CN104395342B - 人源抗纤连蛋白ed‑b结构域的抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种特异识别并结合纤连蛋白Fibronectin中ED‑B结构域的抗体或抗体片段,可以广泛用于ED‑B蛋白结构域的体外检测和体内定位，也可用于肿瘤靶向治疗。

Description

人源抗纤连蛋白ED-B结构域的抗体及其用途

发明领域

本发明涉及单克隆抗体技术，噬菌体展示技术，以及基因重组技术，尤其是结合纤连蛋白(fibronectin，FN)的ED-B结构域的抗体或抗体片段。另外本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法及含有该单克隆抗体的药物组合物。

发明背景

常用的肿瘤治疗方式有化疗与放疗，由于这些治疗方法特异性不高，对正常组织产生显著的毒副作用，在杀死癌细胞的同时，影响正常器官的生理功能，降低患者的免疫能力和生活质量。提高肿瘤治疗药物特异性的一个方法是借助可识别肿瘤细胞标志物的抗体或抗体片段将药物靶向到肿瘤细胞，对肿瘤产生有针对性的杀伤。这首先需要找到能在细胞膜外表面表达的肿瘤标志物，即只在肿瘤细胞表面或基质中表达但在正常细胞或组织中表达量很少，甚至不表达的蛋白。

纤连蛋白是一种多功能的糖蛋白,广泛地存在于细胞外基质、血浆及其他体液中，由上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、蜕膜细胞及绒毛外滋养细胞等表达，参与细胞的粘附、变形与分布，及血管的形成。

FN的基因约有75kb，约含50个外显子，主要由I，II，III型三类同源重复单元构成，ED-B是包含在FN的III型重复序列中，由单个外显子编码的包含91个氨基酸的完整重复。在FN基因表达过程中，有含ED-B结构域的FN(B+)和不含ED-B结构域的FN(B-)两种情况，这两种情况被认为在个体发育过程中发挥着重要作用，FN(B+)在成人正常组织中表达量极少,但在创伤、疾病、伤口愈合特别是肿瘤生长过程中又重新高表达,故又称癌胚基因。如胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等细胞中高表达含ED-B结构域的FN(B+)。通过体外免疫组织化学检测和体内靶向定位显示，FN(B+)在多种肿瘤组织血管中高表达，而在成年人的正常组织中不表达，是肿瘤组织的一种标志性蛋白。

因此，基于ED-B结构域开发出靶向抗体，可用于将候选药物如细胞毒素等靶向至肿瘤部位，可有效抑制或杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗目的，并且同时减少对正常组织的伤害，减少毒副作用。

针对ED-B的抗体筛选或药物开发已有20多年的历史。比如通过杂交瘤技术获得的鼠源单抗BC-1(Carnemolla,Leprini et al.1992)，它可以特异性的识别人新生血管的FN(B+)，而不与FN(B-)发生交叉反应。

另外，通过小鼠免疫和借助噬菌体展示技术的亲和力成熟，获得的Fab形式的鼠源抗体MOR03255，其最高亲和力达到30pM。MOR03255具有中和抗体的特征，通过与ED-B的结合抑制人真皮微血管内皮细胞(HDMVE)与胞外基质的黏附，从而抑制新生血管的形成，使肿瘤组织因缺少血管而营养匮乏，在活体实验中体现出显著的抑制肿瘤生长的效果。

但研究证明，鼠源抗体药物在人体内应用时会产生严重的人抗鼠抗体(HAMA)反应，还可能产生其他副作用，比如变态反应、血液疾病、肾脏受损，另外抗体的半衰期短，影响抗体的治疗效果。因此，鼠源抗体BC-1及MOR03255具有一定的局限性。现在鼠源抗体已逐渐被人源化抗体和全人源抗体代替。

由于人与小鼠ED-B的氨基酸序列100％同源，小鼠免疫系统会将人ED-B当作自身蛋白，难以对人ED-B结构域产生免疫反应，因此针对ED-B的鼠源抗体开发往往事倍功半。现在借助基因工程技术，直接利用噬菌体展示技术表达人工合成的抗体基因，通过筛选获得具有特定功能的抗体，而不需要借助高等动物体的免疫系统产生，具备了开发人源重组抗体技术。目前报导的ED-B人源抗体有CGS-1，CGS-2，L19等(Carnemolla,Neri et al.1996,Pini,Viti et al.1998)，这些抗体均具备了高度的特异性，并且经BIAcore检测，亲和力分别达到5.4×10^-8M，1.1×10^-9M，8.7×10^-10M。尤其是抗体L19的临床研究，充分证明了针对ED-B开发特异性抗体药物，具有显著的抑制或杀伤肿瘤的效果。

我们通过抗体的基因合成及噬菌体展示技术，筛选到特异性的单链抗体，可以直接识别单独的ED-B结构域和FN(B+)，也可以识别其他蛋白与ED-B结构域的融合形式，如GST-ED-B等。筛选到的抗体亲和力不需进行亲和力成熟，即优于已公开的其他抗ED-B的人源单链抗体。另外经过BIAcore检测，所得抗体与抗原结合后几乎不解离。这些特征显示所得抗体可以与ED-B结合，并且极高的亲和力使抗体在与抗原结合后难以解离，使抗体可以靶向至组织中表达FN(B+)部位并高度富集，而难以再次解离扩散至正常组织中。

所得抗体可用于抗肿瘤药物开发，如抗体的放射性同位素标记、与细胞毒素融合、与化学药物偶联等，借助所得抗体使药物高度富集在高表达FN(B+)的肿瘤组织中针对性杀伤肿瘤细胞，提高药效同时对正常组织伤害较小。由于全人源抗体是人的同源蛋白，在人体内免疫原性低，一般不易产生HAMA反应，因此毒副反应较鼠源抗体低。单链抗体结构形式可以使抗体药物小型化，使抗体在人体内的通透性加强，可沿着肿瘤血管到达肿瘤组织内部；并且单链抗体可灵活改变为多种形式抗体，如天然抗体结构、迷你抗体(Minibody)、双抗、多抗融合形式等，通过对抗体结构形式的修改，可改变抗体的稳定性、通透性、用途等。另外，所得抗体可以开发为肿瘤诊断试剂用于体内和体外的肿瘤组织检测，或用于其他各类免疫相关试剂开发。

发明内容

发明人经过大量创造性劳动，得到了一种重组抗含人ED-B蛋白结构域的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述的抗体片段优选为抗原结合片段，该抗体或抗体片段能与含ED-B结构域的纤连蛋白FN(简写为FN(B+))有效结合，可用于FN(B+)的检测与诊断，也可用于高表达FN(B+)肿瘤的靶向治疗。

因此，本发明提供了一种特异性识别并结合人纤连蛋白Fibronectin(FN)中ED-B结构域的抗体或抗体片段。

在一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有一个重链可变区的CDR3区氨基酸序列，CDR3区含有氨基酸序列HTAPLFDY。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有一个轻链可变区的CDR3区氨基酸序列，CDR3区含有氨基酸序列QQGRHTP。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有具有氨基酸序列HTAPLFDY的重链可变区CDR3和具有氨基酸序列HTAPLFDY的轻链可变区CDR3。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有3个重链可变区CDR，所述CDR的氨基酸序列分别为SYAMS(SEQ ID NO:8)，RISPSGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO:9)，HTAPLFDY(SEQ ID NO:10)。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有3个轻链可变区CDR，所述CDR的氨基酸序列分别为RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:11)，KASNLAT(SEQ ID NO:12)，QQGRHTP(SEQ ID NO:13)。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有3个重链可变区CDR和3个轻链可变区CDR，其中所述3个重链可变区CDR的氨基酸序列分别为SYAMS，RISPSGSSTYYADSVKG，HTAPLFDY，所述3个轻链可变区CDR的氨基酸序列分别为RASQSVSSSYLA，KASNLAT，QQGRHTP。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有一个重链可变区(VH)，所述重链可变区含有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有一个轻链可变区(VL)，所述轻链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段含有一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区含有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段是单克隆抗体，平衡结合解离常数(KD)为1×10^-8M或更低、1×10^-9M或更低、或者1×10^-10M或更低。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段是单体或多聚体。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段是源自哺乳动物抗体序列，尤其是源自人的抗体序列。

在另一个特定的实施方式里，所述的抗体或抗体片段直接与ED-B蛋白结构域结合。特别地，其中ED-B蛋白结构域可以为独立的ED-B重组蛋白，或ED-B蛋白与其他蛋白融合形成的重组蛋白，或含有ED-B结构域的天然纤连蛋白。更特别地，其中ED-B蛋白结构域可以来自人、小鼠、大鼠、鸡或其他物种。更特别地，其中ED-B蛋白结构域可以是糖基化蛋白或非糖基化蛋白。

在一个特定的实施方式里，所述的抗体片段可以是单价小分子抗体如单链抗体、单域抗体、超变区多肽等，Fab，或多价小分子抗体，如双链抗体、三链抗体、微型抗体。

在另一个特定的实施方式里，所述抗体是人免疫球蛋白IgG。

另一方面，本发明提供了包含前述抗体或抗体片段的药物组合物。

在一个实施方式里，所述药物组合物进一步包含但不限于融合蛋白、放射性同位素、化学药物、纳米颗粒等。在一个特定的实施方式里，所述药物组合物用于肿瘤相关疾病的诊断或治疗。

另一方面，本发明提供了前述抗体或抗体片段或药物组合物在预防、诊断和治疗癌症相关疾病中的用途。另一方面，本发明提供了前述抗体或抗体片段或药物组合物在制备预防、诊断和治疗癌症相关疾病的药物中的用途。特别地，所述癌症相关疾病是表达含ED-B结构域的FN(B+)的癌症。所述癌症可以是鼻咽癌、喉癌、食管癌、贲门癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤或乳腺癌；更特别地，所述癌症相关疾病是胃癌、结直肠癌、肺癌或乳腺癌。

另一方面，本发明提供了包含前述抗体或抗体片段的诊断试剂盒，所述试剂盒可用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片等，或用于分析鉴定细胞、蛋白质等，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子。本发明进一步提供了前述试剂盒在用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片，分析鉴定细胞、蛋白质，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子中的用途。本发明更进一步提供了前述试剂盒在制备用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片，分析鉴定细胞、蛋白质，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子的试剂盒中的用途。

另一方面，本发明提供了编码前述抗体或抗体片段的多核苷酸分子。

在一个特定的实施方式里，所述多核苷酸分子含有如SEQ ID NO:2所示的编码抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列和如SEQ ID NO:4所示的编码抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列。

特别地，本发明提供了一种抗人ED-B蛋白结构域的单克隆抗体(简称为B5)该抗体为全人源抗体，含有人的重链可变区和轻链可变区，且提供了一种可连接重链可变区和轻链可变区的连接子片段，具体的，本文所述B5抗体可以是B5单链抗体(single—chainantibody fragment，scFv)，其含有重链可变区、轻链可变区以及连接子，优先的构成方式为抗体重链可变区-连接子-抗体轻链可变区。其中，重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；轻链可变区含有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。优选地，连接片段含有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。在一个特定的实施方式里，所述B5抗体具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明也提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。

在其中一个实施例中，该DNA分子含有SEQ IDNO:2所示的编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列和SEQ IDNO:4所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及可选地SEQ ID NO:6所示可用于编码连接单克隆抗体重链和轻链可变区的连接子片段的核苷酸序列。

进一步地，本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物融合蛋白。这种药物融合蛋白的一个优选方式是B5-IL2，该药物融合蛋白含有上述单克隆抗体B5和具有细胞毒性的人白介素2(简称IL2)。其中，单链抗体B5和人IL2蛋白之间通过连接子片段连接。优选地，连接子片段含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。优选地，所述的人IL2为人IL2的重组蛋白，其是IL2去除信号肽后的成熟IL2。在一个特定的实施方式里，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

本文所述的“单克隆抗体”也简称为“单抗”，是指一类高度均质性的特异性抗体，即除少数可能存在的天然发生的突变体外，各抗体氨基酸序列和结构是相同的。单克隆抗体只识别一种抗原表位(抗原决定簇)，具有高度的特异性。“单克隆”仅表示抗体来源或组成的一致性，是对抗体特征的一种描述，非特定的生产方法或技术。

本文所使用的术语“抗体”、“单链抗体”、“抗体片段”或“免疫球蛋白”是指由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，重链和轻链之间可通过一个共价二硫键连接或通过一个人工合成的多肽连接成的单体或多聚体。各可变区可与恒定区连接，也可以与其他的蛋白融合。

本文所述的术语“可变区”表示抗体中某些特定的序列在不同种抗体中存在较大差异，可变区的不同形成了各种抗体可特异性识别特定的抗原或抗原表位。可变区集中在重链和轻链的N端，是氨基酸序列变化较大的区域，分子量一般为约25000道尔顿。可变区内含有三个互补决定区(CDR，或称超变区)，不同CDR区之间较保守的部分称为框架区(FR)。CDR区是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。

本文所述的抗体恒定区含重链恒定区和轻链恒定区，根据氨基酸序列的差异性分类，重链恒定区可分为5类，分别为：IgA，IgD，IgE，IgG，IgM，其中一些可进一步细分亚类；轻链恒定区可分为2类，分别为κ和λ。

本文所述的“融合蛋白”是指利用基因工程技术将两种或两种以上天然蛋白或人工修饰后的蛋白串联成一种蛋白，原蛋白之间可以通过人工设计的多肽片段连接或通过肽键直接连接。本文一般特指抗体与其他蛋白的融合形式，如与其他抗体融合形成双特异性抗体或多特异性抗体，与细胞毒素融合形成免疫毒素。所采用的技术手段为本领域内的技术人员所熟知。

本文所述“多聚体”指多个蛋白质单体通过共价或非共价形式形成的聚合体。例如人抗体IgG一般会以二硫键共价结合形成四聚体。

本文所述“放射性同位素”指具有放射性的核素，常用的同位素有碘131，碘125，磷32等。利用放射性同位素标记到对抗原具有高特异性、高亲和力的抗体上，制备成具有放射性的免疫治疗药物，注射入体内后可到达靶器官，发挥射线的生物学效应。

本文所述“药物组合物”指抗体或抗体片段与其他化学药物或放射性同位素通过化学键交联形成的新药物；也指抗体或抗体片段与其他蛋白质如细胞毒素通过细胞表达出的融合蛋白；也指抗体或抗体片段连接于纳米颗粒表面产生的新靶向制剂；也包括包含上述抗体、抗体片段、新药物、融合蛋白或制剂以及药学上可接受的载体的组合物。

本文所述“试剂盒”主要组成部分是本文所述抗体或抗体融合蛋白，或者在此基础上标记荧光素、放射性同位素、过氧化物酶、碱性磷酸酶等形成的新抗体组合物，试剂盒中可选地包含缓冲液、非本文所述抗体、酶促反应的底物如二氨基联苯胺(DAB)等，以及相应的支撑物如酶标板、磁珠等。试剂盒可用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片等，或用于分析鉴定细胞、蛋白质等，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子。

本文所述”诊断”方法是指能对人体体液、血液、组织等反映人体健康状况的物质作出定性、定量的检测，常用的实验技术有免疫组织化学、免疫细胞化学、酶联免疫法等。

本文所述”治疗”方法是指采用抗体或抗体片段及其形成的药物组合体通过静脉注射或病变局部注射等方式进入体内后到达肿瘤组织，发挥药效的过程。

本发明提供了一种可特异性识别ED-B蛋白的抗体，该抗体含有SEQ IDNO:1所示的重链氨基酸序列和SEQ IDNO:3所示的轻链氨基酸序列。该抗体也可以采用多种形式发挥其生物学功能，但基本的，抗体片段含有重链的CDR3区序列或轻链的CDR3区序列。

本发明还提供了抗体的DNA序列。在一个实施例中，采用的DNA含有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列可以编码抗体的重链可变区氨基酸序列，采用的DNA含有SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列可以编码抗体轻链可变区氨基酸序列。

进一步的，本发明还提供了以上单克隆抗体的制备方法。

在获得编码本发明抗体的氨基酸或核苷酸序列后，本领域的技术人员可通过本领域常规的方法来制备本发明的全人源单克隆抗体，例如，可采用本领域技术人员所熟知的杂交瘤技术、基因工程技术制备，可通过杂交瘤细胞株筛选或利用噬菌体抗体库展示技术分离获得。

将本发明提供的单链抗体克隆到蛋白表达载体中，或将抗体重链核苷酸序列和轻链核苷酸序列分别克隆到不同的表达载体或同一载体中，均可获得本发明的ED-B单克隆抗体。

本文所述的蛋白表达载体，包括但不限于原核细胞蛋白表达载体、酵母细胞蛋白表达载体、昆虫细胞蛋白表达载体、植物细胞蛋白表达载体和哺乳动物细胞蛋白表达载体，载体中含有用于在相应宿主细胞中表达蛋白所需的作用元件，如启动子、终止子、抗性筛选片段等。

编码本发明单克隆抗体的DNA序列可采用本领域技术人员熟知的手段获得，如根据氨基酸序列推测DNA序列，或通过提取mRNA来反转录获得，或直接采用人工合成的方法获得。然后通过酶切连接等技术手段将这些DNA序列插入到表达载体中，并且抗体的DNA序列处在适当的读码框内，具有必要的起始密码子和终止密码子。本发明所采用的表达载体是本领域技术人员熟知的各种商业化的表达载体。

将构建好的表达载体转化或转染到匹配的宿主细胞中，在适当的培养条件下即可表达出抗体蛋白。

“宿主细胞”包括原核细胞、真核细胞等。在本发明中，优选真核宿主细胞，更优选哺乳动物细胞，这些细胞可通过商业途径或合作单位获得，其中包括但不限于，中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，人胚肾细胞(HEK293)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、幼仓鼠肾细胞(BHK)，非洲绿猴肾细胞(COS)及其他多种永生化细胞系。本发明一般采用CHO细胞和HEK293细胞作为宿主细胞，这些细胞株在本领域内已被公认为能为蛋白质分子提供正确的翻译和蛋白折叠、二硫键形成、糖基化等修饰，且接近人源蛋白的天然状态。但本领域的技术人员熟知的，上述提到的各种细胞系及其亚型均可表达本发明所述的抗体或融合蛋白

表达载体转化或转染宿主细胞的方法有电穿孔技术、脂质体介导、磷酸钙沉淀、PEI介导等方法，本领域内的技术人员可根据不同的宿主细胞及目的采用合适的转染方法。如采用PEI介导含抗体核苷酸序列的载体转染HEK293细胞，而采用Invitrogen公司的脂质体来转染CHO细胞用于构建稳定表达抗体的细胞株。

本发明所述抗体的纯化根据蛋白质的特性或采用的蛋白标签决定，如抗体中含有抗体的恒定区片段，可采用Protein A亲和层析方法，若含有6×组氨酸标签，则可采用镍柱亲和层析，或可采用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、透析、凝胶电泳等方法，本领域技术人员采用常规分离纯化方法就可以得到本发明所述的抗体或含有抗体的融合蛋白。

本发明所述的抗体可采用多种方法鉴定，比如酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白质印迹法(Western Blot)鉴定，亲和力检测可采用BIAcore技术或Scatchard分析法(Beatty,Beatty et al.1987)来测定。

本发明的抗体可与多种蛋白融合，或与化学药物、纳米颗粒等偶联，发挥靶向作用，形成靶向药物。本发明的抗体或抗体片段及相应的靶向药物的药效可通过细胞水平、活体水平验证，本领域技术人员可以通过常规药物实验方法实现。

以上对本发明做了具体的描述，但是对于本领域技术人员来说有一点是明显的，即在不脱离本发明的设计思路和保护范围的前提下可对本发明做各种变化和改动，因此所附权利要求覆盖了所有在本发明范围内的变动。

下面结合实施例进一步描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例是为了起说明作用，并不是用来限制本发明。

附图说明

图1 B5抗体氨基酸序列。

图2采用ELISA实验验证抗体对抗原ED-B结构域的特异性识别能力。

图3细胞免疫荧光实验验证B5抗体对FN(B+)细胞的特异性识别能力，其中，A为阴性对照，不加一抗，二抗为FITC标记的兔抗人IgG抗体；B为B5抗体与FN(B+)细胞特异结合，一抗为B5抗体，二抗为FITC标记的兔抗人IgG抗体。

图4 Cy5.5NHS ester标记的B5抗体通过Balb/c nu裸鼠尾静脉注射给药24小时后的分布情况。

图5 B5抗体的热稳定性试验。

实施例

实施例1筛选对人FN中ED-B结构域特异的人源单链抗体

1)抗原表达

通过HEK293细胞的cDNA克隆FN(B+)、ED-B、FN(789)和FN(7B89)，并在羧基端融合6个组氨酸标签，经大肠杆菌表达蛋白，所得重组蛋白用镍柱进行亲和层析柱纯化。FN(7B89)中字母“B”指该表达蛋白含有ED-B结构域，“7、8、9”指FN中与EDB相邻的3个结构域，FN(789)则不含ED-B结构域。

2)抗体库的构建

设计全人合成抗体库用于筛选针对ED-B抗原的单链抗体。以在人类抗体分子中最为常见的DP47为重链模板，以DPK22为轻链模板，用较常用的(G₄S)₃肽链将二者先后连接形成单链抗体库模板，其中轻链和重链的CDR区根据经验添加形成。抗体库DNA模板通过化学合成获得，合成时5’端依次引入Nco I和EcoR I限制性内切酶酶切位点，3’端引入Not I位点，并通过Nco I位点和Not I位点克隆至pCANTAB5E载体中用于构建产生随机抗体库和噬菌体展示，其中EcoR I位点是方便后续的分子克隆。随机抗体库通过在轻链和重链的CDR3区两端添加限制性酶切位点，并借助限制性酶切位点插入DNA随机片段实现CDR3区的随机化(Marks,Hoogenboom et al.1991,Hoogenboom and Winter 1992,Nissim,Hoogenboomet al.1994,Pini,Viti et al.1998,Silacci,Brack et al.2005)。

3)筛选

将抗体库大肠杆菌TG1菌液50ul加入到50ml新鲜的2×YT培养基中于37℃震荡培养至OD600值为0.4-0.5，加入辅助噬菌体于37℃侵染30min，PEG沉淀后用10000g离心30min，用PBS重悬备用，使制备的抗体融合噬菌体库滴度应在10¹²CFU/ml以上。

EDB抗原包被于5ml免疫管，用牛奶封闭后加入2ml上述制备的噬菌体抗体库PBS溶液，37℃孵育2小时，倒掉免疫管中的液体，用0.1％的PBST洗涤20次，加入4ml对数期的TG1细菌，37℃静置孵育1hr。将菌液涂布于含氨苄青霉素和葡萄糖的SOB平板上，过夜培养后收集侵染噬菌体的大肠杆菌TG1菌液，完成第一轮淘选。将获得的TG1菌液再次用于制备抗体融合噬菌体库，进入第二轮淘选。

以ED-B为抗原共进行3轮淘选，所得的大肠杆菌TG1通过合适的比例稀释后涂布至琼脂糖平板上获得单克隆菌落，分别用于表达可溶性的抗体进行ELISA检测，选择在包被抗原相同条件下显色最强的噬菌体克隆用于进一步分析。

4)抗体从原核载体向真核载体的克隆

将淘选所得的单链抗体的DNA片段通过EcoR I和Not I酶切后连接至含有人IgG1抗体恒定区Fc片段DNA序列的pCI-neo载体中，抗体DNA序列与IgG1Fc的DNA序列在同一个开放阅读框内，使二者能表达出的融合蛋白，其中IgG1Fc可用于单链抗体的纯化及提高抗体蛋白的稳定性。

5)蛋白表达

将获得的含抗体融合蛋白的质粒大量提取后，利用Invitrogen的脂质体试剂2000将质粒DNA转染至CHO-K1细胞，借助pCI-neo质粒载体的neo基因在含G418的选择性培养基中进行连续4-8周的选择培养后，经有限稀释法进行克隆化培养，将获得的单克隆细胞继续克隆化培养以获得稳定株。

获得的细胞株经Hyclone SFM4CHO-Utility驯化后悬浮表达，经ELISA和SDS-PAGE实验验证，获得了目标抗体蛋白，抗体蛋白产量约为100mg/L。

6)单克隆抗体的纯化

用Qiagen的镍柱亲和层析纯化带6×His抗体，Genscript Protein A亲和柱纯化带IgG1恒定区Fc的抗体，相应流程按说明书进行。

以此方法，得到了本发明的B5抗体，其序列见图1。

实施例2抗体特异性检测

1)分子水平特异性检测

构建纤维粘连蛋白FN的截短型质粒载体，分别可表达含结构域FN(789)，FN(7B89)，和独立的ED-B结构域蛋白，并带有6×His标签，经大肠杆菌表达后用Ni柱纯化。将三种蛋白作为抗原，用牛奶封闭后以B5抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体为二抗进行ELISA检测试验，实验结果如图2所示。结果表明，抗体B5与L19均显示对抗原ED-B结构域具有特异性识别能力。FN(789)结构域显色数值与不包被抗原的空白对照基本一致，而与独立的ED-B结构域和含ED-B结构域的FN(7B89)均结合。

2)细胞水平特异性检测

用玻璃底的激光共聚焦细胞培养皿，加入高表达FN(B+)的人直肠腺癌Caco-2细胞培养至30％汇合度，去除培养基并用PBS洗涤后加入B5抗体和阳性对照，以PBS为阴性对照，37℃孵育2hr，PBS洗涤3次后加入FITC标记的兔抗人IgG的二抗孵育1hr后用PBS洗涤3次，并加入DAPI复染。置于激光共聚焦下观察，阴性对照背景无绿色荧光，B5及阳性对照组细胞膜均有绿色荧光(见图3)，显示B5抗体可特异性靶向表达ED-B的Caco-2细胞。

3)动物组织分布特异性研究

小鼠移植瘤模型建立：健康Bal b/cnu裸鼠在SPF级屏障系统中饲养至20g/只，在小鼠背部皮下植入人咽鳞癌细胞FaDu的移植瘤组织块约1mm³，继续饲养。

抗体药物的荧光标记：在B5抗体上标记Cy5.5NHS ester荧光染料，抗体蛋白与荧光染料分子的标记比为1：1。

给药方法：待肿瘤生长至直径达到约5mm时，按5mg/kg体重给入Cy5.5标记的抗体，用Xenogen小动物活体成像系统观察抗体在体内的分布情况，给药后每天观察一次。

实验结果如图4所示。抗体药物在给药后24小时即大量富集在肿瘤组织中，其他组织未检测到Cy5.5荧光染料分布，且给药后肿瘤组织中的荧光能维持7天以上。

实施例3抗体亲和力测定。

1)用ELISA方法测定ED-B抗原抗体的绝对亲和力

亲和力测定选用Scatchard分析方法(Beatty,Beatty et al.1987)，0.1ug/ulED-B抗原按1：2，1：4，1：8倍4个浓度梯度稀释后包被酶标板，并于4℃过夜后用4％脱脂奶粉封闭。加入3倍梯度稀释的单链抗体，抗体起始浓度10ug/ml，室温反应1h后加入辣根过氧化物没标记的兔抗人IgG抗体反应1hr，加入四甲基联苯胺(TMB)显色到适当深度后，用2MH₂SO₄终止，测定OD450光吸收值

经计算，结果显示B5抗体平衡解离常数KD为1.8nM。L19抗体平衡解离常数KD为6.0nM，即B5抗体亲和力高于L19。

2)用Biocore3000测定ED-B抗原抗体的绝对亲和力。

选用单层羧基芯片(与蛋白的氨基偶联)，包被用pH＝4的醋酸缓冲液稀释抗原EDB(浓度10ug/ml)为固定相。用1M pH＝8.5的乙醇胺-HCl缓冲液以封闭芯片。

动力学常数测定时，选择合适的抗体浓度梯度，往下1:2梯度稀释，共八个浓度作为流动相,每个浓度平行进样三次，用BIAcore3000检测二者动态的结合与解离的情况。

经检测，B5抗体可特异的结合于ED-B抗原上，但结合后B5与芯片表面的EDB几乎不解离，超过仪器的检测限，提示二者可以稳定结合。而L19抗体经BIAcore3000测得的平衡解离常数为0.4nM。

实施例4抗体在血浆中的稳定性试验

将B5用Bal b/c小鼠血浆分别稀释至1ng/ul和0.1ng/ul，并分装到EP管中，每管100ul，于37℃水浴0、4、8、24hr，同时取出做ELISA检测。

ELISA检测流程为：FN(7B89)融合蛋白包被酶标板于4℃过夜，以B5-IgG1Fc为一抗，室温反应2hr，以辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG作二抗，四甲基联苯胺(TMB)为底物室温显色后用酶标仪450nm波长检测。结果显示两种浓度的抗体在小鼠血浆中孵育不同时间后，其免疫活性变化无统计意义。

以0.1ug/ml B5抗体在血浆中孵育0h为标准，抗体在不同浓度、不同孵育条件下的活性相对于标准活性的变化情况。可见抗体用血浆稀释至1ug/ml或0.1ug/ml后，经37℃孵育4，8，24h后，活性与0h比较没有明显降低(见图5)，B5抗体在Bal b/c小鼠血浆中可维持稳定。

实施例5单克隆抗体生理活性研究

小鼠移植瘤模型建立：健康Bal b/c小鼠饲养至20 g/只，按每只3×10⁶注射小鼠畸胎瘤细胞F9于前肢腋下皮下造模。

给药方法：待实体肿瘤明显可识别时，按每只小鼠30 ug抗体药物B5-IL2经尾静脉注射给药，3天后重复给药1次。阳性对照为B5m-IL2，B5m为B5重链CDR3区经丙氨酸突变后形成的与ED-B无特异性结合的突变抗体。突变方法是将B5重链CDR3区的氨基酸HTAPLFDY突变为丙氨酸AAAAAAAA(SEQ ID NO:14)，其他序列不变，产生的B5抗体突变体命名为B5m。

肿瘤生长率测定：每天测量肿瘤大小，至小鼠肿瘤增大至1000 mm³或达到14天后处死。肿瘤体积计算方法：用游标卡尺测量肿瘤的最大直径(Length)和最小直径(Width)，肿瘤体积＝width²*length*0.5.

实验结果见表1，阳性对照组与阴性对照组肿瘤大小无显著差异，实验组肿瘤平均体积大约为阴性对照组的三倍，实验组与两组对照的肿瘤体积差别均有统计意义(p<0.05)。

表1 Bal b/c小鼠尾静脉注射B5-IL2的治疗效果

Claims (8)

1.一种特异性识别并结合人纤连蛋白Fibronectin(FN)中ED-B结构域的抗体或抗体片段，其为以下几种中的一种：

（1）含有3个重链可变区CDR和3个轻链可变区CDR，其中所述3个重链可变区CDR的氨基酸序列分别为CDR1区为氨基酸序列SYAMS，CDR2区为氨基酸序列RISPSGSSTYYADSVKG，CDR3区为氨基酸序列HTAPLFDY，所述3个轻链可变区CDR的氨基酸序列分别为CDR1区为氨基酸序列RASQSVSSSYLA，CDR2区为氨基酸序列KASNLAT，CDR3区为氨基酸序列QQGRHTP；

（2）该抗体或抗体片段含有一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区含有SEQ IDNO: 1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区含有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段直接与糖基化的ED-B蛋白结构域结合。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段是单克隆抗体，平衡结合解离常数(KD)为1×10^-8M或更低、1×10^-9M或更低、或者1×10^-10M或更低。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段是源自哺乳动物抗体序列。

5.根据权利要求1所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体片段是单价小分子抗体，包括单链抗体、单域抗体、超变区多肽，Fab，或多价小分子抗体。

6.根据权利要求1所述抗体或抗体片段，其用途是用于制备预防、诊断和治疗癌症相关疾病的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的抗体或抗体片段，所述的癌症包括鼻咽癌、喉癌、食管癌、贲门癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤，或乳腺癌。

8.根据权利要求1所述抗体或抗体片段，其用途包括在制备用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片，分析鉴定细胞、蛋白质，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子的试剂盒中的用途。