CN113416246A - 一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用 - Google Patents

一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113416246A
CN113416246A CN202110700617.4A CN202110700617A CN113416246A CN 113416246 A CN113416246 A CN 113416246A CN 202110700617 A CN202110700617 A CN 202110700617A CN 113416246 A CN113416246 A CN 113416246A
Authority
CN
China
Prior art keywords
foot
mouth disease
disease virus
antibody
fmdv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110700617.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113416246B (zh
Inventor
何勇
李坤
娄智勇
杨诚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nankai University
Original Assignee
Nankai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nankai University filed Critical Nankai University
Priority to CN202110700617.4A priority Critical patent/CN113416246B/zh
Publication of CN113416246A publication Critical patent/CN113416246A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113416246B publication Critical patent/CN113416246B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1009—Picornaviridae, e.g. hepatitis A virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • C07K14/09—Foot-and-mouth disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用。所述口蹄疫病毒抗体包括重链和轻链，其中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。这是首次发现以增强口蹄疫病毒衣壳的稳定性来达到中和口蹄疫病毒感染为中和机制的口蹄疫病毒抗体。

Description

一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用
技术领域
本发明涉及一种口蹄疫病毒领域，特别是口蹄疫病毒抗体领域。
背景技术
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是严重危害猪、牛与羊等偶蹄动物的一种急性、高度接触性传染病，每年给我国畜牧养殖业造成巨大损失，被世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)列为A类烈性传染病，我国将其列为一类动物传染病。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，口蹄疫病毒属于微小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。目前世界上主要存在七种不同的血清型，它们分别是O型、A型、C型、亚洲I型(Asia1)、南非I型(SAT1)、南非II型(SAT2)和南非III型(SAT3)，其中每种血清型又可以分为许多不同的血清亚型。O和A具有最广泛的分布，主要分布在欧洲，南美洲，亚洲和非洲，我国目前也主要存在这两种血清型。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同血清型和同种血清型不同分离株的口蹄疫病毒的抗原表位和抗原位点不尽相同，存在广泛的抗原变异。因此口蹄疫病毒不同血清型之间往往不能交叉保护，同种血清型不同亚型之间通常也只有部分交叉保护。其中口蹄疫病毒血清A型具有最广泛的抗原变异，血清A型型内不同的亚型之间往往不能交叉保护。
到目前为止我国口蹄疫病毒血清A型特异性并且型内广谱中和抗体还没有相关报道。
口蹄疫病毒颗粒在形态上近似于球形，直径约25-30nm，没有囊膜。衣壳呈二十面体结构，由十二个五聚体组成，每个五聚体由五个原聚体组成，每个原聚体由VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白组成。其中VP1、VP2和VP3暴露于衣壳表面而VP4完全内化在衣壳内部。过去二十年，科学家们主要使用鼠源杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行口蹄疫病毒抗原特性的研究工作。对于口蹄疫病毒，利用抗体耐受突变株分析得出口蹄疫病毒逃逸突变的关键位点，确认了五个功能相互独立的抗原位点。位点1是口蹄疫病毒的主要抗原位点，由VP1蛋白的G-H环(第122至157位氨基酸)和C端(第200至213位氨基酸)组成，其中影响抗体结合的关键氨基酸残基位点主要包括144、148、150和208。位点2由VP2蛋白的B-C环或者E-F环组成，其主要的氨基酸残基位点位于70-73、75、77和131。位点3由VP1蛋白的B-C环组成，其主要的氨基酸残基位点位于43和44。位点4主要由VP2蛋白β-B“球形扭结”结构组成，其主要的氨基酸残基位点位于58。位点5包含至少一个功能依赖的中和表位，其位于VP1蛋白G-H环的第149位。尽管位点5属于位点1的一部分，但是其明显不同于位点1。此外，位点1是线性表位并且对胰蛋白酶非常敏感，而位点2-5是构象表位且对胰蛋白酶不敏感。目前所报道的抗原表位和抗原位点无一例外地都位于同一个原聚体或五聚体单元之内(图1)。来源于天然宿主的中和抗体和中和抗体识别的抗原表位以及中和抗体介导的中和机制的研究非常有限。
单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一个10-25个氨基酸组成的柔性短肽连接而成，具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位，该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，并且去除了无关结构，具有更广泛的应用前景。作为一种新型抗体分子，单链抗体具有分子质量小、组织穿透力强、血中半衰期短，无交叉反应、容易基因操作、能在原核细胞中表达和易于大量生产等优点，并且可以用化学偶联或基因工程方法与其他靶标分子构建融合蛋白。同时单链抗体作为抗体药物也引起了广泛的关注，Beovu是在美国获批的一款新一代眼科药物，其活性药物成分brolucizumab就是一种人源化单链抗体片段，靶向所有类型的血管内皮生长因子-A(VEGF-A)。
发明内容
本发明之一提供了一种口蹄疫病毒抗体，其包括重链和轻链，其中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其中，重链和轻链可以单独表达，也可以融合表达。
在一个具体实施方式中，所述抗体为所述重链和所述轻链融合的单链抗体，所述重链和所述轻链之间连接有柔性多肽接头，且所述重链位于N端，所述轻链位于C端。所述柔性多肽接头的主要作用是避免重链和轻链在一级结构上相距过近而破坏重链和轻链的天然构象，也就是说，在将重链和轻链融合为单链抗体的情况下，只要保证重链和轻链在一级结构上一定的距离，公认地为10至25个氨基酸的多肽是适宜的，便可以使重链和轻链发挥各自的功能。
在一个具体实施方式中，所述柔性多肽接头的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
在一个具体实施方式中，当所述重链和所述轻链没有融合在一起时，在所述重链的N端和/或C端连接有第一纯化标签，在所述轻链的N端和/或C端连接有第二纯化标签。
当所述抗体为单链抗体时，所述重链和所述轻链融合在一起，在所述单链抗体的N端和/或C端连接有第三纯化标签。
在一个具体实施方式中，所述第一纯化标签、所述第二纯化标签和所述第三纯化标签独立地为His标签、Flag标签和GST标签中的至少一种。
本发明之二提供了编码如本发明之一中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体的核酸。
在一个具体实施方式中，编码所述重链的核酸的序列如SEQ ID No.6所示，编码所述轻链的核酸的序列如SEQ ID No.7所示。
在一个具体实施方式中，编码所述柔性多肽接头的核酸的序列如SEQ ID No.8所示。
为了便于表达的所述抗体从细胞内分泌到细胞外，可以在编码如本发明之一中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体的核酸的5’端或3’端融合编码信号肽的核酸，因此，在一个具体实施方式中，融合编码信号肽的核酸后的核酸的序列如SEQ ID No.11所示。不过，当融合有信号肽的单链抗体在表达后，信号肽会被切割下来，获得不含信号肽的单链抗体。
本发明之三提供了一种携带如本发明之二中任意一项所述的核酸并能够表达如本发明之一中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体的细胞。本领域的技术人员容易理解地，当重链和轻链没有融合在一起时，编码重链和轻链的核酸可以分别转化到宿主细胞中以分别表达。
在一个具体实施方式中，所述细胞为CHO-S细胞。
本发明之四提供了如本发明之一中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体、如本发明之二中任意一项所述的核酸和如本发明之三所述的细胞中的一种在制备用于中和血清型为A型的口蹄疫病毒株的药物中的应用；或如本发明之一中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体、如本发明之二中任意一项所述的核酸和如本发明之三所述的细胞中的一种在制备用于预防或治疗由血清型为A型的口蹄疫病毒株引起的疾病的药物中的应用。
在一个具体实施方式中，所述血清型为A型的口蹄疫病毒株为血清型A型Asia拓扑型的口蹄疫病毒株。
在一个具体实施方式中，所述血清型为A型的口蹄疫病毒株为FMDV A/WH/CHA/09病毒株和/或FMDV A/GDMM/CHA/2013病毒株。
本发明之五提供了如本发明之一中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体、本发明之二中任意一项所述的核酸和如本发明之三所述的细胞中的一种在用于鉴定血清型为A型的口蹄疫病毒中的应用。例如，当利用口蹄疫病毒抗体与待测血清型的口蹄疫病毒进行抗原抗体反应时，如果为阳性，则待测血清型为A型，如果为阴性，则待测血清型为其他型别。
在一个具体实施方式中，所述应用为用于鉴定血清型为A型Asia拓扑型的口蹄疫病毒。
本发明之六提供了口蹄疫病毒的抗原表位，所述抗原表位由位于第一原聚体上的氨基酸位点和位于第二原聚体上的氨基酸位点组成，所述第一原聚体和所述第二原聚体相邻，且所述第一原聚体与所述第二原聚体不在同一个五聚体中；所述第一原聚体上的氨基酸位点为VP3E70；所述第二原聚体上的氨基酸位点为VP2D68、VP2T70、VP2D72、VP2K73、VP2Q196、VP3D59和VP3Y63。
在一个具体实施方式中，所述口蹄疫病毒为血清型A型的口蹄疫病毒。
在一个具体实施方式中，所述口蹄疫病毒为血清型A型Asia拓扑型的口蹄疫病毒。
在一个具体实施方式中，所述口蹄疫病毒为FMDV A/WH/CHA/09病毒株和/或FMDVA/GDMM/CHA/2013病毒株。
在一个具体实施方式中，利用所述口蹄疫病毒的抗原表位制备用于预防口蹄疫病毒的疫苗。
本发明的有益效果：
本发明首次发现以增强口蹄疫病毒衣壳的稳定性来达到中和口蹄疫病毒感染为中和机制的口蹄疫病毒抗体。本发明的口蹄疫病毒抗体能够广谱性地中和血清型为A型的口蹄疫病毒，例如其可以中和血清型A型的Asia拓扑型，具体的病毒株例如可以为FMDV A/WH/CHA/09和FMDV A/GDMM/CHA/2013。因此，可以将其应用于被动免疫，实现对血清型为A型的口蹄疫病毒引起的口蹄疫病的紧急预防。虽然本发明的口蹄疫病毒抗体在血清型A型内具有广谱性，但其具有型间特异性，即并不能与A型以外的口蹄疫病毒血清型结合，因此，可以将其用于区分A型和其他型别的口蹄疫病毒，基于此，可以开发出快速鉴定或检测A型的试剂盒。
此外，基于本发明的口蹄疫病毒抗体，发现了横跨口蹄疫病毒两个五聚体的对血清A型型内广谱的中和表位，可以为广谱中和疫苗提供重要的表位信息。
附图说明
图1：目前已经报道的口蹄疫病毒的中和表位图，其中的中和表位全部位于同一个五聚体内。
图2：单链抗体R55的SDS-PAGE鉴定结果图。
图3：间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测单链抗体R55反应性。
图4：微量病毒中和实验检测单链抗体R55的中和活性。
图5：FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55复合物的冷冻电镜图。
图6：FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55复合物的三维重构密度图。
图7：FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55的相互作用界面图。
图8：图7的局部放大图。
图9：图7的局部放大图。
图10：图7的局部放大图。
图11：单链抗体R55的中和表位图。
图12：FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55结合前后的热稳定性实验。
图13：FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒的酸稳定性实验。
图14：FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55复合物的酸稳定性实验。
图15：FMDV A/WH/CHA/09、FMDV A/GDMM/CHA/2013、FMDV O/Mya/98、FMDV O/Tibet/99和FMDV O/HN/CHA/93原聚体中VP2和VP3结构蛋白的氨基酸序列比对图。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
1.病毒株、细胞和试剂
口蹄疫病毒株FMDV A/WH/CHA/09属于血清A型Asia拓扑型SEA-97/G1。
口蹄疫病毒株FMDV A/GDMM/CHA/2013属于血清A型Asia拓扑型SEA-97/G2。
口蹄疫病毒株FMDV O/Mya/98属于血清O型SEA拓扑型。
口蹄疫病毒株FMDV O/Tibet/99属于血清O型ME-SA拓扑型。
pcDNA3.4表达载体购自赛默飞(Thermo scientific)，美国。
CHO-S细胞和BHK21细胞购自Gibco公司。
金属载网(GIG,Au 1.2/1.3,200mesh)购自江苏蓝拓生物科技有限公司。
SYT09核酸染料购自赛默飞(Thermo scientific)，美国。
2.单链抗体R55重链和轻链可变区表达载体的构建
重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，柔性多肽接头的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，纯化标签Flag-tag和His-tag串联的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
编码重链可变区的核酸的序列如SEQ ID No.6所示，编码轻链可变区的核酸的序列如SEQ ID No.7所示，编码柔性多肽接头的核酸的序列如SEQ ID No.8所示，编码纯化标签Flag-tag和His-tag串联的核酸的序列如SEQ ID No.9所示，编码信号肽的核酸的序列如SEQ ID No.10所示。将SEQ ID No.10、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.7和SEQ IDNo.9按照从5’到3’的顺序串联起来得到SEQ ID No.11。
人工合成序列如SEQ ID No.11所示的核酸，得到编码含有信号肽和纯化标签的单链抗体的核酸。
以人工合成的序列如SEQ ID No.11所示的核酸为模板，利用添加有Not I酶切位点的上游引物和添加有Nhe I酶切位点的下游引物进行高保真PCR扩增，然后对扩增产物进行Not I和Nhe I双酶切，并回收PCR酶切产物；同时将pcDNA3.4载体进行Not I和Nhe I双酶切，回收载体酶切产物。将PCR酶切产物和载体酶切产物连接，转化大肠杆菌，筛选出阳性克隆，以获得阳性重组质粒pcDNA3.4-scFv。重组质粒pcDNA3.4-scFv用于后续在CHO-S细胞中进行单链抗体R55的表达。
3.单链抗体R55的表达与纯化
在温度37℃，相对湿度≥80％，二氧化碳浓度8％的条件下在恒温摇床中培养CHO-S细胞。当细胞密度达到6×106个/ml时转染pcDNA3.4-scFv质粒。即将30μg pcDNA3.4-scFv质粒加入250μl OptiPROTM SFM培养基进行稀释，然后与250μl OptiPROTM SFM培养基稀释的ExpiFectamineTM CHO-S转染试剂混合(80μl转染试剂使用920μl培养基稀释)，得到质粒-转染试剂混合物，室温作用5min。将质粒-转染试剂混合物缓慢加入至CHO-S细胞中。将转染后CHO-S细胞置于37℃恒温悬浮培养箱，悬浮培养18h后，补加150μL转染增强剂(Expi CHO-STM Enhancer)和6mL培养物补料(EXPI CHO-STM Feed)。37℃继续培养10天后，按10 000×g离心30min，收取细胞培养上清，经0.22μm滤器过滤，用于后续纯化表达的单链抗体R55。
使用HiTrap TALON柱(用于纯化融合有His-tag的融合蛋白)在AKAT蛋白纯化仪上进行抗体纯化，使用含有250mM咪唑的PBS缓冲液(pH 7.4)洗脱抗体，进一步利用分子筛(Superdex 200increase 10/300柱子)进行二次纯化，将纯化得到的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证，结果见图2，证明得到蛋白为单链抗体R55。将纯化得到的单链抗体R55 PBS溶液冻存于-80℃冰箱中保存备用。
4.间接酶联免疫吸附实验(ELISA)
将纯化好的FMDV A/WH/CHA/09、FMDV A/GDMM/CHA/2013、FMDV O/Mya/98和FMDVO/Tibet/99病毒颗粒分别使用PBS缓冲液稀释至浓度为1μg/mL，然后分别按照100μl/孔在4℃条件下过夜包被在ELISA酶标板上，同时使用PBS作为阴性对照组。用洗液反复清洗酶标板5次，然后在酶标板的孔中加入1wt％明胶200μl，37℃封闭1h。再将单链抗体R55 PBS溶液以与1wt％明胶1：5的体积比(即单链抗体R55 PBS溶液40μl)加入到酶标板中，然后以2倍倍比稀释按照100μl/孔加入酶标板中，37℃孵育1h。用洗液反复清洗酶标板5次，然后在酶标板的孔中加入100μl以1：10000稀释HRP标记的抗His标签的抗体，37℃孵育1h。用洗液反复清洗酶标板6次，然后按照100μl/孔加入TMB显色液，37℃显色10min，用终止液终止显色，在酶标仪中测定OD450nm吸光度值，结果见图3。实验结果表明单链抗体R55可以与血清A型的FMDV A/WH/CHA/09和FMDV A/GDMM/CHA/2013两种病毒株相结合，但是却不能与血清O型的FMDV O/Mya/98和FMDV O/Tibet/99两种病毒株结合，这表明单链抗体R55对血清A型具有特异性，并且在血清A型型内能够广谱结合。
5.病毒微量中和实验
在96孔板的第一个孔中加入50μL单链抗体R55PBS溶液，然后在96孔板内进行倍比稀释。然后，加入100μL含100个TCID50的纯化的FMDV A/WH/WHA/09病毒，37℃作用1h。同时设置加有50μL PBS缓冲液(即不含单链抗体R55)与100μL分别含有10、100以及1000个TCID50的纯化的FMDV A/WH/WHA/09病毒混合的三个对照孔。然后每孔加入100μL含5×104个BHK21细胞的完全培养基，放入37℃含5％CO2的培养箱作用72h。弃去上清液，然后加入预冷的固定液(体积比为1:1甲醇与丙酮的混合液)，-20℃固定20min。最后弃去固定液，每孔加入100μL结晶紫溶液进行染色。30min后，冲洗96孔板，观察50％细胞未病变的稀释孔抗体最大稀释度。单链抗体R55对FMDV A/GDMM/CHA/2013毒株的中和测定同FMDV A/WH/WHA/09毒株。测定结果见图4。实验结果表明单链抗体R55可以有效中和FMDV A/WH/WHA/09(VNT50＝5.85μg/ml)和A/GDMM/CHA/2013(VNT50＝13μg/ml)的感染，表明单链抗体R55在血清A型型内具有广谱中和性。
6.FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55复合物(FMDV-AWH-R55)的冷冻样品制备
将纯化的颗粒状态良好的FMDV A/WH/WHA/09病毒颗粒PBS悬液与单链抗体R55PBS溶液按照摩尔比1：240在4℃条件下孵育10分钟，得到病毒颗粒与抗体复合物(FMDV-AWH-R55)悬液。然后进行冷冻样品的制备。复合物冷冻样品制备在冷冻制样仪(FEI VitrobotMark IV)上进行，具体操作步骤如下：首先准备冷冻样品制备所需的实验用品如移液枪，镊子，玻璃皿，金属载网(GIG,Au 1.2/1.3,200mesh；Lan tuo)，滤纸，保温杯，液氮，铜碗，金属传感器，液态乙烷皿，计时器，50mL离心管。然后打开冷冻制样仪的开关，加入吸水滤纸，调整仪器制样参数：温度8℃；湿度：100％。用吹风机吹干所有冷冻样品制备所需的物品，将铜碗，金属传感器，液态乙烷皿组装，加入液氮冷却，冷却平衡10-15min，在铜碗中小心加入液态乙烷(注意刚加入时气流要小，防止产生过多的雾气)，加至金属传感器和铜碗的分界面。然后金属载网放电进行亲水化处理：抽真空3分钟，辉光放电40秒。放电时应特别注意保证金属载网的正面朝上。使用冷冻样品制备专用镊夹住金属载网的边缘，置于冷冻制样仪Vitrobot悬架上，然后使用10μL移液枪吸取4μL病毒颗粒与抗体复合物悬液加到金属载网正面，吸附1分钟。设置制样参数：Blot time设为5s，Blot force设为0。待程序完成后，金属载网自动随镊子投入液态乙烷。待Vitrobot悬架缓缓下降后，将液态乙烷中的金属载网迅速转移至液氮中的提前做好标记的样品盒中。制样完成后将存放金属载网的样品盒转移到提前在装满液氮保温杯中预冷好的50mL离心管中，最后将装有样品盒的50mL离心管转移至大的液氮罐中，保存备用。使用200kV场发射投射电子显微镜(Arctina,Falcon II相机)进行冷冻样品的数据收集，数据收集条件为：1)Search模式下放大倍数为3800X，Exposure模式下放大倍数为110kX；2)Spot size：Search模式下为7，Exposure模式下为4；注意Spotsize值越小，电子剂量越大，对样品的损坏越大。3)收集图片的帧数为19帧，欠焦值为-2.4至-1.4μm。4)像素尺寸为
Figure BDA0003129656060000081
/像素。得到最初收集的冷冻电镜图，见图5。从图5的FMDV-AWH-R55的冷冻电镜图片可以看出FMDV-AWH-R55分布比较均一，颗粒形态和完整度较好，适合进一步的大量冷冻数据收集以及后续的FMDV-AWH-R55结构的解析工作。
7.FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55复合物(FMDV-AWH-R55)的结构分析基于上述第6小节相同的操作，总共收集538张FMDV-AWH-R55的冷冻电镜图片。
将538张FMDV-AWH-R55的冷冻电镜图片运用MotionCorr2软件进行图像漂移校正和CTFFIND 4.0软件进行图像衬度传递函数(CTF)校正，将校正完成的图片导入Relion3.05软件对FMDV-AWH-R55进行颗粒的挑选和筛选、二维重构、复优化和三维重构。其中，首先手动挑选出285个FMDV-AWH-R55颗粒进行二维结构分类，得到挑选颗粒的参考样，然后以此参考样进行颗粒的自动挑选，总共挑选出39180个颗粒。这些病毒颗粒经过反复的二维结构分类筛选，排除没有结合单链抗体R55或者含有杂质的颗粒，进一步得到形态完整并且收敛良好的颗粒18663个。将二维结构分类提取出来的18663个颗粒进行三维结构分类，总共分为三类，其中第一类中包含14535个颗粒。对第一类的14535个颗粒进行三维结构的重构，得到FMDV-AWH-R55的三维重构密度图。结果见图6。在图6的三维重构密度图中可以看到单链抗体R55与FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒结合在一起，并且单链抗体R55结合在病毒颗粒的三次轴附近。
FMDV O1BFS属于EURO拓扑型O1病毒株，曾流行于英国地区。其X射线晶体结构(病毒结构)已经得到解析并上传至开放获取的PDB蛋白数据库，其PDB ID号：1BBT。DOI：10.2210/pdb1BBT/pdb。
BOV-7是一种已解析的牛源抗体的X射线晶体结构，其结构也已经上传至开放获取的PDB蛋白数据库，其PDB ID号：6e9u。DOI：10.2210/pdb16e9u/pdb。
利用UCSF Chimera软件将FMDV O1BFS(PDB:1BBT)和BOV-7(PDB:6e9u)的X射线晶体结构分别手动放到FMDV-AWH-R55的三维重构密度图中，然后利用Coot软件进行手动建模，主要包括以下几个方面：1)将FMDV O1BFS或BOV-7的氨基酸残基突变成FMDV-AWH-R55复合物中构成病毒衣壳的原聚体和单链抗体R55对应的氨基酸残基；2)将已经完成突变的每个氨基酸手动调整到对应的FMDV-AWH-R55三维重构密度图中；3)利用Ramachandran Plot调整每个氨基酸残基的二面角处于合理区域，Ramachandran Plot用于反映蛋白质构象的合理性。手动建模完成后，利用Phenix软件进行自动正义空间修正，得到如图7所示的FMDVA/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55的相互作用界面图和如图11所示的单链抗体R55的中和表位图，将图7的图像局部放大之后得到图8至10。
图8至10显示，在FMDV-AWH-R55结构中，R55横跨FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒衣壳的两个五聚体中的两个相邻的原聚体(命名为原聚体1和原聚体2，对应于五聚体1和五聚体2)，R55与原聚体2中VP2的βB(VP2D68)、B-C环(VP2T70,VP2D72和VP2K73)和H-I环(VP2Q196)以及原聚体2中VP3的B-B结(VP3D59和VP3Y63)结合，同时R55也与原聚体1中的VP3 B-C环(VP3E70)相结合；R55中与FMDV A/WH/CHA/09病毒衣壳发生相互作用的氨基酸主要位于HCDR2(VHN56)、HCDR3(VHH100、VHY102、VHT108和VHY112)、LCDR1(VLD35)和FR3(VLR69、VLS70和VLN72)。
图8显示，FMDV A/WH/CHA/09中构成病毒衣壳的原聚体2中的VP3B-B结上的第59位天冬氨酸(VP3D59)和第63位的酪氨酸(VP3Y63)与R55重链第二互补决定区的第56位天冬酰胺(VHN56)和重链第三互补决定区的第102位酪氨酸(VHY102)存在氢键相互作用。
图9显示，FMDV A/WH/CHA/09中构成病毒衣壳的原聚体2中的VP2βB上的第68位天冬氨酸(VP2D68)与R55抗体轻链FR3上第69位精氨酸(VLR69)存在强的盐键相互作用；R55轻链FR3上第69位精氨酸(VLR69)也与VP2 H-I环上的第196位的谷氨酰胺(VP2Q196)以氢键相互作用。
图9还显示，R55抗体轻链FR3上第70位丝氨酸(VLS70)和第72位天冬酰胺(VLN72)与FMDV A/WH/CHA/09中构成病毒衣壳的原聚体1中的VP3 B-C环上第70位谷氨酸(VP3E70)存在强的氢键相互作用。
图10显示，R55轻链第一互补决定区的第35位的天冬氨酸(VLD35)与FMDV A/WH/CHA/09中构成病毒衣壳的原聚体2中的VP2 B-C环上第70位的苏氨酸(VP2T70)和第73位的赖氨酸(VP2K73)存在氢键相互作用；FMDV A/WH/CHA/09中构成病毒衣壳的原聚体2中的VP2 B-C环上第72位的天冬氨酸(VP2D72)与R55重链第三互补决定区的第108位的苏氨酸(VHT108)和第112位的酪氨酸(VHY112)也存在氢键相互作用。
综上所述，单链抗体R55横跨FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒衣壳的两个五聚体中的两个相邻原聚体，其识别FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒衣壳的中和表位为构象表位，其中涉及FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒衣壳的主要氨基酸包括一个原聚体中的VP2D68、VP2T70、VP2D72、VP2K73、VP2Q196、VP3D59和VP3Y63和与之相邻的原聚体中的VP3E70。这是首次发现口蹄疫病毒的横跨两个相邻的五聚体，或者说是横跨两个五聚体中的两个相邻原聚体的中和表位，如图11所示。
8.FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体R55结合前后的热稳定性和酸稳定性实验
热稳定性实验可以用于评估FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒146S在与单链抗体R55结合前后病毒颗粒对热的稳定性。热稳定性实验使用Quant Studio RT-PCR仪(ABI,ThermoFisher Scientific)进行。整个荧光反应按照50μL体系为：1μl纯化的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒样品或纯化的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与抗体复合物样品(1mg/L)、5μlSYT09(50μM)和44μl缓冲溶液(10mM HEPES pH 8.0，200mM NaCl)。温度设置为25-95℃，每0.5℃检测一次荧光值。其中SYT09是一种核酸结合染料，其与RNA结合后的吸收波长为490nm，发射波长为516nm。通过荧光信号的增加可以检测到因病毒衣壳解离释放的病毒RNA。每种分析进行三次独立的重复。将实验数据从PCR仪中导出使用GraphPad Prism 5.0软件进行进一步数据处理得到图12。根据图12的热稳定性实验可知，结合了R55的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒的衣壳的热稳定性明显增强了，结合R55后的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒的溶解温度Tm升高了大约5.5℃。
酸稳定性实验可以用于评估FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒146S在与单链抗体R55结合前后病毒颗粒对酸性条件的稳定性。1)FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒的酸稳定性：将纯化的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒PBS悬液(pH 7.4)用PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，50mM Na2HPO4和10mM KH2PO4，pH 6.0)稀释10倍，调整pH至6.0，得到酸性条件下的病毒颗粒悬液。将酸性条件下的病毒颗粒悬液在4℃条件下孵育10s，得到处理后的病毒颗粒悬液。以纯化的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒PBS悬液(pH 7.4)作为对照。然后分别制作处理后的病毒颗粒悬液和对照的负染样品，然后进行负染电镜观察，通过负染电镜观察评估病毒颗粒的稳定性和衣壳的完整性，结果见图13。2)FMDV-AWH-R55的酸稳定性：将纯化的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒的PBS悬液(pH 7.4)与单链抗体R55 PBS溶液(pH 7.4)按照摩尔比1：240在4℃条件下孵育1分钟形成FMDV-AWH-R55，然后用PBS缓冲液(pH 6.0)稀释10倍，调整pH至6.0，得到酸性条件下的FMDV-AWH-R55悬液。将酸性条件下的FMDV-AWH-R55悬液制备两份，在4℃条件下分别孵育10s和30s，得到处理后的FMDV-AWH-R55悬液。以FMDV-AWH-R55 PBS悬液(pH 7.4)作为对照。然后分别制作处理后的FMDV-AWH-R55悬液和对照的负染样品，然后进行负染电镜观察，通过负染电镜评估病毒颗粒的稳定性和衣壳的完整性，结果见图14。
基于图13可知，FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒在酸性条件下(pH＝6)迅速解离为五聚体，在孵育10s后病毒颗粒几乎全部解离为五聚体，进而几乎看不到完整的病毒颗粒。而基于图14可知，FMDV-AWH-R55复合物在酸性条件下孵育30s，仍然可以看到很高密度的完整病毒颗粒。这表明FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒结合单链抗体R55后明显增强了病毒衣壳的酸稳定性。
9.FMDV A/WH/CHA/09病毒株和FMDV A/GDMM/CHA/2013病毒株的氨基酸序列比对分析
利用ClustalW多序列比对软件对口蹄疫病毒血清A型病毒株(FMDV A/WH/CHA/09和FMDV A/GDMM/CHA/2013)与血清O型病毒株(FMDV O/Mya/98、FMDV O/Tibet/99和FMDV O/HN/CHA/93)原聚体的VP2和VP3结构蛋白的氨基酸序列进行比对分析，然后使用ESPript软件对比对结果进行作图，结果见图15。
图15显示R55所识别的中和表位VP2D68、VP2T70、VP2D72、VP2K73、VP2Q196、VP3D59、VP3Y63和VP3E70在血清型A型的FMDV A/WH/CHA/09病毒株和FMDV A/GDMM/CHA/2013病毒株中是完全保守的；在FMDV O/Mya/98、FMDV O/Tibet/99和FMDV O/HN/CHA/93三个血清型O型的病毒株中，与R55所识别的血清型A型中和表位相同的位点均为VP2D68、VP2V70、VP2S72、VP2D73、VP2Q196、VP3G59、VP3Y63和VP3S70，因此，表明这些位点在血清型O型的病毒株中也是完全保守的；但在血清型A型和血清型O型间发生了VP2T70V、VP2D72S、VP2K73D、VP3D59G和VP3E70S突变，因而，R55所识别的中和表位中的这五处位点在血清型A型和血清型O型间不具保守性。而中和表位的保守性是单链抗体R55在血清型A型内广谱的决定因素。因此，中和表位的保守性解释了单链抗体R55所具有的在血清型A型内广谱中和且血清型A型特异性的特性。此外，中和表位的完全保守也能说明单链抗体R55与其他血清型A型病毒株结合后可以增加有关病毒株病毒衣壳的热稳定性和酸稳定性。
基于本发明的分析，可以明确R55可以横跨血清型A型病毒颗粒两个相邻的五聚体，并因此增强了病毒衣壳的热稳定性和酸稳定性，从而阻止病毒颗粒解离为五聚体，以至于病毒的基因组不能释放出来，进而实现中和病毒的感染。这是首次发现以增强衣壳的稳定性来达到中和口蹄疫病毒感染为中和机制的口蹄疫病毒抗体。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用
<130> LHA2160293
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Phe Leu
35 40 45
Gly Ser Ile Ser Thr Gly Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Lys Ser Ile His Ser Tyr Ser Val Phe Glu Tyr Thr Tyr Met Gln Tyr
100 105 110
Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly Leu Leu Val Pro Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Ala Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Asn Asn Ile Gly
20 25 30
Arg Tyr Asp Val Gly Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Ser Gly Leu Arg
35 40 45
Thr Ile Ile Tyr Ala Ser Lys Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Thr Gly Asp Tyr
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ser Val Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly His His His His His His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Asn Pro Leu Trp Thr Leu Leu Phe Val Leu Ser Ala Pro Arg Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 6
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggtgcagc tgagggagag cggccccagc ctggtgaagc ccagccagac cctgagcctg 60
acctgcaccg tgagcggctt cagcctgagc gactacgccg tgggctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg ccctggagtt cctgggcagc atcagcaccg gcggcaacac cggctacaac 180
cccgccctga agagcaggct gagcatcacc aaggacaaca gcaagaacca ggtgagcctg 240
agcctgagca gcgtgaccac cgaggacacc gccacctact actgcaccaa gagcatccac 300
agctacagcg tgttcgagta cacctacatg cagtacgtgg acgcctgggg ccagggcctg 360
ctggtgcccg tgagcagc 378
<210> 7
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgggcccagg ccgtgctgac ccagcccagc agcgtgagcg gcagcctggg ccagagggtg 60
agcatcacct gcagcggcag cagcaacaac atcggcaggt acgacgtggg ctggtaccag 120
cagatccccg gcagcggcct gaggaccatc atctacgcca gcaagaacag gcccagcggc 180
gtgcccgaca ggttcagcgg cagcaggagc ggcaacaccg ccaccctgac catcagcagc 240
ctgcaggccg aggacgaggc cgactacttc tgcgccaccg gcgactacag cagcagcacc 300
agcgtgttcg gcagcggcac caccctgacc gtgctgggc 339
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagc 45
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gactacaagg acgacgacga caagggcggc caccaccacc accaccac 48
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaaccccc tgtggaccct gctgttcgtg ctgagcgccc ccaggggcgt gctgagc 57
<210> 11
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgaaccccc tgtggaccct gctgttcgtg ctgagcgccc ccaggggcgt gctgagccag 60
gtgcagctga gggagagcgg ccccagcctg gtgaagccca gccagaccct gagcctgacc 120
tgcaccgtga gcggcttcag cctgagcgac tacgccgtgg gctgggtgag gcaggccccc 180
ggcaaggccc tggagttcct gggcagcatc agcaccggcg gcaacaccgg ctacaacccc 240
gccctgaaga gcaggctgag catcaccaag gacaacagca agaaccaggt gagcctgagc 300
ctgagcagcg tgaccaccga ggacaccgcc acctactact gcaccaagag catccacagc 360
tacagcgtgt tcgagtacac ctacatgcag tacgtggacg cctggggcca gggcctgctg 420
gtgcccgtga gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 480
tgggcccagg ccgtgctgac ccagcccagc agcgtgagcg gcagcctggg ccagagggtg 540
agcatcacct gcagcggcag cagcaacaac atcggcaggt acgacgtggg ctggtaccag 600
cagatccccg gcagcggcct gaggaccatc atctacgcca gcaagaacag gcccagcggc 660
gtgcccgaca ggttcagcgg cagcaggagc ggcaacaccg ccaccctgac catcagcagc 720
ctgcaggccg aggacgaggc cgactacttc tgcgccaccg gcgactacag cagcagcacc 780
agcgtgttcg gcagcggcac caccctgacc gtgctgggcg actacaagga cgacgacgac 840
aagggcggcc accaccacca ccaccac 867

Claims (10)

1.一种口蹄疫病毒抗体，其包括重链和轻链，其中，所述重链的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体，其特征在于，所述抗体为所述重链和所述轻链融合的单链抗体，所述重链和所述轻链之间连接有柔性多肽接头，且所述重链位于N端，所述轻链位于C端；
优选地，所述柔性多肽接头的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的口蹄疫病毒抗体，其特征在于，当所述重链和所述轻链没有融合在一起时，在所述重链的N端和/或C端连接有第一纯化标签，在所述轻链的N端和/或C端连接有第二纯化标签；
当所述抗体为单链抗体时，所述重链和所述轻链融合在一起，在所述单链抗体的N端和/或C端连接有第三纯化标签；
优选地，所述第一纯化标签、所述第二纯化标签和所述第三纯化标签独立地为His标签、Flag标签和GST标签中的至少一种。
4.编码如权利要求1至3中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体的核酸。
5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，编码所述重链的核酸的序列如SEQ IDNo.6所示，编码所述轻链的核酸的序列如SEQ ID No.7所示。
6.根据权利要求4或5所述的核酸，其特征在于，编码所述柔性多肽接头的核酸的序列如SEQ ID No.8所示；
优选地，所述核酸的序列如SEQ ID No.11所示。
7.一种携带如权利要求4至6中任意一项所述的核酸并能够表达如权利要求1至3中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体的细胞；优选地，所述细胞为CHO-S细胞。
8.如权利要求1至3中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体、如权利要求4至6中任意一项所述的核酸和如权利要求7所述的细胞中的一种在制备用于中和血清型为A型的口蹄疫病毒株的药物中的应用；或如权利要求1至3中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体、如权利要求4至6中任意一项所述的核酸和如权利要求7所述的细胞中的一种在制备用于预防或治疗由血清型为A型的口蹄疫病毒株引起的疾病的药物中的应用；
优选地，所述血清型为A型的口蹄疫病毒株为血清型A型Asia拓扑型的口蹄疫病毒株；
优选地，所述血清型为A型的口蹄疫病毒株为FMDV A/WH/CHA/09病毒株和/或FMDV A/GDMM/CHA/2013病毒株。
9.如权利要求1至3中任意一项所述的口蹄疫病毒抗体、如权利要求4至6中任意一项所述的核酸和如权利要求7所述的细胞中的一种在用于鉴定血清型为A型的口蹄疫病毒中的应用；
优选地，所述应用为用于鉴定血清型为A型Asia拓扑型的口蹄疫病毒。
10.口蹄疫病毒的抗原表位，所述抗原表位由位于第一原聚体上的氨基酸位点和位于第二原聚体上的氨基酸位点组成，所述第一原聚体和所述第二原聚体相邻，且所述第一原聚体与所述第二原聚体不在同一个五聚体中；所述第一原聚体上的氨基酸位点为VP3E70；所述第二原聚体上的氨基酸位点为VP2D68、VP2T70、VP2D72、VP2K73、VP2Q196、VP3D59和VP3Y63；
优选地，所述口蹄疫病毒为血清型A型的口蹄疫病毒；
优选地，所述口蹄疫病毒为血清型A型Asia拓扑型的口蹄疫病毒；
优选地，所述口蹄疫病毒为FMDV A/WH/CHA/09病毒株和/或FMDV A/GDMM/CHA/2013病毒株；
优选地，利用所述口蹄疫病毒的抗原表位制备用于预防口蹄疫病毒的疫苗。
CN202110700617.4A 2021-06-23 2021-06-23 一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用 Active CN113416246B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110700617.4A CN113416246B (zh) 2021-06-23 2021-06-23 一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110700617.4A CN113416246B (zh) 2021-06-23 2021-06-23 一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113416246A true CN113416246A (zh) 2021-09-21
CN113416246B CN113416246B (zh) 2022-05-17

Family

ID=77716409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110700617.4A Active CN113416246B (zh) 2021-06-23 2021-06-23 一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113416246B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114276446A (zh) * 2022-01-05 2022-04-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170218053A1 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Alfonso Clavijo Monoclonal antibody against novel epitopes of foot-and-mouth disease virus protein 3abc and uses thereof
CN107253979A (zh) * 2017-05-17 2017-10-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 单克隆抗体10b10识别的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170218053A1 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Alfonso Clavijo Monoclonal antibody against novel epitopes of foot-and-mouth disease virus protein 3abc and uses thereof
CN107253979A (zh) * 2017-05-17 2017-10-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 单克隆抗体10b10识别的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE, Y等: "Structures of Foot-and-mouth Disease Virus with neutralizing antibodies derived from recovered natural host reveal a mechanism for cross-serotype neutralization", 《PLOS PATHOGENS》 *
李德山等: "抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选", 《东北农业大学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114276446A (zh) * 2022-01-05 2022-04-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用
CN114276446B (zh) * 2022-01-05 2023-04-18 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113416246B (zh) 2022-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111499765B (zh) 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用
CN113138276B (zh) 用于检测HBcAg的方法及抗体
CN110964102A (zh) 能同时与犬、猫、水貂细小病毒结合的单克隆抗体、其可变区序列、杂交瘤细胞株及应用
WO2020043068A1 (zh) 一种ns1蛋白的结合蛋白以及应用
EA029346B1 (ru) Моноклональное антитело человека против белка vp1 вируса jc
CN105669859A (zh) 人乳头瘤病毒18型单克隆抗体及其应用
CN110845624B (zh) 一种sumo-cp融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法
CN113416246B (zh) 一种口蹄疫病毒抗体、编码其的核酸及应用
WO2020043067A1 (zh) Ns1蛋白的结合蛋白
CN113563461B (zh) 一种基于非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用
KR20210056362A (ko) Ns1-결합 단백질
CN113150134B (zh) 抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒
CN110669142B (zh) 融合rgd的猪圆环病毒2型病毒样颗粒、突变型感染性克隆及其制备方法和应用
CN110887963B (zh) 一种pcv2病毒样颗粒夹心定量elisa检测法及其应用
US20230295272A1 (en) Canine parvovirus nanobody cpv-vhh-e3 and application thereof
CN114249819A (zh) 猫泛白细胞减少症病毒抗体、含有猫泛白细胞减少症病毒抗体的试剂盒及应用
CN117903300A (zh) 一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy1及其制备方法与应用
CN117964746A (zh) 一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy2及其制备方法与应用
CN116102643B (zh) 针对猴痘病毒a35蛋白的单克隆抗体及其应用
CN116375852B (zh) 重组荧光纳米抗体及其在制备狂犬病病毒检测试剂中的应用
CN113861287B (zh) 犬细小病毒纳米抗体cpv-vhh-h1及其应用
CN110903356B (zh) 一种猪圆环病毒ii型抗原以及检测猪圆环病毒ii型抗体的胶体金免疫层析试纸条
CN114349854B (zh) 针对甲型流感病毒n1亚型na蛋白的抗体及其应用
CN117886891B (zh) 靶向巨噬细胞cd169受体的多肽及其应用
CN114316035B (zh) 一种通用型的口蹄疫病毒结构蛋白抗体、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant