CN105017425A

CN105017425A - 抗her2中和活性单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN105017425A
Application number: CN201410183637.9A
Authority: CN
Inventors: 孙乐; 张翠娟; 张小刚; 孙哲; 樊贵宝; 王炜; 张萍萍
Original assignee: AbMax Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Abmax Biopharmaceuticals
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2034-04-30
Also published as: WO2015165368A1; CN105017425B

Abstract

本发明提供一种抗HER2(人表皮生长因子受体2)中和活性单克隆抗体及其应用。结合蛋白信息学与免疫学，设计合成含有HER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得多株杂交瘤细胞分泌可以特异性识别乳腺癌细胞表面HER2且具有中和活性的单克隆抗体。本发明的单抗与HER2结合的亲和力介于1-4nM，结合到肿瘤细胞表面的HER2后，能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，成为非常理想的生物靶向治疗抗体。

Description

抗HER2中和活性单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域及抗体制备技术，具体地说，涉及抗HER2中和活性单克隆抗体及其应用。

背景技术

人表皮生长因子受体2(HER2)是表皮生长因子受体(ErbB2)家族中的一员，是相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，HER2阳性(过表达或扩增)的乳腺癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。作用于HER-2靶点的药物，是目前治疗乳腺癌最常用最有效的药物，主要有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等。

基因泰克公司早在1997年就上市了第一个针对乳腺癌标志物HER2的抗体药物赫赛汀，每年销售额可达50多亿美元，目前成为仿制药的热点。2012年基因泰克又推出一种针对HER-Domain2位点的抗体药，与赫赛汀联合使用治疗效果更佳。2013年3月，基因泰克又上市了赫赛汀和药物DM1偶联物，对癌症晚期病人也有非常好的疗效。

发明内容

本发明的目的是提供抗HER2中和活性单克隆抗体及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的提供两个抗HER2中和活性单克隆抗体，分别命名为clone6B2和clone4G8。

抗HER2中和活性单克隆抗体clone6B2，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

抗HER2中和活性单克隆抗体clone4G8，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还分别提供产生单克隆抗体clone6B2、clone4G8的杂交瘤细胞。

本发明还提供抗HER2中和活性单克隆抗体clone6B2和clone4G8的制备方法，以HER2为靶蛋白，设计合成含有HER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得。其中，所述多肽的氨基酸序列为：PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG。

本发明还提供所述单克隆抗体clone6B2和clone4G8在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。

本发明进一步提供含有所述单克隆抗体clone6B2和/或clone4G8的药物、检测试剂、试剂盒。

具体地，本发明提供针对与Herceptin识别表位不同的人表皮生长因子受体2(HER2)单克隆抗体以及产生所述单抗的杂交瘤细胞系。

使用可以诱发机体产生免疫反应并生成具有中和效应抗体的多肽序列，偶联至KLH载体蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗HER2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。

优选地，上述多肽序列选自HER2：

含有PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG

由多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性地识别HER2蛋白的多肽序列，共筛选出82个阳性克隆，复筛获得15个阳性克隆，进一步中和活性试验筛选出2个阳性克隆，将这两个单克隆抗体分别命名为clone6B2和clone4G8。

所述clone6B2和clone4G8具有良好的亲和力，实验表明，clone6B2和clone4G8与HER2阳性细胞SK-BR-3细胞的亲和力EC50为1-4nM。能够结合到SK-BR-3细胞表面HER2，有效地抑制乳腺癌细胞的增殖生长，可以成为非常理想的生物靶向治疗抗体。

另外，本发明的单克隆抗体识别的是HER2胞外区Domain2中的一个线性表位，比用HER2胞外区Domain2免疫小鼠获得的帕妥珠单抗的位点更清晰，与Hercetpin治疗性单抗药的识别HER2表位完全不同，可以与赫赛汀联合用药，增强治疗效果，在乳腺癌的治疗中有着广阔的前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中通过间接ELISA法筛选识别HER2的阳性克隆，其中筛选了700个克隆，阳性克隆395个，挑选较好的82个阳性克隆进行下一步复筛。

图2为本发明实施例2中单抗的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白分子量标准，6B2和4G8分别为本发明获得的两个单克隆抗体clone6B2和clone4G8。

图3为本发明实施例2中两个克隆的亚型鉴定图；其中，clone6B2显示IgG2b信号最强，clone4G8显示IgG2b同样信号最强，依据亚型鉴定试剂盒说明中结果判定标准，clone6B2及clone4G8的亚型为IgG2b。

图4为本发明实施例3中两个克隆结合SK-BR-3细胞流式细胞仪检测图；其中，clone6B2和clone4G8明显能够结合到SK-BR-3细胞表面。

图5为本发明实施例4中两个克隆结合SK-BR-3细胞且抑制其增殖的增殖曲线图；其中，clone6B2的抑制效果达到40％，显示良好的中和活性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1产生clone6B2、clone4G8的杂交瘤细胞系的建立

一、实验材料

1、免疫原：以HER2作为靶蛋白，从中选取一段多肽序列，序列如下：PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG

采用化学合成的方式制备上述多肽，纯度要求大于90％。将多肽与KLH偶联制备成免疫原。

2、培养基：DMEM培养基购自Hyclone公司，HAT、HT选择培养基、降植烷购自sigma公司。

3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。

4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自Sigma公司，PEG4000购自Fluka公司，HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购自JacksonImmune公司，其余试剂均为国产分析纯产品。

二、杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫

1)基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg。

2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150ug抗原的生理盐水溶液。

2、杂交瘤细胞的制备

按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10-15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗HER2抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200μl的HER2包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG100μl，最后测定450nm OD值。OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。共获得了395个阳性克隆，从中挑选出82个较好的阳性克隆。(图1)

3、杂交瘤细胞系的建立

经过4次亚克隆和间接ELISA或细胞ELISA筛选，得到15株分别针对HER2，识别SK-BR-3细胞的稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。(表1)

4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测

1)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1：500000-1：1000000。

2)纯化抗体效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的纯化抗体效价为：0.05-10ng/ml。

5、杂交瘤细胞系的传代培养

将上述杂交瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。

以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗HER2的单克隆抗体。

获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。因此必须冷藏保存一部分。保存方法如下：

1.材料

(1)细胞：取对数生长期的细胞。

(2)10％二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌)：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI-1640液。

(3)20％FCS-1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

(4)灭菌的2ml安瓶等。

2.操作方法

(1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS-1640液，使细胞悬浮。

(3)1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×10⁷细胞/ml。

(3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。

(4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml-1.0ml，熔封安瓶。

(5)放4℃2h。

(6)放液氮罐气态部分(-70℃)15h。

(7)转入液氮部分。

实施例2抗HER2的单克隆抗体的制备

一、抗体制备

选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种第16代杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶-2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。

将腹水离心(13000r/min30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G～Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH2.7，20mM的甘氨酸缓冲液，得到抗HER2的单克隆抗体。

二、抗体的鉴定

1、抗体纯度鉴定：

SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95％以上。(图2)

2、抗体类及亚类鉴定：

采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗体的Ig亚型，结果显示，clone6B2和clone4G8均为IgG2b(图3)。

3、克隆6B2和克隆4G8的可变区序列测定

将两个克隆的细胞提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。单抗clone6B2和clone4G8的可变区氨基酸序列：clone6B2的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。clone4G8的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。将该序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列为两个克隆各自特异的序列。

实施例3纯化抗体的亲合力实验

一、细胞ELISA法

应用clone6B2和clone4G8抗体做细胞亲和力试验，确定其与HER2阳性SK-BR-3细胞的结合EC50值。(表2)

检测方法：第一天进行SK-BR-3细胞铺板准备，选取生长良好的SK-BR-3细胞，无菌PBS洗3次，加入0.1％的胰蛋白酶消化细胞1-3分钟，加入含10％FBS的DMEM培养基5ml，离心后收获细胞，细胞计数后调成1×10⁵/ml，每孔200μl铺于96孔中，过夜培养。次日，去掉细胞培养上清后，PBS洗2次，加入95％的酒精固定15min。固定细胞后，无菌水清洗细胞2次后加入200μl/孔5％的脱脂牛奶封闭1h。PBS清洗3次后，加入梯度稀释的Clone6B2，Clone4G8，37℃孵育1h后,PBS清洗3次后加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的鼠二抗(1:2000)孵育1h后，PBS清洗5次(前三次5min，最后2次10min)加入显色剂显色15min上机检测OD₄₅₀。

其中显色剂A液配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na₂HPO₄·12H₂O，吐温-20100μL，pH5；B液配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。

检测clone6B2和clone4G8的EC50值皆达到1.3nM，显示较高的亲和力。

二、流式细胞仪检测

细胞准备：取对数期生长的SK-BR-3细胞，吸除细胞上清，5-10mlPBS清洗一次。加入2ml0.1％胰酶37℃消化5min，加入含10％FBS的DMEM终止消化，1400转离心3min收集细胞。加入无胎牛血清的DMEM清洗细胞三次后，PBS重悬细胞后1400转离心3min收集细胞，加入20ug/ml抗体后4℃孵育1h。1400转离心3min收集细胞，PBS清洗细胞三次后，加入FITC标记鼠二抗(1:100)4℃孵育30min后，400转离心3min收集细胞。PBS清洗三次后，上流式细胞仪检测收集荧光信息。

检测如图4所示，clone6B2和clone4G8能够结合SK-BR-3细胞上的HER2。

实施例4纯化抗体的中和活性检测

一、抑制高表达HER2细胞SK-BR-3细胞的增殖

细胞准备：

取对数期生长的SK-BR-3细胞，吸除细胞上清，5-10ml PBS清洗一次。加入2ml0.1％胰酶37℃消化5min，加入含10％FBS的DMEM或F-12终止消化，1400转离心3min收集细胞。加入8ml含10％FBS的DMEM稀释细胞，台盼蓝细胞计数法计数细胞，并用含10％FBS的DMEM稀释细胞成2×10⁴/ml。96孔板中每孔铺入100μl即2000/孔，37℃，5％CO₂贴壁培养4h。

检测样本：

在无菌EP管中，不同浓度抗体加入到细胞孔中，每孔100μl。继续培养4d，期间观察细胞的生长。去除细胞培养上清，加入配制好的CCK-8(按1:10的比例与DMEM混合)100μl37℃，5％CO₂继续培养1-4h。在酶标仪中读取OD₄₅₀。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

检测结果如图5所示，clone6B2和clone4G8能够结合SK-BR-3细胞且抑制其增殖，其中clone6B2抑制SK-BR-3细胞的增殖达到40％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.抗HER2中和活性单克隆抗体clone6B2，其特征在于，

i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

2.产生权利要求1所述单克隆抗体clone6B2的杂交瘤细胞。

3.权利要求1所述单克隆抗体clone6B2的制备方法，其特征在于，以HER2为靶蛋白，设计合成含有HER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得；

所述多肽的氨基酸序列为：PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG。

4.权利要求1所述单克隆抗体clone6B2在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。

5.含有权利要求1所述单克隆抗体clone6B2的药物、检测试剂或试剂盒。

6.抗HER2中和活性单克隆抗体clone4G8，其特征在于，

i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及

7.产生权利要求6所述单克隆抗体clone4G8的杂交瘤细胞。

8.权利要求6所述单克隆抗体clone4G8的制备方法，其特征在于，以HER2为靶蛋白，设计合成含有HER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得；

所述多肽的氨基酸序列为：PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG。

9.权利要求6所述单克隆抗体clone4G8在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应用。

10.含有权利要求6所述单克隆抗体clone4G8的药物、检测试剂或试剂盒。