CN102618503B

CN102618503B - 一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1d7株

Info

Publication number: CN102618503B
Application number: CN 201210081170
Authority: CN
Inventors: 王永山; 毕振威; 夏兴霞; 孙婧; 范红结; 赵艳兵; 温海; 秦海斌; 张汇东
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: CN102618503A

Abstract

本发明涉及一种分泌高中和活性犬瘟热病毒（CDV）单克隆抗体的杂交瘤细胞株，属于生物技术领域。本发明从建立的82株分泌CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞1D7，用其制备的小鼠腹水抗体对CDV的病毒中和效价高达10⁶。本发明的杂交瘤细胞株分泌高中和活性CDV单克隆抗体不仅中和效价高而且抗CDV毒株范围广，用于犬、水貂或狐狸的犬瘟热（CD）发病动物的临床治疗，治疗效果显著，安全无不良副反应。本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体治疗剂，保存二年后中和效价不降低，稳定性好。

Description

一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株

技术领域

本发明涉及一种分泌高中和活性犬瘟热病毒（CDV）单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株，属于生物技术领域，涉及抗体工程技术。具体为高中和活性CDV单克隆抗体，对不同动物源的CDV毒株均具有高中和活性，可以用于犬、水貂和狐狸等多种犬瘟热（CD）发病动物的临床治疗。

背景技术

犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起犬和肉食目中多种动物的一种高度接触性传染病，发病率几乎可达100%，死亡率为80%以上。犬瘟热在我国的发病率和致死率均有升高的趋势，而且临床表现也与以往有所不同。典型CD在临床上以双相热、急性鼻卡他、支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为主要特征。近年来，在临床上发现了大量CD病例，仅表现为一般呼吸道、消化道疾病的临床症状，CDV检测阳性，若不及时地进行CD特异性治疗，死亡率很高，对这种CD病例，我们称之为“非典型CD”。

该病呈世界性分布，敏感宿主广泛且日益扩大。犬瘟热是危害犬的最严重传染病。不同年龄和品种的犬都可感染，尤其是幼龄犬。纯种犬与当地土种犬相比，易感性明显增高。在犬中首次发生犬瘟热，死亡率可达90%。貂的犬瘟热又称貂瘟，是高度接触性、传播迅速的烈性传染病，死亡率达98％以上。CDV在食肉目内及食肉目犬科、鼬科与鳍足目海豹科之间跨宿主传播，是CD流行的重要因素。因此，犬瘟热是养犬业、经济动物养殖业危害最大的传染病。

CDV属于副粘病毒科，麻疹病毒属，病毒粒子呈圆形或椭圆形，有时也呈长丝状，直径为150～300nm。粒子中心含有宽径约15～17nm螺旋形核衣壳，外面被覆一近似双层轮廓的膜，膜上排列有1.3nm杆状纤突。病毒的基因组为不分节段的负链RNA，全长15,616nt，从它的3′端到5′端依次为3′端前导序列、核衣壳蛋白基因（N）、磷蛋白基因（P）、基质蛋白基因（M）、融合蛋白基因（F）、附着或血凝蛋白基因（H）、大L蛋白基因（L）和5′端引导序列。P、N、L为髓芯蛋白，与RNA转录和复制有关，N蛋白有包裹及保护内部基因的功能，P蛋白可能有聚合酶功能。M、F、H为包被蛋白，位于N蛋白的外侧，H蛋白以近N末端的疏水区将其嵌在M蛋白上，H蛋白是病毒侵袭宿主所必需，也是产生中和抗体的主要抗原之一。F蛋白是病毒表面的糖蛋白之一，介导病毒与感染细胞，感染细胞与非感染细胞间的融合，使病毒具有在宿主体内扩散的能力。F蛋白首先以前体的形式被合成，只有经细胞的蛋白酶裂解成F1、F2形式，才具有融合活性。

目前预防该病使用的疫苗多为弱毒苗，但是许多犬、水貂、狐等养殖场在应用弱毒疫苗后仍会发生本病。分析原因，与母源抗体、疫苗效价、使用方法以及病毒变异有关。

在临床上，CD发病动物采用抗体结合对症治疗的方法可以有效降低病死率。但是市场上现有的抗犬瘟热病毒的高免血清多是来自于本源动物或异源动物，不仅抗体中和效价低，而且潜在着异源病毒传播、过敏等风险。应用具有高中和活性的犬瘟热病毒单克隆抗体治疗CD，可以降低上述风险，提高疗效。目前，有关分泌CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株已有报道，部分细胞株分泌的单克隆抗体对CDV具有中和活性，但中和效价低，对不同CDV毒株的中和活性至今未见报道。

本发明从已免疫过Onderstepoort疫苗而发生非典型CD临床症状的病犬组织中分离CDV强毒株，与Onderstepoort疫苗株存在着变异。以该病毒株为免疫原，运用淋巴细胞杂交瘤技建立了CDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞库，通过中和试验筛选出了分泌高中和效价的单克隆抗体杂交瘤细胞，分泌的单克隆抗体对非典型CDV强毒株、Onderstepoort疫苗株、狐源CDV毒株和水貂源CDV毒株均具有相同的高中和活性（均达到10⁶），表明本发明的单克隆抗体不仅中和效价高而且抗CDV毒株范围广。将本发明的高中和活性单克隆抗体治疗剂应用于犬、水貂或狐狸的犬瘟热临床治疗，均具有显著治疗效果。

发明内容

技术问题

犬瘟热是犬和肉食目中多种动物的一种高度接触性传染病，如果对发病动物不进行及时治疗，死亡率达到80%以上。

本发明的目的是提供一种分泌高中和活性CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株的建立是用近期从免疫失败的病犬病理组织中分离的CDV强毒株为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术建立的CDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。用该杂交瘤细胞制备的小鼠腹水，经病毒中和试验证明不仅中和效价高而且抗CDV毒株范围广，应用于犬、水貂或狐狸的犬瘟热临床的治疗，效果显著。

技术方案

一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株，该杂交瘤细胞株于2012年2月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201222。

用所述杂交瘤细胞1D7株制备的犬瘟热病毒单克隆抗体。所述的单克隆抗体可在制备犬瘟热病毒单克隆抗体治疗剂中得到应用。所述单克隆抗体治疗剂对犬源犬瘟热病毒株、水貂源犬瘟热病毒株、狐源犬瘟热病毒株或犬瘟热病毒Onderstepoort疫苗株的中和效价高达10⁶。所述单克隆抗体治疗剂可用于犬、水貂或狐狸的犬瘟热临床治疗。

所述单克隆抗体治疗剂制备方法为，将杂交瘤细胞1D7株注射到经BALB/c小鼠腹腔，制备单克隆抗体腹水，离心，收集上清液，灭活补体，过滤除菌，稀释，加入稳定剂，分装，低温冻存。

有益效果本发明的特点和优点如下：

1.本发明使用的CDV免疫原是从已免疫过Onderstepoort疫苗但发生非典型CD临床症状的病犬组织中分离的CDV毒株。

2.本发明从建立的82株分泌CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞，用其制备的小鼠腹水抗体对CDV的病毒中和效价高达10⁶。

3.本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体对犬源CDV毒株、水貂源CDV毒株、狐源CDV毒株和Onderstepoort疫苗株均表现相同的高中和活性，抗CDV毒株范围广。

4.本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体治疗剂，用于犬、水貂和狐狸等多种CD发病动物的临床治疗，治疗效果显著，安全无不良副反应。于-20℃保存二年后抗体中和效价不降低，稳定性好。

具体实施方式

（一）单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1.CDV抗原的制备将近期从免疫失败的病犬组织中分离的CDV NJ01强毒株（毕振威等,非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达.中国预防兽医学报,2011,33(8):625-629.）接种于vero细胞，3d细胞发病变（CPE），5d后收毒。将病变的细胞培养物反复冻融3次，4000×g离心后去除细胞碎片。病毒上清液经1M醋酸锌溶液沉淀后，用饱和EDTA溶液重新悬浮沉淀，4℃条件下，49000×g离心60min，沉淀用NTE充分悬浮。加入20%、30%、40%、50%和60%（质量/体积）的密度梯度蔗糖溶液，61000×g离心90min。吸取病毒带，通过电镜负染观察病毒形态，并用分光光度计测定病毒浓度，置-70℃保存备用。

2.动物免疫用纯化的CDV NJ01株作为免疫原，腹腔注射免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学实验中心），50μg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂（Sigma公司产品）乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐剂（Sigma公司产品）乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d断尾采血，测定血清抗体效价。选取血清效价＞10⁶的小鼠，融合前3d用不加佐剂的抗原腹腔加强免疫，剂量加倍（100μg/只）。

3.细胞融合采用PEG细胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例，充分混匀，1,000rpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的50%PEG-4000（Sigma公司产品）1mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入15mL预热至37℃的无胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温静置10min，1,000rpm离心10min，弃上清，加入含15％FCS（兰州民海公司产品）和HAT（Sigma公司产品）的RPMI-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5%CO₂培养箱培养。3d后补加含HAT（Sigma公司产品）和15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基，5d后改用含HT（Sigma公司产品）和15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基，10d后换成含15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。

4.杂交瘤细胞的筛选按方阵法确定纯化抗原的包被浓度，用包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液对纯化的CDV抗原进行倍比稀释，用稀释至400倍的抗原量包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜（不少于12h），PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以含10％小牛血清的PBST封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将融合后12d的细胞上清、1∶1600稀释的免疫小鼠阳性血清和1∶1600稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（本试验室自制），100μL/孔，37℃放置1h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色20min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD_450nm值，以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD_450nm值，当阴性参考血清的OD_450nm值≦0.1，阳性参考血清的OD_450nm值与阴性参考血清的OD_450nm值的比值≧2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≧2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性。隔2～3d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞株。

5.杂交瘤细胞的克隆化首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含15％FCS（兰州民海公司产品）的RPMI-1640培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5%CO₂培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近。将克隆化的CDV特异单克隆抗体杂交瘤细胞株扩大培养，冻存，建立了82株稳定分泌CDV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞库。

6.腹水的制备将灭菌的液体石蜡腹腔注射8~10周龄的BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学实验中心），0.5mL/只，7天后，将杂交瘤细胞株1D7注射入小鼠腹腔，每只0.2mL（含2×10⁶～5×10⁶个杂交瘤细胞），7～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，3000×g离心10min，收集上清，分装后于-20℃保存备用。

7.病毒中和试验用建立的82株稳定分泌CDV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备的腹水，分别进行犬瘟热病毒中和试验，进一步筛选分泌中和效价高、且抗CDV毒株范围广的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

7.1CDV NJ01株的病毒中和试验测定CDV NJ01株的TCID₅₀，确定其病毒毒价。采用固定病毒稀释抗体的方法，将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将10倍系列稀释的各株单克隆抗体小鼠腹水分别与等体积含200TCID₅₀的CDV NJ01株悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5%CO₂温箱培养，观察结果，从中选出分泌高中和活性（抗体中和效价为10⁶）CDV单克隆抗体的的杂交瘤细胞株1D7。

7.2CDV Onderstepoort疫苗株的病毒中和试验测定CDV Onderstepoort疫苗株（美国富道动物保健公司产品）的TCID₅₀，确定其病毒毒价。采用固定病毒稀释抗体的方法，将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将杂交瘤细胞株1D7制备的小鼠腹水10倍系列稀释，与等体积含200TCID₅₀的CDV Onderstepoort疫苗株悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5%CO₂温箱培养，观察结果，杂交瘤细胞株1D7制备的小鼠腹水对CDV Onderstepoort株的中和效价为10⁶。

7.3狐源CDV-FOX-TA株的病毒中和试验测定CDV FOX-TA株（杨笃宝等，狐源犬瘟热病毒泰安株（CDV-FOX-TA）的分离与鉴定.西南农业学报，2008,21（1）:204-207.）的TCID₅₀，确定其病毒毒价。采用固定病毒稀释抗体的方法，将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将杂交瘤细胞株1D7制备的小鼠腹水10倍系列稀释，与等体积含200TCID₅₀的CDV FOX-TA株悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5%CO₂温箱培养，观察结果，杂交瘤细胞株1D7制备的小鼠腹水对CDV-FOX-TA株的中和效价为10⁶。

7.4水貂源CDV株的病毒中和试验测定水貂源CDV毒株（袁小远等，一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定.经济动物学报，2006,10（4）:189-192）的TCID₅₀，确定其病毒毒价。采用固定病毒稀释抗体的方法，将Vero细胞消化后，接种于96孔细胞板中。将杂交瘤细胞株1D7制备的小鼠腹水10倍系列稀释，与等体积含200TCID₅₀的水貂源CDV毒株悬液混合均匀，37℃作用1h，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于上述96孔细胞板中，并设立CDV及正常Vero细胞对照，置37℃，5%CO₂温箱培养，观察结果，杂交瘤细胞株1D7制备的小鼠腹水对水貂源CDV毒株的中和效价为10⁶。

8杂交瘤细胞株1D7的生物学特性

8.1杂交瘤细胞株染色体分析用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞进行染色体计数。分别取SP2/0骨髓瘤细胞和阳性杂交瘤细胞培养，生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4-5h。用5mL 37℃预温的0.075mol/LKCI低渗液将细胞吹起混匀，置37℃温箱作用30min，向其中加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸为3：1)1mL，边滴加边混匀，1000rpm离心10min。弃上清留细胞沉淀，用5mL固定液将细胞吹起，37℃作用30min，1000rpm离心10min，重复上述操作一次。细胞沉淀用lmL固定液悬起混匀，用滴管吸取悬液1滴，滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆萨染液染色10min，自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染色体数量为98条，而骨髓瘤细胞的染色体的数量为65条，小鼠脾细胞染色体数量为40条，证明所获得的此杂交瘤细胞株是两种细胞融合的结果。

8.2分泌抗体稳定性测定将获得的杂交瘤细胞株1D7进行连续培养传代20次、液氮冻存与复苏试验，用间接ELISA连续检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价均为10⁴，证明此杂交瘤细胞株1D7仍能稳定地分泌单克隆抗体。

8.3单克隆抗体的亚类测定亚类测定按照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒（购买于Thermoscientific公司）操作说明书进行，结果显示，该单克隆抗体亚类为IgG1κ。

8.4单克隆抗体的效价测定用间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水的效价，结果显示，杂交瘤细胞1D7培养上清ELISA效价为10⁴，腹水ELISA效价10¹²，病毒抗体中和效价10⁶。

8.5单克隆抗体的间接免疫荧光试验实验在24孔细胞培养板中进行。将犬源CDV毒株、水貂源CDV毒株、狐源CDV毒株和Onderstepoort疫苗株分别接种到vero细胞，培养72h病变后，吸弃细胞培养液，用无血清的培养液洗2次，然后向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇1mL/孔，4℃固定30min，用PBS洗3次，拍干；加入杂交瘤细胞培养上清液，200μL/孔，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体（购买于武汉博士德生物工程有限公司），200μL/孔，37℃孵育1h，PBS洗涤5次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，单克隆抗体均能与犬源CDV毒株、水貂源CDV毒株、狐源CDV毒株和Onderstepoort疫苗株感染的vero细胞反应，产生荧光，而与正常vero细胞无荧光，证明该单克隆抗体是抗CDV的特异性单克隆抗体。

8.6单克隆抗体的特异性用包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液对vero细胞抗原进行稀释（400倍）包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以10％小牛血清封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将杂交瘤细胞上清、1∶1600稀释的免疫小鼠阳性血清和1∶1600稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用90min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶2000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD_450nm值，杂交瘤细胞上清和小鼠阴性血清的OD_450nm值均小于0.1，显示了良好的特异性。

(二)单克隆抗体治疗剂的制备与检验

1.单克隆抗体治疗剂的制备将液体石蜡注射入8～10周龄BALB/c小鼠，7天后，将杂交瘤细胞株1D7注射小鼠腹腔，每只注射2×10⁶～5×10⁶个杂交瘤细胞，7～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，3000g，离心10min，收集上清。单克隆抗体腹水经56℃、30分钟处理，离心，收集上清液，灭活补体，过滤除菌，用PBS稀释，加入适宜稳定剂，分装，置-20℃保存备用。

2．单克隆抗体治疗剂的效力试验将CDV检测阴性的50~60日龄的比格犬（南京安立默科技有限公司）随机分成若干组，用CDV NJ01株感染，感染后，皮下注射不同剂量的单克隆抗体治疗剂，逐日观察，观察临床表现、检测CDV。实验同步设立不注射单克隆抗体治疗剂对照组。结果：皮下注射的单克隆抗体在2小时后可进入到血液中，单克隆抗体的中和效价大于50，确定临床治疗剂量。单克隆抗体治疗组中的犬未出现CD临床症状，CDV检测阴性；对照组出现CD临床症状，死亡率90%，CDV检测阳性。

3.单克隆抗体治疗剂的安全性试验为了检验该制剂的安全性，将5倍的治疗剂量皮下注射健康犬，逐日检测试验犬的体温、精神状态以及饮食等表现，试验犬无不良副反应。

4.单克隆抗体治疗剂的稳定性试验将分装的单克隆抗体治疗剂，分别置于37℃、4℃、-20℃保存，经不同的保存时间后，取样，用病毒中和试验测定效价。其中置-20℃保存二年后的单克隆抗体治疗剂，中和效价仍为10⁶。

（三）单克隆抗体治疗剂的临床应用

1．临床CD病犬的治疗将制备的单克隆抗体制备的治疗剂用于门诊CD发病犬的治疗，采用皮下注射的方法，并辅以对症治疗，有效率100%、治愈率在97%。

2．临床CD水貂的治疗将制备的单克隆抗体治疗剂用于门诊CD发病水貂的治疗，采用皮下注射的方法，并辅以对症治疗，有效率100%、治愈率在92%。

3．临床CD狐狸的治疗将制备的单克隆抗体治疗剂用于门诊CD发病狐狸的治疗，采用皮下注射的方法，并辅以对症治疗，有效率100%、治愈率在95%。

Claims

1. 一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株，该杂交瘤细胞株于2012年2月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201222。

2.用权利要求1所述杂交瘤细胞1D7株制备的犬瘟热病毒单克隆抗体。

3、权利要求2所述的单克隆抗体在制备犬瘟热病毒单克隆抗体治疗剂中的应用。

4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体治疗剂用于犬、水貂或狐狸的犬瘟热临床治疗。

5、根据权利要求3所述的应用，所述单克隆抗体治疗剂制备方法为，将杂交瘤细胞1D7株注射到BALB/c小鼠腹腔，制备单克隆抗体腹水，离心，收集上清液，灭活补体，过滤除菌，稀释，加入稳定剂，分装，低温冻存。