NO894598L - Bovinmetallotionein regulatorisk omraade. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår DNA-fragmenter som regulerer transkripsjonen av DNA. En annen side ved oppfinnelsen angår vektorer hvori er opptatt det ovenfor beskrevne DNA-fragment.

Nok en side ved oppfinnelsen angår nye celler transformert

med de ovenfor beskrevne vektorer.

Den foreliggende oppfinnelse angår generelt manipulering av genetisk materiale, særlig reguleringen av transkripsjons-hyppigheten av RNA fra DNA. Oppfinnelsen angår særlig DNA-fragmenter som inneholder det regulatoriske område av bovinmetallotionein-II-genet.

Etter hvert som rekombinant-DNA-bioteknologi har utviklet seg

i de senere år, er den styrte produksjon av en mengde forskjellige nyttige polypeptider ved hjelp av celler blitt mulig. Mange eukaryote polypeptider, f.eks. humanveksthormon, leuko-cyttinterferoner, humaninsulin og humanproinsulin er blitt fremstilt ved forskjellige rekombinante celler. Det er ventet at fortsatt anvendelse av teknikker som man allerede behersker, i fremtiden vil tillate rekombinant produksjon av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter.

De grunnleggende teknikker som anvendes innen området rekombinant-teknologi, er kjent av fagfolk. De elementer som det er ønskelig skal foreligge for utførelse av rekombinant-DNA-bioteknologi, omfatter, men er ikke begrenset til: (1) et gen som koder for ett eller flere ønskede polypeptider, operabelt koblet (operabelt koblet betegner en sammenstilling hvor komponentene er satt sammen på en slik måte at de utfører sin vanlige funksjon) til et regulatorisk område som styrer ekspresjonen i vertscellen, (2) en vektor, vanligvis et plasmid, inn i hvilket en nukleotidsekvens kan innsettes, en vektor er et hvilket som helst nukleotidsekvens-holdig, konstruert stykke som kan transformere en vert, (3) en egnet vert inn i hvilken den ønskede nukleotidsekvens kan overføres, hvor verten også har det nødvendige cellu- lære apparat for å uttrykke den informasjon som er kodet for i den overførte nukleotidsekvens. Oppfinnelsen beskriver for første gang det bovinmetallotionein-II (bMT-II) regulatoriske område, en modifisert bovinmetallotionein-II regulatorisk område-sekvens (mbMT-II), vektorer som består av de nevnte regulatoriske områder og mutanter derav. Mutanter skal forstås å omfatte basepar-forandringer, -tilføyelser eller -slettelser som ikke i vesentlige grad hindrer funksjonene av den muterte nukleotidsekvens. Videre er der beskrevet fremgangsmåter til aktivering av disse bMT-II regulatoriske områder.

De bMT-II og mbMT-II regulatoriske områder reagerer på induksjon ved bruk av eksogene tungmetaller. Regulatorisk reaksjon i en lett manipulerbar eksogen milj©stimulans, såsom nærværet eller fraværet av tungmetaller, gjør disse regulatoriske områder spesielt verdifulle og nyttige innen rekombinant-DNA-teknologi. En forandring i metallkonsentrasjonen vil påvirke ekspresjonen av heterologe proteiner. Videre er disse regulatoriske områder forenlige med bovinceller og ble utledet fra gener som koder for metallotioneinproteiner.

Disse proteiner er små, cysteinrike proteiner som binder used-vanlig høye mengder tungmetaller såsom Cd, Zn, Cu, Ag og Hg. Nærmere bestemt antas det at de cysteinrike områder i proteinene er direkte involvert i bindingen av disse metaller. Metallo-tioneiner er en vidt fordelt klasse proteiner med lav molekylvekt som foreligger i de fleste virveldyr og virvelløse dyr. Disse proteiner spiller en viktig rolle i kadmium- og kvikksølv-avgiftning og kan også være involvert i zink- og kobber-homeostase.

En rekke publikasjoner angår metallotioneingener i andre patte-dyr, såsom Stallings et al. "Assignment of Genes Encoding Metallothioneins I and II to Chinese Hamster Chromosome 3: Evidence for the Role of Chromosome Rearrangement in Gene Amplification", Molecular and Cellular Biology, vol. 4, pp.

2932-2936 (1984); Durnam et al. "Isolation and Characterization of the Mouse Metallothionein-1 Gene", P. N. A. S. 77., pp. 6511-6515, (1980) Karin et al. "Characterization of DNA Sequences Through Which Cadmium and Glucocorticoid Hormones Induce Human Metallothionein-IIA Gene", Nature 308. pp. 513-519 (1984); Schmidt og Harner "Cloning and Sequencing Analysis of Two Monkey Metallothionein cDNA's," Gene. 24, PP. 137-146 (1983). Tre US-patentskrifter er også blitt publisert innen dette område: Karin 4 601 978 (22. juli 1986), Palmiter et al.

4 579 821 (1. april 1986) og Fogel et al. 4 511 652

(16. april 1985). Imidlertid er det ingen av disse publikasjoner som kaster lys over det bovinmetallotionein regulatorisk område.

Før den foreliggende oppfinnelse er ikke noe bovinmetallotionein regulatorisk område blitt identifisert. Med oppdagelsen av det bovinmetallotionein-II regulatoriske område er imidlertid nå et effektivt bovinregulatorisk område blitt identifisert, som er egnet til bruk i eukaryote celler innbefattet pattedyrceller (spesielt bovin).

Det er således en hensikt med oppfinnelsen å skaffe et nytt bovinmetallotionein-II (bMT-II) regulatorisk område som reagerer på nærværet av tungmetaller samt vektorer inneholdende det nevnte bMT-II regulatoriske område. En annen hensikt med oppfinnelsen er å skaffe et modifisert bovinmetallotionein-II (mbMT-II) regulatorisk område som reagerer på nærværet av tungmetaller, samt vektorer som inneholder det nevnte mbMT-II regulatoriske område. Nok en hensikt med oppfinnelsen er nye vektorer omfattende det bMT-II eller mbMT-II regulatoriske område operabelt koblet til heterologe nukleotidsekvenser.

Nok en hensikt med oppfinnelsen er fremgangsmåter til å aktivere det bMT-II og mbMT-II regulatoriske område for å lette ekspresjonen av heterologe nukleotidsekvenser. Andre sider, hensikter og en rekke fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå fra be-skrivelsen, eksemplene og kravene.

I henhold til oppfinnelsen er det funnet, isolert ogkarakterisertet bovin-DNA-fragment som består stort sett av et bovin metallotionein regulatorisk område, hvilket regulatoriske område reagerer på nærværet av tungmetaller i vertscellens miljø. Det bMT-II regulatoriske område som er beskrevet i den foreliggende søknad, er kjennetegnet ved at det kan styre transkripsjonen av DNA til RNA og er induserbart i nærvær av tungmetaller.

I henhold til en annen side ved oppfinnelsen er det også funnet, isolert ogkarakterisertet modifisert bovin-DNA-fragment som fås fra det bMT-II regulatoriske område, hvilket består stort sett av et DNA-fragment, hvilket DNA-fragment reagerer på nærværet av tungmetaller i vertscellens miljø og har det restriksjonskart som er vist på fig. 2. Det mbMT-II regulatoriske område som her er angitt, er kjennetegnet ved at det kan styre transkripsjonen av DNA til RNA og er induserbart i nærvær av tungmetaller.

I en ytterligere side ved oppfinnelsen er vektorer som har innlemmet deri bMT-II eller mbMT-II og fremgangsmåter til aktivering av de bMT regulatoriske områder for å lette ekspresjonen av heterologe gener, skaffet.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er et restriksjonskart av det bovinmetallotionein-II

regulatoriske område.

Fig. 2 er et restriksjonskart av det modifiserte bovinmetallo tionein-II regulatoriske område. Fig. 3 er et restriksjonskart av plasmid pL260. Pstl-setene som er skaffet i henhold til denne figur, er vist (provided) i deres tilnærmede posisjoner. Fig. 4 er et restriksjonskart av plasmid pL266. Pstl-, Bglll-og Apal-setene på denne figur er vist i deres tilnærmede posisjoner. Fig. 5A representerer et flytdiagram for konstruksjonen av

PL260. Fig. 5B representerer et flytdiagram for konstruksjonen av pL223. Fig. 5C representerer et flytdiagram for konstruksjonen av

pL264, pL265 og pL266.

På de ledsagende figurer er restriksjonsseter som anvendes

for manipulering av nukleotidsekvenser, men som ødelegges ved ligering, antydet ved at forkortelsen for det ødelagte sete er satt i parentes.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet et nytt DNA-fragment som omfatter et bovinregulatorisk område som reagerer på nærværet av tungmetaller i vertsmiljøet. Et restriksjonskart av det bMT-II regulatoriske område er vist på fig. 1. Dette regulatoriske område er blitt ytterligerekarakterisert vedden nukleotidsekvens som er angitt i tabell 1. Det bMT-II regulatoriske område strekker seg fra tilnærmet Ncol-setet ved ca. nukleotid -749 til tilnærmet Ncol-setet

ved ca. nukleotid -1 (som vist i tabell 1). Denne nukleotidsekvens innbefatter tilnærmet minst fem tilsynelatende på metall reagerende elementer. Dette regulatoriske område kan styre transkripsjonen av RNA når det er operabelt koblet til og anordnet ved 5'-enden av en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid.

Mutanter av den ovenfor beskrevne nukleotidsekvens, hvilke mutanter har funksjonell aktivitet som er stort sett den samme som den nevnte DNA-sekvens, ligger også innenfor oppfinnelsens omfang.

Videre er der i henhold til oppfinnelsen skaffet et modifisert bovinmetallotionein-II regulatorisk område (mbMT-II) hvor det nevnte regulatoriske område reagerer på nærværet av tungmetaller i vertsmiljøet. Et restriksjonskart av det mbMT-II regulatoriske område er vist på fig. 2. Dette regulatoriske område er blitt ytterligerekarakterisert vedden nukleotidsekvens som er angitt i tabell 2. Det mbMT-II regulatoriske område strekker seg fra tilnærmet BamHI-setet ved ca. nukleotid -464 til tilnærmet Ncol-setet ved ca. nukleotid -1 (som vist i tabell 2). Denne sekvens innbefatter tilnærmet minst fem tilsynelatende på metall reagerende elementer som vist i tabell 2. Videre er mutanter av den mbMT-II-nukleotidsekvens hvor de nevnte mutante har funksjonell aktivitet som stort sett er den samme som den nevnte DNA-sekvens, inkludert innenfor oppfinnelsens omfang. Det bovinmetallotionein regulatoriske område kan utvinnes enten fra bovincellelinjer såsom MDBK (ATCC nr. CCL22) ved fremgangsmåter analoge med dem som er angitt i de følgende eksempler, eller syntetiseres fra de nukleotidsekvenser som er vist i tabellene 1 eller 2.

Den generelle fremgangsmåte til utvinning av et bovin regulatorisk område består av å dyrke bovincellelinjer i nærvær av ett eller flere tungmetaller for en lengre periode i stadig høyere konsentrasjoner av tungmetall. Denne utsettelse for tungmetaller fører til at høye nivåer av metallotionein-RNA foreligger, hvilket kan utvinnes ved en passende teknikk såsom valg av poly-A-holdige molekyler fremfor oligo-T-molekyler.

RNA kan deretter utvinnes og anvendes til å syntetisere cDNA som kan ligeres inn i vektorer for dannelse av et bibliotek. Dette kan deretter etterfølges ved at biblioteket probes med

et kort segment av et pattedyrmetallotionein-gen for å påvise homologe regioner ved sammenføyning. Det cDNA som ble isolert fra biblioteket og var homologt, kunne deretter anvendes som probe for bovingenomet i f.eks. en Southern hybridiserings-analyse eller et bovin genomisk bibliotek for å lokalisere bovinmetallotionein-genet og det regulatoriske område.

Dette regulatoriske område kan også fås ved anvendelse av den nukleotidsekvens som er vist i tabell 1 eller 2 og syntetisering av sekvensen ved enzymatiske eller kjemiske metoder. Egnede metoder omfatter, men er ikke begrenset til kjemiske fremgangsmåter basert på fosfotriester-, fosfitt- eller cyanoetylfos-foramiditt-kj emi.

Fagfolk vil også innse at etterfølgende isolerte regulatoriske områder kan inneholde et de minimis antall nukleotidforskjeller på grunn av genetisk avvik eller sekvenseringsfeil som kan ha oppstått.

Modifikasjon av det bovin regulatoriske område kan også utføres ved tilføyelse av linker-DNA for å skaffe nye restriksjonsseter, fjerning av de eksisterende 5'- eller 3<1->restriksjonsseter ved å gjøre endene av fragmentet butte, eller ved en hvilken som helst annen egnet fremgangsmåte kjent for fagfolk.

Når det bovinmetallotionein regulatoriske område er utvunnet, kan det opprettholdes eller replikeres i et eukaryot eller prokaryot plasmid/vert-system såsom pBR322 opprettholdt i E. coli eller et hvilket som helst annet egnet system som er kjent i faget.

Fagfolk vil innse at en rekke ytterligere DNA-sekvenser også kan innlemmes i vektorene som anvendes til utførelse av den foreliggende oppfinnelse, f.eks. bakterielt plasmid-DNA, markør-gener, bakteriofag-DNA, autonome replikasjonssekvenser eller lange repeterende ender (terminal repeats) bare for å nevne noen få representative eksempler.

For å utnytte de bovinmetallotionein regulatoriske områder som her er angitt, kan de fragmenter som er beskrevet i henhold til fig. 1 og fig. 2, være operabelt koblet til heterologe DNA-sekvenser. Når det gjelder den foreliggende beskrivelse,

er heterologe DNA-sekvenser DNA-sekvenser som ikke naturlig forekommer operabelt koblet til de fragmenter som er beskrevet på fig. 1 og 2. Egnede heterologe DNA-sekvenser som koder for et polypeptid som kan være operabelt koblet til det bovinmetallotionein regulatoriske område innbefatter, men er ikke begrenset til de som koder for bovinveksthormon, humanveksthormon, kyllingveksthormon og humanveksthormon-frigjørings-faktor. Heterologe DNA-sekvenser som anvendes sammen med den foreliggende oppfinnelse bør inneholde et 5<1->ATG-startkodon,

et 3<1->stoppkodon og kan dessuten innbefatte nukleotidsekvenser som tjener til å stabilisere mRNA såsom en sekvens som dirigerer polyadenylering.

Kombinasjonen av et bovinmetallotionein regulatorisk område operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens kan innsettes i en passende vektor for den valgte vertscelle. En rekke forskjellige vektor/vertscelle-kombinasjoner er mulige og er kjent for fagfolk. Vektorer avledet fra passende modifiserte papovaviruser, adenoviruser, fugleretroviruser og pattedyr-retroviruser er velegnet for pattedyrverter. Ytterligere sekvenser såsom markørgener eller andre sekvenser som gjør vektoren i stand til vekstamplifikasjon og hurtig formering i bakterier eller gjær kan også foreligge.

En egnet vektor for utførelse av oppfinnelsen er vektoren

pL260 vist på fig. 3. Det foretrekkes for høye produksjonsnivåer med denne vektor at 2-3 kopier av et seriearrangement omfattende et bovinmetallotionein regulatorisk område operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens (inneholdende et 5'-ATG-startkodon,

et 3'-stoppkodon og en nukleotidsekvens som dirigerer for polyadenylering) foreligger i den samme orientering i denne vektor. Disse seriearrangementer bør være således orientert at det bMT-II regulatoriske område eller mbMT-II regulatoriske område er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens og at der 3' dertil er koblet minst ett seriearrangement av et bMT-II regulatorisk område eller mbMT-II regulatorisk område operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens. En vektor inneholdende denne type seriearrangement i den samme orientering er repre-sentert ved pL266 vist på fig. 4.

Egnede vertsceller for bruk av det bovinmetallotionein regulatoriske område omfatter eukaryote celler, spesielt virveldyr-celler og fortrinnsvis pattedyrceller, innbefattet, men ikke begrenset til bovin- og museceller.

Transformasjon av det bovinmetallotionein regulatoriske område inn i en vertscelle ved en forenlig vektor kan utføres ved egnede transformasjonsteknikker som er kjent for fagfolk.

Ekspresjon av heterologe DNA-sekvenser operabelt koblet til

et bovinmetallotionein regulatorisk område transformert inn i en egnet vert kan induseres ved innføring av tungmetaller i vertscellens miljø på en måte som letter vertscellens opptak av de nevnte tungmetaller. Egnede tungmetaller som vil indusere ekspresjon består av tungemtaller valgt fra gruppen Cd, Zn,

Cu, Ag og Hg og kombinasjoner derav. Kombinasjoner av Cd og

Zn foretrekkes, optimalt i et forhold på 1:4.

Det skal dessuten forstås at celler av forskjellig opprinnelse vil reagere forskjellig på induksjon av ekspresjon med tungmetaller. Menneske-, svine- og apeceller vil lett tilpasse seg tungmetaller såsom kadmium, mens celler av storfe (bovin) kan kreve betydelig lavere tungmetallkonsentrasjoner opprinnelig for å forbli levedyktige. Celler som er dyrket over lange perioder ved økende konsentrasjon av tungmetaller kan også tolerere høyere nivåer av tungmetaller for induksjon av ekspresjon. Disse cellelinjer kan også være fjernet fra tung metallkonsentrasjoner før transformasjon og kan reintroduseres i nærvær av tungmetaller etter transformasjon for forbedret induksjon. Det foretrekkes imidlertid å anvende cellelinjer som ikke tidligere er blitt utsatt for tungmetaller. Disse cellelinjer viser forbedret ekspresjon etter transformasjon med vektorer som består av et bovinmetallotionein regulatorisk område operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid når de utsettes for tungmetaller.

De følgende ikke-begrensende eksempler er angitt for å belyse utførelsen av den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

Generell informasjon

Stammer oa cellelinjer

MDBK (bovinnyre-cellelinje) ATCC nr. CCL22

NIH 3T3 (museembryofibroblast-cellelinje) ATCC nr. CRL1658 E. coli HB101 BRL nr. 5B302

E. coli Y1088 NRRL nr. 37195

Medier, buffere oa oppløsninger

Fullstendige medier:

Til en 500 ml kolbe av Dulbecco modifisert Eagle-medium til-settes følgende: 1) 5 ml penicillin/streptomycin-oppløsning fra GIBCO, endelig konsentrasjon = 10 ug/ml strep, 10 U/ml pen.

2) 50 ml bovinfosterserum

3) 5 ml ikke-essensielle aminosyrer,

endelig konsentrasjon = 1 mM

4) 5 ml glutamin,

endelig konsentrasjon = 2 mM

Eksempel I

Utvikling av kadmiumresistent cellelinje

En bovinnyre-cellelinje (MDBK, ATCC nr. CCL22) ble tilpasset til å vokse i 60 uM kadmium ved at cellene over en lengre periode ble utsatt for meget lave konsentrasjoner av kadmium, fulgt av vekst i gradvis høyere konsentrasjoner av kadmium.

Den tilpassede cellelinje reagerte på den økende kadmiumkonsentrasjon ved å produsere mer BMT-spesifikt mRNA

og ble betegnet MDBK<R>. Spesifikasjonene for MDBK<R->utvikling er som følger: En ampulle med MDBK ble innført i en 7 5 cm<2>falcon-kolbe (falcon flask) i tilnærmet 10 ml fullstendig medium. Falcon-kolben ble inkubert ved 37°C i 5-10% C02~atmosfære over natten. Mediet ble forandret neste dag ved avsuging av det gamle medium og tilsetning av ca. 10 ml nytt medium til kolben. Cellene ble deretter tillatt å vokse ved 37°C i 5-10% CO2inntil de var sammenløpende, vanligvis 3-4 dager.

Cellene ble delt når de ble sammenløpende. Dette ble oppnådd ved avsuging av mediet og tilsetning av 2 ml av en oppløsning av IX trypsin^EDTA (GIBCO). Denne ble suget av og erstattet med 2 ml av den samme oppløsning. Cellene ble etterlatt i berøring med denne oppløsning inntil de begynte å skille seg fra plateoverflaten, vanligvis 5-15 min. Når cellene var fraskilt, ble 10 ml fullstendig medium satt til 2 ml-oppløsningen av celler og det samlede volum ble suget opp og ned for å dispergere celleaggregatene. Alt unntatt 5-10% av de medium-holdige celler ble suget ut av flasken. 10 ml medium ble satt til den 5-10% celleoppløsning som var tilbake i kolben, og kolben ble igjen inkubert ved 37°C i 5-10% CO2. Denne prosess ble gjentatt med noen dagers mellomrom når cellene nådde sammen-løping.

For å utvikle den kadmiumresistente bovinnyre-cellelinje,MDBK<R>, ble cellene sådd som beskrevet ovenfor på dag 0 og

0,2 uM CdCl2ble satt til mediet. Cellene var sammenløpende på dag 18, og de ble delt på dag 28, og igjen på dagene 37, 44 og 47. Mediet ble forandret med noen dagers mellomrom etter behov, og tilførsel med 0,2]iM CdCl2ble fortsatt for hver mediumforandring.

Cellene ble delt igjen på dag 5 2 og til én kolbe ble der tilsatt 2,0 uM CdCl2- Den andre kolbe fortsatte å motta 0, 2 uM CdCl2~supplering. Begge kolbene ble delt på dag 57 og alle kolbene ble supplert med 2,0 uM CdCl2på dette tidspunkt. På dag 58

ble cellene trypsinisert og tillatt å vokse uten CdCl2- En dag senere, på dag 59, ble cellene igjen supplert med 2,0 uM CdCl2.

Cellene ble delt på dag 61 og den nye kolbe ble supplert med 0,2 uM CdCl2- En dag senere, dag 62, ble CdCl2-konsentrasjonen øket til 2,0 uM. Cellene ble delt i tre porsjoner på dag 63,

og CdCl2~konsentrasjonene i de tre kolber var 2 uM, 2 uM og

0,2 uM. Konsentrasjonen av en kolbe ble forandret på dag 64

fra 2 uM til 5 uM. Disse tre kulturer ble delt på dag 66 og CdCl2~konsentrasjonene forble som på dag 64. 5 uM CdCl2-cellene ble sammenløpende på dag 74. De ble delt og deretter delt igjen på dag 75. Én kolbe med celler ble dyrket i 10 liM CdCl2på dag 75. De andre forble på 5 uM CdCl2. Ti dager senere, dag 85, ble 10 uM-cellene igjen delt og dyrket i 15 uM CdCl2-Disse celler ble delt og konsentrasjonene av CdCl2øket som følger:

På dag 237 ble cellene delt og supplert med 60 uM CdCl2pluss

80 uM ZnCl2. Cellene ble holdt på 60 uM CdCl2+ 80 uM ZnCl2.

Eksempel II

Konstruksjon av MDBK<R>cDNA-biblioteket

A. RNA- isolerinq

PolyA<+>RNA ble isolert fra MDBK-celler innrettet til å vokse i

50 uM CdCl2som følger. Tilnærmet IO<8>celler som vokste i

5 0 uM CdCl2ble trypsinisert, samlet opp ved skraping opp i et 50 ml sentrifugerør og spunnet ved 2000 omdr./min i 10 min. Pelleten ble vasket en gang med IX PBS og deretter resuspendert i 5 ml IX PBS. Under lett svirring ble 20 ml proteinase-K-buffer (inneholdende 200 ug/ml av proteinase K) tilsatt. Blandingen ble inkubert ved værelsetemperatur i 30 min og deretter ekstrahert to ganger med fenol/kloroform:isoamylalkohol og deretter en gang med kloroform:isoamylalkohol (24:1). Dette trinn ble fulgt av etanolutfelling av nukleinsyrene.

Et halvt volum fenol (rekrystallisert fenol av molekylærbiologi-kvalitet fra Bethesda Research Laboratory, ekvilibrert med

TE-buffer) og et halvt volum kloroform:isoamylalkohol (24:1)

ble satt til RNA/DNA-blandingen. Oppløsningen ble rystet kraftig for hånd i ca. 1 min og deretter spunnet ved 3000 omdr./min i 15 min. Den nedre organiske fase ble fjernet og kassert. Ekstraksjonen ble gjentatt som angitt ovenfor. Et like stort volum av kloroform:isoamylalkohol (24:1) ble deretter tilsatt og behandlet som angitt ovenfor. Den øvre vandige fase ble samlet opp og etanolutfelt som følger. NaCl ble satt til en endelig konsentrasjon på 0,1 M sammen med to volumer 95% etanol. Oppløsningen ble blandet kraftig og inkubert ved -20°C over natten. Bunnfallet ble samlet opp ved sentrifugering ved 3000 omdr./min i 30 min.

RNA- og DNA-utfellingen ble resuspendert i 10 ml TE-buffer og lagt som lag på to 4 ml puter av CsCl (1 g/ml endelig konsentrasjon) i TE-buffer i Beckman SW41 polyallomer-rør. Rørene ble balansert med TE-buffer og spunnet ved 37 000 omdr./min i 24 h ved værelsetemperatur. RNA-pelleten ble samlet opp ved forsiktig avsuging av supernatanten. (Supernatanten ble fjernet ned til det tyktflytende DNA-bånd). DNA ble samlet opp for seg, etanolutfelt og lagret for senere bruk. Hver pellet ble resuspendert i 3 ml ETS-buffer og deretter overført til et sentrifugerør. Volumet ble øket til 15 ml med ETS-buffer, og rørene ble forsiktig varmet opp ved 65°C inntil RNA gikk i oppløsning, ca. 2 min. RNA ble deretter samlet opp ved sentrifugering ved 3000 omdr./min i 30 min, og pelleten resuspendert i 2 ml ETS-buffer. RNA-konsentrasjonen ble deretter bestemt ved måling av absorbansen ved 260 nm og justert på en konsentrasjon av <5 mg RNA pr. ml med ETS. Denne oppløsning ble deretter inkubert ved 65°C i 5 min, avkjølt med is til værelsetemperatur og 5 M NaCl ble satt til en endelig konsentrasjon på 0,5 M. RNA ble anbragt på en oligo-dT-kolonne behandlet med 2 g oligo-dT-cellulose (Collaborative Research) i en 1 ml kolonne. Før tilsetningen av RNA ble kolonnen pakket i ETS-buffer, vasket med 0,5 M NaOH og ekvilibrert med 0,5 M NETS (ETS-buffer pluss 0,5 M endelig konsentrasjon NaCl). Strømmen gjennom kolonnen ble samlet opp og lastet på nytt på kolonnen to ganger, som deretter ble vasket med 30 ml 0,5 M NETS. PolyA<+->RNA ble eluert med 4 ml ETS-buffer, etanolutfelt med to volumer etanol pluss NaCl til en endelig konsentrasjon på 0,25 M og holdt på -20°C over natten. RNA-utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering ved 10 000 omdr./min i 30 min ved bruk av silikoniserte 15 ml Corex-rør.

Pelleten ble resuspendert i 100 ul ETS-buffer, og 5 ul av

dette ble brukt til å bestemme konsentrasjonen av polyA<+>RNA.

1 ug av polyA<+>RNA ble underkastet elektroforese på en 1,5% agarosegel ved bruk av IX TBE (tris-borat-EDTA) rennende buffer for å bestemme om RNA var intakt. Det resterende polyA<+>RNA

ble utfelt ved tilsetning av to volumer etanol pluss 0,25 M NaCl og holdt på -20°C over natten. RNA-utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering ved 30 00 omdr./min i 3 0 min. RNA-pelleten ble resuspendert til en endelig konsentrasjon på 1 ug/ul med sterilt destillert vann.

B. Produksjon av cDNA

cDNA-biblioteket ble konstruert som følger. 5 yl av RNA-opp-løsningen (5 ug RNA) ble kombinert med 1,2 ul 10 mM metylkvikk-sølvhydroksid (Alfa Biochemicals) og blandingen ble holdt på værelsetemperatur i 5 min. 2,0 ul av 0,7 M (3-merkaptoetanol,

0,5 ul av 100 uM DTT og 3 ul av RNase (24 U pr. ml,Promega Biotec) ble tilsatt, og reaksjonen ble holdt på værelsetemperatur i 5 min. De følgende reagenser ble satt til den ovenfor angitte blanding og den endelige reaksjonsblanding (som nå

var 50 ul) ble holdt på 42°C i 60 min.

23,3 ul reverstranskriptase-buffer

5,0 ul actinomycin D (600 ug/ml)

2,5 ul<32>P-dCTP (3200 Ci/mmol)

8,3]il reverstranskriptase (20 U pr. ml,

(Molecular Genetics Resources)

Før tilsetningen av reverstranskriptase ble en prøve på 0,5 ul tatt som en prøve for tid 0 for TCA-utfelling.

To 0,5 ul prøver ble tatt for tid 60, deretter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 0,5 ul 20% SDS, 2 yl 0,5 M EDTA og 21,7 yl IN NaOH og holdt på 65°C i 30 min. Deretter ble 10 ul av IM Tris, pH 7,4, og 21,7 \ il IN HC1 tilsatt, og blandingen ble ekstrahert med fenol/kloroform:isoamylalkohol en gang og ekstrahert med kloroform:isoamylalkohol en gang som angitt ovenfor.

TCA-utfellinger ble utført på de to 0,5 ul reaksjonsprøver

fra tid 0 og tid 60 min. TCA-metoden var som følger. Hver 0,5 ul prøve ble anbragt i 100 ul endelig volum [80 ul TE-buffer, 20 ul bærer-RNA (10 mg/ml)]. 10 ul ble fjernet og avsatt (spotted) på en nitrocelluloseskive. De resterende 90 ul ble utfelt ved tilsetning av 400 ul 20% TCA, og deretter anbragt på is i 10 min. Utfellingen ble oppsamlet ved filtrering på en nitrocelluloseskive og deretter vasket med 5% TCA ved værelsetemperatur. Alle filtere ble tørket under en varm lampe og hvert filter ble anbragt i scintilleringsfluid for telling (cpm). Den prosentvise innlemmelse av markør (label) i DNA

med høy molekylvekt ble bestemt ved anvendelse av verdiene ved 10 ul og 90 ul- 1Ua av ss cDNA tilsvarte ca. 8,5% innlemmelse .

En 1,5% agarose TBE-gel ble kjørt med 0,5 ul reaksjonsprodukt. Den midlere størrelse av ss cDNA ble vist å være 1500-2000 nukleotider. Den øvre vandige fase som ble fjernet fra ekstrak-sjonene, ble anbragt på en 1 ml Sephadex G5 0-kolonne i TE-buffer for å fjerne ikke-innlemmet markør. TE-buffer ble anvendt for eluering og 100 ul fraksjoner ble tatt. Fraksjoner inneholdende merket ss cDNA ble slått sammen. Sammenslåingen ble butanolekstrahert for å redusere volumet til ca. 50 ul»Q<3 10 Ul av 10 M NH4OACog 2 volumer etanol ble tilsatt. Blandingen ble holdt på -20°C over natten. (For butanolekstraksjonen ble seks volumer butanol satt til ett volum oppløsning og rystet kraftig. Den øvre vandige fase ble fjernet og kassert).

Det enkelttrådede (ss) cDNA-bunnfall ble samlet opp ved sentrifugering i en mikrosentrifuge i 15 min. DNA-pelleten ble vasket en gang med 7 0% etanol. Den ble tørket fullstendig i et vakuum-tørkeapparat (speed vac) og pelleten ble tellet (for å skaffe en grunnlinje fra hvilken man kan bestemme etterfølgende tap av radioaktiv merkelapp). Den annen tråd ble syntetisert ved kombinasjon av de følgende og ved at reaksjonen ble holdt på 14°C i 2 h og deretter 37°C i 20 min:

ss DNA-pellet

25 ul 2X annentråds-buffer

22 yl dH20

1,0yl<32>P-dCTP(3200 ci/mmol)

To 0,5 yl prøver av reaksjonsblanding ble tatt som tid 0 for en TBE-gel og TCA-utfelling som angitt ovenfor. Deretter ble 2,0 yl Klenow (5 U pr. yl, IBI) tilsatt og reaksjonen tillatt å skride frem ved 37°C i 20 min.

To 0,5 yl prøver med tid = 160 min ble tatt for TCA-utfelling og TBE-gel, og deretter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 2 yl 0,5 M EDTA. Reaksjonen ble underkastet én fenol/kloro-form:isoamylalkohol-ekstråksjon og én kloroform:isoamylalkohol-ekstraksjon. En TCA-utfelling ble utført på 0,5<y>l-prøvene som beskrevet tidligere. En 1,0% formaldehydgel ble deretter kjørt sammen med denne prøve. En eksponering over natten viste at det dobbelttrådede (ds) cDNA hadde den rette størrelse,

dvs. større enn enkelttrådet (ss) cDNA. Prøven ble deretter kjørt over en Sephadex G-5 0-kolonne, og 20 0<y>l fraksjoner ble samlet opp først, fulgt av 100 yl fraksjoner. TE ble brukt til eluering. Fraksjoner ble slått sammen og butanolekstrahert til 50<y>l. 10 yl av 10N NH4OAc ble tilsatt, og prøven ble deretter etanolutfelt over natten med 2 volumer etanol.

Det utfelte dobbelttrådede cDNA ble spunnet ned i en mikrosentrifuge i 15 min og pelleten ble resuspendert i 50 yl TE-buffer, 10 yl NH4OAc, og to volumer etanol. Blandingen ble inkubert i et bad av tørris/etanol i 10 min og deretter sentri-fugert i 15 min i en mikrosentrifuge. Pelleten ble vasket med 7 0% etanol og spunnet igjen i 15 min. Etanolen ble suget av og pelleten ble tørket kort i et vakuumtørkeapparat.

En reverstranskriptase-reaksjon ble utført for å komplettere den annen tråd. Pelleten ble resuspendert i 26 ul dr^O og de følgende ble tilsatt og tillatt å reagere ved 42°C i 60 min:

5,0 ul 0,5 M Tris, pH 8,3

2,5 ul 0,2 M MgCl2

2,0 ul 0,7 M (3-merkaptoetanol

6,5 ul 1 M KC1

1,25 yl av 20 mM dNTP (alle 4; 1,25 ul av hver)

3,0 ul av reverstranskriptase (18 U pr. ul)

Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 2 ul 0,5 M EDTA,

fulgt av en fenol/kloroform:isoamylalkohol-ekstraksjon og en kloroform:isoamylalkohol-ektraksjon. 10 ul av 10 M NH4OACble tilsatt, og blandingen ble etanolutfelt ved -20°C over natten. Neste dag ble DNA-utfellingen samlet opp ved sentrifugering i en mikrosentrifuge i 15 min. Etter en vask med 7 0% etanol ble DNA tørket i tørkeapparatet.

En Sl-nuklease-reaksjon ble deretter utført ved resuspendering av pelleten i 44 ul dr^O, kombinasjon av de følgende reagenser og inkubasjon ved 37°C i 30 min:

5 yl 10X Sl-buffer

1 ul Sl (lagret ved 4°C, Sigma, 10 U pr. ul

Før tilsetningen av Sl ble to 0,5 ul prøver tatt for tiden 0 TCA-utfelling og en 1,5% vandig gel. Reaksjonstiden ble stanset ved tilsetningen av 2 ul 0,5 M EDTA. Reaksjonen ble fenol/kloro-form:isoamylalkohol-ekstrahert én gang og kloroform:isoamyl-alkohol-ekstrahert én gang. Før reaksjonen ble stanset, ble to 0,5 ul tid 30-prøver tatt for TCA-utfelling og en 1,5% vandig gel.

Den vandige fase ble anvendt på en G-50-kolonne og 10 0 ul fraksjoner ble samlet opp ved TE-buffereluering. Ca. fem cDNA-holdige fraksjoner ble slått sammen og butanolekstrahert ned til et endelig volum på 50 ul. 10 ul NH4OACpluss 2 volumer etanol ble tilsatt og den dobbelttrådede cDNA-utfelling ble samlet opp ved inkubering ved -20°C over natten. Det utfelte DNA ble spunnet ned og vasket med 7 0% etanol, fulgt av tørking i tørkeapparatet. Pelleten ble resuspendert i 40 ul dl^O.

Halvparten av cDNAet ble C-haletilføyet (C-tailed) ved kombinasjon av de følgende og opprettholdelse på 37°C i 30 min:

20 ulCDNA (100 ng/20 ul)

10 ul 5X haletilføyningsbuffer

3 ul 10 uM kald dCTP

1 ul<32>P-dCTP

15 ul dH20

1 ul endetransferase, TTase

(21 U pr. ul, Ratliffe Biochemicals)

0,5 ul av reaksjonsvolumet ble tatt på tid 0 og 3 0 min og en TCA-reaksjon ble utført. TCA-reaksjonen viste at bare noen få Cer var tilføyet, slik at reaksjonen ble tatt av is og 3 ul

10 uM og 1 ul TTase ble tilsatt. Reaksjonen fortsatte i 30

min ved 37°C. En ny TCA-utfelling viste at det riktige antall Cer var tilføyet.

Det haletilføyede cDNA ble kjørt over en Sephadex G-50-kolonne, fraksjonene ble samlet opp ved TE-buffereluering og deretter slått sammen. Etter butanolekstråksjon ble cDNA etanolutfelt ved -20°C over natten. Det utfelte C-haletilføyde cDNA ble samlet opp ved sentrifugering i en mikrosentrifuge i 15 min og deretter vasket med 7 0% etanol. cDNA ble tørket og resuspendert i 20 ul TE.

Det haletilføyde cDNA ble sammenføyet med en G-haletilføyet pBR322-vektor som følger:

19 pl cDNA (100-150 ng)

5 ul 5X sammenføyningsbuffer

1,0 ul vektor (New England Nuclear pBR322, fortynnet 1:3)

De ovenfor angitte komponenter ble kombinert og holdt på 65°C

i 3 h og deretter 42°C i 2 h. Reaksjonen ble tillatt å kjølne til værelsetemperatur og deretter lagret ved -20°C. 100 ul av kompetente HB101 (BRL nr. 5B302)-celler ble transformert med 16 ng/2 ul av de ovenfor angitte cDNA-vektorer i henhold til fabrikantens instruksjoner. Ca. 10 0 0 kolonier ble generert.

Eksempel III

Sortering (screening) og karakterisering av MDBK<R>cDNA-biblioteket

Det bovine cDNA-bibliotek ble sortert i duplikat med en blanding av tre oligonukleotider (85-47, 85-48, 85-53, se tabell 3)

som koder for henholdsvis 5'-enden av ape-MT-I-sekvensen, 5'-enden av ape-MT-II-sekvensen og antisans-sekvensen av det midtre parti av konsensus-metallotioneinsekvensen, og med et klonet fragment som koder for apemetallotionein (L142-1).

■'■Fullstendig sekvens publisert av Searle et al. Mol. Cell. Biol. 4:1221-1230 (1984).

Duplikatløft av biblioteket ble fremstilt og hvert filter ble prehybridisert i 1,5 h med 5X SSC, 0,1% SDS og 10X Denhardts ved 42°C. De tre oligoer ble kinasert og L142-l-innskuddet ble merket ved tilfeldig priming (5 X 10^ cpm pr. ul). De prehybridiserte filtere ble vasket kort i 5X SSC og til ett ble der satt den blandede oligoprobe (25 ul av hver oligo) og til det andre ble der satt L142-l-proben (10 yl). 5X SSC,

0,1% SDS, 10X Denhardts og lydbehandlet laksesperma-DNA til en endelig konsentrasjon på 500 ug/l ble tilsatt og hybridi-seringen fortsatt over natten ved 54°C.

Filtrene ble vasket ved 65°C fire ganger i 15 min hver gang i 150 ml av en oppløsning bestående av 0,IX SSC pluss 0,1% SDS. Filtrene ble deretter utsatt for røntgenfilm og en autoradiograf av hver ble fremkalt. Seks positiver, A-F, ble identifisert som hybridiserte til begge probene og ble ytterligerekarakterisertsom beskrevet nedenunder.

Minipreparater ble utført på positiver A-F. Pstl-restriksjonsdigereringer ble utført iht. fabrikantens instruksjoner og analysert på en 1% agarosegel. Av de seks positiver ble klon MDBK-C<1>valgt. Det minipreparerte (mini-prepped) DNA ble probet med de blandede oligoer som angitt ovenfor. Prehybridisering var ved 54°C i 3 h (5X SSC, 0,1% SDS, 10X Denhardts). Hybridisering med probe ble fortsatt over natten ved bruk av de samme betingelser. Klon MDBK-C hybridiserte igjen til proben. Den ble omdøpt til L219-1.

Det innskutte materiale fra klon L219-1 ble restriksjonskart-lagt. Et ca. 450 basepar Pstl/BamHI-fragment av L219-1 hybridiserte til de 5'- og 3'-spesifikke oligoprober. Innskuddet fra L219-1 ble subklonet inn i pUC19, hvilket gav klon L220-1.

Eksempel IV

Sekvens av L220- l- innskudd

Innskuddet av L220-1 ble sekvensert ved dideoksymetoden [Sanger et al., PNAS 74, 5463 (1977)]. DNA-sekvensen ble translatert inn i sin utledede aminosyresekvens og den ble funnet å kode for et protein som var identisk med den publiserte aminosyresekvens av bMT-II med unntagelse av én aminosyresubstitusjon. Kodonet for aa nr. 18 i L220-1 koder for et prolin, mens den publiserte sekvens for bMT-II hadde et serin i aa nr. 18-posi-sjonen (Mungen et al. JEC 260:10032-10038 (1985)).

Eksempel V

Konstruksjon av det MDBK aenomiske bibliotek

DNA ble ekstrahert fra MDBK- og MDBK<R->celler som beskrevet i eksempel II. DNA ble resuspendert i TE-buffer og 15 ug DNA ble digerert med PvuII, underkastet elektroforese på en 1,0% agarosegel ved bruk av TBE-buffer, overført til en zetaprobe-nylonmembran og probet med en kinasert 36-mer oligonukleotid-probe som strakte seg over ATG av bMT-innskuddet i L220-1. Sekvensen av oligoet er som følger:

Hybridiseringsbetingelsene var som følger:

Filteret ble tørket og plassert under film i 86 h. Den fremkalte film viste klart et PvuII-fragment med en størrelse på 4,7 kb som var forstørret i MDBK<R->cellene sammenlignet med MDBK-cellene, hvilket øyensynlig inneholdt bMT-genlokuset. En fragmentfremstilling i stor målestokk av genomisk DNA ble utført for å isolere det 4,7 kb-store PvuII-fragment. Det ble digerert med PvuII og størrelseselektert på en 0,8% agarosegel. Lambda-størrelsemarkører ble kjørt i parallell. Gelen ble

lagt på en lysboks og den del av gelen som inneholdt fragmenter på 3,5-6 kb i størrelse, ble kuttet ut med et barberblad og

anbragt i et dialyserør. DNA-fragmentene ble elektroeluert ut av gelskiven som dialyserøret inneholdt, og DNA ble samlet opp fra oppløsningen i røret. Den ble renset ved kjøring over en Schleicher og Schull elutip-kolonne iht. fabrikantens instruksj oner.

Ved preparering for innsetting i XgtlO- og Xgtll-kloningsvek-torer ble EcoRI-linkere satt til endene av de størrelseselek-terte fragmenter.

De følgende linkere ble anvendt:

18 mer 5'CCTTGACCGTAAGACATG-3'

22 mer 3'GGAACTGGCATTCTGTACTTAA-5'

18-meren ble fosforylert ved kombinasjon av de følgende reagenser og inkubering ved 37°C i 15 min:

De følgende to reagenser ble satt til den ovenfor angitte blanding og inkubert ved 37°C i 3 0 min:

Enzymet ble deretter inaktivert ved koking i 10 min. 22-meren ble hybridisert til den fosforylerte 18-mer ved tilsetning av 225 pmol av 22-meren (pluss vann for å bringe volumet på 15 ul), og inkubert ved 65°C i 5 min. Reaksjonen ble deretter tillatt å avkjøle langsomt til værelsetemperatur.

Adapterne forelå ved en konsentrasjon på 15 mmol/yl og var klare for genomisk cDNA-vektorligering.

De følgende ble kombinert:

Det koblede genomiske DNA ble fosforylert ved anvendelse av den følgende teknikk. Ligasen ble inaktivert ved oppvarming av blandingen til 72°C i 15 min. De følgende reagenser ble deretter satt til ligasjonsreaksjonen og varmet opp ved 37°C i 30 min:

Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 2 ul 0,5 M EDTA,

fulgt av en fenol/kloroform-ekstraksjon og en kloroform-ekstraksjon.

Det ovenfor beskrevne DNA ble renset og størrelseselektert

ved bruk av de følgende teknikker. DNA ble tørket i et vakuum-tørkeapparat til ca. 20 yl. 2,5 yl av gel-lastingsfarge ble tilsatt og prøven kjørt over en BIO GEL A-50-kolonne som var blitt vasket med TE-buffer. Fem minutters fraksjoner ble samlet opp (ca. 30 yl) og tellet i et scintillasjonstelleapparat.

0,5 yl av en rekke av de oppsamlede fraksjoner ble kjørt på

en 1,5% agarose minigel. Gelen ble fotografert, tørket og plassert under film.

De EcoRI-avsluttede fragmenter ble ligert inn i Xgtll ved anvendelse av de følgende fremgangsmåter. Fraksjonene inneholdende DNA ble slått sammen, butanolekstrahert ned til 20-30 ul og 5 ul 10 M NH4OACpluss to volumer etanol ble tilsatt for å utfelle DNA. Prøven ble spunnet i en mikrosentrifuge i 15 min og deretter underkastet en vask med 9 5% etanol og tørket. DNA ble resuspendert i TE-buffer (ca. 0,10 pmol/ul).

Ligasjonsreaksjonen inneholdt de følgende, som ble inkubert ved 14-16°C over natten:

(bruk 1 ug Xgtll-vektor = 0,035 pmol vektor)

XgtlO og Xgtll ble pakket ved anvendelse av Gigapack in vitro pakkeutstyr levert av Stratagene, iht. fabrikantens instruksjoner. Xgtll-fagen ble deretter platet med E. coli-verten Y1088 på fem plater ved en konsentrasjon på ca. 20 000 plaques pr. plate.

Eksempel VI

Sortering av aenomisk bibliotek

To prober ble fremstilt for sortering av det MDBK<R>genomiske bibliotek for denne bMT-II regulatoriske sekvens. 36-mer oligoproben fra eksempel V ble kinasert til en spesifikk aktivitet på 5 x IO<8>cpm pr. ug. En plasmidfremstilling i stor skala ble gjort med pL220-l fra eksempel III. Plasmidet

ble nick-translatert til en spesifikk aktivitet på 3 x IO<8>

cpm pr. ml. Duplikatløft ble gjort av hver plate.

Ett sett løft ble hybridisert til oligoen i en blanding av

6 x SSPE, 5x Denhardts, 25% formamid, 0,1% SDS og 200 ug/ml oppkuttet sildesperma-DNA og ca. 1 x 10^ cpm pr. ml probe i 17 h ved 42°C. Filtrene ble vasket flere ganger i 15 min for hver vask i en blanding av 0,2x SSPE og 0,1% SDS ved 55°C. Filtrene ble plassert under film med en netting over natten.

Duplikatsettet av filtrene ble hybridisert med plasmidproben idet man fulgte de betingelser som er angitt for oligoen, bortsett fra at 5x SSPE og 50% formamid ble benyttet istedenfor 6x SSPE og 25% formamid. Filtrene ble vasket flere ganger i 0,lx SSPE og 0,1% SDS ved 65°C og anbragt under film med en netting over natten.

Filmene av duplikatløftene ble fremkalt og flekkene av hybri-diseringer som representerte \-kloner bestående av innskudd-sekvenser homologe med oligoen og plasmidprobene ble sammenlignet. Der ble identifisert 12 potensielt positive kloner som hybridiserte til den over ATG-spennende oligo. Hybridisering med plasmidet pL220-l produserte en sterkt generalisert bakgrunn som gjorde det umulig å identifisere kloner inneholdende sekvenser av bMT-promotorelementet med denne probe. Bakgrunnen skyldtes homologi mellom sekvenser i proben og sekvenser i Xgtll-vektoren pluss sekvenser i E. coli Y1088-verten.

To kloner, XBMT9 og XBMT12, ble valgt for ytterligere karakterisering. Disse kloner ble plaque-renset og minipreparater ble utført som beskrevet av Benson et al., Biotechniques, mai/juni 1984, p. 126. De innskutte størrelser av kloner XBMT9 og XBMT12 ble bestemt ved digerering av minipreparatet med EcoRI for å kutte ut innskuddet, og kjøring av digererings-produktene på en 0,8% agarosegel. 0X174 Haelll-digerert DNA

og X Hindlll-digerert DNA-størrelsesmarkører ble kjørt i parallell. Etidiumbromidfarging viste at begge innskuddene var 4,7 kb i størrelse. En annen porsjon av først-digerert mini-

preparat DNA ble kjørt på en annen 0,8% agarosegel, og begge agarosegelene ble fullstendig tørket. Etter denaturering og nøytralisering av nukleinsyrene ble gelene probet med enten den over ATG-spennende oligo eller pL220-l som tidligere beskrevet. Begge innskuddene hybridiserte til begge probene.

Et annet minipreparat ble utført for XBMT9. Et restriksjonskart ble generert ved digerering av porsjoner av minipreparat-DNA med de følgende enzymer: BamHI, Bglll, Hindlll, Kpnl, Ncol, Pstl, SacI, Xbal iht. fabrikantens instruksjoner. Restrik-sjonskartet av XBMT9 er vist på fig. 1.

Eksempel VII

Sekvenserin<g>av XBMT9- innskuddet

En fremstilling av XBMT9 i stor skala ble utført og innskudd-DNA ble kuttet ut ved EcoRI-digerering. Innskuddet ble renset ved elektroforese i en 0,8% TBE-agarosegel. 4,7 kb-fragmentet ble kuttet ut av gelen og fragmentet ble elektroeluert i dia-lyserør. Fragmentet ble deretter renset ved en elutip-kolonne. Forskjellige subkloner av innskuddet ble konstruert i M13, og det ca. 1740 bp HindIII/EcoRI-fragment ble deretter sekvensert iht. Sangers dideoksy-sekvenseringsmetode (Sanger, F. og A. R. Coulsoun, 1975, "A Rapid Method for Determining Sequences in DNA by Primed Synthesis with DNA Polymerase" J. Mol. Biol. 94:441-448).

Sekvensen av XBMT9-innskuddet (tabell 1) ble sammenlignet med kjente sekvenser av metallotionein-promotorelementer fra andre materialer. Identifiseringen av multippel metallregulatoriske områder, "TATA"-boks, og en initiator-ATG identifiserte XBMT9-innskuddet som inneholdende et MT-promotorelement. Sammen-ligningen av sekvensen for det strukturelle gen av XBMT9 med den publiserte aminosyresekvens for bMT-II-proteinet identifiserte XBMT9-innskuddet som kodende for bMT-II-promotorelementet og et parti av det strukturelle gen.

Eksempel VIII

Konstruksjon av pL260

Plasmid pL17-l er et pBR322-basert plasmid som inneholder

både de 5'- og 3'-MSV LTR. Det 5'-LTR-holdige fragment ble kuttet ut fra pL17-l ved at der først ble fremstilt et plasmid-preparat i stor skala (Maniatis et al.) og deretter digerering med EcoRI og Pstl iht. fabrikantens instruksjoner. Fragmentet med den riktige størrelse ble identifisert på og isolert fra en 1% agarosegel. Det tilnærmet 1680 bp LTR-holdige fragment ble ligert inn i pUC8 plasmid-DNA, som tidligere var blitt kuttet med Pstl og EcoRI. Ligeringsbetingelsene var som følger. Ca. 100 ng av hvert fragment ble plassert i en ligasjonsreak-sjonsblanding med T4-ligase ved 14°C over natten. Ligasjons-produktene ble transformert inn i bakterielle HBlOl-celler. Transformantene ble selektert for ved Amp<R>. DNA-minipreparater ble fremstilt på transformanter, og restriksjonsdigereringer med diagnostiske enzymer bekreftet den riktige konstruksjon av plasmidet. Det resulterende plasmid ble kalt pL15 3.

Plasmid pL38 er en rekombinant retroviral vektor konstruert for å uttrykke kyllingveksthormon (cGH). Det 5<1->LTR er fra MSV og anvendes til å fremme ekspresjon av cGH-genet. Det bakterielle neomycin-gen, neo, anvendes av plasmidet som en seleksjonsmarkør i eukaryote celler. Dets ekspresjon styres av musemetallotioneinpromotoren (mMT-I). 3'-LTR-elementet er fra MLV og dets nærvær i vektoren sammen med 5'-LTR tillater tilfeldig enkeltkopi-integrering av plasmidet inn i det eukaryote genom. En plasmidpreparering i stor skala av pL38 ble utført. DNA ble digerert med Hindlll og BamHI og det mindre fragment på tilnærmet 3220 bp ble isolert. I dette fragment inneholdes mMT-neo-ekspresjonsenheten. En annen digerering som anvendte BamHI og EcoRI, gav et fragment på ca. 4260 bp, som inneholdt det bakterielle replikasjonsopprinnelsessted (ori), det bakterielle ampicillinresistensgen (amp) og MLV LTR.

En plasmidfremstilling i stor skala av pL15 3 ble utført og

det MSV LTR-holdige fragment ble kuttet ut ved EcoRI- og

Hindlll-digerering. Fragmentet med den riktige størrelse, ca. 1200 bp, ble identifisert på og isolert fra en agarosegel.

De tre isolerte fragmenter ble ligert sammen ved anvendelse

av standard ligeringsbetingelser. Bakterieceller ble transformert med ligasjonsblandingen og deretter dyrket i ampicillin-holdige media. Transformanter ble identifiset ved deres evne til å vokse i ampicillin. Plasmider ble utvunnet fra transformanter og diagnostiske digereringer bekreftet riktig plasmid-sammensetning. En Hindlll/BamHI-digerering gav to bånd på

5499 og 3215 bp, en Hindlll/BamHl/EcoRI-digering gav bånd på 4310, 3184, 1189, 31 (ikke synlig). Det resulterende plasmid ble kalt pL156.

Plasmid pL156 inneholdt det følgende i orientering med urviseren: MSV LTR, mMT-neo, MLV LTR, bakterielt ori og bakterielt amp. To separate digereringer ble utført på plasmidfremstilling i stor skala av pL156 for å isolere henholdsvis mMT-neo-ekspresjonsenheten og plasmidsekvensene pluss LTR. Først ble en Hindlll/AsuII-dobbeltdigerering utført. To fragmenter ble resultatet fra denne digerering. Ett var tilnærmet 5660 bp og inneholdt 5'-MSV LTR og 3'-MLV LTR. Dette ble isolert fra en agarosegel. En EcoRI/AsuII-dobbeltdigerering av pL156 ble også utført og resulterte i tre fragmenter. Det mellomstore fragment, ca. 3000 bp, inneholdt mMT-neo-ekspresjonsenheten. Det ble identifisert på og isolert fra en agarosegel.

Plasmid pL223 er et pUC9-basert plasmid inneholdende bovinveksthormon (bGH) cDNA-sekvens. En plasmidpreparering i stor skala av pL223 ble utført og bGH cDNA ble kuttet ut fra pL223 ved en EcoRI/Hindlll-dobbeltdigerering. To fragmenter ble resultatet av denne digerering. Det mindre, tilnærmet 900 bp fragment inneholdt bGH-sekvensen. Det ble identifisert på og isolert fra en agarosegel.

En treveis-ligasjon ble utført med EcoRI/HindIII-fragmentet, EcoRI/AsuII-fragmentet og AsuII/HindIII-fragmentet ved anvendelse av standard ligasjonsbetingelser. Bakterier ble transformert med det resulterende plasmid, pL239, og ampicillin-resistente transformanter ble selektert. pL239 var det eneste mulige ligasjonsprodukt, og det ble identifisert ved diagnostisk digerering av minipreparert DNA. Plasmid pL239 inneholder de følgende, i orientering med urviseren: 5<1->MSV LTR, bGH-cDNA, mMT-neo-ekspresjonsenheten, 3'-MLV LTR og det bakterielle ori og amp-genet.

Vektoren pL260 ble konstruert fra pL239 ved kutting ut av bGH-genet og mMT-promotoren som følger. En plasmidpreparering i stor skala av pL239 ble utført og digerert med Bglll, hvilket gav to fragmenter. Det største vektorfragment, ca. 67 5 0 bp,

ble identifisert på og isolert fra en agarosegel. Den lineære vektor ble sirkularisert med DNA T4-ligase. Det resulterende plasmid, pL260, ble bekreftet fra minipreparert DNA fra amp<R>bakterieceller som var blitt transformert med plasmidet. Det består av 5'-MSV LTR, det bakterielle neo-aen og det 3'-MLV LTR sammen med det bakterielle amp-gen og ori. Plasmid pL260 (fig. 3) er tilnærmet 6700 bp. Et representerende flytdiagram av denne konstruksjon er vist på fig. 5A.

Eksempel IX

Konstruksjon avPL264, pL265 oa pL266

De følgende manipuleringer ble utført for å innsette bMT-bGH-sekvensen i den generaliserte rekombinante ekspresjonsvektor pL260 fra eksempel VIII.

Plasmid pBGHlOA er et pBR322-basert plasmid bestående av bGH-cDNA. En partiell Pstl-digerering av en plasmidpreparering i stor skala av pBGHlOA gav flere forskjellige fragmenter, av hvilke ett var tilnærmet 910 bp og inneholdt bGH-sekvensen minus 9 bp av 5'-kodingsekvens. Dette fragment ble identifisert på og isolert fra en agarosegel. Plasmid pUC9 ble linearisert ved Pstl-digerering og deretter isolert fra en gel. En standard ligering av Pstl-digerert pUC9 og det Pstl-avsluttede bGH-fragment ble utført. Bakterier ble transformert med ligasjonsblandingen og amp<R->kolonier ble selektert. Diagnostiske dige reringer av minipreparert DNA identifiserte det riktige kon-struerte stykke, kalt pL187. En Apal/Pstl-digerering gav vektor-fragmentet pluss et 332 bp-bånd. En Hindlll/EcoRI-digerering gav vektoren pluss et 900 bp-bånd.

Plasmid pL187 består av pUC9-plasmidsekvenser, innbefattet

det bakterielle amp<->aen og ori. og den nesten fullstendige kodingssekvens av bGH. Orienteringen av dette bGH-fragment iPL187 er det motsatte av den i pBGHlOA.

Den manglende 5<1->bGH-sekvens ble erstattet med den følgende treveis-ligasjon. 5'-enden av bGH-genet i pL187 ble isolert som et tilnærmet 315-bp Pstl/Apal-fragment ved digerering av en plasmidpreparering i stor skala av pL187 med disse enzymer. Fragmentet med riktig størrelse ble identifisert fra de mange Pstl/Apal-fragmenter som kom til syne på en gel og ble isolert. En Hindlll/Apal-digerering ble utført på preparert pL187 og

det store,tilnærmet 3180 bp-fragment ble identifisert og isolert. Dette fragment inneholder mesteparten av pL187-plasmid-sekvensen. Pstl/Apal- og ApaI/HindIII-fragmentene ble anvendt i en treveis-ligasjon med et dobbelttrådet syntetisk oligo-nukleotid. Oligoen tjente til å tilføye på nytt den manglende 5'-bGH-sekvens og generere ytterligere to kloningsseter ved 5'-enden av bGH-genet (Bglll og Ncol), foruten de allerede eksisterende Hindlll- og Pstl-seter. Ligasjonsbetingelsene var standard. Sekvensen av det syntetiske oligonukleotidpar var:

Hindlll Pstl

5' AGCTTAGATCTCC|ATG|GCTGCA 3'

ATCTAGAGG TAC GC

Bakterier (MC1061) ble transformert med ligasjonsblandingen

og amp<R->kolonier ble selektert. Det resulterende plasmid ble kalt pL223 og ble identifisert ved diagnostisk digerering av minipreparert DNA. (Digerering med Hindlll, Ncol eller Bglll lineariserte den riktige vektor). Plasmid pL223 inneholdt den fullstendige kodingssekvens for bGH.

Det bMT regulatoriske område inneholdes i XgtlO-basert plasmid XBMT9. bMT-fragmentet ble utvunnet fra XBMT9 ved en Ncol-digerering av en plasmidpreparering i stor skala av XBMT9. Det tilnærmet 680 bp-fragment ble identifisert på og isolert fra en agarosegel.

En plasmidpreparering i stor skala av pL223 ble digerert med Ncol som åpnet plasmidet ved 5<1->enden av bGH-genet. Det lineariserte plasmid ble isolert fra en agarosegel. En ligering ble utført med de to Ncol-avsluttede fragmenter for å innsette bMT-promotoren 5' i forhold til bGH-genet. Bakterieceller MC1061 ble transformert med ligasjonsproduktet og amp<R->kolonier ble selektert. Plasmid-DNA ble isolert fra transformerte celler ved minipreparering og orienteringen av bMT-innskuddet ble bekreftet ved restriksjonsdigerering av minipreparerte prøver av forskjellige kloner. Ett plasmid som plasserte seg i den riktige orientering var pL254.

Plasmid pL254 består av en bMT-bGH-ekspresjonskassett. BamHI-digerering frigjør et fragment som inneholder den 5'-endefor-kortede bMT-promotor funksjonelt orientert for å uttrykke den fullstendige bGH-gensekvens. En slik digerering ble utført på en plasmidpreparering i stor skala, og plasmidet med riktig størrelse, tilnærmet 1250 bp, ble identifisert og isolert fra en gel. Det BamHI-avsluttede fragment ble deretter ligert inn i plasmid pL260 som var blitt åpnet ved 3<1->enden av neo-genet ved digerering av en plasmidpreparering i stor skala med BamHI. Ligasjonsproduktet ble transformert inn i bakterielt MC1061,

og amp<R->kolonier ble selektert.

Tre typer plasmider ble isolert: pL264, pL265 og pL266 (fig. 4). Plasmid pL264 bærer bMt-bGH-ekspresjonsenheten i den samme orientering som neo-genet, ekspresjonsenheten er i den motsatte orientering i pL265. Plasmid pL266 bærer to kopier av bMT-bGH-ekspresjonsenheten, i tandem i, i motsatt orientering i forhold til neo-genet. Et representerende flytdiagram av disse kon-struksjoner er vist på fig. 5B og 5C.

Eksempel X

Aktiverinasbetinaelser for bMT- ll- promotor

A. Cellekultur

Tre cellelinjer ble anvendt:

1) MDBK-celler - en bovinnyre-cellelinje, ATCC nr. CCL22,

2) MDBK<R->celler, som beskrevet i eksempel I,

3) NIH3T3-celler - en musembryonisk fibroblastcellelinje, ATCC nr. CRL1658.

Alle tre cellelinjer ble dyrket på følgende måte. En ampulle med celler ble innført i en 7 5 cm<2>falcon-kolbe inneholdende ca. 10 ml fullstendig medium. Kolben ble inkubert ved 37°C

over natten i 5-10% CO2. Mediet ble byttet ut neste dag, og cellene tillatt å vokse ved 37°C i 5-10% CO2inntil sammen-løpende, tilnærmet 3-4 dager.

Cellene ble deretter delt når de ble sammenløpende. Dette ble oppnådd ved avsuging av mediet og tilsetning av 2 ml av en oppløsning av IX trypsin-EDTA (GIBCO). Denne ble suget av og erstattet med 2 ml av den samme oppløsning. Cellene ble etterlatt i berøring med denne oppløsning inntil de begynte å skille seg fra plateoverflaten, vanligvis 5-15 minutter. Når cellene var fraskilt, ble 10 ml fullstendig medium satt til oppløsningen av celler på 2 ml, og det samlede volum ble suget opp og ned for å dispergere celleaggregatene. Alt unntatt 5-10% av mediet inneholdende celler ble suget ut av kolben. 10 ml medium ble tilsatt, og kolben ble inkubert ved 37°C i 5-10% CO2. Dette ble gjentatt med noen få dagers mellomrom etter hvert som cellene ble sammenløpende.

B. Transfeksion av celler i kultur

Vevskulturceller ble delt opp på 60 mm's skåler ved en konsentrasjon på ca. 5 x 10^ celler pr. skål 24 h før transfeksjon. 3 ml fullstendig medium ble tilsatt, og cellene ble inkubert over natten ved 37°C. 2-3 h før transfeksjon ble mediet byttet ut ved avsuging av gammelt medium og tilsetning av 3 ml nytt medium.

En kalsiumfosfatutfelling ble deretter fremstilt med hvert plasmid som følger. 10 ug renset plasmid-DNA og 400<y>l samlet volum av utfelt DNA-oppløsning ble tilsatt for hver 60 mm's skål.

Hvert rør ble preparert (vanligvis 15 ml's falcon-rør) separat i et kammer med laminær strømning. Idet man langsomt boblet en strøm med luft inn i røret inneholdende DNA-CaCl2, ble HBS-oppløsningen tilsatt dråpevis. Den resulterende Ca3(P04)2~oppløsning ble deretter tillatt å inkubere ved værelsetemperatur i 15-30 min. De 400 ul med utfelt DNA-oppløsning ble deretter satt til en 60 mm skål, fortsatt inneholdende 3 ml medium. Etter lett svirring for å fordele oppløsningen jevnt ble skålen inkubert ved 37°C i 6 h. Etter 6 h ble mediet byttet ut og erstattet med nytt fullstendig medium. Etter 48 h ble cellene fordelt på en 100 mm's skål og G418, en neomycin-analog, ble satt til i de følgende konsentrasjoner:

3T3-celler - 400 ug/ml

MDBK-celler - 800 - 1 000 ug/ml

På dette punkt ble 1/5 av cellene anbragt i en 100 mm's skål

og de resterende 4/5 av cellene ble anbragt i en annen 100 mm's skål. En sammenligningsplate ble også arrangert i parallell. Denne transfeksjon inneholdt den samme mengde DNA, men inneholdt

ikke et selekterbart markørgen. Laksesperma-DNA ble anvendt istedenfor plasmidet, og de resulterende transfiserte celler ville ikke overleve seleksjonsprosessen.

Etter 3-4 dager ble de transfiserte celler vasket med nytt medium for å fjerne dødt celleavfall. Medium inneholdende antibiotikum ble satt til skålen. I løpet av 10-12 dager ble isolerte kloner av celler synlige.

G418<R->kloner ble isolert som følger. 100 yl trypsin-EDTA ble satt til hver brønn av en Linbro 6-brønns plaquing-skål. Mediet ble suget av fra skålen som inneholdt synlige kloner, og hver klon ble merket på bunnen av skålen med en permanent markering. En pinsett ble varmet opp i flamme, avkjølt og deretter brukt til å plukke opp et sterilt, sirkelformet filter (Whatman sirkelfilter 1-2 mm i diameter, tidligere sterilisert). Det sterile filter ble fuktet med en dråpe av mediet og deretter anbragt oppå en enkelt klon. Filteret ble gnidd lett på toppen av hver klon for å fange opp celler for overføring. Hvert filter ble deretter anbragt i en separat brønn inneholdende trypsin og tillatt å sitte der i 10-15 min. 2 ml fullstendig medium ble deretter satt til hver brønn. Den opprinnelige plate inneholdende kloner ble etterfylt med fullstendig medium. Klonene ble tillat å vokse i 6 brønnskåler (3-5 dager, avhengig av celletypen) og deretter analysert og/eller fordelt på større skåler.

Ekspresjon av bGH

Transfeksjoner av NIH3T3-, MDBK- og/eller MDBK<R->cellelinjer

med plasmider pL264, pL265 og/eller pL266 ble utført som angitt ovenfor og neomycinresistente celler ble selektert. Syntesen og frigjøringen av bGH-protein ble målt ved RIA fra mediet av de forskjellige transfiserte cellelinjer. I de fleste tilfeller ble kloner som var oppnådd fra en enkelt 100 mm skål slått sammen. En 100 mm skål inneholdende en sammenslåing av kloner ble analysert for konsentrasjonen av bGH.

Tabell 4 er en sammenstilling av RIA-data fra representative cellelinjer transfisert med disse plasmider. Disse data viser at i fravær av metallsupplering av mediet var der et lavt nivå av bGH-protein som ble syntetisert i disse celler transfisert med bMT-bGH-ekspresjonsvektorene.

Fra disse data ble NIH3T3/pL266-klon nr. 11 identifisert som den som uttrykte det høyeste nivå av bGH-protein.

Tabell 5 angir de metall-induserte bGH-proteinekspresjonsdata. Metall ble ikke satt til mediet hvor kontrollceller vokste. Således betyr "prosent av sammenligning"-verdien økningen i bGH-proteinekspresjon som respons på metaller. (En verdi på 10 0% betyr et bGH-proteinnivå som er det samme som sammen-ligningen, dvs. ikke noen induksjon).

Et forhold mellom zink:kadmium på 4:1 gav den beste induksjon av genekspresjon. (Bemerk: Den absolutte konsentrasjon av metallioner kan være høyere i celler som er resistente for metallioner, f.eks. MDBK<R->celler, og bør være lavere i celler som ikke vanligvis dyrkes i nærvær av metaller).

Claims (10)

1. DNA-fragment, karakterisert ved at det omfatter et bovinmetallotionein regulatorisk område som reagerer på nærværet av tungmetaller i vertscellens miljø.

2. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det har det restriksjonskart som er vist på fig. 1, særlig at det har den nukleotidsekvens som er vist i tabell 1.

3. Eukaryote celler transformert med DNA-fragmentet som angitt i krav 2, karakterisert ved at DNA-fragmentet er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid.

4. DNA-fragment, karakterisert ved at det består stort sett av et bovinmetallotionein regulatorisk område hvor DNA-fragmentet reagerer på nærværet av tungmetaller i vertscellens miljø og har det restriksjonskart som er vist på fig. 2, særlig at det har den nukleotidsekvens som er vist i tabell 2.

5. DNA-fragment som angitt i krav 1 eller 4, karakterisert ved at det er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid, særlig at det er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et peptid valgt fra gruppen bovinveksthormon, humanveksthormon, kyllingveksthormon og humanveksthormon-frigjørings-faktorer.

6. Eukaryote celler transformert med DNA-fragmentet som angitt i krav 4, karakterisert ved at DNA-fragmentet er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid.

7. Vektor, karakterisert ved at den omfatter et bovinmetallotionein regulatorisk område, hvilket område reagerer på nærværet av tungmetaller i vertscellens miljø og er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid, idet vektoren kan replikere i celler valgt fra gruppen bestående av eukaryote og prokaryote celler eller begge deler, særlig at den inneholder i) minst ett markørgen ii) minst en lang repeterende ende, og iii) minst ett bakterielt replikasjonsopprinnelsessted.

8. Vektor som angitt i krav 7, karakterisert ved at den inneholder: i) minst to sammenkoblede seriearrangementer i samme orientering av et bovinmetallotionein regulatorisk område operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid, ii) et markørgen for neomycinresistens iii) et markørgen for ampicillinresistens.

9. Celler, karakterisert ved at de omfatter gruppen eukaryote celler transformert med vektoren som angitt i krav 7 eller 8, bovinceller transformert med vektoren som angitt i krav 7 eller 8, NIH 3T3-celler transformert med vektoren som angitt i krav 7, eller MDBK-celler transformert med vektoren som angitt i krav 7.

10. Plasmid pL266.