CN103370337B - 用于产生针对金属酶的抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了用于产生抑制金属酶的抗体的方法。所述方法包括用以下各项来免疫受试者:（i）具有与金属酶的催化结构域类似的结构和电子性能的合成的锌模拟化合物;以及（ii)金属酶。还披露了通过所述方法生产的抗体以及其应用。

Description

用于产生针对金属酶的抗体的方法
技术领域
本发明，在其一些实施方式中，涉及用于产生针对金属酶的抗体的方法，更具体地但并非排他地涉及MMP-7和炭疽致死因子(ALF)。
背景技术
基质金属蛋白酶(MMP)是参与细胞外基质(ECM)的重塑的关键酶。这些酶能够破坏关节软骨或基膜的各种结缔组织成分。
人MMP基因家族由至少28种结构相关蛋白组成，其共享类似的整体球形拓扑结构。每种MMP被分泌为无活性的、潜在的酶原。催化的锌结构域由约180个氨基酸构成，其中高度保守序列HE-GH-LGL-H提供三个组氨酸(即，H)残基，其结合于金属Zn(2+)离子。在酶原中催化锌离子的向外（向前，forth）结合位点结合于半胱氨酸残基(Morgunovaetal.,1999)，其在酶激活以后与活性位点分离(VanWartandBirkedal-Hansen,1990)。因此，在激活的MMP中的向外结合位点被水分子占据，其还氢键键合于保守的谷氨酸残基。该过程有利于用活化的水分子水解目标底物的肽键。
MMP-7(在文献中也称为"基质溶解因子")在正常和病变组织的上皮细胞中表达并且能够消化位于细胞外基质中的一个较大系列的蛋白。这些包括胶原IV和X、明胶、酪蛋白、层粘连蛋白、聚集蛋白聚糖、巢蛋白、弹性蛋白和多能聚糖。MMP-7似乎在其他蛋白酶（如血纤蛋白溶酶原、MMP-1、MMP-2、和MMP9）的活化中发挥作用。除了它在结缔组织重塑中的作用以外，MMP-7已显示在一些恶性肿瘤中表达并在肿瘤侵袭和转移中可能发挥重要作用。在结构上，MMP-7是最小的MMP并由两个结构域组成：原结构域，其在活化以后被切割，和催化结构域，其包含锌结合位点。数种出版物已经表明，MMP蛋白，以及尤其是MMP-7，与卵巢癌和其他癌症如肾细胞癌相关。它还表明是卵巢癌的候选生物标志物，参见，例如，Wangetal.(2005)Int.J.Cancer114(1):19-31;Wangetal.(2006)Int.J.Cancer118(4):879-88;Maureletal.(2007)Int.J.Cancer121(5):1066-1071；以及Sarkissianetal.(2008)Clin.Chem.54(3):574-581。
炭疽是由形成孢子的细菌炭疽杆菌引起的高致命性传染病。在2001年，通过美国邮件系统的炭疽孢子的蓄意分发导致在接触吸入性炭疽的11位个体中5人死亡，其突显在恐怖主义和战争中由炭疽的潜在使用所造成的巨大威胁。吸入性炭疽的致命性主要是由于炭疽毒素的作用。细菌产生三种毒素成分；它们是保护性抗原(PA)、致死因子(LF)、和水肿因子(EF)。PA连同LF一起形成致死毒素(LT)并且PA连同EF一起形成水肿毒素(ET)。PA充当载体来调节LF和EF的细胞摄取。LF是金属酶，其切割促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)，并且当在动物体内连同PA一起注射时可以复制炭疽病的症状。EF是钙-钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶，其在宿主中具有一些毒性作用。这些毒素是炭疽病的显性毒性因子。
目前，对于炭疽病，除抗生素以外，没有批准的疗法。然而，用抗生素进行的治疗具有相当大的局限性。暴露于细菌，接着细菌分裂，会导致产生大量的炭疽毒素。因此，除非对于积极的抗生素治疗足够早地诊断出暴露，甚至在杀死所有细菌以后患者也将死于疾病。由美国食品和药物管理局批准的目前的疫苗还不能有效地保护新感染个体，因为它需要重复给予并且需要至少4周来发展保护滴度。
国际专利申请WO2004/087042和WO2008/102359教导了产生靶向催化锌离子和在动物体内自然表达的MMP的酶表面的抗体。
美国专利申请号20100119520教导了针对炭疽致死因子的单克隆抗体。
美国专利申请号20100227335教导了针对MMP-7的单克隆抗体。
发明内容
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种抗体，该抗体包含抗原识别区，其结合炭疽致死因子(ALF)的催化位点，其中抗体抑制ALF的活性。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种抗体，该抗体包含抗原识别区，其结合MMP-7的催化位点，其中抗体抑制MMP-7的活性以及其中抗体对于MMP-7的Ki是比抗体对于MMP2或MMP9的Ki低至少5倍。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于产生抑制金属酶的抗体的方法，该方法包括用以下各项来免疫受试者：
(i)合成的锌模拟化合物，其具有与金属酶的催化结构域类似的结构和电子性能；以及
(ii)金属酶，
从而产生抑制金属酶的抗体。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了杂交瘤细胞系，其表达识别炭疽的抗体。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了杂交瘤细胞系，其表达识别MMP-7的抗体。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了由炭疽杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了由MMP-7杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于治疗在需要其的受试者体内与MMP-7的不平衡或异常活性相关疾病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的抗MMP-7的抗体，从而治疗受试者体内与MMP-7的不平衡或异常活性相关的疾病。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于诊断受试者体内与MMP-7的不平衡或异常活性相关疾病的方法，该方法包括使受试者的样品与本发明的抗体接触，以便分析MMP-7的表达，其中MMP-7的表达上调指示与MMP-7的不平衡或异常活性相关的疾病。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于治疗或预防在需要其的受试者体内炭疽病的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本发明的抗体，从而治疗或预防炭疽病。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于诊断受试者体内炭疽感染的方法，该方法包括使受试者的样品与本发明的抗体接触，以便分析ALF的表达，其中ALF的表达指示炭疽感染。
按照本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含本发明抗体的药物组合物。
按照本发明的一些实施方式，抗原识别区结合具有通式(I)的化合物：
其中：
m和n各自独立地为1至6的整数；
X1-X3和Y1-Y3各自独立地为O或S；
R1-R3各自独立地选自由氢、烷基、和环烷基组成的组；以及
R是(CH2)x-C(=O)NR'-(CH2)y-NR'R''
其中：
x和y各自独立地为1至6的整数；和
R'和R''各自独立地选自由氢、烷基、和环烷基组成的组。
按照本发明的一些实施方式，抗原识别区结合在ALF的催化锌位点内配位氨基酸的金属离子。
按照本发明的一些实施方式，抗原识别区还结合在ALF的催化锌位点内配位氨基酸的金属离子的金属离子。
按照本发明的一些实施方式，金属酶是MMP-7或ALF。
按照本发明的一些实施方式，锌模拟化合物具有通式(I)：
其中：
m和n各自独立地为1至6的整数；
X1-X3和Y1-Y3各自独立地为O或S；
R1-R3各自独立选自由氢、烷基、和环烷基组成的组；以及
R是(CH2)x-C(=O)NR'-(CH2)y-NR'R''
其中：
x和y各自独立地为1至6的整数；和
R'和R''各自独立地选自由氢、烷基、和环烷基组成的组。
按照本发明的一些实施方式，通过首先用(i)免疫并且随后用(ii)免疫来进行免疫。
按照本发明的一些实施方式，通过用(i)和(ii)的共免疫来进行免疫。
按照本发明的一些实施方式，金属酶并非由受试者自然地表达。
按照本发明的一些实施方式，抗体连接至可检测部分或治疗部分。
按照本发明的一些实施方式，疾病是癌症或炎性肠病。
按照本发明的一些实施方式，预防性地进行给予。
除非另有界定，本文中所使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。虽然在本发明的实施方式的实践或测试中可以使用类似于或等效于本文描述的那些方法和材料的方法和材料，以下将描述示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书（包括定义）为准。另外，这些材料、方法、和实施例仅是说明性的而并非旨在进行必要限制。
附图说明
本文仅通过举例的方式并参照附图来说明本发明的一些实施方式。现在详细地具体参照附图，需要强调的是，示出的详细情况是通过举例的方式，并且用于本发明的实施方式的说明性讨论。在这方面，连同附图一起进行描述使本领域技术人员清楚如何实施本发明的实施方式。
在附图中：
图1A-图1D示出识别合成的模拟分子和靶向锌依赖性金属酶的交叉反应活性mAb的分离。A.通过针对合成的锌模拟抗原接着人MMP-7的免疫作用而提高的mAb的交叉反应性。通过直接抗原ELISA（其上吸收有合成的锌模拟表位、人MMP-7或BSA作为抗原）来确定来自不同稀释度的杂交瘤上清的抗体的亲和力。B.通过针对合成的锌模拟抗原接着炭疽致死因子的免疫作用而提高的mAb的交叉反应性。通过直接抗原ELISA（其上吸收有合成的模拟锌表位、炭疽致死因子或BSA作为抗原）来确定来自不同稀释度的杂交瘤上清的抗体的亲和力。C.在具有半透明表面的二级结构图中示出的人MMP-7催化结构域，锌离子(橙色球)，催化位点组氨酸显示为棒杆(PDB:1MMQ)。D.在具有半透明表面的二级结构图中示出的炭疽致死因子催化结构域，锌离子(橙色球)，催化位点组氨酸和谷氨酸显示为棒杆(PDB:1J7N)。
具体实施方式
本发明，在其一些实施方式中，涉及用于产生抗金属酶的抗体的方法，更具体地但并非排他地涉及MMP-7和炭疽致死因子(ALF)。
基质金属蛋白酶参与许多生物过程，范围从细胞增殖，细胞分化，细胞外基质(ECM)的重塑，至血管形成，和细胞迁移。这些过程需要在基质金属蛋白酶(MMP)的功能和其天然组织抑制剂(TIMP)之间的微妙平衡。这种平衡的丧失是许多病理状况（包括转移性肿瘤、神经退行性疾病和骨关节炎）的标志。在本领域中，许多MMP抑制剂是已知的，包括小肽抑制剂如hydroxomate、非微生物四环素和单克隆抗体。
本发明的发明人已先前发现，识别金属酶的催化位点的电子和结构决定子的抗体可以用作其有效抑制剂。利用模拟金属酶的金属结合催化位点的半抗原作为免疫原能够产生高效治疗抗体，这表明能够治疗特点为升高的金属蛋白活性的临床病症(参见WO2004/087042和WO2008/102359)。
本发明的发明人现已表明，用上文描述的模拟半抗原和金属酶本身进行的免疫可以产生高度选择性抗体（金属体（metallobody））。
本发明的发明人通过用以下各项进行免疫证明了这种免疫方式的可行性：a)Imisdp作为模拟半抗原和MMP-7作为金属酶；以及b)Imisdp作为模拟半抗原和炭疽致死因子作为金属酶。产生针对MMP-7或炭疽致死因子(ALF)的抗体，参见图1A-D。
这些结果表明本发明的免疫方式的一般性原则以及产生靶向所选金属酶的金属体的可行性。
因此按照本发明的一个方面，提供了用于产生抑制金属酶的抗体(或其片段)的方法，该方法包括用以下各项来免疫受试者：
(i)合成的锌模拟化合物，其具有与金属酶的催化结构域类似的结构和电子性能；以及
(ii)金属酶，
从而产生抑制金属酶的抗体。
利用本发明的教导，可以被抑制的金属酶的实例包括但不限于中性白细胞胶原酶、胶原酶-3、明胶酶A、明胶酶B、基质溶素-2和3、基质溶解因子、巨噬细胞弹性蛋白酶；膜型MMP、聚集蛋白聚糖酶、细胞因子转化酶、黏着分子"脱落酶"、内皮素转化酶、血管紧张素转化酶、中性内肽酶、FTSH-细菌蛋白酶、金属内酰胺酶(carbapenases)、细菌毒素例如，炭疽致死因子、破伤风毒素或腊肠毒素、ras法尼基蛋白转移酶、碳酸酐酶等。金属酶的其他实例披露于Hodgson,Bio/Technology,13:554(1995);Gordon,etal.,Clin.Exper.Rheum.,11(8):S91-S94(1993);Ray,etal.,Eur.Respir.J.,7:2062-2072(1994);O'Connor,etal.,Thorax,49:602-609(1994);Docherty,etal.,Tibtech,Vol.10,(1992);Newby,etal.,BasicRes.Cardiol.,89(Suppl):59-70;Freije,etal.,J.Biol.Chem.,269(24):16766-16773(1994);Shapiro,etal.,J.Biol.Chem.,268(32):23824-23829(1993);Belaauoaj,etal.,J.Biol.Chem.,27(24):14568-14575(1995);Gearing,etal.,LetterstoNature,Nature,370:555-557(1994);McGeehan,etal.,LetterstoNature,Nature,370:558-561(1994);Mohler,etal.,LetterstoNature,Nature,370:218-220(1994);Sato,etal.,LetterstoNature,Nature,370:61-65(1994);Crowe,etal.,J.Exp.Med.,181:1205-1210(1995);Payne,J.Med.Microbiol.,32:93-99(1993);Deshpande,etal.,Toxicon,33(4):551-557(1995);DePhillips,etal.,Eur.J.Biochem.,229:61-69(1995)。
按照一种实施方式，金属酶并非由受试者天然地表达(或以低水平表达)。这样的金属酶包括MMP-7、和细菌毒素(例如，炭疽致死因子)。
具有与金属酶的催化结构域类似的结构和电子性能的合成的锌模拟化合物通常是包含螯合金属离子的化合物。金属离子通常是锌或它的类似离子钴或镉。
按照一种实施方式，螯合剂是卟啉。
可以基于在靶多肽中实际催化结构域的结构和电子性能来选择锌模拟化合物。通常，靶多肽包括3个氨基酸，其提供过渡金属配位所需要的三个接触点。代表性的配位复合物几何形状可以是四面体、平面正方形或三角形，这取决于过渡金属离子。通常，本发明的模拟成分的选择是基于氨基酸侧链结构和配位的几何形状。通常，可以配位过渡金属结合的氨基酸是组氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其中前两种是优选的。
示例性合成的锌模拟化合物披露于WO2004/087042和WO2008/102359，其以引用方式结合于本文。
按照一种实施方式，合成的锌模拟化合物具有通式(I)：
其中：
m和n各自独立地为1至6的整数；
X1-X3和Y1-Y3各自独立地为O或S；
R1-R3各自独立地选自由氢、烷基、和环烷基组成的组；以及
R是(CH2)x-C(=O)NR'-(CH2)y-NR'R''
其中：
x和y各自独立地为1至6的整数；和
R'和R''各自独立地选自由氢、烷基、和环烷基组成的组。
按照本发明这方面的一种优选实施方式，化合物是[2-(2-亚氨基乙基甲酰基)-乙氧基甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷，称作Imisdp，具有通式(II)：
其中R=-CH2-C(=O)NH-CH2-CH2-NH2
如前面提到的，通过用上文描述的锌模拟化合物和金属酶本身进行免疫来实施本发明的方法。
本发明考虑用全长金属酶或其部分进行免疫。通常，上述部分应包含抗原决定簇(即表位)，其对于特定金属酶具有特异性。
按照一种实施方式，抗原决定簇是在金属酶的表面上。
用于免疫的金属酶可以从它的体内环境中纯化或可替换地可以通过重组方式来产生。
按照一种实施方式，免疫操作包括用锌模拟化合物进行初次免疫以及随后(例如，3-12周以后)用金属酶进行免疫。可以通过检查以看看是否在免疫动物(例如小鼠)中存在免疫反应来确定免疫的确切时间。例如，可以分析在血清中抗体的滴度。
按照另一种实施方式，免疫操作包括用金属酶进行初次免疫以及随后(例如3-12周以后)用锌模拟化合物进行免疫。
按照又一种实施方式，免疫操作包括用金属酶和锌模拟化合物两者进行共免疫。
如在本文中所使用的，术语"抗体"是指完整的抗体分子，而短语“抗体片段”是指其功能片段，如Fab、F(ab')2、和Fv，其能够结合至巨噬细胞。这些功能抗体片段的定义如下：(i)Fab，包含抗体分子的单价抗原-结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化全抗体来产生从而生成完整轻链和一个重链的一部分；(ii)Fab'，抗体分子的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原来获得，从而产生完整轻链和重链的一部分；每个抗体分子获得两个Fab'片段；(iii)(Fab')2，抗体的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理全抗体而没有随后的还原来获得；F(ab')2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体；(iv)Fv，定义为基因工程片段，其包含轻链的可变区和重链的可变区（表达为两个链）；(v)单链抗体("SCA")，基因工程分子，其包含轻链的可变区和重链的可变区，通过适当的多肽接头加以连接，成为基因融合的单链分子；以及(vi)肽，其编码单一互补决定区(CDR)。
用于产生抗体(即，单克隆和多克隆)的方法是本领域中众所周知的。可以通过本领域已知的数种方法中任何一种来产生抗体，所述方法可以采用：诱导体内生产抗体分子，筛选免疫球蛋白库或如以下披露的高度特异性结合试剂的板[OrlandiD.R.etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833-3837,WinterG.etal.(1991)Nature349:293-299]，或通过在培养物中连续细胞系来产生单克隆抗体分子。这些方法包括但不限于杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术，和EB病毒(EBV)-杂交瘤技术[KohlerG.,etal.(1975)Nature256:495-497,KozborD.,etal.(1985)J.Immunol.Methods81:31-42,CoteR.J.etal.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030,ColeS.P.etal.(1984)Mol.Cell.Biol.62:109-120]。
在本发明的化合物太小以致不能诱发强免疫源应答的情况下，可以将这类抗原(半抗原)结合至抗原中性载体上如钥孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白[例如，牛血清白蛋白(BSA)]载体(参见美国专利号5,189,178和5,239,078以及实施例部分的实施例2)。可以利用本领域中众所周知的方法来结合至载体；例如，可以直接结合至氨基并且可选地接着还原形成的亚氨基键。可替换地，可以利用缩合剂如二环己基碳二亚胺或其他碳二亚胺脱水剂来结合载体。还可以用接头化合物来进行结合，同型双功能和异型双功能接头均可获自PierceChemicalCompany,Rockford,Ill。然后可以将产生的免疫原复合物注射到适当的哺乳动物受试者体内如小鼠、兔等。合适的方案涉及在佐剂存在的条件下按照时间表（其提高在血清中抗体的生产）重复注射免疫原。可以利用在本领域中众所周知的免疫测定程序来容易地测量免疫血清的滴度。
可以直接使用获得的抗血清或可以获得单克隆抗体（如上文描述的）。
利用本领域中众所周知的方法，可以获得抗体片段(参见例如，HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1988，其以引用方式结合于本文)。例如，可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码片段的DNA来制备按照本发明的抗体片段。
可替换地，可以通过常规方法通过全抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生抗体片段，从而提供5S片段，其表示为F(ab')2。可以利用硫醇还原剂、以及可选地用于硫氢基（来自二硫键切割）的保护基团来进一步切割该片段，从而产生3.5SFab'单价片段。可替换地，利用胃蛋白酶进行的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段。这些方法描述于，例如，Goldenberg的美国专利号4,036,945和4,331,647，以及其中包含的参考文献，这些专利的全部内容以引用方式结合于本文。还参见Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959。还可以使用切割抗体的其他方法，如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步切割，或其他酶学、化学、或基因技术，只要片段结合于由完整抗体识别的抗原。
Fv片段包含VH和VL链的结合。这种结合可以是非共价的，如描述于Inbaretal.,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA69:2659-62,1972。可替换地，可以通过分子间二硫键来连接可变链或通过化学物质如戊二醛来交联可变链。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。通过构造包含DNA序列（其编码通过寡核苷酸连接的VH和VL结构域）的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载体，随后将其引入宿主细胞如大肠杆菌。重组宿主细胞合成单一多肽链，其具有桥连两个V结构域的接头肽。用于产生sFv的方法描述于，例如，WhitlowandFilpula,Methods,2:97-105,1991;Birdetal.,Science242:423-426,1988;Packetal.,Bio/Technology11:1271-77,1993；以及Ladner等人，美国专利号4,946,778。
可以通过构造编码感兴趣的抗体的CDR的基因来获得CDR肽("最小识别单元")。例如，通过利用聚合酶链反应由抗体生成细胞的RNA合成可变区，来制备这类基因。参见，例如，LarrickandFry,Methods,2:106-10,1991。
应当理解的是，对于人类治疗或诊断，优选使用人源化抗体。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自非人类物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基（具有所期望的特异性、亲和力和能力）来替换来自受体的互补决定区(CDR)的残基。在一些情况下，用相应的非人残基来替换人免疫球蛋白的Fv构架残基。人源化抗体还可以包含在受体抗体和在输入CDR或构架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体可以包括基本上全部中的至少一个，并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体最佳地还可以包括至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区[Jonesetal.,Nature,321:522-525(1986);Riechmannetal.,Nature,332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
用于人源化非人抗体的方法是本领域中众所周知的。通常，人源化抗体具有由非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称作输入残基，其通常来自输入可变结构。可以基本上按照Winter和同事的方法[Jonesetal.,Nature,321:522-525(1986);Riechmannetal.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyenetal.,Science,239:1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行人源化。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著地少于完整人可变域已由来自非人类物种的相应序列所替代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基所替代。
还可以利用在本领域中已知的各种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库[HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术还可用于人单克隆抗体的制备(Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)andBoerneretal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如，小鼠（其中已部分或完全灭活内源性免疫球蛋白基因）来制备人抗体。在攻击以后，观测人化抗体生产，其在所有方面非常类似于在人类中看到的情况，包括基因重排、装配、和抗体谱。这种方式例如描述于美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016，以及以下科学出版物：Marksetal.,Bio/Technology10,779-783(1992);Lonbergetal.,Nature368856-859(1994);Morrison,Nature368812-13(1994);Fishwildetal.,NatureBiotechnology14,845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14,826(1996);LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
在获得抗体以后，可以测试它们的金属酶抑制活性和亲和力。用于金属蛋白抑制活性的适当的测定条件描述于Knightetal.,FEBSLetters296(3):263-266(1992),Cawstonetal.,Anal.Biochem,99:340-345(1979),Cawstonetal.,MethodsinEnzymology80:771etseq.(1981);Cawstonetal.,Biochem.J.,195:159-165(1981),Weingartenetal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,139:1184-1187(1984)以及美国专利号4,743,587和5,240,958。
如前面提到的，利用上述方法，本发明的发明人能够产生识别炭疽致死因子(ALF)的抗体和识别MMP-7的另外抗体。
因此，按照本发明的另一个方面，提供了抗体，该抗体包含抗原识别区，其结合炭疽致死因子(ALF)的催化位点，其中抗体抑制ALF的活性。
按照本发明的又一个方面，提供了抗体，该抗体包含抗原识别区，其结合MMP-7的催化位点，其中抗体抑制MMP-7的活性。
本发明这方面的抗体对于MMP-7通常具有非常高的结合亲和力和特异性，其中EC50为约1-500nM，更通常为约1-250nM，更通常为约1-100nM以及甚至更通常为约1-50nM。本发明这方面的抗体对于MMP-7通常显示紧密结合抑制模式(Ki=1-500nM以及更优选50-200nM)，Ki比针对其他MMP如MMP2、MMP9或MMP14的抗体的Ki低至少2倍、至少5倍或甚至至少10倍。
抗体可以结合至催化位点的金属配位离子但并不结合至金属离子本身，或可替换地抗体可以结合至在活性位点口袋（activesitepocket）中存在的金属离子和它的配位离子两者。
按照本发明的另一个方面，提供了单克隆抗体，其产生自杂交瘤细胞系（在下文的实施例1中举例说明）。
本发明还提供了任何(多)肽序列，其包含这些抗体的CDR序列的至少一种以及其同系物和片段，只要保留它的金属酶抑制活性(金属蛋白的催化活性的特异性抑制)。这样的多肽的一个实例是抗体(参见上文)。
如在本文中所使用的，术语"多肽"涵盖天然肽(降解产物、以合成方式合成的肽或重组肽)和拟肽类(通常为以合成方式合成的肽)、以及类肽和半类肽（其是肽类似物），其可以具有，例如，修饰，这使得肽在体内期内更加稳定或更能够渗入细胞。这类修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰，其包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH、主链修饰，以及残基修饰。用于制备拟肽化合物的方法是本领域中众所周知的并说明于，例如，QuantitativeDrugDesign,C.A.RamsdenGd.,Chapter17.2,F.ChoplinPergamonPress(1992)，其以引用方式结合于本文就像在此完整地提出一样。下文提供在这方面的进一步详情。
在肽内的肽键(-CO-NH-)可以被以下各项取代，例如，N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基，例如，甲基，卡巴（carbabond）(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH=CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是自然地存在于碳原子上的"正常"侧链。
这些修饰可以发生在沿着肽链的任何键处，并且甚至同时发生在数个(2-3)个键处。
天然芳族氨基酸，Trp、Tyr和Phe，可以取代合成的非天然酸如苯基甘氨酸、Tic、萘基丙氨酸(Nal)、苯基异丝氨酸、苏氨醇、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或邻-甲基-Tyr。
除上述以外，本发明的肽还可以包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复杂的碳水化合物等)。
如在本说明书中和在以下权利要求部分中所使用的，术语"一个氨基酸"或"多个氨基酸"应当理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些通常在体内翻译后修饰的氨基酸，包括，例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。另外，术语"氨基酸"包括D-和L-氨基酸。
以下表1和2列出天然存在的氨基酸(表1)和非常规的或修饰的氨基酸(例如，合成的，表2)，其可以用于本发明。
表1
氨基酸 三字母缩写词 单字母符号
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酰胺 Gln Q
谷氨酸 Glu E
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Iie I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
如上述的任何氨基酸 Xaa X
表2
可以通过本领域中众所周知的方法（包括噬菌体展示和计算生物学）来产生对于感兴趣的金属酶具有改善的亲和力或提高的生物活性的肽。
可以通过肽合成领域中的技术人员已知的任何技术来合成本发明的肽。对于固相肽合成，许多技术的汇总可以参见Stewart,J.M.andYoung,J.D.(1963),"SolidPhasePeptideSynthesis,"W.H.FreemanCo.(SanFrancisco)；和Meienhofer,J(1973)."HormonalProteinsandPeptides,"vol.2,p.46,AcademicPress(NewYork)。关于经典的溶液合成的综述，参见Schroder,G.andLupke,K.(1965).ThePeptides,vol.1,AcademicPress(NewYork)。关于重组技术，参见下文进一步的参考文献。
按照本发明的一些实施方式，可以将抗体结合至官能部分(也被称为“免疫结合物”)如可检测或治疗部分。免疫结合物分子可以是分离的分子如可溶性和/或合成的分子。
可以将各种类型的可检测部分或报告部分结合至本发明的抗体。它们包括但不限于放射性同位素(如[125]碘)、磷光化学品、化学发光化学品、荧光化学品(荧光团)、酶、荧光多肽、亲和标记物、和分子(造影剂)（可通过正电子发射断层照相(PET)或磁共振成像(MRI)加以检测）。
适宜的荧光团的实例包括但不限于藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-铬、罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、得克萨斯红、PE-Cy5等。关于荧光团选择的另外的指导，将荧光团连接于各种类型的分子的方法，参见RichardP.Haugland,“MolecularProbes:HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals1992–1994”,5thed.,MolecularProbes,Inc.(1994)；授权给OncoimmuninInc.的美国专利号6,037,137；Hermanson,“BioconjugateTechniques”,AcademicPressNewYork,N.Y.(1995)；KayM.etal.,1995.Biochemistry34:293；Stubbsetal.,1996.Biochemistry35:937；GakamskyD.etal.,“EvaluatingReceptorStoichiometrybyFluorescenceResonanceEnergyTransfer,”in“Receptors:APracticalApproach,”2nded.,StanfordC.andHortonR.(eds.),OxfordUniversityPress,UK.(2001)；授权给Targesome,Inc.的美国专利号6,350,466。当结合于荧光可检测部分时，可以用来检测抗体的荧光检测方法包括，例如，荧光激活流式细胞术(FACS)、免疫荧光共聚焦显微术、荧光原位杂交(FISH)和荧光共振能量转移(FRET)。
可以将多种类型的酶连接于本发明的抗体[例如，辣根过氧化物酶(HPR)、β-半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶(AP)]并可以利用ELISA(例如，在溶液中)、酶联免疫组织化学测定(例如，在固定组织中)、酶联化学发光测定(例如，在电泳分离的蛋白混合物中)或本领域中已知的其他方法来检测酶结合抗体[参见例如，KhatkhatayMI.andDesaiM.,1999.JImmunoassay20:151-83;WisdomGB.,1994.MethodsMolBiol.32:433-40;IshikawaE.etal.,1983.JImmunoassay4:209-327;OellerichM.,1980.JClinChemClinBiochem.18:197-208;SchuursAH.andvanWeemenBK.,1980.JImmunoassay1:229-49]。
亲和标记物(或结合对的成员)可以是通过相应抗体可识别的抗原[例如，地高辛配基(DIG)，其被抗DIG抗体识别)或对于标记具有高亲和力的分子[例如，链霉亲和素和生物素]。结合亲和标记物的抗体或分子可以荧光标记或结合至上文所述的酶。
在本领域中广泛使用的各种方法可以用来将链霉亲和素或生物素分子连接至本发明的抗体。例如，可以通过生物素蛋白连接酶(例如，BirA)的识别序列将生物素分子连接于本发明的抗体，如在以下实施例部分和在Denkberg,G.etal.,2000.Eur.J.Immunol.30:3522-3532中所描述的。可替换地，可以将链霉亲和素分子连接于抗体片段，如单链Fv，基本上如在以下所描述：CloutierSM.etal.,2000.MolecularImmunology37:1067-1077;DubelS.etal.,1995.JImmunolMethods178:201;HustonJS.etal.,1991.MethodsinEnzymology203:46;KipriyanovSM.etal.,1995.HumAntibodiesHybridomas6:93;KipriyanovSM.etal.,1996.ProteinEngineering9:203;PearceLA.etal.,1997.BiochemMolecBiolIntl42:1179-1188。
结合至链霉亲和素的功能部分，如荧光团，可商业上获自免疫荧光流式细胞术试剂的基本上所有主要供应商(例如，Pharmingen或Becton-Dickinson)。
按照本发明的一些实施方式，将生物素结合的抗体结合至链霉亲和素分子以形成多价成分(例如，抗体的二聚体或四聚体形式)。
表3提供可结合至本发明抗体的可识别部分的非限制性实例。
表3
如前面提到的，可以将抗体结合至治疗部分。治疗部分可以是，例如，细胞毒性部分、毒性部分、细胞因子部分和二抗部分，其包括对于本发明的抗体不同的特异性。
下表4提供了可以结合至本发明抗体的治疗部分的非限制性实例。
表4
可以将官能部分(本发明的可检测或治疗部分)以各种方式附连或结合至本发明的抗体，这取决于上下文、应用和目的。
当官能部分是多肽时，可以通过重组方式来产生免疫结合物。例如，可以将编码毒素(例如，PE38KDEL)或荧光蛋白[例如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或黄色荧光蛋白(YFP)]的核酸序列框内连接于编码本发明抗体的核酸序列并在宿主细胞中表达，从而产生重组结合抗体。可替换地，可以通过，例如，以限定次序逐步加入一个或多个氨基酸残基如固相肽合成技术，来化学合成官能部分。
还可以利用在本领域中广泛实行的标准的化学合成技术将官能部分附连至本发明的抗体[参见例如，hypertexttransferprotocol://worldwideweb(dot)chemistry(dot)org/portal/Chemistry)]，如利用任何适宜的化学键（直接或间接的），如通过肽键(当官能部分是多肽时)，或通过共价键连至干扰接头元件，如接头肽或其他化学部分，如有机聚合物。可以通过在肽的羧基(C)或氨基(N)末端处的键合，或通过键连至内部化学基团如直链、支链或环状侧链，内部碳原子或氮原子等，来连接嵌合肽。在美国专利号3,940,475、4,289,747、和4,376,110中详细提供了抗体的荧光标记的描述。
下文描述了用于将肽部分(治疗或可检测部分)结合至本发明抗体的示例性方法。
SPDP结合–SPDP结合方法的非限制性实施例描述于Cumberetal.(1985,MethodsofEnzymology112:207-224)。简言之，使肽，如可检测或治疗部分(例如，1.7mg/ml)与10倍过量的SPDP(50mM，在乙醇中)混合；使抗体与处于20mM磷酸钠、0.10MNaClpH7.2中的25倍过量的SPDP混合，并在室温下温育每个反应约3小时。然后相对于PBS来透析反应。将肽还原，例如，在室温下使用50mMDTT持续1小时。通过在G-25柱(达到5%样品/柱体积)上的平衡，使用50mMKH2PO4pH6.5来将还原肽脱盐。以1:10抗体:肽的摩尔比率将还原肽和SPDP-抗体合并，并在4°C下温育过夜，从而形成肽-抗体结合物。
戊二醛结合-戊二醛结合方法的非限制性实施例描述于G.T.Hermanson(1996,"AntibodyModificationandConjugation,inBioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego)。简言之，在10倍过量下，使抗体和肽(1.1mg/ml)与处于0.1M磷酸盐、0.15MNaClpH6.8中的0.05%戊二醛混合，然后允许在室温下反应2小时。可以添加0.01M赖氨酸以阻断过量位点。在反应以后，利用用PBS平衡的G-25柱(10%v/v样品/柱体积)来除去过量戊二醛。
碳二亚胺结合-可以利用脱水剂如碳二亚胺来完成肽与抗体的结合，例如，在4-二甲基氨基吡啶存在下。碳二亚胺结合可以用来在肽的羧基和抗体的羟基(导致形成酯键)、或抗体的氨基(导致形成酰胺键)或抗体的硫氢基(导致形成硫酯键)之间形成共价键。同样地，碳二亚胺结合可以用来在抗体的碳基和肽的羟基、氨基或硫氢基之间形成类似的共价键[参见，J.March,AdvancedOrganicChemistry:Reaction's,Mechanism,andStructure,pp.349-50&372-74(3ded.),1985]。例如，可以利用碳二亚胺（如二环己基碳二亚胺）通过共价键将肽结合至抗体[B.Neisesetal.(1978),AngewChem.,Int.Ed.Engl.17:522;A.Hassneretal.(1978,TetrahedronLett.4475);E.P.Bodenetal.(1986,J.Org.Chem.50:2394)以及L.J.Mathias(1979,Synthesis561)]。
如上文提到的，针对MMP-7的抗体的一种特定用途是预防或治疗与MMP-7的不平衡或异常活性相关的疾病。
这类疾病的实例包括但不限于关节炎疾病，如骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)、脓毒性关节炎、软组织风湿病、多软骨炎和腱炎；转移性肿瘤、牙周病；角膜溃疡，如由碱或其他烧伤、由辐射、由维生素E或类视黄醇缺乏引起的；肾小球疾病，如蛋白尿、营养不良型大疱性表皮松解症（dytrophobicepidermolysisbullosa）；骨吸收病，如骨质疏松症、佩吉特病、甲状旁腺功能亢进症和胆脂瘤；通过防止排卵或植入的节育；血管发生，其涉及肿瘤生长或涉及与糖尿病性视网膜病和黄斑变性相关的新血管形成；与动脉粥样硬化性血小板破裂相关的冠状动脉血栓形成；肺气肿、伤口愈合和HIV感染。
按照一种实施方式，疾病是癌症。示例性癌症包括卵巢癌、肾细胞癌、结肠癌、乳癌、胃癌、直肠癌和前列腺癌。
按照另一种实施方式，疾病是炎性肠病(IBD)，其是严重的胃肠道疾病，特点在于肠炎和组织重塑，其会增加频率并可以证实患者致残。IBD的主要形式，溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病，是慢性的、复发性病症，其临床特点是腹痛、腹泻、直肠出血、和发热。
可以治疗的受试者包括哺乳动物受试者如人类。
针对MMP-7的抗体的另一种用途是诊断与MMP-7的表达上调相关的疾病。
因此，按照本发明的另一个方面，提供了用于诊断受试者体内与MMP-7的不平衡或异常活性相关疾病的方法，该方法包括使受试者的样品与本文描述的抗体接触以分析MMP-7的表达，其中MMP-7的表达上调指示与MMP-7的不平衡或异常活性相关的疾病。
利用所披露的抗体来分析MMP-7的表达的方法包括但不限于Western分析、免疫沉淀和免疫组织化学。
样品可以是液体如尿、唾液、脑脊液、血液、血清等；固体或半固体如组织、粪便等；或可替换地，固体组织如通常用于组织学诊断的那些固体组织。
通常，将MMP-7的量与对照(来自健康受试者的相应样品)或对应于健康受试者的MMP-7的已知量进行比较。
在诊断以后，可以将结果告知受试者。可以基于利用本文披露的MMP-7抗体的测试结果，进行进一步的另外的诊断测试。
应当理解的是，除体外进行诊断之外(即，对受试者的样品)，还可以体内进行诊断。
可以加以诊断的疾病包括针对可以治疗的疾病在前面列出的那些。
应当理解的是，针对炭疽致死因子的抗体的特定用途是炭疽感染的治疗或预防。
如在本文中所使用的，术语"炭疽"是指直接或间接由炭疽杆菌感染引起的疾病。吸入：初始症状可以类似于普通感冒-咽喉痛、轻度发烧、肌痛和不适。在数天以后，症状可以进展为严重的呼吸问题和休克。吸入炭疽通常是致命的。皮肤：当细菌进入在皮肤上的切口或擦伤处时，如当处理感染动物的受污染的羊毛、皮料、皮革或毛发制品(尤其是山羊毛发)时，可以发生炭疽感染。皮肤感染开始表现为凸起的发痒肿块，这类似于昆虫叮咬，但在1-2天内发展成水泡，然后发展成无痛性溃疡，通常直径为1-3cm，并在中心具有独特的黑色坏死(将死)区。在相邻区中的淋巴腺可以肿胀。约20%的皮肤炭疽的未经治疗病例将导致死亡。胃肠：炭疽的肠道疾病形式可以发生在消费受污染肉类之后并且特点在于肠道的急性炎症。恶心、食欲不振、呕吐、发热的初步迹象以后是腹痛、呕血、和严重腹泻。肠炭疽导致25%至60%的病例死亡。
治疗可以在炭疽感染以后进行或可以用作在预计感染以前进行预防。
在一些实施方式中，本文披露的单克隆抗体可以单独地或与其他抗体结合使用用于检测、预防人类体内的炭疽病和/或作为其疗法。例如，针对炭疽毒素的所有三种成分(PA、LF、和EF)的中和抗体的混合剂可以用于检测、预防和/或作为疗法。可替换地，可以使用成对的组合，例如，疗法可以包括抗PA抗体和抗LF抗体；抗PA和抗EF抗体；或抗LF和抗EF抗体。在本文披露的实施方式中可以使用的抗PA抗体包括但不限于在PCT公开号WO2007/084107中描述的那些抗PA抗体，其全部内容以引用方式结合于本文。
应当理解的是，识别炭疽致死因子(ALF)的抗体还可以用来诊断炭疽感染。
利用所披露的抗体来分析ALF的表达的方法包括但不限于Western分析、免疫沉淀和免疫组织化学。
样品可以是液体如尿、唾液、脑脊液、血液、血清等；固体或半固体如组织、粪便等；或可替换地，固体组织如通常用于组织学诊断的那些固体组织。
高于背景水平的ALF的任何量的检出可以指示炭疽感染。
应当理解的是，除体外进行诊断之外(即，对受试者的样品)，还可以体内进行诊断。在诊断以后，可以将结果告知受试者。基于利用本文披露的MMP-7抗体进行测试的结果，可以进行进一步的另外的诊断测试。
可以将本发明的抗体本身或作为药物组合物的一部分给予受试者。
如在本文中所使用的，"药物组合物"是指制剂，其包含本文描述的一种或多种活性组分和其他化学成分如生理上合适的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进将化合物给予生物体。
在本文中，术语"活性组分"是指对生物效应负责的抗体。
在下文中，可以互换使用的短语"生理学上可接受的载体"和"药用载体"是指这样的载体或稀释剂，其并不引起对生物体的显著刺激并且并不取消所给予化合物的生物活性和性能。这些短语包括佐剂。
在本文中，术语"赋形剂"是指惰性物质，其被加入药物组合物用来进一步促进活性组分的给予。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和给予药物的技术可以参见“Remington’sPharmaceuticalSciences,”MackPublishingCo.,Easton,PA，最新版，其以引用方式结合于本文。
给予的适宜途径可以，例如，包括口服途径、直肠途径、经粘膜途径，尤其是经鼻、肠道或胃肠道外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内注射，例如，进入右或左心室腔、进入总冠状动脉，静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。
用于药物递送至CNS的常规方式包括：神经外科策略(例如，脑内注射或脑室内灌注)；制剂的分子操作(例如，生产嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含对于内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽与本身不能穿越BBB的制剂结合)，以试图开发BBB的内源性转运途径之一；药理策略，其设计成用来增加制剂的脂质可溶性(例如，水溶性剂与脂质或胆固醇载体结合)；以及其中通过高渗性破坏(源于甘露醇溶液输注进入颈动脉或使用生物活性剂如血管紧张肽)短暂地破坏BBB的完整性。然而，这些策略的每一种均具有局限性，如与侵入性手术操作相关的内在风险，由内源性转运系统中固有的限制所提出的大小限制，与全身地给予由在CNS的外面可能具有活性的载体基序组成的嵌合分子相关的潜在地不希望的生物学副作用，以及在脑部区域（其中BBB被破坏）内可能的脑损伤的风险，这使得它是不理想的递送方法。
可替换地，能够以局部而不是全身方式来给予药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域。
术语“组织”是指由具有类似结构和/或共同功能的细胞聚集体组成的生物体的一部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
可以通过本领域中众所周知的过程来制造本发明的药物组合物，例如，通过常规混合、溶解、粒化、制作糖衣丸、磨细、乳化、封装、包埋或冷冻干燥过程。
因此，按照本发明使用的药物组合物能够使用一种或多种生理学上可接受的载体（包括赋形剂和助剂）（其有助于将活性组分处理成可以药用的制剂），以常规方式加以配制。适当制剂取决于所选的给予途径。
对于注射，可以将药物组合物的活性组分配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中如Hank溶液、林格氏液、或生理盐缓冲液。对于经粘膜给予，在配方中使用适合于渗透阻挡层的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服给予，可以通过结合活性化合物和本领域中众所周知的药用载体来容易地配制药物组合物。这类载体能够将药物组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等，用于由患者口服摄取。可以在添加适宜的助剂（如果需要的话）以后，利用固体赋形剂，可选地研磨生成的混合物，并处理颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心来制备用于口服的药物制剂。适宜的赋形剂尤其为填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇，纤维素制剂如，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣丸核心提供有适当的包衣。为此目的，可以使用浓糖溶液，其可以可选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料加入片剂或糖衣丸包衣，用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合的胶囊剂（push-fitcapsule）以及由明胶和增塑剂（如甘油或山梨醇）制成的软、密封胶囊剂。推入配合的胶囊剂可以包含活性组分与填充剂（如乳糖）、粘合剂（如淀粉）、润滑剂（如滑石粉或硬脂酸镁），以及，可选地，稳定剂的混合物。在软胶囊剂中，可以将活性组分溶解或悬浮于适宜的液体，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于口服给予的所有剂型应具有适用于所选给予途径的剂量。
对于颊部给予，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入的给予，以来自加压包装或使用适宜的推进剂（例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳）的喷雾器的气溶胶喷雾剂形式，来方便地递送按照本发明使用的活性组分。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。用于分样器的例如明胶的胶囊剂和药筒可以配制成包含化合物和适宜粉末基质（如乳糖或淀粉）的粉末混合物。
可以配制本文描述的药物组合物，用于胃肠道外给予，例如，通过丸剂注射或连续输注。能够以单位剂型来提供用于注射的剂型，例如，以安瓿或以多剂量容器形式，可选地具有添加的防腐剂。组合物可以是处于油性或水性载体中的混悬剂、溶液或乳剂，并且可以包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠道外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，可以将活性组分的悬浮液制备成适当的油基或水基注射悬浮液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以包含这样的物质，其增加悬浮液的粘度，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。可选地，悬浮液还可以包含适宜的稳定剂或增加活性组分的可溶性的制剂，以允许制备高度浓缩溶液。
可替换地，活性组分可以具有粉末形式，在使用以前，用于和适宜载体（例如，无菌、无热原水性溶液）进行构造。
还可以将本发明的药物组合物配制成直肠组合物如栓剂或滞留型灌肠剂，使用，例如，常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。
适用于本发明上下文的药物组合物包括这样的组合物，其中以达到预期目的的有效量包含活性组分。更具体地，治疗有效量是指活性组分(抗体)的量可有效地预防、缓解或改善病症(例如，癌症/炭疽感染)的症状或延长接受治疗的受试者的生存期。
确定治疗有效量是在本领域技术人员的能力内，尤其是在本文提供的详细的披露内容的启发下。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初由体外和细胞培养测定来估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以实现所期望的浓度或滴度。这类信息可以用来更准确地确定在人类中的有用剂量。
可以通过在体外、在细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定本文描述的活性组分的毒性和疗效。由这些体外和细胞培养测定和动物研究得到的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。剂量可能会有所不同，这取决于所采用的剂型和所使用的给予途径。确切的配方、给予途径和剂量可以由单个医生考虑到患者的病情来选择。(参见例如，Fingl,etal.,1975,in"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",Ch.1p.1)。
可以单独地调节剂量和间隔以提供活性组分的组织或血液水平，其足以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)。对于每种制剂，MEC将有所不同，但可以由体外数据估计。为实现MEC所必要的剂量将取决于个体特征和给予途径。检测测定可以用来确定血浆浓度。
取决于待治疗病症的严重性和响应性，配量（剂量，dosing）可以是单次或多次给予，其中治疗过程持续数天至数周或直到治愈或实现疾病状态的减弱。
待给予的组合物的量当然将取决于接受治疗的受试者、痛苦的严重性、给予方式、处方医师的判断等。
如果需要的话，能够以包装或分样器装置来提供本发明的组合物，如FDA批准的试剂盒，其可以包含含有活性组分的一个或多个单位剂型。包装可以，例如，包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分样器装置可以伴随有给药说明书。包装或分样器还可以伴随有与由管理药品的制造、使用或出售的政府机构规定形式的容器相关的通知，该通告反映了机构批准该组合物或人用或兽用给予的形式。这类通告，例如，可以是由美国食品和药物管理局认可的处方药的标记或批准的产品插页的标记。还可以制备包含配制在相容的药用载体中的本发明制剂的组合物，放置在适当容器中，并标示用于指定病症的治疗（如上文进一步详述的）。
术语“治疗”是指抑制、预防或阻止病理(疾病、障碍或病症)的发展和/或引起病理的减弱、缓解、或消退。本领域技术人员应当理解的是，各种方法和测定可以用来评估病理的发展，以及类似地，各种方法和测定可以用来评估病理的减弱、缓解或消退。
如在本文中所使用的，术语“预防”是指在可以具有疾病的风险但还未诊断为患有疾病的受试者中防止疾病、障碍或病症的发生。
如在本文中所使用的，术语“受试者”包括哺乳动物，优选人类（在患有病理的任何年龄）。优选地，该术语涵盖具有发展病理风险的个体。
术语“包含”、“包含了”、“包括”、“包括了”、“具有”和它们的同根词是指“包括但不限于”。
如在本文中所使用的，术语"方法"是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或容易从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
应理解的是，本发明的某些特点（为清楚起见，其描述于分开的实施方式的上下文中），还可以结合地提供在单个实施方式中。相反地，本发明的各种特征（为简便起见，其描述于单个实施方式的上下文中），还可以分别地或以任何适宜的子组合方式或当适合时在本发明的任何其他描述的实施方式中加以提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特点并不应认为是那些实施方式的必不可少的特点，除非在没有这些要素的情况下实施方式是不起作用的。
如上文描述的和如在所附权利要求部分中要求保护的，本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现参照以下实施例，其连同以上描述一起以非限制性的方式来说明本发明的一些实施方式。
通常地，本文中使用的命名法和在本发明中采用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中详细解释了这类技术。参见，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrooketal.,(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubeletal.,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watsonetal.,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork;Birrenetal.(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；如在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中陈述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),ThirdEdition；"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.,ed.(1994)；Stitesetal.(eds),"BasicandClinicalImmunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；MishellandShiigi(eds),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；可用的免疫测定广泛描述于专利和科学文献，参见，例如，美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1985)；"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)and"MethodsinEnzymology"Vol.1-317,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshaketal.,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；所有这些以引用方式结合于本文就像在此完整地提出一样。贯穿本文献提供了其他一般性参考资料。其中的程序被认为是本领域中众所周知的并加以提供以方便读者。其中包含的所有信息以引用方式结合于本文。
实施例1
识别MMP-7或炭疽致死因子的抗体的产生
材料与方法
锌-三骨架物（Zn-Tripod）的合成：
A.
在烧瓶中混合季戊四醇(9.53g,0.07mol)和NaOH(0.7mL，30%w/w)并缓慢添加丙烯腈(20.3mL,0.44mol)，使得温度并不超过30°C。在室温下搅拌混合物过夜，用1NHCl中和，提取到EtOAc(200mL)中，用水洗涤两次，经Na2SO4干燥，并浓缩。获得22.9g四腈衍生物(产率为94%)。
B.
用浓HCl(10mL)处理四腈1(7.22g,0.021mol)，在95°C下回流4小时，提取到冷EtOAc(300mL)中，用水洗涤两次，经Na2SO4干燥，并浓缩。获得四酸(6.67g)，产率为75%。
C和D
将SOCl2(11.9mL)加入四酸2(11.5g)并温热溶液至40°C持续15小时(过夜)。蒸馏过量亚硫酰氯并将残余物，粗四酰基卤化物，溶解于干燥CHCl3(30ml)。添加五氯苯酚(28.76g)，将混合物冷却至0°C，添加Et3N(15mL,0.108mol)并在室温下搅拌混合物。反应以后接着是IR以看到氯化物的峰消失(约1天)。除去溶剂并通过快速层析(硅胶，洗脱剂CHCl3)来纯化残余物。通过在失活的中性氧化铝上过滤来除去残余五氯苯酚，从而产生11.94g(8.42毫摩尔，产率31%)的四活性酯。
IR(CDCl3)：(COOC6-Cl5)。
1HNMR(CDCl3)δ=3.81(t,J)6Hz,8H,CCH2OCH2),3.46(s,8H,CCH2O),2.91(t,J)6Hz,8H,CH2CN)
E.
将四活性酯3(1g,0.69毫摩尔)和单BOC-乙二胺(100mg,0.62毫摩尔)溶解于20ml干燥二氯甲烷。搅拌溶液过夜，同时用三乙胺将pH保持在～8。除去溶剂，使用氯仿:乙酸乙酯(90:10)通过快速层析来纯化残余物，从而产生(152mg，产率15%)化合物4。
1HNMR250MHz(CDCl3):δ=1.4(s,9H,Boc);2.4(t,2H,J=6Hz,-CH2-CH2-CONH);2.9(t,6H,J=6Hz,-CH2-CH2-COOPCP);3.2(q,2H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-NHBoc);3.31(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-NHBoc);3.38(s,2H,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-);3.42(s,6H,-C-CH2-O-CH2-CH2-COOPCP);3.61(t,2H,J=6Hz,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-);3.78(t,6H,J=6Hz,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH);5.03(t,1H,NH);6.7(t,1H,NH)。
F.
将化合物4(150mg,0.11毫摩尔)和1-(3-氨基丙基)-咪唑(33μl,0.39毫摩尔)溶解于干燥THF(20ml)并在室温下搅拌过夜。除去溶剂，用氯仿:甲醇(5:9)作为洗脱液通过柱层析并来纯化残余物。获得45mg产物5，产率为44%。
1HNMR250MHz(CDCl3/MeOD)δ=1.45(s,9H,Boc);2.0(m,6H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);2.4(t,6H,J=6Hz,-O-CH2-CH2-CONH-);2.5(t,2H,J=6Hz,-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc)3.0(m,8H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi,-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc);3.1(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-NHBoc);3.4(b,8H,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc,
-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-);3.6(m,8H,J=6Hz,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-,
-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc,);4.0(t,6H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);5.5(t,1H,NH);6.98(s,3H,Imi);7.06(s,3H,Imi)7.32(t,3H,NH);7.57(s,3H,Imi).ESI-MS:910.87[M+Na]+,925.98[M+K]+。
G.
将三(咪唑)衍生物5(40mg,0.045毫摩尔)溶解于二氯甲烷和三氟乙酸的2:1溶液(6ml)并搅拌1小时。除去溶剂并通过和四氯化碳一起的共蒸发来进一步除去过量TFA。获得30mg产物6，产率为85%。
1HNMR250MHz(CDCl3/MeOD)δ=1.9(m,6H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);2.3(m,8H,J=6Hz,-O-CH2-CH2-CONH-,-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);2.9(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);3.0(t,2H,J=14Hz,-CONH-CH2-CH2-NH2);3.31(t,2H,J=6Hz,-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);3.4(b,8H,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-);3.6(m,8H,J=6Hz,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);4.0(t,6H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);7.26(s,3H,Imi);7.32(s,3H,Imi);8.82(s,3H,Imi)。
H.三骨架物6的Zn(II)复合物。
将三骨架物6(30mg)溶解于甲醇(1ml)。添加1NNaOH(1-2滴)，接着处于甲醇中的ZnCl2(5mg)的溶液，并搅拌溶液半小时。获得白色沉淀物并过滤。获得产率为37%的复合物(12mg)。
1HNMR250MHz(MeOD/D2O)δ=1.8(m,6H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);2.4(m,8H,J=6Hz,-O-CH2-CH2-CONH-,-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);3.0(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);3.0(t,2H,J=6Hz,-CONH-CH2-CH2-NH2);3.31(b,2H,-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);3.4(b,8H,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-);3.6(m,8H,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-,-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2);4.2(b,6H,-CONH-CH2-CH2-CH2-imi);7.19(s,3H,Imi);7.28(s,3H,Imi);8.55(s,3H,Imi).ESI-MS:852.09[M+1]+。
锌-三骨架物-蛋白质结合物的制备：将锌-三骨架物结合至钥孔血蓝蛋白(KLH)，用于免疫，以及结合至牛血清白蛋白(BSA)，用于捕获特异性抗体。将锌-三骨架物(4mg)溶解于NaHCO3的饱和溶液(0.5ml)，并在搅拌下将1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(4mg)加入溶液。类似地，在搅拌下，将KLH(以50:1摩尔比率)或BSA(以25:1或10:1摩尔比率)（两者均在PBS缓冲液中），加入溶液。在RT下3小时和4°C下过夜以后，广泛地透析(2xPBS)结合物并稀释至1mg/ml的最终浓度。利用来自Spectro(Kleve，德国)的ICP-AES模型"Spectroflame"通过电感耦合等离子体原子发射光谱法通过测量锌含量，来确定锌-三骨架物的半抗原密度(半抗原分子的数目/BSA或KLH分子)。用处于无金属水中的5%硝酸来消化样品，并将体积调节至6ml。相对于它的当量蛋白浓度，来确定样品的锌含量。
利用锌-三骨架物-KLH作为免疫原制备抗-MMP金属体：在第1天，用完全弗氏佐剂和30μg的Zinc-三骨架物-KLH来免疫雌性BALB/c小鼠，接着(在用Zinc-三骨架物3至4次加强以后，在小鼠血清中通过ELISA可以检测针对Zinc-三骨架物的免疫反应以后)使用整个目标金属酶例如人MMP-7或炭疽致死因子细菌蛋白酶催化片段(炭疽LF)进行二次免疫。分离杂交瘤，其分泌与合成的锌模拟表位进行交叉反应的抗体，和金属酶目标物。
每2至3周进行加强，首先用不完全弗氏佐剂（通过乳化和腹膜内注射），接着在PBS中加强。将来自免疫小鼠的脾细胞与NSO鼠骨髓瘤细胞融合并在HAT(次黄嘌呤/氨喋呤/胸苷)选择培养基中培养。
利用ELISA来筛选杂交瘤的培养上清液，采用其上吸收有MMP-7、炭疽致死因子和锌-三骨架物-BSA作为抗原的微量滴定板中的成对孔(0.5μg的MMP-7、炭疽致死因子或锌-三骨架物-BSA结合物/孔)。在用100μl杂交瘤上清温育以后，用Tris缓冲盐水（pH7.5，包含0.05%吐温20(TBS-吐温)）进行干预洗涤，用过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG，接着用包含2'-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的底物溶液来温育孔。
结果
用合成的锌-蛋白模拟化合物接着用整个目标金属酶来免疫小鼠。此免疫程序产生交叉反应活性杂交瘤，其分泌识别合成的模拟分子和目标金属酶的单克隆抗体(图1A-D)。
虽然已结合其具体实施方式描述了本发明，应当清楚的是，本领域技术人员应该了解许多替换、修改和变化。因此，它旨在包括落在所附权利要求的精神和广阔范围内的所有这类替换、修改和变化。
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用方式结合于本说明书，其程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请明确地并且单独地指出通过引用结合在此一样。另外，在本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的程度上，它们不应该解释为进行必要限制。

Claims (7)

1.一种抗体，包含抗原识别区，所述抗原识别区结合MMP-7的催化位点，其中所述抗体抑制所述MMP-7的活性以及其中所述抗体对于所述MMP-7的Ki比所述抗体对于MMP2或MMP9的Ki低至少5倍，所述抗体能够结合具有下式的化合物：
其中R是O-CH2-C(＝O)NH-CH2-CH2-NH2。
2.一种杂交瘤细胞系，表达权利要求1的抗体。
3.权利要求1的抗体，其为单克隆抗体。
4.根据权利要求1或3中任一项所述的抗体，连接至可检测部分或治疗部分。
5.根据权利要求1所述的抗体用于制备用于治疗癌症或炎性肠病的药物的用途。
6.根据权利要求1所述的抗体在制备用于诊断癌症或炎性肠病的诊断试剂中的用途，其中所述MMP-7的表达上调指示癌症或炎性肠病。
7.一种药物组合物，包含根据权利要求1所述的抗体。
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