CN115975035A

CN115975035A - 干细胞和抗体联合治疗癌症的用途

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Publication number: CN115975035A
Application number: CN202210990631.7A
Authority: CN
Inventors: 张晚秋; 赵耀文
Original assignee: Beijing Nuosai International Medical Research Institute
Current assignee: Beijing Nuosai International Medical Research Institute
Priority date: 2022-08-18
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-08-18
Also published as: CN115975035B

Abstract

本发明涉及干细胞和抗体联合治疗癌症的用途。本发明特异性的开发了针对乳腺癌细胞的单克隆抗体，所述抗体具有较好的结合乳腺癌细胞的特性同时具有抑制乳腺癌细胞增殖的效果，将所述单克隆抗体与骨髓间充质干细胞联用具有增强的抑制乳腺癌细胞在小鼠体内增殖的效果，具有较好的应用前景。

Description

干细胞和抗体联合治疗癌症的用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及干细胞和抗体在联合治疗癌症的用途。

背景技术

我国恶性肿瘤发病率和死亡率仍居高不下，同时面临发达国家和发展中国家高发癌谱共存的局面。2000年全球新发癌症病例1010万，死亡620万，癌症现患者2240万。过去10年间，全球癌症的发病及死亡增长了约22％。世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球人口80亿，癌症新发病例将达到2000万，1200万人死于癌症，癌症将成为全球最大的公共卫生问题之一；据测算，中国恶性肿瘤造成的经济损失高达1400多亿元人民币。

目前临床常用的化疗、放疗和手术切除等肿瘤治疗方法，都存在着在杀死癌细胞的同时又会杀伤正常细胞的“弊端”，因此很早就有人提出了对恶性肿瘤“定点清除”或称为“靶向治疗”的新思路，癌症“靶向治疗”的最大好处就在于针对性强、效果显著，在杀伤癌细胞时基本上不损伤正常组织，被认为是未来癌症治疗中最具前景的研究方向。包括肿瘤抗体靶向药物治疗、基因治疗和病毒治疗、细胞载体的靶向治疗等全新的肿瘤靶向治疗方法涌现出来。特别是作为与功能基因组、蛋白质组研究进展密切相关的抗体靶向药物更是得到了快速的发展。

由于抗体技术的发展，至今全球已报道的抗体有10多万种，其中基因工程抗体有1000多种，人源化抗体200多种。目前国际上已有500多种抗体用于诊断与治疗，FDA至今已批准18个抗体上市，其中8个是用于肿瘤治疗的靶向抗体。单克隆抗体之所以颇受青睐，是由于单克隆抗体具有以下难以比拟的技术优势：即它比传统生物药物产品开发过程更快捷，疾病治疗的靶点特异性高、副作用低；患者治疗依从性好，具有携带各种药物或毒素等到达靶目标的能力，以及诱导针对疾病的免疫反应的能力。

越来越多的抗体药物治疗肿瘤的实验研究表明，抗体对肿瘤细胞的选择性杀伤作用；动物试验有更高的疗效或较低的毒性，体内显示特异性分布；与肿瘤相关分子靶点有特异性作用；对抗药性肿瘤细胞有杀伤作用。

抗肿瘤Mab药物一般包括2类:一类是抗肿瘤Mab,这些Mab所针对的靶点通常为肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体；另一类是抗肿瘤Mab偶联物,或称免疫偶联物(Immunoconjugate),免疫偶联物由Mab与抗肿瘤物质(放射性核素、毒素和药物)2部分构成,其中与放射性核素连接者称放射免疫偶联物,与毒素连接者称免疫毒素,与药物连接者称化学免疫偶联物。这类抗肿瘤Mab本身如果能够抑制癌干细胞的增殖就可以避免后续花费大量的资源去研发偶联物。

干细胞(stemcell)是机体内存在的一类特殊细胞，它们具有自我更新及多向分化潜能。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)是由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外培养而筛选出的细胞，具有发育全能性，理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞。成体干细胞是存在于已经分化组织中的未分化细胞，能够自我更新并特化形成该类型组织。例如，造血干细胞(haematopoieticstemcell，HSC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、神经干细胞、内皮干细胞及骨骼肌干细胞等。ESC由于培养获得需破坏胚胎而受到伦理学限制，还没有用于临床。目前，可应用于癌症治疗的干细胞有HSC和MSC。

MSC是一类来源于中胚层的、具有自我更新及多向分化潜能的干细胞，在体外能够分化为多种细胞，如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。与HSC的研究相比，对MSC的研究起步较晚，但发展很快。研究发现，MSC可以定向归巢到肿瘤细胞并在肿瘤组织中存活和增殖，在体外对MSC进行基因修饰后注入体内，能够归巢到肿瘤基质而杀死肿瘤细胞，这一特点使MSC成为了抗肿瘤治疗的极好的细胞载体。

研究发现MSC可直接抑制乳腺癌细胞生长。在小鼠乳腺癌模型中发现MSC能抑制乳腺癌细胞生长及肺转移，机制是MSC诱导肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞内细胞凋亡相关因子细胞凋亡蛋白酶3的表达增加。也有研究证实，MSC与肿瘤细胞接触时，可通过抑制靶细胞磷脂酰肌醇-3-激酶和Akt信号途径中的Akt蛋白激酶活性，而直接抑制肿瘤细胞生长。此外，MSC还可分泌Wnt通路抑制因子Dickkopf-1抑制肿瘤细胞的增殖。也有研究表明，在成瘤后的MDA-MB-231人乳腺癌的瘤组织内分次注射等数量的MSCs，利用分子成像技术检测到CD31的表达在MSCs治疗组中表达减少，且肿瘤的凋亡指数在该组明显增加，MSCs可能通过抑制血管生成及促进肿瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤生长。成瘤后再输入MSCs多表现出抑制肿瘤血管生成，MSCs输入的时机可能影响其对肿瘤血管生成的影响。从以上研究可以发现，MSCs可以用于癌症的治疗。

虽然目前针对癌症治疗的研究很多，但是将特异性单克隆抗体与MSCs一起联用目前报道的还很少。如果能获得特异性靶向癌干细胞的功能性单克隆抗体，并与干细胞治疗方案联合，建立以癌干细胞为靶点的分子靶向治疗新方案，将为靶向癌干细胞治疗癌提供抗体候选药物和治疗方案。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种特异性针对乳腺癌细胞的单克隆抗体及使用该抗体用于治疗乳腺癌的药物。

本发明一方面，提供了一种特异性针对乳腺癌细胞的单克隆抗体1F9，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。

轻链可变区：

DIVITQRPALMAASPGEKVTITCKEIIKYMKDQQHWYQQKSGISPKPWIYHDPVQGMGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCGVQTYVFLDFGAGTKLELK

重链可变区：

EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSCRMMIWIKQRPGQGLEWIGHERRKYHARVQRPDWCGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGASVDHDEWGLGTTLAVSS。

在具体实施方案中，所述抗体可以特异性地结合具有亲和力的结合乳腺癌细胞(例如，通过KD)不不大于5.0×10^-6M，不大于1.0×10^-7M，不大于5.0×10^-7M，不大于1.0×10^-8M，不大于5.0×10^-8M，或不大于1.0×10^-9M，不大于5.0×10^-9M。KD可以例如通过使用已知方法用感兴趣抗体及其抗原的Fab版本进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量。

进一步的，所述抗体还可以用检测乳腺癌，所述抗体标记有可检测标记。

进一步的，所述可检测标记为：可检测分子(也称为可检测标记)，其直接或间接缀合至第二分子，例如抗体，以促进第二分子的检测。例如，可检测标记能够通过ELISA，分光光度法，流式细胞术，显微镜或诊断成像技术(例如CT扫描，MRI，超声，纤维光学检查和腹腔镜检查)进行检测。可检测标记物的具体，非限制性例子包括荧光团，化学发光剂，酶键，放射性同位素，核酸(例如DNA条形码)和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。在一个实施例中，“标记抗体”是指在抗体中掺入另一个分子。例如，标签为可检测标签，例如掺入放射性标记的氨基酸或生物素基部分与多肽的连接，所述生物素基部分可通过标记的亲和素(例如，含有荧光标记的链霉亲和素或可通过光学或比色法检测的酶活性)检测。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的，并且可以使用。

还提供了药物组合物，例如用于治疗或抑制乳腺癌细胞的增殖。在一些实施方案中，药物组合物包括治疗有效量的本文公开的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

还提供了本文所公开的单克隆抗体或含有所述抗体的药物组合物在治疗，预防或诊断受试者中的乳腺癌中的用途。

用于给药的组合物可包括溶解在药学上可接受的载体中的乳腺癌特异性抗体的溶液。可以使用各种含水载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些组合物可通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌。所述组合物可根据需要包含药学上可接受的辅助物质以近似生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂等，例如乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。这些制剂中抗体的浓度可以有很大的变化，并且主要根据所选择的特定给药方式和受试者的需要，根据流体体积，粘度，体重等来选择抗体的浓度。

用于静脉内给药的典型组合物包括每天每个体约0.01至约30mg/kg的抗体或抗原结合片段或缀合物(或包括抗体或抗原结合片段的缀合物的相应剂量)。制备可给药组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的。在一些实施例中，该组合物可以是包含一种或多种抗体的液体制剂，抗原结合片段(例如特异性结合乳腺癌的抗体或抗原结合片段)，在约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度范围内，或约0.5mg/ml-约20mg/ml，或约1mg/ml-约20mg/ml，或约0.1mg/ml-约10mg/ml，或约0.5mg/ml-约10mg/ml，或约1mg/ml-约10mg/ml。

进一步的，本发明还提供了乳腺癌单克隆抗体和骨髓间充质干细胞在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物组合物中的用途。

所述乳腺癌细胞是MCF-7细胞。

有益效果

本发明特异性的开发了针对乳腺癌细胞的单克隆抗体，所述抗体具有较好的结合乳腺癌细胞的特性同时具有抑制乳腺癌细胞增殖的效果，将所述单克隆抗体与骨髓间充质干细胞联用具有增强的抑制乳腺癌细胞在小鼠体内增殖的效果，具有较好的应用前景。

附图说明

图1单抗对MCF-7生长的抑制作用效果图

图2单抗对微球体形成的影响结果图

图3单抗单独或联合骨髓间充质干细胞裸鼠体内抑瘤效果图

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1乳腺癌细胞特异性单克隆抗体的制备

免疫细胞：MCF-7细胞(货号：HTX1646，深圳市豪地华拓生物科技有限公司)。

细胞培养：MCF-7用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM-F12培养液，在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化、传代。实验选用对数生长期细胞。

BALB/c小鼠，用PBS缓冲液将MCF-7细胞浓度稀释为单次剂量为10⁷，加入相等体积弗氏完全佐剂用注射器反复抽吸达到“油包水”状态。取3只4-6周龄的BALB/c雌鼠做好标记，腹腔注射10⁷剂量进行初次免疫；两周后，同等体积弗式不完全佐剂用注射器反复抽吸达到“油包水”状态，以同样剂量、同样方法再次免疫小鼠。每次间隔2周，免疫方法与第一次免疫相同，一共进行三次免疫。达到免疫效价的小鼠在做细胞融合的前3天，进行脾脏加强免疫，剂量5*10⁶/只。将免疫小鼠脾细胞分别与NS-1、SP2/0细胞按10：1在50％PEG2000作用下进行融合。经18％HAT选择培养3d后换用HT培养基，6d后换液为18％完全RPMI1640培养液。

间接ELISA法筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，96孔培养板中，74孔有融合的杂交瘤细胞生长，挑选A值较高的2个单集落(如表1所示)进行克隆。各经过3次亚克隆后，克隆阳检率均达100％，克隆分别是1F9、4D21。

表1间接ELISA检测单抗阳性率(空白对照为0.016)

抗体编号	1F9	4D21
			OD值	1.9986	1.9921

1F9、4D21单克隆抗体的制备：选取6周龄以上的BALB/c雄鼠，在接种杂交瘤细胞1周前，给小鼠腹腔液注射0.5mL的液体石蜡。分别收集生长状态良好的1F9、4D21杂交瘤细胞，离心去上清，用无血清培养液洗涤1次，重悬于无血清培养液中，调整细胞密度为2×10⁶个/mL，独立的分别在每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液。10d后，可见小鼠腹部明显膨大，消毒腹部皮肤，用注射器刺入腹腔抽取腹水。2500r/min离心10min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，于冰水混合物中化冻，以1:1比例缓慢加入饱和硫酸铵溶液，边加边混匀直到出现白色沉淀。1000r/min离心10min，去掉上清，沉淀用一定体积的PBS(pH7.45)溶液溶解，移至透析袋中，以20倍体积结合缓冲液(Protein ASefinose(TM)Kit中提供)透析以除去高浓度离子，蛋白A亲和层析获得纯化蛋白。BCA蛋白定量试剂盒鉴定2个纯化后的单克隆抗体1F9、4D21的浓度分别是0.521mg/mL，0.642mg/mL。将所述纯化后的抗体分装，-20℃保存备用。

组织细胞学交叉反应鉴定单抗特异性：运用细胞爬片法进行组织细胞学交叉反应性检测，光镜下观察2个抗体分别与人上皮细胞、MCF-7细胞、Hela细胞、CW-2细胞、LoVo细胞的交叉反应，结果显示，2个抗体与MCF-7细胞呈阳性反应，而与其他正常细胞或者癌细胞均呈阴性反应，表明这2个抗体具有较好的特异性。

实施例2单克隆抗体亲和力鉴定

以Friguent法测定亲和力常数：(1)包被：CB液稀释MCF-7细胞至浓度为10⁵，每孔100μL，4℃过夜。洗板1次。(2)封闭：200μL ED封闭液，37℃放置2h。洗板5次。(3)一抗：本发明的二个抗体初始浓度为50ng/mL，抗原初始浓度为10⁵/mL，然后倍比稀释，共做8个梯度，抗原抗体混合37℃放置1h。加入上述反应液，每孔100μL，37℃放置1h。洗板5次。(4)二抗：HRP-羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃放置1h。洗板5次。(5)显色：加入100μLTMB底物显色液，37℃避光显色10min；(6)终止：加入50μL终止液终止反应；(7)比色：450nm/630nm双波长测定各孔的OD值。计算方法：(1)先求出每个抗原浓度梯度OD值的平均值；(2)算出B值，其中B＝(A0-Ai)/A0(A0：抗原浓度为0时的OD，Ai:每个浓度梯度的OD)；(3)求出1-B，算出B/(1-B)的值；(4)用抗原浓度i对B/(1-B)做散点图，拟合直线求出斜率，其斜率即为亲和力常数。结果如下表2所示。

表2各株抗体的相对亲和力测定结果

抗体编号	1F9	4D21
			相对亲和力(nM)	9.83±0.23	6.27±0.17

从表2的结果可以看出，本发明筛选获得的2株单克隆抗体具有较好的亲和力。

实施例3单克隆抗体1F9轻重链序列鉴定及亚型鉴定

提取杂交瘤细胞总RNA，逆转录合成cDNA，采用如下引物进行扩增：

引物序列为：重链：上游引物：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTFGGCCCCAGAGGTGCAACTGCAGCAGTCAGG-3’，下游引物为5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’(S/M/R是碱基兼并码)。轻链：上游引物：5’-GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC-3’，下游引物：5’-GCGCCGTCTAGAATFAACACTCATTCCTGTTGAA-3’。将扩增产物进行克隆后进行基因测序，对可变区基因序列进行分析，分别制备获得抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。

轻链可变区：

重链可变区：

同时，使用小鼠单克隆抗体亚型鉴定ELISA检测试剂盒，鉴定了1F9单克隆抗体为IgG抗体，且为IgG1亚型。

实施例4 1F9单抗抑制乳腺癌细胞增殖实验

MTT法检测细胞增殖：取对数生长期的MCF-7，以1×10⁴个接种96孔板，加入200μL培养液，置于37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养。24h细胞贴壁后，换无血清培养液，细胞饥饿24h。加入含有1F9单抗的培养液，设浓度梯度，使其终浓度分别为0、1、10、20、50、100、200μg/mL，每组均设3个重复孔，每3天更换含1F9的培养液，培养9d。培养结束前4h，各孔加入20μL MTT(5mg/mL)继续培养。弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min后，酶标仪检测各孔的光密度(D570nm)，以不加单抗的阴性对照组D570nm均数作为对照，上述实验重复3次。细胞增殖抑制率计算公式：增殖抑制率(％)＝(1一实验组D570nm/对照组D570nm)×100％。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，IF9单抗对MCF-7生长的抑制作用随着单抗质量浓度增加，MCF-7增殖抑制率明显上升。当单抗质量浓度达到20μg/mL时，MCF-7增殖抑制率约为66.3％(图1)。

实施例5 1F9单抗对微球体形成的影响

取处于对数生长期的MCF-7制备单细胞悬液，取1×10⁴个细胞，用含有20ng/mLEGF、10ng/mL bFGF、5％B27和5μg/mL胰岛素含或不含质量浓度为20μg/mL的单抗无血清DMEM/F12培养液，在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养12d，每3天半量换液并观察微球体形成情况及大小。根据培养液中是否加入单抗，分为阴性对照组和单抗组，另设置多西他赛阳性对照组(20μg/mL)。在微球体培养第l2天时分别计数3组微球体数量。微球体形成率(MFE)＝微球体个数/接种的单个细胞数。结果如图2所示。

从图2的结果可以看出，1F9单抗组以及阳性对照组的MFE明于对照组低(P<O.01)；单抗组MFE只有(0.72±0.15)％(图2)。而且在培养到13d时，观察单抗以及阳性对照组组形成的微球体明显小于对照组，这说明单抗和阳性药物能够有效的抑制微球体的形成及生长。更加说明单抗不仅对MCF-7有抑制作用，而且对MCF-7形成的微球体有更加明显的抑制作用。

实施例6 1F9单抗单独或联合骨髓间充质干细胞裸鼠联合实验

人骨髓间充质干细胞(hBMSC)，货号：PC-045h,武汉赛奥斯生物科技有限公司。

取对数生长期MCF-7细胞.PBS洗涤3次.重悬于PBS中并调整浓度为6x10⁷m1于每只裸鼠右侧腹股沟皮下注射0.2ml细胞悬液.观察成瘤情况。成瘤(瘤体长径>0.5cm)后开始治疗，裸鼠随机分为5组，每组10只A组：1F9单抗(1mg)组，B组：hBMSC细胞(1x10⁹/ml，1m1)，C组：1F9单抗(1mg)+hBMSC细胞(1x10⁹/ml，1m1)组，D组(对照组)：0.9％NaC1溶液1.5m1；E组(阳性对照组)：1mg多西他赛；均为尾静脉注射。每7d重复治疗1次，共治疗4次，第四次给药后的第7d处死裸鼠，剥离瘤体，称量瘤体质量。抑瘤率：{(对照组瘤体质量-治疗组瘤体质量)/对照组瘤体质量}x100％，结果如图3所示。

从图3的结果可以看出，单抗、阳性对照组和单抗联合hBMSC均可以有效的抑制肿瘤生长，特别是1F9单抗+hBMSC细胞与hBMSC相比效果提高显著(P<O.01)，1F9单抗+hBMSC细胞组的抑瘤率达到了(91.6±2.08)％。单抗本身的抑瘤效果也比阳性对照组的效果要好，证明了本发明具有较好的应用前景。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。

Claims

1.一种乳腺癌细胞的单克隆抗体1F9，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。

2.乳腺癌细胞的单克隆抗体1F9和骨髓间充质干细胞在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物组合物中的用途；其中，乳腺癌细胞的单克隆抗体1F9，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。

4.如权利要求3所述的用途，其中药学上可接受的载体包括pH调节剂和缓冲剂。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述缓冲剂选自乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙或乳酸钠。