CN111671896A

CN111671896A - 骨髓间充质干细胞和单克隆抗体联合治疗癌症的用途

Info

Publication number: CN111671896A
Application number: CN202010754890.0A
Authority: CN
Inventors: 刘欢; 朱小明
Original assignee: Beijing Guangwei Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Taihua Sail Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111671896B

Abstract

本发明涉及骨髓间充质干细胞和单克隆抗体联合治疗癌症的用途。本发明通过制备骨髓间充质干细胞以及特异性的针对肾癌细胞的单克隆抗体，将二者组合用于抑制肾癌细胞的转移以及增殖，具有较好的抑制效果，有着广阔的应用前景。

Description

骨髓间充质干细胞和单克隆抗体联合治疗癌症的用途

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的，涉及一种骨髓间充质干细胞和单克隆抗体联合治疗癌症的用途。

背景技术

干细胞来源广泛，种类繁多。根据发育阶段，分为胚胎干细胞(ESCs)和成体干细胞(ASCs)。其中ESCs由于伦理争议，其临床研究和应用受到一定限制。尽管作为全能干细胞的ESCs也有临床研究报道；但至少目前看来，多种ASCs具有较好的临床治疗价值，造血干细胞(HSCs)和少数种类的间充质干细胞(MSCs)已被批准应用于临床。目前HSCs移植是治疗白血病、恶性贫血、再生障碍性贫血等血液系统疾病唯一有效的方法。

大量临床研究表明，一些种类的干细胞对许多难治性疾病具有明显疗效。这些疾病包括自身免疫性疾病、退行性疾病、代谢性疾病、组织缺损性疾病、创伤性疾病、炎症性疾病、放射性疾病、中毒性疾病、缺血性疾病以及肿瘤、失眠、亚健康状态、抗衰老、美容等，涉及人体的神经、循环、呼吸、消化、内分泌、泌尿、生殖、运动等各大系统。临床上研究较多的用干细胞治疗的疾病主要有白血病、恶性贫血、再生障碍性贫血、肝硬化、克罗恩病、小儿自闭症、脑瘫、帕金森症、阿尔兹海默症、糖尿病、糖尿病足、系统性红斑狼疮、关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、急性心肌梗死、肿瘤等。这种疾病治疗的多样性，是由干细胞治疗机制的复杂性决定的。研究表明，干细胞治疗的机制包括:通过归巢与多向分化潜能直接修复或再生损伤的组织器官；通过内分泌、远程分泌和旁分泌功能参与组织器官修复替代；通过免疫反应和炎症反应调节功能参与组织器官修复；通过介导自噬作用、趋化作用、抗氧化应激功能参与疾病治疗；通过血管、神经再生作用参与疾病治疗等。迄今，各种干细胞治疗的机制并没有完全弄清，还需要深入研究。

肾癌也称肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，是一种起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤。在我国RCC的发病率位居泌尿系肿瘤第二位，仅次于膀胱癌。约20％～30％的患者术后出现复发或转移。肾癌早期无明显症状，待出现症状后约30％的患者已到晚期，就诊时肿瘤已发生转移，手术效果差或丧失了手术时机。

目前在肾癌的治疗中单克隆抗体是重要的研究方向。贝伐单抗是一种单克隆抗体，其直接与VEGF结合从而阻断VEGF和自身受体结合，达到阻断肿瘤血管生成的作用。Escudier等和Rini等分别于2007、2008和2010年在三期临床试验中比较了贝伐单抗+干扰素与单纯使用干扰素的效果，在这两项研究中均没有单独使用贝伐单抗的组别。研究结果表明含有贝伐单抗组别有着较好的无进展生存期(Rini：8.5个月比5.2个月，HR 0.71；Escudier：10.2个月比5.4个月，HR 0.63)。pembrolizumab(MK-3475)是一种阻断PD-1的人源性抗体IgG4。现正进行I期临床试验，实验对象为包括肾癌在内的晚期实体肿瘤患者。发现最常见的不良反应为疲劳、皮肤瘙痒和呼吸困难。另一项研究pembrolizumab在新辅助化疗中联合口服INCB024360(吲哚胺2-3-双加氧酶抑制剂)治疗包括肾癌在内的晚期实体肿瘤患者。

但是目前国产的针对肾癌治疗的单克隆抗体还不多，特别是将单克隆抗体与干细胞联用用于肾癌的治疗也研究较少。

发明内容

本发明填补现有技术的空白，提供了针对肾癌治疗的新方法。

本发明一方面，提供了一种分离并制备获得骨髓间充质干细胞的方法，将采集到的抗凝骨髓经低糖的DMEM稀释后,用针头沿管壁慢慢注入到Percoll淋巴细胞分离液上，使之成为单细胞悬液，离心。轻轻吸出中间呈白色浑浊状的骨髓间充质干细胞层，清洗。弃PBS，用含10％FCS的L-DMEM培养液制成的细胞悬液进行计数板计数，接种于含青霉素、链霉素的含10％FCS的L—DMEM培养液的25ml⁶⁰Co照射(照射量5Gy)处理后的细胞培养瓶中，置于5％CO₂、37℃二氧化碳培养箱中培养。48h后首次换液，吸弃未贴壁的悬浮细胞，加入新鲜培养液继续孵育，每3～4d换液。每天倒置相差显微镜下观察MSCs贴壁情况、细胞形态及生长状态。待贴壁细胞80％融合后，弃掉培养液，PBS冲洗瓶壁，0.25％胰酶消化，镜下观察控制2～3min，用含血清培养液终止消化，反复吹打瓶壁，制成单细胞悬液，再次传代培养到第三代备用。

本发明的另外一个方面，提供了所述骨髓间充质干细胞在制备抑制肾癌细胞侵袭及增殖中的用途。

进一步的，本发明还提供了特异性针对肾癌细胞的单克隆抗体及其制备方法。

进一步的，所述单克隆抗体，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，本发明还提供一种如上述抗肾癌细胞的单克隆抗体的编码基因。

进一步的，还提供了抗肾癌细胞的单克隆抗体编码基因的表达载体。

更进一步的，本发明提供了抗肾癌细胞的单克隆抗体在制备抗肾癌的药物中的应用。

进一步的，所述肾癌是由人肾癌细胞A498导致的。

更进一步的，本发明提供了骨髓间充质干细胞和抗肾癌干细胞在制备抗肾癌的药物组合物中的应用。

本发明还提供一种检测肾癌的方法，包括如下的步骤：上述的单克隆抗体与待检样品在体外接触，检测上述的抗体与所述待检样品的结合即可。

所述结合的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为FACS检测。

更进一步的，本发明提供一种检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有本发明制备的单克隆抗体以及相应的检测试剂。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

有益效果

本发明的积极进步效果在于：本发明通过制备骨髓间充质干细胞以及特异性的针对肾癌细胞的单克隆抗体，将二者组合用于抑制肾癌细胞的转移以及增殖，具有较好的抑制效果。此外，将所述的单克隆抗体制备成为相应的检测试剂盒可以检测肾癌，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为骨髓间充质干细胞表面抗原

图2单抗抑制人肾癌细胞A498增殖结果图

图3肾癌细胞的抑制实验结果图

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1骨髓间充质干细胞的分离

骨髓来源于正常献髓者,将采集到的抗凝骨髓经低糖的DMEM稀释后,用1ml针头沿管壁慢慢注入到1.073g/ml的Percoll淋巴细胞分离液上，使之成为单细胞悬液，2000r/min离心20min。轻轻吸出中间呈白色浑浊状的骨髓间充质干细胞层，放入另一个离心管中，加入PBS，1500r/min离心10min，如此共洗3次。弃PBS，用含10％FCS的L-DMEM培养液制成的细胞悬液进行计数板计数，以1X10⁹/L的细胞数量接种于含青霉素、链霉素各1万U/1O0ml、含10％FCS的L—DMEM培养液的25ml⁶⁰Co照射(照射量5Gy)处理后的细胞培养瓶中，置于5％CO₂、37℃二氧化碳培养箱中培养。48h后首次换液，吸弃未贴壁的悬浮细胞，加入新鲜培养液继续孵育，每3～4d换液。每天倒置相差显微镜下观察MSCs贴壁情况、细胞形态及生长状态。待贴壁细胞80％融合后，弃掉培养液，PBS冲洗瓶壁，0.25％胰酶消化，镜下观察控制2～3min，用含血清培养液终止消化，反复吹打瓶壁，制成单细胞悬液，按1X10⁹/L再次传代，传代培养到第三代备用。

对细胞标记分子进行鉴定，结果如图1所示，鉴定结果显示骨髓间充质干细胞表面抗原CD73,CD90,CD105阳性,CD34,CD45阴性，符合间充质干细胞的特性要求。

实施例2肾癌细胞特异性单克隆抗体的制备

给小鼠腹腔注射人肾癌细胞A498(Solarbio，货号：SCC-110511)细胞1×10⁶，每2周1次，共免疫3次。4周后，于融合前3d腹腔注射5×10⁶。加强免疫1次。将免疫小鼠脾细胞分别与NS-1、SP2/0细胞按10：1在50％PEG2000作用下进行融合。经18％HAT选择培养3d后换用HT培养基，6d后换液为18％完全RPMI1640培养液。每个96孔培养板中，平均有78孔有融合的杂交瘤细胞生长。间接ELISA法筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行亚克隆，共筛选获得420个阳性克隆。

实施例3抑制肾癌细胞增殖的单克隆抗体的筛选

将对数生长期的人肾癌细胞A498按1×10³个接种到96孔板中，培养24h后吸弃培养液，加入3种抗体的杂交瘤上清。培养3d后换液1次，继续培养3d，吸弃上清，每孔加入l0微升CCK-8，测定光密度(D)值。实验以SP2/O细胞培养上清为阴性对照。按照以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(％)＝(对照组D-实验组D)/对照组D×100％。结果如图2所示，有2株株杂交瘤单抗410A，512C抑制人肾癌细胞A498的增殖效果最为显著，其抑制率分别是88.5％，89.2％，提示该2株杂交瘤单抗均是具有特异性识别、并且抑制人肾癌细胞A498增殖的功能性单抗。

实施例4单克隆抗体的纯化

以上述的杂交瘤细胞410A进行小鼠腹水的制备。提前7d给试验的Balb/c小鼠注射1mL的石蜡油，待杂交瘤细胞培养并计数后给小鼠进行腹腔注射，每只小鼠注射不少于1X10⁶个杂交瘤细胞。注射杂交瘤细胞待第五天后，对小鼠进行观察若小鼠腹部己明显变大即可采集腹水，采用抗体常规纯化方法进行纯化，将纯化后的抗体通过BCA试剂盒对纯化蛋白的含量进行测定。纯化抗体结果如表1所示。

表1抗体纯化数据

名称	缓冲体系	浓度mg/ml	体积ml	总量mg	纯度
						410A	0.01MPBS	2.3	5.8	13.34	>96％

实施例5410A单克隆抗体的性能鉴定

利用Fortibio测定抗体结合及解离常数。利用OctetRED(Fortebio,USA)仪器，测定抗410A抗体亲和力。PBS稀释抗体浓度为10μg/mL，包被AHC传感器；PBS为对照，稀释410A浓度为0.1μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、10μg/mL、测定抗410A抗体与肾癌细胞相互作用的结合、解离曲线；利用GlobeFitting拟合曲线，计算两者相互作用的解离常数。结果，本发明获得的单克隆抗体410A抗体其解离常数达到了1.52nM。而且所述抗体与人表皮细胞，血红细胞，正常的肾小管上皮细胞都不结合，具有较好的特异性。

针对410A的单克隆抗体，参照SMARTer RACE试剂盒使用说明书，根据鼠重链和轻链的片段保守区设计下游引物，利用RACE PCR技术，对抗体重链和轻链可变区基因进行扩增和测序。经鉴定，得到抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1和重链可变区序列如SEQ IDNO：2所示。

轻链可变区(SEQ ID NO：1)

DIVIAQSPRLMARSPGEKVAITCSAGGSISTSYADWYQQKSGISPKPPIYSTAPLSGGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEDEDAATQYCVQWSASPGSFGASTKLELK

重链可变区(SEQ ID NO：2)

EVQLEGSSTELARPGASVKASCKASSYIFSSYWSDWIKQRPGQGLEWIGPIYPGDISTRYTQSTGGKATLTADKSSQTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGANQRPVSWALGTTLAVSS

实施例6骨髓间充质干细胞与单克隆抗体联用抑制肾癌细胞侵袭能力

实验分为实验组、对照组1和对照组2和阴性对照组，实验组为骨髓间充质干细胞1×10⁵个/mL+0.1mg/mL的410A单克隆抗体与1×10⁶个/mL A498细胞共培养，阴性对照组为1×10⁶个/mL野生型A498细胞，对照组1为单克隆抗体与1×10⁶个/mL A498细胞共培养，对照组2为骨髓间充质干细胞1×10⁵个/mL与1×10⁶个/mL A498细胞共培养。用50mg/L Matrigel1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。消化共培养后的细胞，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1×10⁴/mL。取细胞悬液200u L加入24孔板Transwell小室。培养32h后用棉签擦去基质胶和上室内细胞，加入4多聚甲醛固定30min，0.5％结晶紫染色10min。使用正置显微镜进行观察和拍照，采用3～5个视野进行细胞计数，并求平均值。结果如表2所示。

表2肾癌细胞侵袭能力抑制结果

组别	细胞个数
		实验组	28.21±4.55
对照组1	35.41±9.63
		对照组2	70.29±16.23
阴性对照组	119.86±13.12

从表2的结果可以看出，骨髓间充质干细胞与410A单克隆抗体的组合能够显著的抑制A498细胞的侵袭能力，其穿过滤膜的细胞数量为28.21±4.55远远少于阴性对照组的119.86±13.12，而单用410A单克隆抗体的穿过滤膜的细胞数量为35.41±9.63同样要好于阴性对照组，当然单用干细胞处理肾癌细胞其穿过滤膜的细胞数量为70.29±16.23，虽然没有抗体的效果显著，但是也能够具有较好的抑制效果。但是总体上看，用干细胞和单抗一起使用具有较好的协同作用，能够显著的抑制肾癌细胞的侵袭能力。

实施例7肾癌细胞的抑制实验

将肾癌细胞进行培养，选择细胞融合率在80％左右时进行细胞传代细胞计数以每孔1000个细胞的标准将细胞均匀接种到3个96孔板中，每孔保持为100u1的培养基；实验组、对照组1和对照组2和阴性对照组，实验组为骨髓间充质干细胞1×10⁵个/mL+0.1mg/mL的410A单克隆抗体与1×10⁶个/mL A498细胞共培养，阴性对照组为1×10⁶个/mL野生型A498细胞，对照组1为单克隆抗体与1×10⁶个/mL A498细胞共培养，对照组2为骨髓间充质干细胞1×10⁵个/mL与1×10⁶个/mL A498细胞共培养。均设计6个复孔设立，做好标记。配置好CCK-8稀释溶液(l0ul/ml，吹打混匀后加入实验组和对照组并在没有细胞的空中设立空白对照组放入培养箱孵育至少4h，保证每天在固定时间，用酶标仪选取在490nm检测细胞的吸光度，连续检测24h,48h,72h数据。将数据空白校准取均值进行统计学分析。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制肾癌细胞生长曲线。结果如图3所示。结果发现，实验组和对照组1以及对照组2均能够抑制肾癌细胞的增殖，而实验组采用干细胞与抗体组合使用后，能够使得肾癌细胞的增殖被显著的抑制，在72h的OD490只有0.050远远小于阴性对照的1.323，具有极大的抑制效果。

序列表

<110> 北京广未生物科技有限公司

<120> 骨髓间充质干细胞和单克隆抗体联合治疗癌症的用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Val Ile Ala Gln Ser Pro Arg Leu Met Ala Arg Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Ala Ile Thr Cys Ser Ala Gly Gly Ser Ile Ser Thr Ser

20 25 30

Tyr Ala Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Pro

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ala Pro Leu Ser Gly Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Asp Glu Asp Ala Ala Thr Gln Tyr Cys Val Gln Trp Ser Ala Ser Pro

85 90 95

Gly Ser Phe Gly Ala Ser Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Glu Gly Ser Ser Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ala Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ser Asp Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Asp Ile Ser Thr Arg Tyr Thr Gln Ser Thr

50 55 60

Gly Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Gln Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ala Asn Gln Arg Pro Val Ser Trp Ala Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

Claims

1.一种药物组合物，其由骨髓间充质干细胞和特异性结合肾癌细胞的单克隆抗体组成。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.由骨髓间充质干细胞和单克隆抗体组成的药物组合物在用于治疗肾癌中的用途；其中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述肾癌是由人肾癌细胞A498导致的。

5.如权利要去3所述的用途，其特征在于还添加本领域常规的癌症治疗剂进行辅助治疗。

6.一种特异性结合肾癌细胞的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。