CN112430269B

CN112430269B - 一种促进脐带血干细胞成骨分化的组合物及其应用

Info

Publication number: CN112430269B
Application number: CN202110114416.6A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 陈博
Original assignee: Zhongsai Stem Cell Genetic Engineering Co ltd
Current assignee: Zhongsai stem cell genetic engineering Co.,Ltd.
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN112430269A

Abstract

本发明涉及一种促进脐带血干细胞成骨分化的组合物及其应用。本发明制备获得了骨硬化蛋白特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性的促进干细胞向成骨分化的同时还能够在二种干细胞中弱促进细胞的增殖，具有较好的应用前景。

Description

一种促进脐带血干细胞成骨分化的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及一种促进脐带间充质干细胞向成骨分化的方法及其组合物和应用。

背景技术

骨相关疾病是近年来发病率升高较快的病种。而骨组织工程的进步为骨缺损修复提供了新的思路，在一定程度上克服了传统骨缺损修复所存在的缺点，如免疫排斥反应、二次损伤、可移植部位及数量有限等。骨组织工程的关键之一是选择合适的种子细胞。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病。相对于骨髓内的干细胞，进行脐带血干细胞移植所引发的后遗症更低，而且干细胞的排斥概率也低。成骨细胞时骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化形成新骨。成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。干细胞骨分化是骨骼细胞再生的重要环节，干细胞分化成骨组织用以进行移植研究和潜在治疗具有重要的价值。

脐带等结构在女性生产后，常作为医疗废弃物处置，这极为可惜，因为脐血有很多具有多向分化能力的干细胞，除了造血干细胞，间充质干细胞也可在体内外分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

目前，关于脐带间充质干细胞成骨分化的研究已比较多。许多胞外成分可引导间充质干细胞向成骨细胞分化，如骨形成蛋白2、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、力生长因子等，但较常用的方法为地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸共同促间充质干细胞成骨分化。其中地塞米松可以促进间充质干细胞碱性磷酸酶活性增强，早期促基质合成，后期促钙化; β-甘油磷酸钠迅速水解生成磷酸根离子，可作为碱性磷酸酶的底物，促进钙盐沉积; 抗坏血酸可以促进细胞合成胶原，形成钙化。有研究表明，干细胞所处的微环境对细胞分化起着正向或者负向调节作用，骨损伤过程的局部为炎性微环境，炎性细胞因子是否对干细胞成骨分化存在促进或抑制作用。有研究表明， IL-10等细胞因子可抑制破骨细胞活性、加速成骨，但是也有研究者提出IL-6 促进破骨细胞增殖和活性。成骨细胞和破骨细胞都是已经分化的细胞，而各类细胞因子是否影响原始的多能间充质干细胞分化成为成骨细胞、对骨修复进行支持是有争议的。研究也表明细胞因子TNF-α， IL-6和IL-4 在人类脐血来源间充质干细胞的成骨分化中的促进作用。

此前研究也表明，骨硬化蛋白可通过与Wnt通路中Lrp5/6结合，抑制Wnt/β-catenin通路的活化，对骨形成起负性调控作用。动物实验证明拮抗骨硬化蛋白在增加骨量，改善骨强度和骨折愈合都有很好的效果,通过骨硬化蛋白单链抗体作用与骨髓间充质干细胞，发现对细胞增殖作用不明显，但可以促进成骨分化，为拮抗骨硬化蛋白治疗骨质疏松症的临床应用提供了新的思路。但是目前，还有拮抗骨硬化蛋白来研究其他干细胞向成骨分化的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速促进脐带血干细胞增殖的同时还能促进其诱导分化为成骨细胞的方法。发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速促进干细胞增殖的同时还能促进其诱导分化为成骨细胞的方法。

具体的本发明针对骨硬化蛋白，筛选获得了特异性的单克隆抗体。

更具体的，所述单克隆抗体的序列为：

轻链可变区(SEQ ID NO:1)

DIVITQSPALRAASPGEKSTITCAVRAYISRRYLDWYQQKSGSSPKPWIYSTPNLAAGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMETEDAATYYCQQWSSSPLTFGAGTKLELK

重链可变区(SEQ ID NO:2)

EVQLEEAGTELARPGAGVKLSCKAAGYIFSQYWAEWIKQRPGRGLEWIGSIYPSQGDTSQTRKFSGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEQSAVYYCAGSNFCADSWGLGTTLAVSS。

本发明提出了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。

在本发明的另外一个方面，本发明提出了一种表达载体，该表达载体包含前面所述的多核苷酸。

根据本发明的具体实施例，上述表达载体进一步包括：控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操纵地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。

在本发明的另外一个方面，本发明还提出了前面所述的多核苷酸、表达载体、或重组细胞在制备抗体或其抗原结合片段的用途，所述抗体与骨硬化蛋白特异性结合。

在本发明的另外一个方面，本发明提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、表达载体、重组细胞或前面所述的抗体在制备促进干细胞成骨分化中的用途。

进一步的，所述干细胞为脂肪干细胞或者脐带血干细胞，或者其他合适的干细胞。

本发明还提供一种促进干细胞增殖以及成骨分化的方法，具体为如下步骤：取分离纯化的干细胞加入成骨诱导液，每3d换液，诱导10-20d即可。采用茜素红染色镜下观察成骨诱导后细胞形态变化。其中成骨诱导液：加终浓度为50ug/mL 骨硬化蛋白特异性单克隆抗体的a-MEM完全培养基。

在本发明的另外一个方面，本发明提出了一种药物联合。根据本发明的实施例，该药物联合包括： (1)前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面的多核苷酸、前面的表达载体、前面的重组细胞或前面所述的单克隆抗体；以及 (2)与(1)不同的干细胞成骨分化诱导增强药物。

有益效果

本发明制备获得了骨硬化蛋白特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性的促进干细胞向成骨分化的同时还能够在二种干细胞中弱促进细胞的增殖，具有较好的应用前景。

附图说明

图1 脐带血间充质干细胞标记物结果图

图2 单抗对干细胞成骨基因表达的影响结果图

图3 单抗对干细胞增殖的影响结果图

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1 脐带血间充质干细胞的制备

无菌条件下取健康胎儿小块胎盘组织，PBS充分洗涤后剔取胎儿面脱膜并剪碎。0.1％IV型胶原酶消化20min，100目筛网过滤，收集细胞接种于T75细胞培养瓶，以含10％UCBS的-MEM培养基于37，5％CO₂的饱和湿度环境下进行培养。培养生长至80％融合后，用0．05％的胰酶消化传代到第4代进行PMSCs表面标志鉴定，用0.05％胰蛋白酶消化后，调整细胞密度至1×10⁶个／mL，分为每管100uL，分别加入鼠抗人CD105、CD34、CD45、HLA-DR、CD44及CD29单克隆抗体，避光4摄氏度孵育30min，4％多聚甲醛固定后流式细胞仪进行检测。经流式细胞术检测，结果图1所示。PMSCs高表达CD29、CD44及CD105，不表达或低表达CD34、CD45及HLA-DR，差异无统计学意义(P>0.05)。

实施例2 骨硬化蛋白的制备

以人DNA为模板，以引物：5’-ACAGGATCCATGCAGCTCCCACTGGCC-3’,

5’-ATCCTCGAGCTAGTAGGCGTFCTCCAG-3’ ，进行PCR扩增：PCR反应缓冲液5μl，模板DNA 1μl，10mmol/L dNTP 2μl ，25 μmol/L引物各1μl，Taq酶1μl，补水至50 μl。PCR反应条件为：94℃变性3min后，3O个循环(94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60s)，最后72℃充分延伸10 min，4℃保温。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段大小。将PCR产物与pET-28a质粒载体双酶切后，通过T4连接酶连接，转化E.coli DH5α克隆菌株，提取重组质粒进行BamHI和Xho I双酶切检测，并对重组质粒进行测序检测，最后转化重组质粒入E.coli BL21（DE3）表达菌株。选取经鉴定的重组菌株过夜培养，以1：100倍转接人新鲜的LB培养基中，待0D约0．5时，加入终浓度0.5 mmol/L IPTG，37℃诱导培养6h，收集菌体，并利用SDS-PAGE电泳切胶的方法，对骨硬化蛋白进行纯化，并采用骨硬化蛋白检测试剂盒（百奥莱博，货号ZN2401）进行检测发现，表达的重组蛋白可以被试剂盒特异性阳性检测，并且蛋白的浓度达到了1mg/mL，保存备用。

实施例3 单克隆抗体的制备

选择7周龄雌性Balb/c小鼠3只进行免疫，免疫共分3次，间隔14d，具体步聚：第1次免疫为弗氏佐剂与实施例1制备的蛋白按1:1比例混合物100μL腹部皮下注射，抗原计量100μg；14d后第2次免疫，不完全弗氏佐剂与实施例1重组蛋白1:1比例混合100μL腹部皮下注射，抗原计量100μg；再过14d后进行第３次免疫，不完全弗氏佐剂与实施例1重组蛋白1:1比例混合200μL腹腔注射，抗原计量100μg。14d后尾静脉采血，测定血清效价。使用血清效价大于1:10000的Balb/c鼠进行尾静脉加强免疫，抗原量100μg，3d后可进行细胞融合。

取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1的比列，融合剂为PEG6000，按常规方法进行融合。将融合后的细胞低速离心后弃上清，用HAT的1640培养液重悬，加到含有饲养细胞的96孔板中，100μL/孔，置37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养，第5天用HAT培养基换出1/2培养基；10d后用HT培养基换出HAT培养基。待细胞生长到占孔底面积1/3时，取上清用间接ELISA进行筛选，选取阳性最强的阳性孔采用有限稀释法克隆４次后，获得单克隆杂交瘤细胞3株，并进行扩大培养。腹水制备：取8周龄的雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL，7d后将扩大培养的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，注入细胞数量约为3×10⁴个/只，１周左右小鼠腹腔臌胀，即可收集腹水，将腹水进行单克隆抗体效价测定：将腹水10倍倍比稀释，同时以PBS阴性对照，采用间接ELISA法。用纯化的实施例1重组蛋白包被，一抗为不同稀释度的抗骨硬化蛋白单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，采用TMB显色，于波长450nm测定OD值。单克隆抗体效价以腹水的稀释度表示。结果如下表1所示。

表1 单克隆抗体的间接ELISA结果

细胞株	效价
		GYH-3	4.5×10<sup>7</sup>
GYH-8	1.7×10<sup>8</sup>
		GYH-17	3.6×10<sup>8</sup>

将3株单抗腹水离心后收集上清，纯化后置-20℃保存备用。

实施例4 单抗特异性鉴定

分别用实施例2制备的纯化的骨硬化蛋白和BSA分别包被酶标板，评价两者OD值的差异，单克隆抗体和纯化的骨硬化蛋白的OD值与单克隆抗体与BSA的OD值之比＞1.5，则认为有单抗特异性。结果显示，3株单克隆抗体的骨硬化蛋白包被原OD值与BSA包被原OD值之比＞1.5，认为具有单抗特异性。

实施例5 GYH-17抗体序列鉴定

GYH-17杂交瘤细胞株进行离心收集杂交瘤细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cFNA。采用如下引物进行扩增。引物序列为：重链：上游引物：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGAGGTGCAACTGCAGCAGTCAGG-3’ ，下游引物为5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’(S／M／R是碱基兼并码)。轻链：上游引物：5’-GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC-3’，下游引物：5’- -GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’。扩增产物经过克隆后进行测序。结果如下所示。

轻链可变区(SEQ ID NO:1)

重链可变区(SEQ ID NO:2)

实施例6 检测抗体与S蛋白的亲和力

抗体与S蛋白和实施例2重组蛋白的结合动力学使用基于表面等离振子共振(SRP)技术的BIAcore 8K仪器测量。通过GE anti-Human-IgG-Fc氨基偶联试剂盒，将anti-humanIgG抗体氨基偶联到CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将实施例1制备的重组蛋白用HBS-EP缓冲液2倍连续稀释，50nM起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。Startup 3次。抗体：2μg/ml，进样时间100s，流速10μL/min；抗原蛋白：结合120s，流速30μL/min，解离600s；再生：用3M MgCl2buffer再生30s，流速30μL/min。使用1:1binding结合模型或Two state reaction结合模型计算平衡解离常数(KD)。结果显示抗体能与相应抗原结合，亲和力为0.28nM。

实施例7 脐带血间充质干细胞的成骨诱导实验

第4代脐带血间充质干细胞加入成骨诱导液，每3d换液，第17天倒置相差显微镜观察细胞形态变化，第17天行茜素红染色：脐带血间充质干细胞用PBS冲洗，100g／L多聚甲醛固定后，蒸馏水冲洗，加入1％茜素红-Tris-HCl(PH 8.3)，染色后蒸馏水反复冲洗，镜下观察成骨诱导后细胞形态变化。

其中，阳性对照组成骨诱导液：含10% 胎牛血清的DMEM + 0. 01μmol /L 地塞米松+ 10 mmol /Lβ-甘油磷酸钠+ 0.1 mmol/L 抗坏血酸；

实验组：加终浓度为50ug/mL GYH-17抗体的含10%胎牛血清的DMEM；

对照组：含10%胎牛血清的DMEM；

成骨诱导17d后，在阳性对照组和实验组均可见着橘红色的典型钙化结节，对照组没有相应的橘红色的典型钙化结节，其中，实验组与阳性对照组相比，钙化结节的数量要高13.9%，这说明所述的抗体能够促进脂肪干细胞向成骨细胞诱导。

实施例8 单抗对脐带血间充质干细胞成骨基因表达的影响

分别取实施例7中诱导第9天的细胞样品少量，用Trizol裂解细胞，提取细胞RNA,反转录为cDNA, 釆用实时定量PCR检测成骨基因Col1, ALP, RUNX2, OPN的表达,GAPDH作为内参，结果采用2^-△△Ct法进行计算，对照组的相应表达水平为1，比较抗体处理后的成骨基因表达水平。具体引物为：

Coll 上游（5’-3’）AACTTTGCTTCCCAGATGTCCT

下游（5’-3’) CTTCCCCATCATCTCCATTCTT

ALP 上游（5’-3’）TCGGGACTGGTACTCGGATAA

下游（5’-3’) TTCAGTGCGGTTCCAGACATAG

OPN 上游（5’-3’) CAGTGATTTGCTTTTGCCTGTTTG

下游（5’-3’) GGTCTCATCAGACTCATCCGAATG

RUNX2 上游（5’-3’) GACTGTGGTTACCGTCATGGC

下游（5’-3’) ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA

GAPDH 上游（5’-3’) AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

下游（5’-3’）TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。结果如图2所示。

从图2可以看出，在抗体的作用下，本发明实验组与阳性对照组相比都能够显著的促进成骨相关基因的表达，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2 。特别是针对RUNX2基因的增强效果最显著，这与在脂肪干细胞中的诱导表达情况稍有不同。

实施例9 单抗对脐带血干细胞增殖的影响

取生长良好的第4代干细胞，调整细胞浓度为1X10⁷/L，接种于96孔板，每孔细胞数1x10³个，总体积为100uL。脐带血干细胞贴壁后用不含血清的a-MEM培养基同歩化处理24h。实验组加入含50 ug/L单抗的a-MEM完全培养基，对照组仅加a-MEM培养基，每组设6个复孔，分别在第1,3,5,7,9天同一时间点各取1板，毎孔加MTT(5g/L)20uL,37°C,体积分数为5%CO₂,饱和湿度培养箱孵育，4h后每孔加二甲基亚砜150uL,置于摇床上低速振荡约10min,使紫色结晶物溶解，酶标仅490nm波长检测吸光度值。

结果如图3所示，在第9d，实验组的吸光度值比对照组的吸光度值稍有提高，这说明，单抗的加入能够促进干细胞分化时期的增殖，促进率达到了9.38%。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明造构思的前提下，还可以做出若干改变和改进，这些都属于发明的保护范围。

序列表

<110> 天津汉青生物科技有限公司

<120> 一种促进脐带血干细胞成骨分化的组合物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Leu Arg Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ser Thr Ile Thr Cys Ala Val Arg Ala Tyr Ile Ser Arg Arg

20 25 30

Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Pro Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ala Gly Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Gly Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Ile Phe Ser Gln Tyr

20 25 30

Trp Ala Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ser Ile Tyr Pro Ser Gln Gly Asp Thr Ser Gln Thr Arg Lys Phe

50 55 60

Ser Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Gln Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ser Asn Phe Cys Ala Asp Ser Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

Claims

1.一种骨硬化蛋白的单克隆抗体，其特征在于具体的轻重链可变区序列为：

轻链可变区如SEQ ID NO:1所示：

重链可变区如SEQ ID NO:2所示：

2.编码权利要求1所述骨硬化蛋白单克隆抗体的多核苷酸。

3.含有权利要求2所述多核苷酸的表达载体。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备促进脐带血间充质干细胞增殖及成骨分化的诱导液中的用途。

5.骨硬化蛋白的单克隆抗体的编码多核苷酸或含有前述多核苷酸的表达载体在制备促进脐带间充质干细胞增殖及成骨分化的诱导液中的用途；其中单克隆抗体的的轻重链可变区序列为：

轻链可变区如SEQ ID NO:1所示：

重链可变区如SEQ ID NO:2所示：