CN105461807B - 肿瘤相关基因tp53表位多肽单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了TP53基因的一种单克隆抗体，其是以TP53基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得。本发明提供的单克隆抗体与设计合成表位多肽，可用于检测人血或组织TP53抗体的定量表达，具有高特异性、高敏感性的优点，在临床检测和实验研究中将会得到广泛应用。

Description

肿瘤相关基因TP53表位多肽单克隆抗体及其应用
技术领域:
本发明涉及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用，特别是涉及针对TP53基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系以及该抗体的应用。
技术背景:
TP53是由TP53基因编码的一种细胞周期抑制蛋白质，由393个编码氨基酸组成。TP53蛋白包含多个功能结构域，是TP53基因执行功能的重要结构。TP53基因位于人类染色体17p13.1，全长16kb，分子量为53KD，共有10个内含子和12个外显子，其中第1个外显子不编码。TP53基因是正常细胞增殖和分化的负向调节因子，也是目前研究的最重要的抑癌基因，基因的突变和失调与人类多种肿瘤发生密切相关。TP53基因分为野生型和突变型两种。正常功能的TP53基因又被称为野生型TP53基因，对细胞的生长起负调节作用，参与细胞周期调控，修复DNA损伤，诱发细胞程序性死亡，防止细胞恶性增殖。正常情况下野生型TP53蛋白不稳定，半衰期短，用常规免疫组化方法检测到的TP53蛋白多数为稳定性的突变型TP53表达产物。突变型TP53基因失去调节控制细胞增殖和诱导细胞凋亡的能力而促进肿瘤生长。
TP53失去正常功能的机理主要表现为两方面，最主要的方式是基因突变，另一个主要方式是TP53与蛋白质相互作用而失活。在大约50％以上的人类肿瘤中，可以发现TP53基因突变导致的功能失调，突变区域主要集中在高度保守区内，使突变体的特异性位点的结合能力和结构域发生改变。在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌等肿瘤中，TP53基因缺失率高，功能明显失调。
发明内容:
本发明的目的是提供能与TP53专一结合的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系。
本发明提供的单克隆抗体，其是以TP53基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得。
具体地说是使用可以诱发机体产生免疫反应并生成具有中和效应抗体的表位多肽，偶联至KLH作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。
优选地，上述多肽序列选自：
TP53:PGTRVRQSQHMTELIRVEC
由这个多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性地识别该序列，将这个单克隆抗体分别称之为clone 3D1。clone 3D1具有良好的特异性，间接ELISA表明这个抗体具有较高的效价，因此可用于TP53及上述表位多肽的检测。
本发明还提供产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明提供的单克隆抗体与设计合成表位多肽，可用于检测人血或组织TP53抗体的定量表达，具有高特异性、高敏感性的优点，在临床检测和实验研究中将会得到广泛应用。
附图说明
图1是抗体的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准(kDa)，3D1分别为本发明获得的单克隆抗体；
图2是两个克隆的亚型鉴定图，其中clone 3D1显示IgG1信号最强，明中结果判定标准，clone 3D1的亚型为IgG1。
图3所示的是ELISA法灵敏度实验的拟合曲线。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1、杂交瘤细胞系的建立
一、实验材料
1、免疫原：本例以TP53基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，TP53表位多肽：PGTRVRQSQHMTELIRVEC，采用化学合成的方式制备这表位多肽，纯度要求大于95％。表位多肽分别与KLH偶联制备成免疫原。
2、培养基：DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma公司。
3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。
4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于JacksonImmune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。
二、杂交瘤细胞系的建立
1、动物免疫
1)基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg。
2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150ug抗原的生理盐水溶液。
2、杂交瘤细胞的制备
按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗表位多肽抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200μl的表位多肽包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后测定450nm OD值。凡OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。
3、杂交瘤细胞系的建立
重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株分别针对表位多肽，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测
1)细胞培养液上清效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价为：1：50000-1：100000。
2)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1：500000-1：1000000。
5、杂交瘤细胞系的传代培养
将上述杂交瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。
以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗TP53表位多肽的单克隆抗体。
获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：
1.材料
(1)细胞：取对数生长期的细胞。
(2)10％二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌)：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3)20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
(4)灭菌的2ml安瓶等
2.操作方法
(1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。
(3)1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞/ml。
(3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。
(4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。
(5)放4℃2h。
(6)放液氮罐气态部分(-70℃)15h。
(7)转入液氮部分。
实施例2抗TP53表位多肽的单克隆抗体的制备
一抗体制备
选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种第16代杂交瘤细胞，每只小鼠1×106-2×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。
将腹水离心(13000r/min 30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G～Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH2.7,20mM的甘氨酸缓冲液，得到TP53表位多肽的单克隆抗体(将由表位多肽序列产生的单克隆抗体称之为clone 3D1。
二抗体的鉴定
1、抗体纯度鉴定：
SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95％以上。
2、抗体类及亚类鉴定：
采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗体的Ig亚型，结果显示，TP53表位多肽的的5个单克隆抗体均为(IgG1)(图二)。
3、抗体免疫印迹检测：
常规Western Blot检测方法检测该抗体的特异性，使用SDS-PAGE电泳，湿转法转至PVDF膜上，使用纯化的抗体进行Western Blot杂交检测。结果显示，上述方法制得的单克隆抗体均能特异性识别TP53表位多肽。
4、克隆3D1的可变区序列测定
将克隆细胞株提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。clone 3D1抗体的可变区氨基酸序列：clone 3D1的氨基酸序列为：轻链如SEQ IDNo.1所示，重链如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.1：
SEQ ID No.2：

Claims (4)

1.一种单克隆抗体，其是以TP53保守蛋白序列设计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得，所述多肽序列选自：
TP53表位多肽:PGTRVRQSQHMTELIRVEC；
所述载体蛋白为KLH；
所述单克隆抗体特异性地识别TP53蛋白PGTRVRQSQHM TELIRVEC表位序列；
所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1中所述的TP53表位多肽。
3.含有权利要求1所述单克隆抗体的检测试剂盒。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其为ELISA检测试剂盒，其以特异性地识别TP53蛋白PGTRVRQSQHMTELIRVEC表位的单克隆抗体为包被抗体；或以酶标记的异性地识别TP53蛋白PGTRVRQSQHMTELIRVEC表位的单克隆抗体作为检测抗体；其中所述的特异性地识别TP53蛋白PGTRVRQSQHMTELIRVEC表位的单克隆抗体为权利要求1所述的单克隆抗体。
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