CN102695722A - 对错误折叠的朊病毒蛋白具有特异性的抗体和表位 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对错误折叠的朊病毒蛋白(PrP，例如PrPSc)具有特异性的抗体和免疫原性肽及其用途。所述免疫原性肽包含酪氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸(YML)氨基酸序列。所述抗体或肽可用于治疗或预防与错误折叠的PrP相关的疾病或病症，包括癌症。特别地，使用由GGYMLGS序列(即SEQ ID NO 8)组成的肽(其对应于识别错误折叠PrP但不识别正常PrP的人PrP 1A1的126至132位残基)产生了名为“1A1”的IgM单克隆抗体。
Description
发明领域
本发明涉及对错误折叠的朊病毒蛋白具有特异性的抗体和表位。更具体地，本发明提供对错误折叠的朊病毒蛋白的YML表位具有特异性的抗体和表位。
发明背景
朊病毒病(例如，克罗伊茨费尔特-雅各布病、牛海绵样脑病、瘙痒病，以及鹿和马鹿的慢性萎缩病)一般特征为正常的细胞朊病毒蛋白(PrPC)由模板指导转变成异常的蛋白酶抗性同工型(PrPSc)。一些朊病毒病可以是遗传性的，并且可在PNRP基因中包含突变，而另一些则是偶发性的或感染性的。已经鉴定了多种可遗传形式的突变，并且所述突变可致使PrPC更易于转变成异常且与疾病相关的PrPSc形式。
PNRP基因的翻译产物一般由253个(在人中)、254个(在仓鼠中)或256个(在绵羊中)氨基酸组成，并且可发生若干翻译后修饰(例如，Pucket，C.等，Am.J.Hum.49：320-329(1991))。例如，在仓鼠中，在N端切除22个氨基酸的信号肽，添加糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定后从C端去除23个氨基酸，以及将连接天冬酰氨的寡糖附着到以二硫键形成的环的181和197位残基上(例如，Stahl，N.等，Biochemistry 29：5405-5412(1990)；Safar，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6377，(1990))。在朊病毒相关的脑病中，PrPC(正常的细胞同工型)转变成名为PrPSc的改变形式，后者可基于例如一个或多个以下特征而在实验上将其与PrPC区分开：(1)PrPSc在生理溶剂中不能溶解，而是形成聚集体；(2)PrPSc对蛋白酶K的蛋白水解降解具有部分抗性，因为在PrPC完全降解的条件下蛋白酶K消化仅除去了N端～67个氨基酸，产生称为PrP27-30的N端截短形式；(3)PrPSc在蛋白质构象上有改变，从PrPC的α-螺旋变成了富含β-折叠片二级结构的改变形式(例如，Cohen等Science264：530-531(1994))。
结构在PrPC到PrPSc同工型的转变中起作用，这是众所周知的，然而PrPSc同工型的详细结构细节了解得比较晚，这一部分是因为与PrPSc聚集体的增溶作用和无序结构相关的困难。在人PrPC中，结构元件包括β链1(128-131位残基)、α螺旋1(144-154位残基)、β链2(161-164位残基)、α螺旋2(173-194位残基)和α螺旋3(200-228位残基)(Riek等，1996，Nature 382：180；Zahn 2000，Proc.Natl Acad.Sci 97：145-150)。Knaus等，2001(Nature Structural Biology 8：770-774)通过描述朊病毒蛋白中经过一些结构元件的相互作用和重排进行寡聚化的可能机制而增进了这一认识。
因为PrPC和PrPSc同工型具有相同的氨基酸序列，所以在健康个体中刺激免疫应答或提供与两种同工型均相互作用的治疗剂可能至少是无效的，并可能对受试者有害。已经报道，朊病毒蛋白的正常细胞同工型(PrPC)免疫原性很弱。此外，已经报道，尽管对PrPC具有偏好反应性的抗体干扰朊病毒在体外和体内的繁殖，但这种基本普遍的细胞表面蛋白的免疫识别可能是有害的。
疾病中朊病毒蛋白的转变与某些细胞表面表位的丢失以及其他表位的获得相关。Paramithiotis等(Nat Med 20039：893-899)描述了三肽基序YYR。US 7041807描述了哺乳动物朊病毒蛋白的YYR表位的抗体，并讨论了YYX表位。US 6765088讨论了牛PrP的片段的抗体。US5846533描述了对PrPSc蛋白具有特异性的抗体，其通过噬菌体展示方法产生。
发明概述
本发明的一部分提供对错误折叠的朊病毒蛋白具有特异性的抗体和表位，例如对错误折叠的朊病毒蛋白的YML表位具有特异性的抗体和表位。
一方面，本发明提供与错误折叠的PrP中的YML表位结合的抗体或其片段。
在一个实施方案中，所述抗体选择性结合PrPSc。
在一个实施方案中，所述抗体不特异性结合PrPC。
在一个实施方案中，表位存在于选自以下的一个或多个序列中：GGYMLGS、GGYMLG、GYMLGS、GGYML、YMLGS、GYML和YMLG(SEQ ID NO：8-14)。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA。
在一个实施方案中，可通过培养在加拿大国际保藏机构(International Depositary Authority of Canada)以登录号260210-01保藏的杂交瘤来产生所述抗体。
另一方面，本发明提供免疫缀合物，其包含与错误折叠的PrP的YML表位结合的抗体或其片段，以及与之缀合的选自一种或多种检测标记和细胞毒素的试剂。
另一方面，本发明提供针对与错误折叠PrP选择性结合的抗体的免疫原性肽，所述肽包含YML序列。
在一个实施方案中，所述肽可用于产生选择性结合错误折叠的PrP的抗体，所述错误折叠的PrP选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：14序列中的一个或多个。
在一个实施方案中，所述肽不是全长PrP蛋白质。
在一个实施方案中，所述肽可进一步包含免疫原性载体，以增强所述肽的免疫原性。
另一方面，本发明提供组合物，其包含与错误折叠的PrP的YML表位结合的抗体或其片段。
另一方面，本发明提供包含免疫缀合物的组合物，所述免疫缀合物包含与错误折叠PrP的YML表位结合的抗体或其片段，以及与之缀合的选自一种或多种可检测标记和细胞毒素的试剂。
另一方面，本发明提供包含针对抗体(其选择性结合错误折叠PrP)的肽的组合物，所述肽包含YML序列。在另一实施方案中，所述肽可选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14序列中的一个或多个。
在一个实施方案中，所述肽可进一步包含免疫原性载体，以增强所述肽的免疫原性。
在一个实施方案中，所述组合物可以是药物组合物。
在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含药物载体。
另一方面，本发明提供所述抗体或其片段、所述免疫缀合物、所述肽或所述组合物用于治疗与错误折叠PrP相关的疾病或病症的用途。
另一方面，本发明提供包含所述肽或免疫缀合物的疫苗用于治疗与错误折叠PrP相关的疾病或病症的用途。
另一方面，本发明提供所述抗体或其片段、所述免疫缀合物、所述肽或所述组合物用于治疗PrPSc相关疾病或病症的用途。
另一方面，本发明提供包含所述肽或免疫缀合物的疫苗用于治疗PrPSc相关疾病或病症的用途。
在一个实施方案中，所述疾病或病症可选自Gerstmann-
-Scheinker病(GSS)、家族性克罗伊茨费尔特-雅各布病、偶发性克罗伊茨费尔特-雅各布病、医源性克罗伊茨费尔特-雅各布病、变型克罗伊茨费尔特-雅各布病、致命性家族性失眠症、瘙痒病、库鲁病、海绵状脑病、传染性水貂脑病、慢性萎缩病、猫科海绵状脑病和外来有蹄类脑病。
另一方面，本发明提供所述抗体或其片段、所述免疫缀合物、所述肽或所述组合物用于治疗包含表达错误折叠PrP之致瘤细胞的肿瘤的用途。
另一方面，本发明提供包含所述肽或免疫缀合物的疫苗用于治疗包含表达错误折叠PrP之致瘤细胞的肿瘤的用途。
在一个实施方案中，所述肿瘤可具有YML+表型。
另一方面，本发明提供治疗或预防与错误折叠PrP相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的所述抗体或其片段、所述免疫缀合物、所述肽或所述组合物。
另一方面，本发明提供对患有与错误折叠PrP相关的疾病或病症或有患病风险的受试者进行免疫的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的包含所述肽的疫苗。
在一个实施方案中，所述疾病或病症与PrPSc相关。
在一个实施方案中，所述疾病或病症选自Gerstmann-
-Scheinker病(GSS)、家族性克罗伊茨费尔特-雅各布病、偶发性克罗伊茨费尔特-雅各布病、医源性克罗伊茨费尔特-雅各布病、变型克罗伊茨费尔特-雅各布病、致命性家族性失眠症、瘙痒病、库鲁病、海绵状脑病、传染性水貂脑病、慢性萎缩病、猫科海绵状脑病和外来有蹄类脑病。
另一方面，本发明提供治疗包含表达错误折叠PrP之致瘤细胞的肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的所述抗体或其片段、所述免疫缀合物、所述肽或所述组合物。
在一个实施方案中，所述肿瘤可具有YML+表型。
另一方面，本发明提供杂交瘤细胞系，其产生与错误折叠的PrP的YML表位结合的单克隆抗体。
在一个实施方案中，所述错误折叠的PrP是PrPSc。
在一个实施方案中，所述杂交瘤细胞系是International DepositaryAuthority of Canada在登录号260210-01下保藏的杂交瘤，及其后代和衍生物。
在另一实施方案中，所述YML表位存在于序列GGYMLGS、GGYMLG、GYMLGS、GGYML、YMLGS、GYML和YMLG(SEQ IDNO：8-14)中。
另一方面，本发明提供检测生物样品中错误折叠的PrP的方法，其包括：(a)使生物样品与所述抗体或其片段或所述免疫缀合物在在允许所述抗体或所述免疫缀合物与所述错误折叠PrP之间形成复合物的条件下接触，和(b)检测所述复合物，作为该生物样品中存在错误折叠的PrP的指示。
在一个实施方案中，通过免疫印迹检测所述复合物。
在一个实施方案中，所述错误折叠的PrP是PrPSc。
另一方面，本发明提供产生与错误折叠PrP的YML表位结合的抗体的方法，所述方法包括：(a)将产生与错误折叠PrP的YML表位结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系在使抗体释放到培养物上清液的条件下进行培养；和(b)从上清液中分离抗体。
在一个实施方案中，培养的杂交瘤是登录号为260210-01的杂交瘤。
另一方面，本发明提供产生与错误折叠PrP的YML表位结合的抗体的方法，所述方法包括：(a)用所述肽对受试者进行免疫；和(b)从该受试者的组织中分离所述抗体，或从由该组织制备的杂交瘤中分离所述抗体。
另一方面，本发明提供检测生物样品中错误折叠PrP的存在情况的试剂盒，其包含：(a)与错误折叠PrP的YML表位特异性结合的一种或多种抗体或抗血清；和(b)其使用说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含一种或多种检测试剂。
本发明内容不一定描述了本发明的全部特征。根据下文对本发明具体实施方案描述的综述，本发明的其他方面、特征和优点对本领域技术人员而言会是很明显的。
附图简述
本发明的这些特征及其他特征在下文描述中会变得更明显，其中参考以下附图：
图1显示了使用磁珠偶联的PrP特异单克隆抗体和对照(包括识别朊病毒蛋白的两种同工型的抗体，和不识别朊病毒蛋白任一同工型的其他抗体)对小鼠和仓鼠的脑匀浆物进行免疫沉淀，然后使用识别PrPC和PrPSc的单克隆抗体(与生物素偶联的6D11)进行检测。仓鼠WT-正常仓鼠的脑匀浆；RML-来自RML小鼠(适应朊病毒感染的小鼠)的脑匀浆；Tg20-来自PrPC过表达小鼠品系的脑匀浆；K/O-来自PrPC-/-小鼠的脑匀浆；WT-来自野生型(未感染的，正常的)小鼠的脑匀浆；263K-来自263K仓鼠(适应朊病毒感染的仓鼠)的脑匀浆；对照-PrPSc蛋白。8B4珠子-利用8B4抗体偶联珠子(识别PrPC和PrPSc)免疫沉淀的脑匀浆；1A1珠子-利用1A1抗体偶联珠子(识别PrPSc蛋白)免疫沉淀的脑匀浆；4E4珠子-利用4E4抗体偶联珠子(识别不相关蛋白质)免疫沉淀的脑匀浆；IgM同种型珠子-利用IgM同种型阴性对照抗体免疫沉淀的脑匀浆；仅珠子-仅利用珠子(无抗体)免疫沉淀的脑匀浆。
图2显示A)人，B)绵羊，C)小鼠，D)仓鼠，E)牛和F)马鹿朊病毒蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-6)。
图3显示图2的人、绵羊、小鼠、仓鼠和牛序列的Clustal W比对。
图4提供了利用同种型对照抗体(黑色阴影)或PrP抗体6D11或YML特异性抗体1A1(黑线，如指示)检测正常和肿瘤细胞的结果的流式细胞术柱状图。
图5显示1A1抗体对携带B16-F10肿瘤的小鼠的治疗效果。
发明详述
在下文的描述中，广泛使用大量术语，提供以下定义便于理解本发明的多个方面。说明书中实例(包括术语的实例)的使用仅为说明目的，并不旨在限制本文本发明实施方案的范围和含义。数值范围包括限定该范围的数值。在本说明书中，“包含”用作开放式术语，基本等同于短语“包括但不限于”，“包括”也具有相同的含义。
“朊病毒”指主要由(或者也可能仅由)单个蛋白质(即“朊病毒蛋白”或“PrP”)组成的物质。错误折叠的朊病毒蛋白(错误折叠的PrP)已经牵涉到多种疾病。正常的细胞朊病毒蛋白通常称为PrPC，而错误折叠的蛋白酶抗性同工型称为PrPSc。已经在许多物种中鉴定到了PrP，包括哺乳动物和鸟类。在SEQ ID NO：1-6中描述了示例性哺乳动物PrP。
术语“表位”指蛋白质中氨基酸的排列或其上的修饰(例如糖基化)。氨基酸可以线性形式排列，如蛋白质的一级序列，或者一旦蛋白质部分或完全形成构型，其可以是紧密接近的二级或三级排列。表位可与抗体、抗体片段、肽、肽模拟物等特异性结合，或与配体特异性结合。表位可具有一定范围的大小，例如线性表位可以小至两个氨基酸，或可以更大，从约3个氨基酸到约20个氨基酸。在一些实施方案中，表位长度可以从约5个氨基酸至约10个或约15个氨基酸。氨基酸二级或三级排列的表位可包括少至两个氨基酸，或可以更大，从约3个氨基酸到约20个氨基酸。在一些实施方案中，二级或三级表位的长度可以是与表位内一些或其他氨基酸邻近的约5个氨基酸至约10个或约15个氨基酸。
“同工型”是同一蛋白质的若干不同形式中的任一种。变体形式可由一个或多个单核苷酸多态性引起(例如，导致单个氨基酸改变)，或可以是由剪接变体引起，例如包括或排除翻译蛋白质中的氨基酸序列。变体也可由蛋白质折叠的差异引起，以至于在一个同工型中“掩埋”在3维结构中的一个或多个表位暴露在蛋白质的第二个同工型中。这些折叠变体可能是因序列不同、翻译后修饰或其他影响(如特定同工型的存在)造成。朊病毒蛋白是相同氨基酸序列存在于两种结构同工型中的蛋白质的实例：PrPC(‘正常的’、‘未受影响的’、‘天然的’或‘野生型’同工型)和PrPSc同工型(‘疾病状态的’、‘受影响的’、‘错误折叠的’或‘异常的’同工型)。
朊病毒蛋白的错误折叠特异表位的暴露提供了一个或多个朊病毒特异的表位，其允许区分朊病毒蛋白的PrPC和错误折叠同工型，例如PrPSc同工型。这些表位可用作诊断靶标(例如，用于基于ELISA或流式细胞计量术的诊断方法，其利用来自患有或怀疑患有朊病毒相关疾病或病症的受试者的生物样品进行)。这些表位还可用作治疗或预防靶标。例如，可在药物组合物中使用一个或多个表位，用于在其所施用的受试者中诱导免疫力，以防止可见于朊病毒相关疾病或病症中的朊病毒错误折叠的增多。作为另一实例，一个或多个表位可特异性地被免疫分子(如抗体)结合，所述免疫分子已被修饰成向包含错误折叠的朊病毒蛋白的细胞或组织输递治疗剂。
Pruisner 1993(Dev.Biol Stand.80：31-44)提供了动物和人的一些朊病毒疾病和病症(或者称为传染性海绵状脑病；TSE)的综述。在人或动物中发现的与朊病毒蛋白错误折叠相关的疾病或病症(“朊病毒相关的”或“朊病毒错误折叠相关的”)包括但不限于Gerstmann--Scheinker病(GSS)、家族性克罗伊茨费尔特-雅各布病、偶发性克罗伊茨费尔特-雅各布病、医源性克罗伊茨费尔特-雅各布病、变型克罗伊茨费尔特-雅各布病、致命性家族性失眠症、瘙痒病(例如绵羊或山羊中)、库鲁病、牛海绵状脑病(疯牛病)、传染性水貂脑病、慢性萎缩病(例如，鹿、马鹿和驼鹿中)、猫科海绵状脑病、外来有蹄类脑病(例如，尼牙薮羚、羚羊、大弯角羚(great kudu)中)、鸵鸟的海绵状脑病。与朊病毒蛋白错误折叠相关的疾病或病症还包括癌症，尤其是与具有PrP+表型的细胞类型相关的癌症，其最终可呈现仅与错误折叠的PrP相关的表面表位，如YML表位。
PrP的球形结构域中存在两条β链。β1链(使用人序列编号的残基128-131)包含YML(SEQ ID NO：7)序列。在天然PrPC同工型(天然结构的PrPC)中，β链1包埋在PrPC同工型的三维结构内部，并且对于与免疫细胞、抗体或其他分子的相互作用而言是溶剂无法接近的。不受任何特定假说的束缚，在对产生错误折叠形式的构象转变进行诱导后(例如，通过低pH处理、暴露在PrPSc同工型中、或诱导PrPC到PrPSc重排的其他已知方法)，β链1可暴露于溶剂并可用于与免疫细胞、抗体或其他分子的相互作用。
包含YML序列和哺乳动物PrP氨基酸序列β链1的一些或全部氨基酸以及在一些实施方案中还包含β链1侧翼额外氨基酸的氨基酸序列包括但不限于GGYMLGS(SEQ ID NO：8)、GGYMLG(SEQ ID NO：9)、GYMLGS(SEQ ID NO：10)、GGYML(SEQ ID NO：11)、YMLGS(SEQ ID NO：12)、GYML(SEQ ID NO：13)、YMLG(SEQ ID NO：14)和YML(SEQ ID NO：7)。
因此，本发明提供包含SEQ ID NO：7-14之一个或多于一个氨基酸肽。更一般地，本文所用的肽是包含并呈现YML序列为表位的那些肽，所述表位用于产生选择性结合YML的抗体。此类肽可包括全长PrP蛋白质，但是其必须处于错误折叠的形式，以便YML表位呈递到抗体生产宿主中。在实践中，含有YML的肽一般由不多于约50个氨基酸残基组成，例如由不多于约40个残基、30个残基、20个残基或15个残基组成，其中最大残基数的选择是基于期望以免疫原形式呈现YML表位，同时将与其产生相关的成本降至最低。除了YML序列以外，肽会包含少量残基，其足以呈现YML作为可用于产生抗体的免疫原性表位。例如，含有YML的肽通常需要至少约5个残基、6个残基或7个残基。如本文指出，肽可偶联到用于增强其在抗体生产宿主中的免疫原性的任何试剂上。
可使用包含YML表位的免疫原肽(如包含SEQ ID NO：7-14之一个或多个的肽)在受试者中诱导对错误折叠PrP(如PrPSc同工型)具有特异性的免疫应答。例如，此类肽可用于免疫小鼠或其他动物，以产生对错误折叠的PrP(如PrPSc同工型)具有特异性的多克隆(抗血清)或单克隆抗体。此类抗体可用于例如在免疫测定中检测生物样品中错误折叠的PrP，如PrPSc。可在药物制剂中提供此类肽。
阐明本领域技术人员已知的肽合成技术和方法一般原则的标准参考文献包括，例如：Chan等，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2005；Peptide andProtein Drug Analysis，编辑Reid，R.，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，编辑Westwood等，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2000；Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY2001；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and John Wiley & Sons，NY，1994)。
当其序列可与同一种、属、科或目中发现的其他序列区分开时，则可特异性地鉴定蛋白质或多肽，或者蛋白质或多肽的片段或部分。可通过比较序列来鉴定该区别。可使用BLAST算法完成序列比较(Altschul等1009.J.Mol Biol 215：403-410)。BLAST检索允许将查询序列与特定序列或序列组进行比较，或与更大的序列文库或数据库(例如，GenBank或GenPept)进行比较，并且不仅鉴定显示100％同一性的序列，还鉴定具有更低程度同一性的那些序列。对于具有多个同工型的蛋白质，当同工型与来自相同或不同物种的其他同工型区分开时，可通过特异检测一个同工型上存在而在一个或多个其他同工型上缺少或不可检测的结构、序列或基序来特异性地鉴定同工型。
本领域技术人员应理解的是，序列内氨基酸的任何数字标号与该具体序列相关。同样，根据序列编号方式和所选序列，相同的位置可指定为不同的数字标号。此外，序列变异(如插入或缺失)可改变相对位置，并因此改变二级或三级结构的位点上和位点周围的特定氨基酸的数字标号。例如，SEQ ID NO：1-6代表的序列均代表来自人、小鼠、绵羊、牛、仓鼠或马鹿的哺乳动物朊病毒蛋白的氨基酸序列。然而，如图3所示，序列之间存在一些序列差异，编号差异，或序列及编号差异。对本领域技术人员同样显而易见的是，朊病毒蛋白表位、序列和结构元件的相对位置在各种物种中是相同的。可对核酸样品或蛋白质样品进行测序(例如，使用标准方法，如本文中提到的那些方法)，或在包含一种或多种朊病毒氨基酸或核酸序列(突变体或正常的，全长、部分或片段)的序列数据库BLAST检索中使用本文列出的任何序列或任何这些序列的片段，从而鉴定代表朊病毒蛋白序列(正常或野生型，或者有或没有与一些朊病毒错误折叠相关疾病或病症相关的突变)的其他序列。BLAST也可用于在其他物种中鉴定朊病毒蛋白序列，或朊病毒蛋白样序列。
用于描述本发明肽化合物的命名法遵循常规实践，其中氨基出现在每一氨基酸残基的左边，而羧基出现在右边。在代表本发明选定的特定实施方案的序列中，尽管未明确显示，但均应理解成氨基和羧基末端基团处于它们在生理pH值下所采取的形式，除非另有说明。一般根据下表1通过单字母或三字母的名称(对应于氨基酸的惯用名)代表每一氨基酸残基：
表1通常见于肽中的20种标准L-氨基酸的命名法和缩写：
| 全名 | 三字母缩写 | 单字母缩写 |
| 丙氨酸 | Ala | A |
| 半胱氨酸 | Cys | C |
| 天冬氨酸 | Asp | D |
| 谷氨酸 | Glu | E |
| 苯丙氨酸 | Phe | F |
| 甘氨酸 | Gly | G |
| 组氨酸 | His | H |
| 异亮氨酸 | Ile | I |
| 赖氨酸 | Lys | K |
| 亮氨酸 | Leu | L |
| 甲硫氨酸 | Met | M |
| 天冬酰胺 | Asp | N |
| 脯氨酸 | Pro | P |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q |
| 精氨酸 | Arg | R |
| 丝氨酸 | Ser | S |
| 苏氨酸 | Thr | T |
| 缬氨酸 | Val | V |
| 色氨酸 | Trp | W |
| 酪氨酸 | Tyr | Y |
阐明本领域技术人员已知的免疫学一般原理的标准参考文献包括，例如：Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1999)；HARLOW和LANE，Using Antibodies：A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York；COLIGAN等人编辑Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York，NY(1992-2006)；和Roitt等人，Immunology，第3版，Mosby-Year BookEurope Limited，London(1993)。
阐明本领域技术人员已知的重组DNA技术的一般原理的标准参考文献包括，例如：Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York(1998和2001的附录)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York(1989)；Kaufman等，编辑，Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology AndMedicine，CRC Press，Boca Raton(1995)；McPherson，编辑，DirectedMutagenesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford(1991)。
如本文所用，“抗体”包括来自任何天然来源的多克隆抗体，和IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类的天然或重组单克隆抗体、杂合衍生物、人源化或嵌合抗体，以及包括Fab、Fab′和F(ab′)2的抗体片段，和Fab或其他免疫球蛋白表达文库的产物。抗体可以是天然存在的，例如从动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)中分离和/或纯化的。抗体可以是单体或多聚体形式。可修饰抗体或其抗原结合部分以包含检测标记，例如生物素、放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)、或元素颗粒(例如，金颗粒)。
通过错误折叠而暴露的YML表位从而与错误折叠PrP“选择性”结合的抗体和片段将以这样的亲和力结合错误折叠的PrP，所述亲和力比它们结合天然结构PrP的亲和力高至少一个数量级(例如，高至少2、3、4或5个数量级)。例如，YML抗体对PrPSc的结合亲和力优选比其对PrPC蛋白质的结合亲和力高至少一个数量级。可基于本领域通常用于此目的的成熟测定和技术来测定相对结合亲和力并选择的YML抗体。
杂交瘤方法可用于制备单克隆抗体(KOHLER等(1975)Nature256：495)。或者，可通过重组DNA方法制备单克隆抗体(例如美国专利号4,816,567)。也可使用例如CLACKSON等(1991)Nature352：624-628；和MARLTS等1991 J.Mol.Biol.222：581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。制备和表征嵌合或人源化抗体的方法为本领域所知，并描述于例如Kashmiri等，2005.Methods36：25-34；Gonzales等，2005.Tumor biology 26：31-43中。在对错误折叠的PrP特异具有特异性(例如对PrPSc具有特异)的杂交瘤的制备中(例如，US 6765088提供的方法)，可有利地使用PrP0/0小鼠(‘敲除小鼠’)。
本发明人已经使用肽(Gly-Gly-Tyr-Met-Leu-Gly-Ser，SEQ ID NO：8)产生了杂交瘤并制备了命名为1A1的IgM单克隆抗体，所述肽的序列中包含见于β链1的氨基酸。该序列在朊病毒敏感物种包括但不限于人(SEQ ID NO：1)、小鼠(SEQ ID NO：3)、牛(SEQ ID NO：5)、仓鼠(SEQID NO：4)、羊(SEQ ID NO：2)和马鹿(SEQ ID NO：6)中保守(图3)。与同种型对照抗体相比，1A1单克隆抗体特异性识别朊病毒蛋白的疾病错误折叠同工型(图1)。
因此，本发明提供抗体或其片段，其与包含哺乳动物PrP氨基酸序列中YML序列的表位结合。
本发明还提供抗体或其片段，其与包含哺乳动物PrP氨基酸序列中YML序列的表位结合，并且其中所述抗体不与天然结构的PrPC特异性结合。
本发明还提供与全部或部分存在在哺乳动物PrP氨基酸序列β链1中的表位结合的抗体。
本发明还提供杂交瘤细胞系，其产生与哺乳动物PrP氨基酸序列的YML表位结合的单克隆抗体。
在一个具体实施方案中，本发明提供2010年2月26日按照布达佩斯条约在加拿大国际保藏机构以登录号260210-01保藏的杂交瘤，及其所有后代和衍生物，包括掺入编码重链和轻链之基因的衍生物，或编码保藏杂交瘤所产生抗体的互补决定区的序列。
在另一具体实施方案中，本发明提供命名为1A1的单克隆抗体，其作为培养上文提到的杂交瘤的产物而获得。还提供的是1A1抗体的YML结合片段。在相关实施方案中，本发明提供并包括与1A1抗体竞争结合YML表位的抗体及其片段。
本发明多个实施方案的抗体可用于测定或测试中，以确定生物样品中PrPSc同工型的存在与否或相对量。生物样品可得自受试者。同样，抗体可用于测定或测试中，以确定在其膜表面上呈现错误折叠形式PrP的肿瘤细胞的存在与否或相对量。
蛋白质或蛋白质复合物可通过本领域已知的多种方法特异地鉴定和定量，并可单独使用或组合使用。基于免疫学或抗体的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、western印迹、免疫荧光、微阵列、一些色谱技术(即，免疫亲和色谱)、流式细胞术、免疫沉淀等。此类方法基于抗体对与目的蛋白质或蛋白质复合体相关的特定表位或表位组合的特异性。非免疫方法包括基于蛋白质或蛋白质复合物本身物理特征的那些方法。此类方法的实例包括电泳、一些色谱技术(例如，高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白质液相色谱(FPLC)、亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱等)、质谱术、测序、蛋白质消化等。此类方法基于质量、电荷、疏水性或亲水性，其来自蛋白质或蛋白质复合体的氨基酸互补以及氨基酸的特异序列。可组合免疫和非免疫方法来鉴定或表征蛋白质或蛋白质复合物。
本文描述且相关领域技术人员所知的标准参考文献描述了免疫和非免疫技术、其对特定样品类型、抗体、蛋白质或分析的适用性。
在本发明的一些实施方案中，可将包含PrPSc或错误折叠PrPC的细胞结合形式的组织提取物或匀浆在允许抗体与朊病毒蛋白之间形成复合物的条件下与结合PrP的YML呈现形式(如PrPSc)的抗体相组合，并允许其发生相互作用。抗体可结合支持基质，例如塑料珠或磁珠。对结合的蛋白质复合物进行收集(例如通过离心或通过磁珠收集)、洗涤、变性并进行凝胶电泳。凝胶电泳后，对蛋白质进行western印迹，并用多种抗体检测印迹，包括一种或多种对照、对PrPC同工型具有特异性的一种或多种抗体和对PrPSc同工型具有特异性的一种或多种抗体。如果样品中存在PrPSc同工型，那么PrPSc特异抗体会鉴定到样品中PrPSc同工型的存在。如果样品中存在PrPC同工型，那么仅检测PrPC同工型的抗体会鉴定到样品中PrPC同工型的存在。在一些实施方案中，PrPSc和PrPC同工型的检测是定量的或半定量的，因此可以获得对样品中PrPC与PrPSc相对比例的评估。
在一些实施方案中，检测目标是诊断PrPSc相关神经疾病或血液癌症的情况下，研究YML免疫反应性的生物样品是血液样品或其YML抗体活性级分。或者，在检测目标是诊断实体癌的情况下，生物样品是组织样品或其匀浆，如肿瘤活检。
因此，本发明提供检测生物样品中PrPSc的方法，所述方法包括使生物样品与结合PrPC和PrPSc的抗体在允许形成复合物的条件下接触，并检测复合物中PrPSc同工型的存在。同样，本发明提供检测生物样品中对YML抗体具有免疫反应性的任何错误折叠形式PrP的方法。
术语“受试者”或“患者”一般指哺乳动物和其他动物，包括人和其他灵长类、宠物动物、动物园动物和农场动物，包括但不限于猫、狗、啮齿类、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、马、牛、绵羊、猪、马鹿或其他有蹄类动物、山羊、家禽等。受试者包括待测试或已经测试来预测、评估或诊断与朊病毒蛋白错误折叠相关疾病或病症的受试者。受试者可以是之前已经使用其他方法(如本文描述的那些或目前临床实践中的那些方法)进行过评估或诊断，或可选择作为一般群体的一部分(对照受试者)。受试者可以是转基因动物，例如啮齿类，如小鼠，其包含PrPC或PrPSc同工型，或不表达朊病毒蛋白(例如‘敲除’小鼠)。例如，受试者可以是过表达正常同工型(PrPC)的转基因小鼠，或可以是已经感染了疾病相关同工型(PrPSc)的野生型小鼠或仓鼠。
“生物样品”或“样品”一般指来自受试者的体液或组织或器官样品。例如，生物样品可以是体液，如脑脊液、血液、血浆、淋巴液、血清、尿液或唾液。可将组织或器官样品(如从固体或半固体组织或器官中获得的那些)进行消化、提取或以其他方式使其变成液体形式——此类组织或器官的实例包括培养细胞、血细胞、脑、神经组织、皮肤、肝、心脏、肾、胰腺、胰岛、骨髓、血液、血管、心瓣膜、肺、肠、肠、脾、膀胱、阴茎、脸、手、骨、肌肉、脂肪、角膜等，包括其致瘤形式。可在任何时候同时收集多种生物样品。可在任何时间从受试者中获得生物样品或样品，包括在受试者被诊断为或疑似为患有朊病毒错误折叠相关疾病或病症之前，在治疗或改善朊病毒错误折叠相关疾病或病症的症状过程中，受试者死亡之后(不管死因或疑似死因为何)。或者，在代表集中的血液供应组织或机构时，生物样品可包括捐赠的体液或组织，如血液、血浆或血小板。或者，生物样品可包括例如在屠宰场屠宰时取得的食物动物的肉、血液或组织。
样品也可包括但不限于细胞培养中正常或修饰的(例如通过重组DNA技术)细胞产生的PrPC或PrPSc蛋白。样品也可以是在实验条件下产生的细胞或细胞系，其不是直接从受试者中分离的。样品也可以是无细胞的，人工衍生或合成的。“对照”包括所获得用于测定基线(例如表达或活性或存在情况)的样品或标准品。因此，对照可得自正常细胞或组织，例如得自未受朊病毒错误折叠相关疾病或病症影响的受试者、得自未怀疑具有朊病毒错误折叠相关疾病或病症风险的受试者，或者得自来自此类受试者的细胞或细胞系，或其提取物或匀浆。对照也可以是标准品，例如先前确定的标准品。因此，根据本发明进行的任何测试或测定可与标准品进行比较；此外，不必每次比较都获得对照样品。
在另一实例中，本文描述的抗体可用于药物组合物中用于治疗、预防或改善受试者中的朊病毒错误折叠相关疾病或病症。可向受试者施用包含治疗有效量的本发明一些实施方案所述抗体和可药用赋型剂的药物组合物，来治疗朊病毒错误折叠相关疾病或病症。抗体可抑制PrPSc聚集体的形成、抑制通过错误折叠的PrP进行的细胞间通讯或胞内信号转导，或阻断PrPC向PrPSc同工型的进一步转化。药物组合物例如可用于降低PrPSc形成和/或聚集的神经毒性作用。药物组合物可进一步包含增加血脑屏障渗透性的添加剂或试剂(用于向血液中施用)。
在本发明的另一实施方案中，抗体可用于制备治疗朊病毒错误折叠相关疾病或病症的药物。抗体或者包含抗体的药物或药物组合物可用于治疗患有或疑似患有该疾病或病症的受试者中的朊病毒错误折叠相关疾病或病症。
在另一实例中，包含SEQ ID NO：7-14中一个或多个的肽可用于药物制剂中，用于在受试者中诱导免疫应答，所述免疫应答对PrPSc同工型具有特异性。所述药物制剂可用作疫苗。
在本发明的另一实施方案中，肽可用于制备预防或治疗朊病毒错误折叠相关疾病或病症的疫苗组合物。肽或包含肽的药物或疫苗组合物可用于预防或治疗患有或疑似患有该疾病或病症的受试者中的朊病毒错误折叠相关疾病或病症。对PrPSc同工型具有特异性的由宿主产生的抗体可防止PrPSc聚集，或防止PrPC向PrPSc的转化。
肽可以偶联载体，以促进或增强宿主对所述肽的免疫应答。载体的实例描述于例如在本文公开的标准参考文献中。疫苗组合物可进一步包含一种或多种佐剂、赋型剂等。本文描述了佐剂和赋型剂的实例，其他实例描述于例如在本文描述的标准参考文献中。
阐明本领域技术人员已知的医学生理学和药理学一般原理的标准参考文献包括：Fauci等，编辑，Harrison′s Principles Of InternalMedicine，第14版，McGraw-Hill Companies，Inc.(1998)。
本发明所用的“有效量”的抗体或肽指(1)药物组合物中可用于减少受者中错误折叠的PrP的影响(如减少PrPSc的神经毒性作用或减少错误折叠PrP阳性肿瘤的繁殖)的抗体量，和(2)药物组合物中用于诱导受试者中针对PrPSc同工型或呈现错误折叠PrP的肿瘤细胞的免疫应答的肽量。可基于质量/质量(例如每千克受试者的微克或毫克数)或基于质量/体积(例如，浓度，每毫升的微克或毫克数)计算有效量。使用质量/体积单位，抗体可以从约0.1ug/ml到约20mg/ml的量或其间任何量存在，例如0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000、1500、2000、5000、10000、20000ug/ml，或其间任何量；或从约1ug/ml到约2000ug/ml，或其间任何量，例如1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000、1500、2000、ug/ml，或其间任何量；或从约10ug/ml到约1000ug/ml或其间任何量，例如10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000ug/ml，或其间任何量；或从约30ug/ml到约1000ug/ml或其间任何量，例如30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000ug/ml。
可基于质量/质量(例如每千克受试者的微克或毫克数)或基于质量/体积(例如，浓度，每毫升的微克或毫克数)计算量和/或浓度。使用质量/体积单位，抗体或肽可以从约0.1ug/ml到约20mg/ml的量或其间任何量存在，例如0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000、1500、2000、5000、10000、20000ug/ml，或其间任何量；或从约1ug/ml到约2000ug/ml，或其间任何量，例如1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160 180、200、250、500、750、1000、1500、2000、ug/ml，或其间任何量；或从约10ug/ml到约1000ug/ml或其间任何量，例如10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000ug/ml，或其间任何量；或从约30ug/ml到约1000ug/ml或其间任何量，例如30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000ug/ml。
可以包含有效量的抗体或肽的剂量施用本发明多个实施方案的组合物，包括治疗组合物。剂量可包含从约0.1ug/kg到约20mg/kg(基于受试者的质量)，例如0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000、1500、2000、5000、10000、20000ug/kg，或其间任何量；或从约1ug/kg到约2000ug/kg，或其间任何量，例如1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000、1500、2000ug/kg，或其间任何量；或从约10ug/kg到约1000ug/kg或其间任何量，例如10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000ug/kg，或其间任何量；或从约30ug/kg到约1000ug/kg或其间任何量，例如30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160、180、200、250、500、750、1000ug/kg。
给出受试者的重量、药物组合物的浓度、单个组分或其组合、或药物组合物的体积、单个组分或其组合，则本领域技术人员根据需要能够容易地互换单位成适合于期望应用的形式。
组合物的施用量、施用位置、施用方法和施用时程均可对观察效果有影响。例如，组合物可全身施用(例如静脉施用)并具有毒性或不想要的效果，而皮下施用的同一组合物可能不产生相同的不想要效果。在一些实施方案中，局部刺激皮下注射位点附近的淋巴结中的免疫细胞是有利的，而全身免疫刺激却不是。
本发明多个实施方案的药物组合物可与任何多种生理赋形剂或可药用赋形剂一起制备，经常是在水载体中制备，如注射用水、乳酸林格氏液、等渗盐水等。此类赋型剂可包括，例如盐、缓冲剂、抗氧化剂、络合剂、等张剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、助悬剂、乳化剂、抗微生物剂、防腐剂、螯合剂、粘合剂、表面活性剂、湿润剂、抗黏着剂、崩解剂、包衣、助流剂、抗絮凝剂、抗成核剂、表面活性剂、稳定剂、非水载体(如不挥发油)、用于持续释放或控制释放的聚合物或密封剂、软膏基、脂肪酸、膏基、软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、增溶剂、湿润剂、水、醇等。参阅例如，Berge等(1977.J.Pharm Sci.66：1-19)，或Remington- The Science and Practice of Pharmacy，第21版.Gennaro等编辑Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia(通过引用并入本文)。
包含本发明多个实施方案的抗体或肽的组合物可通过任何几种途径施用，包括例如但不限于鞘内施用、皮下注射、腹膜内注射、肌内注射、静脉注射、表皮或经皮施用、粘膜施用、经口、经鼻、直肠、局部或阴道施用。或者，这些组合物可直接注射到肿瘤中，或肿瘤附近的淋巴结，或肿瘤附近的器官或组织，或包含肿瘤细胞的器官或组织。参阅例如，Remington-The Science and Practice of Pharmacy，第21版.Gennaro等编辑.Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia。可根据施用途径选择并修饰载体制剂。
可向上皮表面应用本发明多个实施方案的组合物。一些上皮表面可包括粘膜，例如口腔、牙龈、鼻、气管、支气管、胃肠、直肠、尿道、阴道、宫颈、子宫等。一些上皮表面可包含角质化细胞，例如皮肤、舌、牙龈、腭等。
本发明多个实施方案的组合物可以单位剂量形式提供，或以适于在使用时配制或稀释的批量形式提供。
本发明多个实施方案的组合物可以单剂量施用于受试者，或随时间施用若干剂量。剂量方案可取决于例如受试者的情况、年龄、性别、体重、施用途径、制剂或一般健康情况。可从受试者吸收、分布、代谢、排泄和毒性的测量来计算用于人受试者的剂量方案，或可从实验动物(如大鼠或小鼠)的测量中推导出剂量方案。例如在Goodman &Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics第11版.2006.LLBrunton，编辑McGraw-Hill，New York，或者Remington-The Scienceand Practice of Pharmacy，第21版Gennaro等编辑.LippincottWilliams & Wilkins Philadelphia中讨论了剂量和治疗方案的优化。
用作本发明多个实施方案的疫苗组合物的药物组合物可进一步包含佐剂并如描述进行施用。例如，用于疫苗组合物中的肽可与佐剂组合，佐剂的实例包括氢氧化铝、明矾、AlhydrogelTM(三水合氢氧化铝)或其他含铝盐、病毒小体、包含CpG基序的核酸、菠菜烯、油、MF59、QS21、多种皂甙、病毒样颗粒、单磷酰脂质A/海藻糖二棒杆菌酸酯(trehalose dicorynomycolate)、toll样受体激动剂、共聚物如聚氧丙烯和聚氧乙烯等。
在本发明的上下文中，本文所用的术语“治疗”、“治疗用途”或“治疗方案”可互换使用，并旨在包括本发明组合物的预防性、治标性和治疗性施用模式，并包括本申请要求保护的化合物的任何及全部用途，其治疗基于炎症的病理学、感染性疾病、变态反应、超免疫反应或待治疗的其他疾病或病症引起的疾病状态、状况、症状、体征或病症，或预防、阻碍、延迟或逆转其相关症状、体征、状况或病症的进展。
其他实施方案
在另一实施方案中，本发明提供鉴定用于治疗朊病毒错误折叠相关疾病或病症的化合物的方法。将对PrPSc同工型或其他错误折叠PrP形式呈现的YML表位具有特异性的抗体与包含本文所述靶抗原(例如PrPSc)的样品在存在和缺失测试化合物的情况下相组合。收集结合的抗体与PrPSc的复合物并如本文描述分析复合物中PrPSc的相对量。存在测试化合物时PrPSc特异抗体的结合水平比缺失测试样品时的结合水平低表明该测试化合物可以是用于治疗或改善朊病毒错误折叠相关疾病或病症的潜在治疗化合物。在一些实施方案中，所述抗体与包含SEQID NO：7的表位结合。
在另一实施方案中，本发明提供从组织或旨在向受试者移植、口腔摄入或施用的组合物中清除PrPSc的方法。例如，将所述组合物或组织与对哺乳动物PrPSc同工型具有特异性的一种或多种抗体组合，以使PrPSc同工型在复合物中与抗体结合。随后从组织或组合物中分离结合的同工型和抗体复合物，并且如预期使用组织或组合物。
制成品
还提供制成品，其包含包装材料和包含对错误折叠PrP(如哺乳动物PrPSc)具有特异性的抗体或抗血清的组合物。所述组合物包含生理学上或药学上可接受的赋型剂，并且包装材料可包括标明组合物活性成分(例如抗血清或抗体)的标签。标签可进一步包括组合物的预期用途，例如作为待与本文所述试剂盒一起使用的诊断试剂。
还提供制成品，其包含包装材料和含有本文提供的一种或多种肽的组合物。所述组合物可包含生理学上或药学上可接受的赋型剂，并且包装材料可包括标明组合物活性成分(例如肽)的标签。标签可进一步包括组合物的预期用途，例如作为待与本文所述试剂盒一起使用的治疗或预防试剂，或作为在受试者中诱导免疫应答以生产对哺乳动物PrPSc具有特异性的抗血清或抗体的组合物。
试剂盒
提供了试剂盒，其包含含有一种或多种本文所提供肽的组合物，以及所述化合物或组合物用于产生或筛选抗体以鉴定YML特异性抗体或抗血清的说明书。试剂盒可用于产生和/或鉴定YML特异抗体或抗血清，并且说明书可包括例如剂量浓度、剂量间隔、优选的实施方法、免疫筛选或测试方法等。
在另一实施方案中，提供用于制备药物的试剂盒，其包含组合物与其使用说明书，所述组合物包含本文提供的一种或多种肽。说明书可包含用于制备药物的一系列步骤，所述药剂用于在其所施用受试者中诱导治疗性或预防性免疫应答。试剂盒还可包含将该药物用于治疗、预防或改善与朊病毒错误折叠相关疾病或病症(或其中牵涉到朊病毒错误折叠)的一个或多个症状的说明书，并包括例如给药浓度、给药间隔、优选的施用方法等。
在另一实施方案中，提供了用于诊断朊病毒错误折叠相关疾病或病症的试剂盒。所述试剂盒包含本文描述的一种或多种YML抗体或抗血清，及其使用说明书。抗体还可进一步偶联检测试剂。检测试剂的实例包括二抗，如抗小鼠抗体、抗兔抗体等。此类二抗可偶联酶，其在有合适的底物时提供可检测的生色或化学发光反应。所述试剂盒还可包含用于进行检测反应的试剂，包括酶(如蛋白酶K)、封闭缓冲液、匀浆缓冲液、提取缓冲液、稀释缓冲液等。
在另一实施方案中，提供了用于检测生物样品中PrPSc存在情况的试剂盒。所述试剂盒包含与本文所述哺乳动物PrP的PrPSc同工型特异性结合的一种或多种抗体或抗血清，及其使用说明书。抗体还可进一步偶联检测试剂。检测试剂的实例包括二抗，如抗小鼠抗体、抗兔抗体等。此类二抗可偶联酶，其在有合适的底物提供可检测的生色或化学发光反应。所述试剂盒还可包含进行检测反应的试剂，包括酶(如蛋白酶K)、封闭缓冲液、匀浆缓冲液、提取缓冲液、稀释缓冲液等。
YML表位也可用作癌症治疗诊断的靶标。如本文示例，某些肿瘤细胞系呈现与针对该表位产生的抗体反应的抗原。这些细胞系尽管为PrP+，但明显呈现被YML抗体识别的PrP错误折叠形式。因此，本发明的抗体(本身或作为免疫缀合物)可用于YML+肿瘤细胞的检测和治疗靶向。含YML的疫苗同样可用于癌症治疗。肿瘤细胞包括实体肿瘤和液体肿瘤。如本文示例，肿瘤靶标是呈现YML表位的那些靶标，并因此是在其表面上呈现PrP(但是是暴露YML表位的错误折叠形式)的那些靶标。此类肿瘤可描述为“YML+”或者具有或包含YML+表型。显示呈现YML的肿瘤包括来自淋巴样组织的那些(以细胞系MOLT-4为代表)，和来自少突胶质细胞的那些(以细胞系MO3.13为代表)，以及黑素瘤细胞系(以B16为代表)。当然，可首先使用上文和本文实施例中描述的YML抗体筛选来揭示可用YML抗体靶向的其他肿瘤。
本文使用术语“肿瘤细胞”指癌细胞和包含此类细胞的肿瘤，其以不受调节的细胞生长为特征。肿瘤细胞因此以赘生性细胞生长和增殖(恶性的或良性的)为特征，并包括所有癌前细胞和癌细胞以及包含此类细胞的组织，包括液体肿瘤和实体肿瘤。术语“肿瘤细胞”包括人癌细胞和来自其他哺乳动物(包括宠物)和家畜(包括马、绵羊、牛和有蹄动物)的癌细胞。
本发明的治疗方法导致对呈现YML表位的癌细胞“生长或增殖”的抑制。在体外水平上，通过所治疗的癌细胞的数量、大小、活力、生长速率、增殖速率或代谢活性的降低来揭示这种生长或增殖相对于未治疗对照样品的抑制。在体内水平上，生长或增殖的这种抑制可进一步揭示为带有呈现靶表位的癌细胞的肿瘤的生长速率、大小、数量或转移状态的降低。应理解的是，可使用肿瘤学领域中用于此目的的成熟测定和方法，并借助于本发明提供并本文进一步详细描述的检测靶表位的试剂容易地确定所有这些终点。
为了允许其本身用作细胞毒素来直接抑制呈现YML表位的癌细胞的生长和增殖，抗体可通过内源机制(如补体介导的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC))发挥其抗癌活性。为此，YML抗体最好是IgG1同种型。应理解的是，可改造或选择抗体以使其具有改变的效应功能，来增强在治疗癌症中的作用。例如可向Fc区中引入半胱氨酸残基，以允许形成链间二硫键。所得到的同二聚体抗体可具有改善的细胞内化能力，并且更重要的是可具有增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或ADCC活性。也可使用如Wolff等，Cancer Research53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备具有增强抗肿瘤活性的同二聚体抗体。或者，可改造抗体，以使其具有双Fc区和增强的CDC和ADCC活性。
可用于本发明的抗体片段包括抗YML抗体的YML结合片段，包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体。如上文指出，也可改造或缀合掺入Fc区的抗体片段，以提供改变的效应功能，由此增强ADCC和/或CDC活性。对于癌症治疗，也可提供YML抗体及其结合片段，并将其用作免疫缀合物，其中抗体或片段与细胞毒素偶联。
包含抗体的免疫缀合物可缀合到上文指出的多种试剂上，包括检测标签(包括用于成像的那些)和药物(包括细胞毒素)。在一些实施方案中，所述缀合物包含细胞毒素和选择性结合YML表位的试剂。“细胞毒素”指包括化学治疗化合物或放射治疗化合物等的化合物，其在治疗中用于降低癌细胞的生存力，例如抑制癌细胞的生长和/或增殖。
YML抗体和细胞毒素可通过非共价相互作用缀合，但更期望直接通过共价连接或更优选通过合适的接头而偶联。在一个优选的实施方案中，所述缀合物包含细胞毒素和YML抗体，以形成免疫缀合物。抗体与细胞毒素的免疫缀合物使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)、亚氨酸酯的双功能衍生物，如二甲基己二亚酰胺化物盐酸盐、活性酯如辛二酸双琥珀亚胺酯、醛如戊二醛、二叠氮化合物如二-(对重氮基苯甲酰)-氨茶碱)、二异氰酸酯如2，6-二异氰酸苯甲酯，和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。碳14标记的1-异硫氰苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是适于将放射性核苷酸缀合到抗体上的螯合剂。
免疫缀合物中的细胞毒素组分可以是化学治疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或其片段，或小分子毒素)或放射性同位素如212Bi、131I、111In、90Y和186Re，或可用于抑制癌细胞生长或增殖的任何其他试剂。
可用于产生此类免疫缀合物的化学治疗剂包括阿霉素、多柔比星、表柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消安、cytoxin、紫杉烷类(taxoid)例如紫杉醇和多西紫杉醇、多西他赛、氨甲喋呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、柔红霉素、去甲柔红霉素、氨喋呤、更生霉素、丝裂霉素、埃斯培拉霉素(esperamicin)、5-FU、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、放线菌素D、VP-16、苯丁酸氮芥、美法仑，和其他相关氮芥。还包括激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，如三苯氧胺和奥那司酮。
可使用的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非键合活性片段、霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、皂草素、米托洁林、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类(tricothcenes)。小分子毒素包括例如，刺孢霉素、美登素类(maytansinoids)、海葵毒素和CC1065。
为了治疗呈现YML+肿瘤的受试者，可如上文所述进行给药来治疗PrPSc病症。为了鉴定适合于治疗的受试者，也可如上文描述筛选包含肿瘤细胞的生物样品，以证实其YML+表型。或者，可在免疫缀合物施用和累积后，通过局部和全身成像获取受试者的图像，在所述免疫缀合物中YML抗体偶联成像剂，如锝同位素(例如Tc99)、钆同位素等。
对呈现YML+肿瘤的受试者的成功治疗表现为YML+肿瘤负荷减轻，如YML+肿瘤数量或分布和特定YML+肿瘤大小的减少，和/或患者总体存活率的提高。
其他治疗方案可与施用抗癌剂(例如本发明的疫苗、抗体或缀合物)相组合。例如，待用此类抗癌剂治疗的患者也可接受放射治疗，如外线束放射。作为替代或补充，可向患者施用化学治疗剂。此类化学治疗剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用，或由技术人员经验性地确定。这种化学治疗的制备和给药方案还描述于ChemotherapyService Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，Md.(1992)。可在施用抗肿瘤剂(例如抗体)之前或之后施用化学治疗剂，或与其同时施用。抗体可与抗雌激素化合物(如三苯氧胺)或抗黄体酮(如奥那司酮)(参阅EP 616812)以此类分子已知的剂量组合。
还可能期望施用针对其他肿瘤相关抗原的抗体或缀合物，如结合ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。作为替代或补充，与本文公开的一种或两种或更多种不同抗原结合的两种或更多种抗体可一起向患者施用。有时候，也向患者施用一种或多种细胞因子是有益的。在一个优选的实施方案中，本文的抗体与生长抑制剂一起施用。例如，可首先施用生长抑制剂，然后施用本发明的抗体。然而，也考虑同时施用或首先施用本发明的抗体。生长抑制剂的合适剂量是目前使用的那些剂量，并由于生长抑制剂与本文抗体的组合作用(协同作用)而可以减少剂量。此外，YML抗体或片段可与疫苗组合施用，用于产生YML抗体，向受体同时提供主动和被动的免疫治疗。
在表2中给出了本发明序列识别号码的列表。
表2 序列识别号码的列表
将在下文实施例中进一步阐明本发明。然而应理解的是，这些实施例仅为说明性目的，并不应该用于以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：方法
一般参考文献：263K仓鼠适应的朊病毒由Kimberlin等1978描述。RML小鼠适应的朊病毒由Chandler，R.L.(1961)(Lancet 1，1378-1379)描述。使用本领域已知的方法，例如Bueler H等1993(Cell 73：1339-1347)、Oldstone等2002或Meade-White等2009的那些方法，可使用它们来感染小鼠或仓鼠。Bolton等1987描述了可用于分离并纯化瘙痒病因子的方法。Carlson等1986(Cell，46：503-511)描述了可用于临床诊断小鼠和仓鼠中瘙痒病的方法。Fischer等1996(EMBO J 15：1255-1264)和Weissmann等2003(British Medical Bulletin 66：43-60)描述了过表达、部分表达或不表达PrP的多种转基因小鼠。
脑和脾匀浆的制备物
如Fischer等2000(Nature 408：479-483)所述的改进，加工并分析脑组织(正常的和瘙痒病感染的小鼠或仓鼠)。简言之，在PBS、0.5％脱氧胆酸(Sigma)、0.5％NP-40中制备10％的匀浆。通过BCA测定法(Pierce)来测定匀浆中总蛋白质的浓度并用匀浆缓冲液调整至5mg/ml。为了检测PK抗性材料，将1.5μl匀浆与或不与0.15μg PK(Sigma)在37℃下孵育60分钟。通过加入20mM PMSF(Sigma)来终止消化。
磁珠抗体缀合和免疫沉淀
如Paramithiotis，2003中所述改进，将抗体缀合到磁珠上并用于免疫沉淀实验。简言之，根据生产商说明书将7×108个磁珠(1ml PBS中)(Dynal；Lake Success，New York)与1A1、8B4、4E4或IgM同种型对照缀合。根据生产商建议洗涤并封闭缀合的珠子，随后在1ml PBS中重悬。
将10μL抗体偶联的珠与1μL 10％的脑匀浆在室温下在6％去污剂(PBS中3％Tween20和3％NP40)中孵育3小时。用4％去污剂(PBS中2％Tween20和2％NP40)洗涤磁铁捕获的免疫复合物3次，在无还原剂的4％SDS中煮沸，并在15％Tris甘氨酸或4-12％的双tris丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)中分离。
免疫印迹
如所描述进行免疫印迹(Paramithiotis等，2003)。将蛋白质转移至PVDF膜(Invitrogen)上。用5％(w/v)脱脂奶粉封闭膜。所有孵育均在TBST(25mM Tris-HCl，0.2M NaCl，0.5％Tween-20)中进行。通过化学发光、增强型ECL(Amersham)或superWest Dura(Pierce；Rockford，Illinois)来检测过氧化物酶活性。
实施例2：抗体产生
通过用KLH偶联的肽GGYMLGS(SEQ ID No.8)(其对应于人朊病毒蛋白的126-132位氨基酸)免疫Balb/c小鼠来产生抗体。该肽位于第一条β链上，并已被预测为在错误折叠的PrPSc中是未折叠并可接近的，而在天然PrPC中则不然。通过标准杂交瘤方法产生单克隆抗体。基于与偶联BSA的免疫原肽的结合(通过ELISA)来选择抗体。
更具体而言，使用众所周知的技术合成具有乙酰基-Cys-GGYMLGS-NH2氨基酸序列的肽，将其与KLH缀合并肌内注射兔子。加入N端的半胱氨酸残基以允许肽与蛋白质载体缀合。通过乙酰化将肽的氨基封闭，并通过酰胺化来将肽的羧基封闭。使用固相肽合成法手动或自动合成肽(MPS396 peptides synthesizer，Advanced ChemTech)。使用Fmoc肽合成化学法(Fields等，1990，IJPPR 35，161)来完成氨基酸残基的偶联。在Wang或在酰胺Rink树脂上进行合成，其中氨基酸的全部侧链受到保护。合成后，使用试剂K作为切割混合物：水(2.5％)、TIS(2.5％)、EDT(2.5％)、TFA(92.5％)，将肽从树脂上切割下来。随后用冰冷的乙醚沉淀肽。将沉淀物离心、用乙醚洗涤三次，并溶于20％-50％AcCN/水混合物，并低压冻干。使用分析型RP-HPLC和电喷雾MS进行粗产物分析。通过Rp-HPLC(反相高效液相色谱)在Vydac C18柱2.5x25cm上纯化粗制肽，其中使用水中10-50％乙腈的线性梯度，与0.06％TFA(1％/分钟梯度，10ml/分钟流速)，通过UV在215nm和254nm处进行监测。将肽与载体偶联，在这种情况下为钥孔槭血蓝蛋白(KLH)。用于此类偶联的其他载体包括但不限于白蛋白、或卵清蛋白、8map或溶菌酶。通过与半胱氨酸的巯基形成硫醚键来实现偶联。如下进行与KLH的偶联。将10mg肽溶于2ml磷酸盐缓冲溶液(PBS 1x)中。将1ml KLH(pierce产品#77100)加入肽溶液中并搅拌(1摩尔肽/50氨基酸)。KLH浓度为10mg/ml。将20ul的戊二醛(25％水溶液)加入肽/载体溶液中并持续搅拌，孵育1小时，随后加入甘氨酸终止溶液。通过用PBS进行透析将肽/载体缀合物与肽分离开。
如下产生单克隆抗体。用在完全弗氏佐剂中含小鼠PrP-AP融合蛋白质的杆状病毒上清液免疫小鼠，随后在2周后用不完全弗氏佐剂中的相同抗原进行免疫加强。该免疫后两周用PrP-AP上清液加100ug的KLH-CGGYMLGS缀合物对小鼠进行免疫加强。将来自这些小鼠的脾细胞与FO小鼠B细胞系(ATCC CRL-1646)融合来产生特异性杂交瘤克隆。
小鼠单克隆抗体作为腹水产生，并使用A蛋白柱试剂盒(Pierce)根据制造商的说明书进行纯化。简言之，利用结合缓冲液以1∶1的最终比例稀释腹水样品。然后将样品加入之前已经用结合缓冲液进行平衡的柱顶部，并允许样品流过基质。收集流出材料并用5倍体积的结合缓冲液洗涤所述柱。向柱中加入温和的洗脱缓冲液，以从基质上释放结合的抗体。在1ml级分中收集所有的抗体，通过BCA进行分析以测定总蛋白质含量，并通过SDS-PAGE电泳确定抗体纯度水平。通过使其通过D-盐柱(Pierce)将含有想要的抗体的级分脱盐。分装抗体馏分并储存在-80 C PBS中。
产生名为1A1的小鼠单克隆抗体的杂交瘤在2010年2月26日根据布达佩斯条约以登录号260210-01保藏于加拿大国际保藏机构。
同样，针对其他含YML的肽(包含具有SEQ ID No.7和9-14的那些)产生了抗体及产生所述抗体的杂交瘤。
实施例3：免疫沉淀PrPSc
用6D11生物素作为一抗(1∶5000)和Strep-HRP作为二抗(1∶5000)通过Western印迹(图1)来分析免疫沉淀的样品。8B4珠作为阳性对照，其能够从除PrP敲除小鼠(K/O)之外的所有脑匀浆样品中免疫沉淀PrP。仅珠子本身、IgM同种型珠子和4E4珠子作为阴性对照，像预计的那样，除了在RML和263K泳道由于4E4免疫沉淀而出现两条非常浅的条带之外，没有PrP发生免疫沉淀。针对PrP的β1链产生的IgM抗体1A1能够免疫沉淀来自RML(小鼠瘙痒病品系)和263K(仓鼠瘙痒病品系)的瘙痒病蛋白。在Tg20泳道中有浅的条带，可能是由于在过表达PrP的小鼠脑部中有错误折叠PrP的少量表达。我们的数据表明，1A1仅能够识别小鼠和仓鼠脑中的瘙痒病PrP，而不能识别野生型PrP。
实施例4-YML肿瘤靶标
检测1A1抗体其结合正常细胞和肿瘤细胞的能力。作为对照，使用抗PrPC抗体6D11来鉴定每一种细胞类型中PrP的表达水平。使用HUVEC(人脐静脉上皮细胞)作为正常细胞类型通过流式细胞术来观察抗体结合细胞的能力。显示了结合八种类型肿瘤细胞的数据。所测试的五种癌细胞为来自小鼠的永生化细胞系(B16-黑色素瘤，NSC34-运动神经元/成神经细胞瘤杂合体)和人(HL60-早幼粒细胞白血病，MO3.13-少突胶质细胞/肌肉杂合体，SiHa-宫颈癌)。其余所测试的癌症细胞为在BritishColumbia Cancer Agency已经Living Tumor Laboratory(LTL)增殖的原代肿瘤细胞。原代人肿瘤在免疫缺陷小鼠的肾小囊下增殖。这使得原始的肿瘤结构和表型与最初采集的肿瘤保持一致。已测试了结合1A1抗体的三种肿瘤为LTL-013(大的弥散性B-细胞淋巴瘤)、LTL-257(结肠直肠肉瘤)和LTL-323(黑色素瘤)。
结果显示在图4中。黑色柱状图为用同种型对照抗体所观察到的染色结果，而以黑线显示的柱状图为用特异性抗体6D11或1A1的染色结果(如指示)。PrP在显示的所有九种细胞类型中均表达。1A1抗体显示了对正常HUVEC细胞和白血病细胞(HL60)的极低结合。1A1抗体显示了对显示的其他七种肿瘤细胞可检测的结合。
实施例5-肿瘤模型中的效力
测试1A1抗体在雌性C57Bl/6小鼠中改变鼠类黑色素瘤(B16)生长的能力。在研究的第0天，将3×105个肿瘤细胞皮下植入12只小鼠的侧腹。将小鼠随机分为两个处理组。组1用PBS处理。组2用1A1抗体按10mg/kg处理。在第1、2和5天处理小鼠。
从第2天开始用测径器通过测量肿瘤直径来监测肿瘤生长。获取肿瘤长度和宽度的测量值并根据方程L×W2/2来计算肿瘤体积，长度(mm)为肿瘤的长轴。一旦肿瘤负荷过重，就根据标准的动物护理程序来处死小鼠。图5显示了在两个处理组中肿瘤生长的进程，其中截至终止前从头至尾记录了肿瘤体积。两组间在肿瘤生长上存在显著差异(配对t检验＝0.012；Wilcoxin＝0.007)，表明1A1抗体已产生了治疗效果。
所有引用文献均通过引用并入本文，视同每一出版物均单独明确指出通过引用并入本文，并视同已在本文中完全公开。本文引用的参考文献不应被解释为或认为是承认这些参考文献是本发明的现有技术。
已经通过实施例描述了本发明一个或多个目前优选的实施方案。本发明包括基本如上文描述并参考实施例和图形的所有实施方案、修改和变体。对本领域技术人员显而易见的是，可进行大量改变和修改，而不背离权利要求书中定义的本发明的范围。此类修改的实例包括在本发明任一方面中为了以基本相同的方式实现相同结果而进行的已知等同方案的替换。
Claims (41)
1.与错误折叠的PrP的YML表位结合的抗体或其片段。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体与PrPSc选择性结合。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体不与PrPC特异性结合。
4.权利要求1到3任一项的抗体，其中所述表位存在于选自以下一个或多个的序列中：GGYMLGS、GGYMLG、GYMLGS、GGYML、YMLGS、GYML和YMLG(SEQ ID NO：8-14)。
5.权利要求1到4任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求1到5任一项的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
7.权利要求1到6任一项的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA。
8.权利要求1到7任一项的抗体，其通过培养以登录号260210-01保藏于加拿大国际保藏机构的杂交瘤而产生。
9.免疫缀合物，其包含权利要求1到8任一项的抗体，以及与之缀合的选自一种或多种检测标记和细胞毒素的试剂。
10.针对与错误折叠的PrP选择性结合之抗体的免疫原性肽，所述肽包含YML序列。
11.权利要求10的肽，其中所述肽选自SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14序列中的一个或多个。
12.权利要求10的肽，其还包含免疫原性载体，以增强所述肽的免疫原性。
13.包含权利要求1到8任一项所述抗体的组合物。
14.包含权利要求9所述免疫缀合物的组合物。
15.包含权利要求10到12任一项所述肽的组合物。
16.权利要求13到15任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
17.权利要求16的组合物，其还包含药物载体。
18.权利要求1到8任一项的抗体、权利要求9的免疫缀合物、权利要求10到12任一项的肽或权利要求13到17任一项的组合物用于治疗与错误折叠PrP相关的疾病或病症的用途。
19.包含权利要求10到12任一项所述肽或权利要求9所述免疫缀合物的疫苗用于治疗与错误折叠PrP相关的疾病或病症的用途。
20.权利要求18或权利要求19的用途，其用于治疗与PrPSc相关的疾病或病症。
21.权利要求18到20任一项的用途，其中所述疾病或病症选自Gerstmann-
-Scheinker病(GSS)、家族性克罗伊茨费尔特-雅各布病、偶发性克罗伊茨费尔特-雅各布病、医源性克罗伊茨费尔特-雅各布病、变型克罗伊茨费尔特-雅各布病、致命性家族性失眠症、瘙痒病、库鲁病、海绵状脑病、传染性水貂脑病、慢性萎缩病、猫科海绵状脑病和外来有蹄类脑病。
22.权利要求18或权利要求19的用途，其用于治疗包含表达错误折叠PrP之致瘤细胞的肿瘤。
23.权利要求22的用途，其中所述肿瘤具有YML+表型。
24.用于治疗或预防与错误折叠PrP相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1到8任一项所述抗体、权利要求9所述免疫缀合物、权利要求10到12任一项所述肽或权利要求13到17任一项所述组合物。
25.对患有或有风险发生与错误折叠PrP相关的疾病或病症的受试者进行免疫的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的包含权利要求10到12任一项所述肽的疫苗。
26.权利要求24或25的方法，其中所述疾病或病症与PrPSc相关。
27.权利要求24到26任一项的方法，其中所述疾病或病症选自Gerstmann-
-Scheinker病(GSS)、家族性克罗伊茨费尔特-雅各布病、偶发性克罗伊茨费尔特-雅各布病、医源性克罗伊茨费尔特-雅各布病、变型克罗伊茨费尔特-雅各布病、致命性家族性失眠症、瘙痒病、库鲁病、海绵状脑病、传染性水貂脑病、慢性萎缩病、猫科海绵状脑病和外来有蹄类脑病。
28.权利要求24或权利要求25的方法，其用于治疗包含表达错误折叠PrP之致瘤细胞的肿瘤。
29.权利要求28的方法，其中所述肿瘤具有YML+表型。
30.杂交瘤细胞系，其产生与错误折叠PrP的YML表位结合的单克隆抗体。
31.权利要求30的杂交瘤细胞系，其中所述错误折叠的PrP是PrPSc。
32.权利要求30的杂交瘤细胞系，其为以登录号260210-01保藏于加拿大国际保藏机构的杂交瘤及其后代和衍生物。
33.权利要求30的杂交瘤细胞系，其中所述YML表位存在于序列GGYMLGS(SEQ ID NO：8)中。
34.用于检测样品中错误折叠的PrP的方法，其包括：
(a)使生物样品与权利要求1到8任一项所述抗体或权利要求9所述免疫缀合物在允许所述抗体或所述免疫缀合物与所述错误折叠PrP之间形成复合物的条件下接触，和
(b)检测所述复合物作为该生物样品中存在错误折叠PrP的指标。
35.权利要求34的方法，其中通过免疫印迹检测所述复合物。
36.权利要求34或35的方法，其中所述错误折叠的PrP是PrPSc。
37.产生与错误折叠PrP的YML表位结合的抗体的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求30到33任一项所述杂交瘤细胞系在使抗体被释放到培养上清液中的条件下进行培养；和
(b)从所述上清液中分离所述抗体。
38.权利要求37的方法，其中所培养的杂交瘤是登录号260210-01的杂交瘤。
39.产生与错误折叠PrP的YML表位结合的抗体的方法，所述方法包括：
(a)用权利要求10到12任一项的肽免疫受试者；和
(b)从该受试者的组织中分离所述抗体，或从由所述组织制备的杂交瘤中分离所述抗体。
40.用于检测生物样品中错误折叠PrP的存在情况的试剂盒，其包含：
(a)与错误折叠PrP的YML表位特异性结合的一种或多种抗体或抗血清；和
(b)其使用说明。
41.权利要求40的试剂盒，其还包含一种或多种检测试剂。
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Application publication date: 20120926 |