CN114276446B - 一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用。本发明筛选获得一株高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，并获得了一种鼠单克隆抗体m12。所述单克隆抗体m12与结构蛋白VP2特异性反应，对A型谱系代表毒株具有广谱反应性，而不和O型谱系代表毒株反应。利用鼠单克隆抗体m12和A型结构蛋白兔抗血清建立A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测试剂盒，相较于现有抗体，具有更好的灵敏度和特异性，适用于A型口蹄疫感染或灭活疫苗免疫后结构蛋白抗体的检测，同时，也是一种监测口蹄疫非免疫地区感染情况的新方法。

Description

一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员，目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。

由于同一血清型内不同亚型的抗原性均有不同程度的差别，血清学交叉反应的程度也各有不同，使得口蹄疫的诊断和控制存在很大的难度。单克隆抗体具有识别单一抗原位点的能力，与抗原结合特异性强，均质性高，生物活性单一，易于标准化，可批量生产的特点，广泛应用于生物医学领域中。目前，中国主要流行O型、Asial型和A型FMD，而随着A型FMD的流行，研发A型口蹄疫病毒单克隆抗体对于该病的诊断和预防具有重要意义。

目前关于口蹄疫血清学检测方法有3种：病毒中和试验(VNT)、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)、固相竞争ELISA(SPC-ELISA)，固相竞争ELISA方法除了具有液相阻断ELISA方法的传统优势外，其特异性更好，操作更为简单，2004年被OIE确立为口蹄疫血清学调查的最新推荐方法。但是，由于FMDV抗原结构复杂，开发广谱且特异性针对A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒，需要筛选到识别型内保守表位的特异性单克隆抗体，但目前针对A型口蹄疫病毒检测的特异性单克隆抗体稀少，这给建立广谱且特异性的A型FMDV抗体检测方法带来一定障碍。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体、制备方法及应用，具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体m12，所述单克隆抗体m12重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述单克隆抗体m12为IgG2b型单克隆抗体。

第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述单克隆抗体m12的基因片段，编码所述单克隆抗体m12重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述单克隆抗体m12轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

第三方面，本发明提供了一种含有上述第二方面所述的基因片段的表达载体。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合有上述第二方面所述的基因片段。

第五方面，本发明提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：

(i)上述第一方面所述的单克隆抗体m12；

(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

第六方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的单克隆抗体m12在制备检测A型口蹄疫病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。

第七方面，本发明提供了一种A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面所述的单克隆抗体m12。

优选地，所述试剂盒包括酶标板、A型口蹄疫病毒灭活抗原、单克隆抗体m12、抗体稀释液、浓缩洗涤液、显色剂、终止液。

优选地，所述酶标板包被有A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清及A型口蹄疫病毒灭活抗原。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清。

优选地，所述A型口蹄疫结构蛋白兔抗血清的浓度为1:3200。

优选地，所述A型口蹄疫病毒灭活抗原的包被浓度为1:8。

优选地，所述单克隆抗体m12的工作浓度为1:4000。

第八方面，本发明提供了一种A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测方法，所述方法包括以下步骤：

用A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清包被酶标板；将A型口蹄疫灭活抗原加入酶标板中孵育；

加入待检血清，以及上述第一方面所述的单克隆抗体m12，孵育；

加入山羊抗小鼠二抗，孵育，后加入TMB，避光显色，然后加入H₂SO₄溶液终止反应，用酶标仪读取OD₄₅₀；

计算抑制百分率PI，以40％的PI为临界值，若被检血清PI≥40％，则为阳性；若被检血清<40％，则为阴性。

优选地，所述方法为：

(1)使用pH＝9.6的Na₂CO₃/NaHCO₃包被液1:3200稀释A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清，包被酶标板，4℃过夜；

(2)使用PBST洗板并拍干，使用PBST1:8稀释A型口蹄疫病毒灭活抗原，并加入步骤(1)所述酶标板中，37℃孵育1h；

(3)使用PBST洗板并拍干，使用PBST稀释待检血清，然后加入PBST 1:4000稀释的上述第一方面所述的单克隆抗体m12，震荡混匀，37℃孵育1h；

(4)使用PBST洗板并拍干，加入山羊抗小鼠二抗，37℃孵育1h；

(5)使用PBST洗板并拍干，加入TMB，37℃避光显色15min，加入2M H₂SO₄溶液终止反应，用酶标仪读取OD₄₅₀；

(6)计算抑制百分率PI，当待检血清PI≥40％，待检血清为阳性，当待检血清<40％，待检血清为阴性。

本发明的有益效果是：①本发明提供了一种抗A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体m12，所述单克隆抗体m12为IgG2b型单克隆抗体；②免疫印迹试验表明其特异性的和结构蛋白VP2反应；③而且所述单克隆抗体m12不与O型谱系代表毒株(O/ZK/93、O/Mya/98和O/HK/93)反应，能广谱特异性的与A型谱系代表毒株(A/GDMM/2013、A/WH/CHA/09和A/AF72)反应，能够用于A型口蹄疫病毒的检测与诊断；④本发明利用所述单克隆抗体m12和A型口蹄疫结构蛋白兔抗血清建立了A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测试剂盒及检测方法，相较于现有抗体检测方法，本发明所述方法具有更好的灵敏度和特异性，适用于A型口蹄疫感染或灭活疫苗免疫后结构蛋白抗体的检测，同时，也是一种监测口蹄疫非免疫地区感染情况的新方法。

附图说明

图1WB检测单克隆抗体m12对FMDV不同结构蛋白的反应活性；

图2间接免疫荧光试验检测单克隆抗体m12对O型和A型FMDV不同谱系代表毒株的反应活性。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1单克隆抗体m12的制备

1.杂交瘤细胞的制备

1.1小鼠免疫

以A型口蹄疫病毒(A/GDMM/2013)结构蛋白VP2作为抗原，免疫5～6周龄Balb/c小鼠，免疫方式为背部皮下多点注射，每只注射量为100μg。首免使用弗式完全佐剂，之后加强免疫使用弗式不完全佐剂，每次免疫时间间隔为两周，三免后1周采集小鼠血清，检测抗体效价，当抗体效价不低于1:1440时，进行冲击免疫，即腹腔注射抗原，冲击免疫后三天，取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞融合。

1.2细胞融合

无菌获取免疫后小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞按照10:1的比例混合，在37℃条件下，1分钟内加入1mL PEG 1500，作用1分钟后，加入1mL 37℃预热的DMEM培养液终止反应，1分钟内加完，作用1分钟，如此共加5次(整个融合过程需晃动融合管)，补加预热的DMEM培养液至20mL，37℃作用15分钟后，800rpm离心7min；弃去上清，用胎牛血清培养液(加HAT选择培养基)重悬；将上述细胞加入96孔板中，每孔50μL；将培养板置于37℃5％CO₂培养箱中培养。第3天和第6天用20％胎牛血清培养液(加HAT选择培养基)进行半换液，观察杂交瘤细胞生长至孔底约1/5时，取上清检测特异性抗体。

1.3筛选杂交瘤细胞

使用ELISA试验将检测为阳性的杂交瘤细胞用20％胎牛血清培养液(加HT选择培养基，Sigma)制成细胞悬液，计数，调整细胞为3～5个细胞/mL，每孔滴加100μL稀释后的细胞，后每孔补加100μL HT选择培养基，置于37℃5％CO₂培养箱中；在第3天和第6天进行半换液20％胎牛血清培养液(加HT选择培养基，Sigma)，观察细胞克隆形成情况，及时检测抗体活性。亚克隆获得阳性单克隆细胞后，将其传代扩大培养，并以2×10⁶个细胞/支于液氮中保存。

2.单克隆抗体m12的制备

2.1单克隆抗体m12腹水的制备

用灭菌液体石蜡致敏7～8周龄Balb/c小鼠，0.5mL/只，10天～18天内向腹腔注入0.5mL(约3.0×10⁶个细胞/mL)的杂交瘤细胞。注射后每天轻揉小鼠腹部，至小鼠腹部明显横向涨大时抽取腹水。将腹水10000rpm离心10min，取上清，分装，-20℃保存。

2.2单克隆抗体m12的纯化

采用亲和层析进行杂交瘤细胞小鼠腹水的纯化，具体操作如下：将冻存的腹水样品解冻，10000rpm 4℃离心10min，吸取澄清液体，用3倍柱体积的上样缓冲液(Bindingbuffer配方：20mM Na₂HPO₄，0.15M NaCl，pH8.0)稀释后，进行Protein A亲和层析柱纯化，柱层析洗脱液为pH2.5，0.1M的甘氨酸缓冲液，洗脱下来的抗体需立即用中和缓冲液(1MTris-HCl，pH8.5)调整pH值至中性，并进行SDS-PAGE胶分析和蛋白含量测定，

结果显示：纯化后的单克隆抗体m12蛋白含量为4.3mg/mL，可满足临床应用的需求。

2.3单克隆抗体m12的亚型鉴定和测序

亚型鉴定：按照鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(购自Sigma公司)说明书进行单克隆抗体Ig亚型的鉴定，测得m12的亚型均为IgG2b。抗体IgG2b可变区序列测定如下：

(1)总RNA提取：取10⁶个细胞，Trizol裂解，加入氯仿分层获取RNA，异丙醇沉淀后用乙醇洗涤，干燥，用DEPC水溶解RNA；

(2)反转录和PCR扩增：取500ng RNA，加入Oligo(dT)，Random，dNTP及5×RTbuffer，反转录酶(Takara公司)，37℃25min，85℃5sec，4℃终止反应获得cDNA，之后进行PCR扩增；

(3)测序和分析：将扩增得到的重链和轻链可变区克隆至pMD18-T，送至公司测序，使用IMGT/V-QUEST数据库进行数据比对分析。

经测序，编码所述单克隆抗体m12的重链可变区的DNA序列为：caggtccaactccagcagcctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaacctgtcctgcaaggcttctggctacacattccccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggaaatatttttcctgatggtggttttactaactacgatgagaactttaagagcagggccacactgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaacaatttatgattacgtcgtcggagtcggtgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgagc(SEQ ID NO.3所示)；

编码所述单克隆抗体m12的轻链可变区的DNA序列为gaaacaactgtgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcaataggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtataaaaagaaactagggcaatctcctagaccactgatttattcggcatcctaccggttcagtggagtccctgaccgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtatttctgtcagcaatttaacagctaccctctgacgttcggcggaggcaccaagctggaaatcaaa(SEQ IDNO.4所示)；

根据密码子编码规则，所述单克隆抗体m12的重链可变区的氨基酸序列为：QVQLQQPGSELVRPGASVNLSCKASGYTFPSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIFPDGGFTNYDENFKSRATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTTIYDYVVGVGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.1所示)；

所述单克隆抗体m12的轻链可变区的氨基酸序列为：ETTVTQSQKFMSTSIGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYKKKLGQSPRPLIYSASYRFSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQFNSYPLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.1所示)。

实施例2单克隆抗体m12与结构蛋白VP2特异性反应

1.免疫印迹试验

构建A型口蹄疫病毒(A/GDMM/2013)结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的真核表达质粒，将其转染293T细胞进行表达，之后使用免疫印迹试验检测其与单克隆抗体m12的反应性。具体实验流程如下：

(1)送金维智公司合成口蹄疫A/GDMM/2013毒株结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4基因，并将其构建到真核表达质粒pCDNA3.1；

(2)将293T细胞均匀铺到6孔细胞培养板中，待细胞生长至80％左右进行转染；

(3)使用脂质体2000将真核表达质粒VP1、VP2、VP3和VP4转染细胞；

(4)转染后48h收取细胞，制备样品进行WB试验；

(5)电泳：取变性后的样品加入至12％预制胶孔中；

(6)按照10μL/孔上样，浓缩胶按照90V的恒压进行电泳，分离胶按照120V的恒压进行电泳；

(7)转膜：组装好转膜装置，并将其置于冰水混合物中，设置200mA恒定电流转膜2h，将电泳分离好的样品从凝胶中转印至PVDF膜上；

(8)封闭：用TBST溶液配制的5％脱脂奶粉作为封闭液，摇床室温封闭1小时；

(9)孵育一抗：用TBST溶液配制的5％脱脂奶粉将待检单克隆抗体m12稀释至终浓度2μg/mL，摇床上4℃孵育过夜；

(10)洗膜：用TBST溶液振荡洗膜三次，每次洗十分钟；

(11)孵育二抗：用TBST溶液配制的5％脱脂奶粉稀释山羊抗小鼠抗体(1:5000)，摇床上室温孵育1小时；

(12)洗膜：用TBST溶液振荡洗膜三次，每次洗十分钟；

(13)显影：将ECL发光液中的A液与B液按照1:1比例轻轻混合均匀，均匀滴加到PVDF膜上，反应3min，之后在进行扫膜。

检测结果如图1所示，本发明所述的单克隆抗体m12与口蹄疫病毒结构蛋白VP2特异性反应，而不和口蹄疫病毒其他结构蛋白VP1、VP3和VP4反应。说明本发明所述的单克隆抗体m12能够特异性与结构蛋白VP2反应。

实施例3单克隆抗体m12对A型口蹄疫结构蛋白VP2反应活性测定

1.免疫印迹试验

分别用A型口蹄疫不同谱系代表毒株(A/AF72、A/GDMM/2013和A/WH/CHA/09)和O型口蹄疫不同谱系代表毒株(O/ZK/93、O/Mya/98和O/HK/93毒株)(毒株均由口蹄疫国家参考实验室保存)感染BHK-21细胞，通过荧光显微镜下的荧光强度来判定制备的单克隆抗体m12与FMDV抗原的反应情况，具体操作步骤如下：

(1)培养细胞：将BHK-21细胞均匀铺到12孔细胞培养板中，待细胞生长至70％左右进行接毒；

(2)接毒：按MOI＝1的比例将3个谱系的A型毒株与3个谱系的O型毒株分别接种于12孔板中，同时设立未接毒正常细胞作为阴性对照，将接毒细胞在37℃培养箱中孵育，待细胞病变至50％左右，将细胞上清进行灭活处理；

(3)固定：在每个孔中添加多聚甲醛进行固定15min，PBS清洗3次；

(4)通透：用PBS溶液配制含有0.5％Triton X-100的通透液，将细胞通透10min，PBS清洗3次；

(5)孵育一抗：PBS清洗3次，用PBS将待检单克隆抗体m12稀释至终浓度10μg/mL，500μL/孔加入，同时使用已知阳性鼠源抗体作为阳性对照，37℃孵育1h；

(6)孵育二抗：PBS清洗3次，加入山羊抗小鼠IgG-FITC荧光抗体(1:1000稀释)，200μL/孔加入，37℃孵育1h；

(7)用PBS清洗5次，500μL/孔加入PBS以保证细胞表面湿润，放入荧光显微镜下进行荧光观察。

检测结果如图2所示，本发明所述的单克隆抗体m12与A型口蹄疫不同谱系代表毒株(A/AF72、A/GDMM/2013和A/WH/CHA/09)均具有很好的反应性，而和O型口蹄疫不同谱系代表毒株(O/ZK/93、O/Mya/98和O/HK/93毒株)均不反应。说明本发明所述的单克隆抗体m12是A型口蹄疫结构蛋白VP2的广谱抗体。

实施例4 A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测方法的建立

1.A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测方法最佳反应条件

1.1A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清和A型口蹄疫病毒灭活抗原最佳使用浓度的确定：

使用方阵滴定法确定A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清和A型口蹄疫病毒灭活抗原的最佳使用浓度。首先，使用Na₂CO₃/NaHCO₃包被液(pH＝9.6)在稀释板中从1:200起连续倍比稀释A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清(横向)，并将其对应移入酶标板中(50μL/孔)，4℃过夜；弃去酶标板中液体，并使用PBST洗涤3次，在吸水纸上拍干；使用PBST从1:2开始连续倍比稀释A型口蹄疫病毒灭活抗原(纵向)(50μL/孔)，37℃孵育1h；洗板拍干(同上)；加入豚鼠抗血清工作液(本实验室保存)(50μL/孔)，37℃孵育1h；洗板拍干(同上)；加入山羊抗豚鼠二抗(50μL/孔)，37℃孵育1h；洗板拍干(同上)；加入TMB(50μL/孔)，37℃避光显色15min，加入2M H₂SO₄溶液终止反应(50μL/孔)，用酶标仪读取OD₄₅₀值，取OD₄₅₀值在1.6～2.0范围时对应A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清和A型口蹄疫病毒灭活抗原的最高稀释倍数为二者的最佳使用浓度。

结果表明，A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清的最佳包被浓度为1:3200，A型口蹄疫病毒灭活抗原的使用浓度为1:8。

1.2单克隆抗体m12最佳使用浓度的确定：

利用以上确定的A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清和A型口蹄疫病毒灭活抗原的最佳使用浓度，使用Na₂CO₃/NaHCO₃包被液(pH＝9.6)包被A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清的最佳使用浓度(50μL/孔)，4℃过夜；洗板拍干(同上)；将最佳使用浓度的A型口蹄疫病毒灭活抗原加入酶标板(50μL/孔)，37℃孵育1h；洗板拍干(同上)；使用PBST从1:250开始连续倍比稀释单克隆抗体m12(横向)(50μL/孔)，37℃孵育1h；洗板拍干(同上)；加入山羊抗小鼠二抗(50μL/孔)，37℃孵育1h；洗板拍干(同上)；加入TMB(50μL/孔)，37℃避光显色15min，加入2M H₂SO₄溶液终止反应(50μL/孔)，用酶标仪读取OD₄₅₀值，取OD₄₅₀值在1.6时对应单克隆抗体m12的最高稀释倍数为其最佳工作浓度。

结果表明，单克隆抗体m12的最佳使用浓度为1:4000。

2.A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测方法的操作步骤

(1)使用Na₂CO₃/NaHCO₃包被液(pH＝9.6)包被液稀释A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清至最佳使用浓度，包被酶标板(50μL/孔)，4℃过夜；

(2)使用PBST洗板5次并拍干，使用PBST稀释A型口蹄疫病毒灭活抗原至工作浓度并加入酶标板中(50μL/孔)，37℃孵育1h；

(3)洗板拍干(同上)，使用PBST稀释阳性血清和待检血清(1:4倍比稀释至1:512)，以及阴性血清(1:4倍比稀释至1:32)(50μL/孔)，然后每孔加入稀释至工作浓度的单克隆抗体m12，轻轻震荡混匀，37℃孵育1h；

(4)洗板拍干(同上)，加入山羊抗小鼠二抗(50μL/孔)，37℃孵育1h；

(5)洗板拍干(同上)；加入TMB(50μL/孔)，37℃避光显色15min，加入2M H₂SO₄溶液终止反应(50μL/孔)，用酶标仪读取OD₄₅₀；

(6)通过对血清的检测，计算抑制百分率(PI)，以40％的PI为临界值，若被检血清PI≥40％，阳性血清最高稀释度为该血清的抗体滴度，即效价，则为阳性。若被检血清<40％，则判为阴性。

3.A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法的特异性

使用本发明建立的A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法对O型口蹄疫、A型口蹄疫、猪水泡病、塞内卡和猪瘟阳性参考血清进行测定，结果如表1所示，表明，A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法只和A型口蹄疫参考阳性血清特异性反应，而不和O型口蹄疫、猪水泡病、塞内卡和猪瘟阳性参考血清反应，具有特异性。

表1A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法测定O型口蹄疫、A型口蹄疫、猪水泡病、塞内卡和猪瘟阳性参考血清抗体效价

4.A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法的敏感性

使用本发明建立的A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法对77份猪阴性血清，50份猪O型阳性血清，39份猪A型阳性血清，29份牛阴性血清，16份牛A型阳性血清，以及18份牛O型阳性血清进行测定。结果表明A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法具有很好的敏感性和特异性(表2)。

表2A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA方法对不同性质血清的测定

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Asn Ile Phe Pro Asp Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Asp Glu Asn Phe

    50                  55                  60

Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Thr Thr Ile Tyr Asp Tyr Val Val Gly Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

            20                  25                  30

Val Ala Trp Tyr Lys Lys Lys Leu Gly Gln Ser Pro Arg Pro Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggtccaac tccagcagcc tgggtctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaacctg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacattcccc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttttcctg atggtggttt tactaactac 180

gatgagaact ttaagagcag ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aacaatttat 300

gattacgtcg tcggagtcgg tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360

tcgagc 366

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaacaactg tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat caataggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtataa aaagaaacta 120

gggcaatctc ctagaccact gatttattcg gcatcctacc ggttcagtgg agtccctgac 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tttaacagct accctctgac gttcggcgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

Claims (9)

1.一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体m12，其特征在于，所述单克隆抗体m12重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述单克隆抗体m12的基因片段，其特征在于，编码所述单克隆抗体m12重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述单克隆抗体m12轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的基因片段。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的基因片段。

5.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：

（i）如权利要求1所述的单克隆抗体m12；

（ii）和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

6.如权利要求1所述的单克隆抗体m12在制备检测A型口蹄疫病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。

7.一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2固相竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的单克隆抗体m12。

8.如权利要求7所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标板、A型口蹄疫病毒灭活抗原、单克隆抗体m12、抗体稀释液、浓缩洗涤液、显色剂、终止液。

9.如权利要求8所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板包被有A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清及A型口蹄疫病毒灭活抗原。

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