一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

将与信号肽连接的目的片段与哺乳动物表达载体pcDNA3.1进行同源重组连接，以构建表达质粒，使用EXPI293F细胞真核系统表达蛋白；所述目的片段与表达载体同源连接的摩尔比例为3:1～10:1，所述目的片段大小为291bp；

所述信号肽的氨基酸序列为MRTALLLLAALAVATGPALT；

所述目的片段C端添加标签，所述标签为C-Mouse FC-6His；所述目的基因的序列如SEQID NO.6所示，用于表达人源Ly6d蛋白的1-97aa氨基酸序列；所述人源Ly6d重组蛋白大小为37.7KD；所述C-Mouse FC-6His的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

其中，所述目的片段的PCR扩增体系，以50μL计包括：25μL Gloria High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer、17μL ddH₂O、1.5μL DMSO、1.5μL模板、2.5μL上游引物和2.5μL下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为AtccagcctccggacGCCACCATGAGGACAGCATTGCTGCTCCTT，所述下游引物的核苷酸序列为TTATCATCGTCGTCGGCGTGCAGCTTCTCATTGCACAGGTCC；

所述人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法还包括将所述表达质粒以Opti-MEM稀释成1146ng/μL后，瞬时转染至细胞密度为2.6E6/mL的EXPI293F细胞中的步骤。

2.如权利要求1所述的一种人源Ly6d重组蛋白细胞分泌表达方法在制备Ly6d重组蛋白中的应用。

Images