EA031729B1 - Антитела к матриксной металлопротеиназе 9 - Google Patents

Антитела к матриксной металлопротеиназе 9 Download PDF

Info

Publication number
EA031729B1
EA031729B1 EA201390146A EA201390146A EA031729B1 EA 031729 B1 EA031729 B1 EA 031729B1 EA 201390146 A EA201390146 A EA 201390146A EA 201390146 A EA201390146 A EA 201390146A EA 031729 B1 EA031729 B1 EA 031729B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
mmp9
seq
binding protein
ser
amino acid
Prior art date
Application number
EA201390146A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390146A1 (ru
Inventor
Скотт Алан Макколи
Мария Вайзберг
Original Assignee
Джилид Байолоджикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Джилид Байолоджикс, Инк. filed Critical Джилид Байолоджикс, Инк.
Publication of EA201390146A1 publication Critical patent/EA201390146A1/ru
Publication of EA031729B1 publication Critical patent/EA031729B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области внеклеточных ферментов, ферментам внеклеточного матрикса, протеазам и иммунологии. В изобретении предложены белки, которые связываются с белком матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9, также известна как желатиназа-В), причем указанные ММР9-связывающие белки содержат полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент и полипептид легкой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент. Также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие ММР9-связывающий белок или его функциональный фрагмент, вектор и клетка для получения ММР9-связывающего белка, фармацевтические композиции для лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9, способ ингибирования активности ММР9 у субъекта и способ обнаружения экспрессии ММР9 в ткани пациента.

Description

Изобретение относится к области внеклеточных ферментов, ферментам внеклеточного матрикса, протеазам и иммунологии. В изобретении предложены белки, которые связываются с белком матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9, также известна как желатиназа-В), причем указанные ММР9-связывающие белки содержат полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент и полипептид легкой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент. Также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие ММР9связывающий белок или его функциональный фрагмент, вектор и клетка для получения ММР9связывающего белка, фармацевтические композиции для лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9, способ ингибирования активности ММР9 у субъекта и способ обнаружения экспрессии ММР9 в ткани пациента.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США № 61/377886, поданной 27 августа 2010 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники
Настоящая заявка относится к области внеклеточных ферментов, ферментам внеклеточного матрикса, протеазам и иммунологии.
Введение
Матриксные металлопротеиназы (ММР) представляют собой семейство внеклеточных ферментов, участвующих в формировании и ремоделировании внеклеточного матрикса. Эти ферменты содержат консервативный каталитический домен, в котором атом цинка координируют три остатка гистидина. В настоящее время известно более 20 членов этого семейства, организованных в ряд групп, включая коллагеназы, желатиназы, стромелизины, матрилизины, энамелизины и мембранные ММР.
ММР2 и ММР9 принадлежат к группе желатиназ матриксных металлопротеиназ. Кроме сигнального пептида, пропептида, каталитического, цинк-связывающего и гемопексин-подобного доменов, общих для большинства ММП, желатиназы также содержат множество фибронектин-подобных доменов и Огликозилированный домен.
Показано, что аномальная активность некоторых ММП играет роль в опухолевом росте, метастазировании, воспалительных и сосудистых заболеваниях. См., например, Hu et al. (2007) Nature Reviews: Drug Discovery 6:480-498. Из-за этого может быть желательным ингибировать активность одной или нескольких ММП при определенных терапевтических протоколах. Тем не менее, активность некоторых других ММП часто необходима для нормального функционирования. Так как мишенью большинства ингибиторов ММР является консервативный каталитический домен и, как следствие, они ингибируют ряд различных ММР, их терапевтическое применение вызывает побочные эффекты, обусловленные ингибированием незаменимых, не связанных с патологией ММП.
Несмотря на указанные проблемы, оказалось трудным разработать ингибиторы, являющиеся специфичными для конкретной ММР, поскольку ингибирование ферментативной активности в целом требует, чтобы мишенью ингибитора являлся каталитический домен. Следовательно, большинство ингибиторов ферментативной активности матриксных металлопротеиназ, с большой вероятностью, реагируют с более чем одной ММР в связи с гомологией их каталитических доменов. Таким образом, остается потребность в терапевтических реагентах, специфичным образом ингибирующих каталитическую активность одной ММР и не реагирующих с другими ММП.
Сущность изобретения
Настоящая заявка обеспечивает композиции и способы, в которых использованы связывающие белков, например, антитела и их антиген-связывающих фрагменты, которые связываются с белком матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9) (ММР9 также известна как желатиназа-В), причем указанные связывающие белки включают тяжелую цепь иммуноглобулина (Ig) (или ее функциональный фрагмент) и легкую цепь Ig (или ее функциональный фрагмент). Настоящая заявка также обеспечивает ММР9связывающие белки, специфично связывающиеся с ММР9, но не с другими родственными матриксными металлопротеиназами. Такие ММР9-связывающие белки находят применение в приложениях, где необходима или желательна специфичная регуляция (например, ингибирование) ММР9, например, без непосредственного влияния на активность других матриксных металлопротеиназ. Так, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитело против ММР9 является специфичным ингибитором активности ММР9. В частности, ММР9 связывающие белки, описанные в настоящей заявке, будут полезны для ингибирования ММР9, допуская при этом нормальное функционирование других родственных матриксных металлопротеиназ.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает, в том числе:
1. ММР9-связывающий белок, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина, или ее функциональный фрагмент, и легкую цепь иммуноглобулина, или ее функциональный фрагмент, причем указанный белок не связывается с другой матриксной металлопротеиназой, кроме ММР9.
2. Белок согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что указанная тяжелая цепь содержит гипервариабельный участок (CDR), выбранный из одной или более из SEQ ID NOs: 13-15, а легкая цепь содержит CDR, выбранный из одной или более из SEQ ID NOs: 16-18.
3. Белок согласно варианту реализации 2, отличающийся тем, что указанная тяжелая цепь содержит вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 3 или 5-8, а легкая цепь содержит вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 4 или 9-12.
4. Белок согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что тяжелая цепь представляет собой IgG.
5. Белок согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что легкая цепь представляет собой каппа-цепь.
6. Белок согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что связывание белка с ММР9 ингибирует ферментативную активность ММР9.
7. Белок согласно варианту реализации 6, отличающийся тем, что указанное ингибирование являет
- 1 031729 ся неконкурентным.
8. Белок согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что указанную тяжелую цепь кодирует полинуклеотид, который имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 19-22, а легкую цепь кодирует полинуклеотид, который имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 23-26.
9. Вектор, содержащий один или более полинуклеотидов, имеющих нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-26.
10. Клетка, которая содержит вектор согласно варианту реализации 9.
11. Фармацевтическая композиция, которая содержит белок согласно варианту реализации 1.
12. Фармацевтическая композиция, которая содержит вектор согласно варианту реализации 9.
13. Фармацевтическая композиция, которая содержит клетку согласно варианту реализации 10.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 приведена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела мыши против ММР9 (АВ0041), а также аминокислотные последовательности гуманизированных вариантов тяжелой цепи (VH1-VH4), выроа, полученных в результате гуманизации. CDR выделены курсивом, а аминокислоты, отличающиеся в гуманизированных вариантах от исходных моноклональных антител мыши, подчеркнуты.
На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела мыши против ММР9 (АВ0041), а также аминокислотные последовательности гуманизированных вариантов легкой цепи (VH1-VH4), выровненные для показа различий в аминокислотной последовательности каркаса, полученных в результате гуманизации. CDR выделены курсивом, а аминокислоты, отличающиеся в гуманизированных вариантах от исходных моноклональных антител мыши, подчеркнуты.
На фиг. 3 показана схема белка ММР9.
Подробное описание
При реализации настоящего изобретения используют, если не указано иное, стандартные способы и традиционные методики в области клеточной биологии, токсикологии, молекулярной биологии, биохимии, культивирования клеток, иммунологии, онкологии, технологии рекомбинантных ДНК и смежных областях, доступные специалистам в данной области техники. Такие методики описаны в литературе и, таким образом, доступны специалистам в данной области техники. См., например, Alberts, В. et al., Molecular Biology of the Cell, 5th edition, Garland Science, New York, NY, 2008; Voet, D. et al. Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level, 3rd edition, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2008; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 и периодические обновления; Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th edition, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000; и серию Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA. См. также, например, Current Protocols in Immunology, (R. Coico, series editor), Wiley, последнее обновление (август 2010).
ММР9-связывающие белки
Настоящая заявка обеспечивает связывающие белки, например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с белком матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9) (ММР9 также известна как желатиназа-В). Связывающие белки согласно настоящему описанию, в целом, включают тяжелую цепь иммуноглобулина (Ig) (или ее функциональный фрагмент) и легкую цепь Ig (или ее функциональный фрагмент).
Заявка также обеспечивает ММР9-связывающие белки, специфично связывающиеся с ММР9, но не с другими матриксными металлопротеиназами, например, ММР1, ММР2, MMP3, ММР7, ММР9, ММР10, ММР12, ММР13. Такие специфичные ММР9-связывающие белки, таким образом, как правило, не обладают существенной или обнаруживаемой перекрестной реакционной способностью с матриксными металлопротеиназами, отличными от ММР9. ММР9-связывающие белки, специфично связывающие ММР9, находят применение в приложениях, где необходима или желательна специфичная регуляция (например, ингибирование) ММР9, например, без непосредственного влияния на активность других матриксных металлопротеиназ.
В некоторых вариантах реализации настоящего описания антитело против ММР9 является ингибитором активности ММР9, и может представлять собой специфичный ингибитор ММР9. В частности, ММР9 связывающие белки, описанные в настоящей заявке, будут полезны для ингибирования ММР9, при этом допуская нормальное функционирование других родственных матриксных металлопротеиназ. Ингибитор ММР или ингибитор активности ММР9 может представлять собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который прямо или косвенно ингибирует активность ММР9, включая ферментативный процессинг, ингибирование действия ММР9 на его субстрат (например, путем ингибирования связывания субстрата, расщепления субстрата и т.п.) и т.п., но не ограничиваясь указанным.
Настоящая заявка также обеспечивает ММР9-связывающие белки, специфично связывающиеся с ММР9 животных, не являющихся мышью, например, ММР9 человека, ММР9 яванского макака и ММР9
- 2 031729 крысы.
Настоящая заявка также обеспечивает ММР9-связывающие белки (например, антитела против ММР9 и их функциональные фрагменты), которые действуют как неконкурентные ингибиторы. Неконкурентный ингибитор относится к ингибитору, связывающемуся с сайтом, отличным, от сайта связывания фермента с субстратом, и, таким образом, способному связывать фермент и проявлять ингибиторную активность независимо от того, связан ли фермент со своим субстратом или нет. Такие неконкурентные ингибиторы могут, например, обеспечить уровень ингибирования, который может быть практически независим от концентрации субстрата.
ММР9-связывающие белки (например, антитела и их функциональные фрагменты) согласно настоящему описанию включают белки, связывающие ММР9, в частности, ММР9 человека, и содержащие полипептид тяжелой цепи (или его функциональный фрагмент), обладающий по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90, 95% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с полипептидом тяжелой цепи, описанным в настоящем документе.
ММР9-связывающие белки (например, антитела и их функциональные фрагменты) согласно настоящему описанию включают белки, связывающие ММР9, в частности, ММР9 человека, и содержащие полипептид легкой цепи (или его функциональный фрагмент), обладающий по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90, 95% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с полипептидом тяжелой цепи, описанным в настоящем документе.
ММР9-связывающие белки (например, антитела и их функциональные фрагменты) согласно настоящему описанию включают белки, связывающие ММР9, в частности, ММР9 человека, и содержащие полипептид тяжелой цепи (или его функциональный фрагмент), содержащий гипервариабельные участки (CDR) полипептида тяжелой цепи и CDR полипептида легкой цепи (или его функционального фрагмента), описанные в настоящем документе.
Термины гомология или идентичность или сходство, используемые в настоящем документе в контексте нуклеиновых кислот и полипептидов, относятся к взаимоотношению между двумя полипептидами или двумя молекулами нуклеиновой кислоты на основе выравнивания аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей, соответственно. Гомологию и идентичность можно определить путем сравнения положений в каждой последовательности, которые можно выровнять в целях сравнения. Если эквивалентное положение в сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или аминокислотой, то молекулы идентичны по указанному положению; если эквивалентный сайт занят одним и тем же или сходным аминокислотным остатком (например, сходным по стерическим и/или электронным свойствам), то молекулы могут называться гомологичными (сходными) по этому положению. Процентное выражение гомологии/сходства или идентичности относится к функции количества идентичных или сходных аминокислот по положениям, общим у сравниваемых последовательностей. При сравнении двух последовательностей отсутствие остатков (аминокислотных или нуклеотидных) или наличие дополнительных остатков также снижает идентичность и гомологию/сходство.
В настоящем описании идентичность означает процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков в соответствующих положениях в двух или более последовательностях при выравнивании указанных последовательностей для их максимального соответствия, т. е. с учетом пробелов и вставок. Последовательности, как правило, выравнивают для максимального соответствия в заданной области, например, в области длиной по меньшей мере приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или более аминокислот или нуклеотидов, и, возможно, вплоть до полноразмерной эталонной аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютерную программу, задают координаты частичных последовательностей, если необходимо, и задают параметры алгоритма последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процент идентичности последовательности для тестируемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности на основе заданных параметров программы.
Примеры алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей, представляют собой алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные в работах Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа BLAST общедоступно на сайте Национального центра биотехнологической информации США (www.ncbi.nlm.nih.gov). Дополнительные типичные алгоритмы включают ClustalW (Higgins D., et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680), доступный на www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html.
Остатки в положениях, не являющихся идентичными, могут отличаться друг от друга вследствие консервативных аминокислотных замен. Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемости остатков, содержащих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, несущих алифатические боковые цепи, представляет собой глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, несущих алифатические гидроксильные боковые цепи, представляет собой серин и трео
- 3 031729 нин; группа аминокислот, несущих амидсодержащие боковые цепи, представляет собой аспарагин и глутамин; группа аминокислот, несущих ароматические боковые цепи, представляет собой фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, несущих основные боковые цепи, представляет собой лизин, аргинин и гистидин; а группа аминокислот, несущих содержащие атом серы боковые цепи, представляет собой цистеин и метионин.
Идентичность последовательности двух нуклеиновых кислот также можно описать в терминах гибридизации двух молекул друг с другом в жестких условиях. Условия гибридизации выбирают в соответствии со стандартными способами в данной области техники (см., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Примером жестких условий гибридизации является гибридизация при 50°C или выше и в 0,1 х SSC (15 мМ хлорид натрия/1,5 мМ цитрат натрия). Еще одним примером жестких условий гибридизации является инкубирование в течение ночи при 42°C в растворе: 50% формамида, 5 х SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 х раствор Денхардта, 10% декстрансульфата и 20 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, деградированной в результате гидродинамического сдвига, с последующей промывкой фильтра в 0,1 х SSC при температуре приблизительно 65°C. Жесткие условия гибридизации представляют собой условия гибридизации, по меньшей мере такие же жесткие, как указанные выше типичные условия, причем условия считаются по меньшей мере такими же строгими, если они по меньшей мере приблизительно на 80% такие же строгие, как правило, по меньшей мере на 90% такие же строгие, как и вышеуказанные жесткие условия.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, включающие полипептид вариабельной области тяжелой цепи, обладающий по меньшей мере 80, 85, 90, 95% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, описанной в настоящем документе (например, SEQ ID NO: 1 или 5-8), и полипептид вариабельной области легкой цепи, обладающий по меньшей мере 80, 85, 90, 95% или большей идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью полипептида легкой цепи, как указано в настоящем документе (например, SEQ ID NO: 2 или 9-12).
Примеры антител против ММР9 согласно настоящему изобретению более подробно описаны ниже.
Антитела
ММР9-связывающие белки включают антитела и их функциональные фрагменты. В настоящем документе термин антитело означает выделенный или рекомбинантный полипептидный связывающий агент, включающий пептидные последовательности (например, последовательности вариабельных областей), специфично связывающие антигенный эпитоп. Этот термин используется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, нанотела, диатела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, включая Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 и Fab2, при условии, что они проявляют желательную биологическую активность, но не ограничиваясь ими. Термин антитело человека относится к антителам, содержащим последовательности человеческого происхождения, за исключением возможных CDRучастков нечеловеческого происхождения, и не подразумевает присутствия полной структуры молекулы иммуноглобулина, а лишь то, что такое антитело обладает минимальным иммуногенным действием в организме человека (т.е. не вызывает продукции антител к самому себе).
Фрагмент антитела включает часть полноразмерного антитела, например, антиген-связывающую или вариабельную область полноразмерного антитела. Такие фрагменты антител могут также называться в настоящем документе функциональными фрагментами или антиген-связывающими фрагментами. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); молекулы одноцепочечных антител; и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Папаиновый гидролиз антител позволяет получить два идентичных антиген-связывающих фрагмента, названных Fab''-фрагментами, каждый из которых содержит одиночный антиген-связывающий сайт, и оставшийся Fc''-фрагмент, название которого указывает на хорошую способность к кристаллизации. Обработка пепсином дает F(ab')2-фрагмент, содержащий два антиген-связывающих сайта и сохраняющий способность к перекрестному связыванию антигена.
Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера вариабельных доменов одной тяжелой и одной легкой цепей, жестко связанных посредством нековалентных связей. Именно в этой конфигурации три гипервариабельные участки (CDR) каждого вариабельного домена взаимодействуют, задавая антигенсвязывающий сайт на поверхности V|i-Vi.-Димера. В совокупности шесть CDR придают антителу специфичность связывания с антигеном. Однако даже одиночный вариабельный домен (или выделенная VHили ^-область, содержащая только три из шести CDR, специфичных по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя, в общем случае, с более низким сродством, чем
- 4 031729 весь Fv-фрагмент.
'FAB''-фрагмент также содержит, в дополнение к вариабельным областям тяжелой и легкой цепи, константный домен легкой цепи и первый константный домен (CHJ тяжелой цепи. Fab-фрагменты впервые наблюдались после папаинового гидролиза антитела. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что F(ab')-фрагменты содержат несколько дополнительных остатков на С-конце CHj-домена тяжелой цепи, в том числе один или более остатков цистеина из шарнирной области антитела. F(ab')2фрагменты содержат два Fab-фрагмента, соединенные дисульфидными связями вблизи шарнирной области, и впервые наблюдались после пепсинового гидролиза антитела. Fab'-SH представляет собой обозначение, используемое в настоящем документе для Fab'-фрагментов, в которых остаток(ки) цистеина в константных доменах несет(ут) свободную тиоловую группу. Кроме того, известны другие варианты химического соединения фрагментов антител.
Легкие цепи антител (иммуноглобулинов) любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа- и лямбда-цепями, на основе аминокислотной последовательности их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей иммуноглобулины можно отнести к пяти основным классам: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из которых можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
Одноцепочечные Fv- или sFv- или scFv-''фрагменты антител включают VH- и VL-домены антитела, причем указанные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. В некоторых вариантах реализации полипептид Fv также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, позволяющий sFv формировать структуру, желательную для связывания с антигеном. Обзор sFv см. в работе Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113 (Rosenburg and Moore eds.) SpringerVerlag, New York, pp. 269-315 (1994).
Термин диатела относится к небольшим фрагментам антител с двумя антиген-связывающими сайтами, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) на той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который является слишком коротким для спаривания двух доменов на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, создавая тем самым два антиген-связывающих сайта. Диатела дополнительно описаны, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Выделенное антитело представляет собой антитело, идентифицированное и отделенное и/или очищенное от какого-либо компонента своего природного окружения. Компоненты природного окружения могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах реализации выделенное антитело очищено (1) до более чем 95 мас.%, согласно определению по Лоури, например, более чем на 99 мас.%, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, например, при использовании секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до однородности согласно гельэлектрофорезу (например, электрофорезу в ДСН-ПААГ) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, при обнаружении путем окрашивания Кумасси голубым или серебром. Термин выделенное антитело включает антитело in situ в составе рекомбинантных клеток, при условии отсутствия по меньшей мере одного компонента природного окружения антитела. В некоторых вариантах реализации выделенное антитело получают с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.
В настоящем документе термин иммунореактивный относится к антителам или их фрагментам, специфичным по отношению к последовательности аминокислотных остатков (сайту связывания или эпитопу), даже если они обладают перекрестной реакционной способностью по отношению к другим пептидам/белкам, и не являющимся токсичными в концентрации, используемой в составе для введения человеку. Эпитоп относится к части антигена, способной связываться с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Эпитоп может представлять собой линейную пептидную последовательность (т.е., являться непрерывным) или может быть составлен из несмежных аминокислотных последовательностей (т.е., являться конформационным или прерывистым). Термин преимущественно связывается означает, что связывающий агент связывается с сайтом связывания с более выраженным сродством, чем при его связывании с неспецифичными аминокислотными последовательностями.
Антитела против ММР9 можно описать в терминах CDR тяжелых и легких цепей. В настоящем документе термин CDR или гипервариабельный участок предназначен для обозначения несмежных антиген-связывающих сайтов в пределах вариабельной области полипептидов тяжелых и легких цепей. Эти участки описаны Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of proteins of immunological interest (1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), причем их определения включают перекрывание наборов аминокислотных остатков при их сравнении друг с другом. Тем не менее, подразумевается, что применение любого определения по отношению к CDR антитела или привитого антитела или их вариантов находится в рамках указанного термина в соответствии с его определением и использованием в настоящем документе. Аминокислотные остатки, входящие в состав CDR согласно определе
- 5 031729 нию по каждой из вышеприведенных ссылок, приведены ниже в табл. 1 для сравнения. Таблица 1. Определения CDR
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1Нумерация остатков соответствует номенклатуре Kabat et al., supra 2Нумерация остатков соответствует номенклатуре Chothia et al., supra 3Нумерация остатков соответствует номенклатуре MacCallum et al., supra
В настоящем документе термин каркас при использовании по отношению к вариабельной области антитела предназначен для обозначения всех аминокислотных остатков вне CDR-участков в пределах вариабельной области антитела. Каркас вариабельной области, как правило, представляет собой прерывистую аминокислотную последовательность длиной приблизительно 100-120 аминокислот, но относится только к аминокислотам, находящимся за пределами CDR. В настоящем описании термин каркасная область предназначен для обозначения каждого домена каркаса, отделенного от другого домена гипервариабельными участками.
В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело или антитело человека. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (антитела реципиента), в которых остатки из гипервариабельного участка (CDR) реципиента замещены остатками из CDR антитела нечеловеческого происхождения (антитела донора), например, антитела мыши, крысы или кролика, обладающими желательной специфичностью, сродством и емкостью. Таким образом, гуманизированные формы антител нечеловеческого происхождения (например, антител мыши) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. Последовательности нечеловеческого происхождения расположены в основном в вариабельных областях, особенно в гипервариабельных участках (CDR). В некоторых вариантах реализации остатки Fv-каркаса иммуноглобулина человека замещают соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, не встречающиеся ни в антителах реципиента, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасного участка. В некоторых вариантах реализации гуманизированные антитела содержат практически все из по меньшей мере одного, а обычно - двух вариабельных доменов, в которых все или практически все CDR соответствуют аналогичным участкам из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или практически все каркасные области, соответствующие консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Для целей настоящего описания гуманизированные антитела могут также включать фрагменты иммуноглобулинов, например, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антиген-связывающие частичные последовательности антител.
Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере фрагмент константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно происходящий из иммуноглобулина человека. См., например, Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329 и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.
Известны способы гуманизации антител нечеловеческого происхождения. В общем случае гуманизированное антитело несет один или несколько аминокислотных остатков, внедренных в него из источника нечеловеческого происхождения. Эти аминокислотные остатки нечеловеческого происхождения часто называют импортными или донорными остатками, которые обычно получены из импортного или донорного вариабельного домена. Например, гуманизацию можно выполнить в основном в соответствии со способом Winter и сотрудников, подставляя CDR или последовательности CDR грызунов вместо соответствующих последовательностей антитела человека. См., например, Jones et al., supra; Riechmann et al., supra и Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536. Соответственно, такие гуманизированные антитела включают химерные антитела (патент США № 4816567), в которых фрагмент, существенно меньший по сравнению с интактным вариабельным доменом человека, замещен соответствующей последовательностью нечеловеческого происхождения. В некоторых вариантах реализации гуманизированные антитела представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и, необязательно, некоторые остатки каркасной области замещены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов (например, моноклональных антител мыши).
Антитела человека также можно получить, например, используя библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom et al. (1991) J. Mol. Biol, 227: 381; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581. Other methods for preparing human monoclonal antibodies are described by Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 и Boerner et al. (1991) J. Immunol. 147: 86-95.
- 6 031729
Антитела человека можно получить путем внедрения локусов иммуноглобулина человека в трансгенных животных, например, мышей, у которых частично или полностью инактивированы гены эндогенных иммуноглобулинов. После иммунологической стимуляции наблюдают продукцию антител человека, весьма сходную с таковой в организме человека во всех отношениях, включая реаранжировку генов, сборку и репертуар антител. Этот подход описан, например, в патентах США №№ 5545807; 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016 и в следующих научных публикациях: Marks et al. (1992) Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859; Morrison (1994) Nature 368: 812-813; Fishwald et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; Neuberger (1996) Nature Biotechnology 14:826; и Lonberg et al. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93.
Можно обеспечить аффинное созревание антител с помощью способов селекции и/или мутагенеза, описанных выше. В некоторых вариантах реализации аффинно зрелые антитела имеют сродство, в пять или более раз, в десять или более раз, в двадцать или более раз, или в тридцать или более раз превышающее сродство исходного антитела (как правило, мыши, кролика, курицы, гуманизированного антитела или антитела человека), из которого получено зрелое антитело.
Антитело также может представлять собой биспецифичное антитело. Биспецифичные антитела являются моноклональными, и могут представлять собой антитела человека или гуманизированные антитела, обладающие специфичностью связывания по крайней мере с двумя различными антигенами. В данном случае две различных специфичности связывания могут быть направлены на две различные ММР или два различных эпитопа в составе одной ММР (например, ММР9).
Антитело, описанное в настоящем документе, также может представлять собой иммуноконъюгат. Такие иммуноконъюгаты включают антитело (например, к ММР9) конъюгированное с другой молекулой, например, репортером. Иммуноконъюгат также может включать антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, например, химиотерапевтическим агентом, токсином (например, токсином бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, обладающим ферментативной активностью, или его фрагментами) или радиоактивным изотопом (т. е. радиоконъюгат).
Антитело, которое специфично связывается с или является специфичным к определенному полипептиду или эпитопу, представляет собой антитело, которое связывается с указанным определенным полипептидом или эпитопом в составе определенного полипептида и практически не связывается с любым другим полипептидом или эпитопом. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему описанию специфично связывается с ММР9 человека с константой диссоциации (Kd) равной или меньшей 100 нм, необязательно меньшей 10 нМ, необязательно меньшей 1 нм, необязательно меньшей 0,5 нМ, необязательно меньшей 0,1 нМ, необязательно меньшей 0,01 нм или необязательно меньшей 0,005 нм; в форме моноклонального антитела, scFv, Fab или другой форме антитела, измеренной при температуре приблизительно 4, 25, 37 и 42°C.
В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему описанию связывается с одним или несколькими сайтами процессинга (например, сайтами протеолитического расщепления) в ММР9, тем самым эффективно блокируя процессинг профермента или предшественника профермента в каталитически активный фермент, и, таким образом, снижая протеолитическую активность ММР9.
В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему описанию связывается с ММР9 со сродством, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз или по меньшей мере в 1000 раз более высоким, чем его сродство к другим ММР. Сродство связывания можно измерить любым способом, известным в данной области техники, и выразить, например, в виде скорости ассоциации, скорости диссоциации, константы диссоциации (Kd), константы равновесия (Keq) или любого показателя, известного в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему описанию является неконкурентным ингибитором каталитической активности ММР9. В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему описанию связывается с каталитическим доменом ММР9. В дополнительных вариантах реализации антитело согласно настоящему описанию связывается вне каталитического домена ММР9.
В настоящем описании также рассматриваются антитела или их антиген-связывающие фрагменты, конкурирующие с антителами против ММР9 или их антиген-связывающими фрагментами, которые, как описано в настоящем документе, связываются с ММР9. Таким образом, в настоящем описании рассматриваются антитела против ММР9 и их функциональные фрагменты, конкурирующие за связывание с, например, антителом, содержащим полипептид тяжелой цепи с любой из SEQ ID NOS: 1 или 5-8, полипептид легкой цепи с SEQ ID NOS: 2 или 9-12 или их комбинации. В одном из вариантов реализации антитело против ММР9 или его функциональный фрагмент конкурирует за связывание с ММР9 человека с антителом, описанным в настоящем документе как АВ0041.
Последовательность ММР9
Аминокислотная последовательность белка ММР9 человека выглядит следующим образом:
- 7 031729
MSLWQPLVLV LLVLGCCFAA PRQRQSTLVL FPGDLRTNLT DRQLAEEYLY 50
RYGYTRVAEM RGESKSLGPA LLLLQKQLSL PETGELDSAT LKAMRTPRCG 100
VPDLGRFQTF EGDLKWHHHN ITYWIQNYSE DLPRAVIDDA FARAFALWSA 150
VTPLTFTRVY SRDADIVIQF GVAEHGDGYP FDGKDGLLAH AFPPGPGIQG 200
DAHFDDDELW SLGKGVVVPT RFGNADGAAC HFPFIFEGRS YSACTTDGRS 250
DGLPWCSTTA NYDTDDRFGF CPSERLYTRD GNADGKPCQF PFIFQGQSYS 300
ACTTDGRSDG YRWCATTANY DRDKLFGFCP TRADSTVMGG NSAGELCVFP 350
FTFLGKEYST CTSEGRGDGR LWCATTSNFD SDKKWGFCPD QGYSLFLVAA 400
HEFGHALGLD HSSVPEALMY PMYRFTEGPP LHKDDVNGIR HLYGPRPEPE 450
PRPPTTTTPQ PTAPPTVCPT GPPTVHPSER PTAGPTGPPS AGPTGPPTAG 500
PSTATTVPLS PVDDACNVNI FDAIAEIGNQ LYLFKDGKYW RFSEGRGSRP 550
QGPFLIADKW PALPRKLDSV FEEPLSKKLF FFSGRQVWVY TGASVLGPRR 600
LDKLGLGADV AQVTGALRSG RGKMLLFSGR RLWRFDVKAQ MVDPRSASEV 650
DRMFPGVPLD THDVFQYREK AYFCQDRFYW RVSSRSELNQ VDQVGYVTYD 700
ILQCPED (SEQ ID N0:27)
Домены белка схематически показаны на фиг. 3 и указаны ниже:
№ аминокислот Свойство
1-19
Сигнальный пептид
38-98
Домен связывания пептидогликана
R98/C99
Сайт расщепления пропептида (зависит от расщепляющего фермента)
112-445
Домен Zn-зависимой металлопротеиназы
223-271
Домен фибронектина II типа (желатин-связывающий домен)
281-329
Домен фибронектина II типа (желатин-связывающий домен)
340-388
Домен фибронектина II типа (желатин-связывающий домен)
400-411
Zn-связывающая область
521-565
Гемопексин-подобный домен
567-608
Гемопексин-подобный домен
613-659
Гемопексин-подобный домен
661-704
Гемопексин-подобный домен
Аминокислотная последовательность зрелой полноразмерной ММР9 человека (которая представляет собой аминокислотную последовательность прополипептида SEQ ID NO: 27 без сигнального пептида) представляет собой:
PRQRQSTLVL
FPGDLRTNLT
DRQLAEEYLY
RYGYTRVAEM
RGESKSLGPA
LLLLQKQLSL
PETGELDSAT
LKAMRTPRCG
VPDLGRFQTF
EGDLKWHHHN
ITYWIQNYSE
DLPRAVIDDA
FARAFALWSA
VTPLTFTRVY
SRDADIVIQF
GVAEHGDGYP
FDGKDGLLAH
AFPPGPGIQG
DAHFDDDELW
SLGKGVVVPT
RFGNADGAAC
HFPFIFEGRS
YSACTTDGRS
DGLPWCSTTA
NYDTDDRFGF
CPSERLYTRD
GNADGKPCQF
PFIFQGQSYS
ACTTDGRSDG
YRWCATTANY
DRDKLFGFCP
TRADSTVMGG
NSAGELCVFP
FTFLGKEYST
CTSEGRGDGR
LWCATTSNFD
SDKKWGFCPD
QGYSLFLVAA
HEFGHALGLD
HSSVPEALMY
PMYRFTEGPP
LHKDDVNGIR
HLYGPRPEPE
PRPPTTTTPQ
PTAPPTVCPT
GPPTVHPSER
PTAGPTGPPS
AGPTGPPTAG
PSTATTVPLS
PVDDACNVNI
FDAIAEIGNQ
LYLFKDGKYW
RFSEGRGSRP
QGPFLIADKW
PALPRKLDSV
FEEPLSKKLF
FFSGRQVWVY
TGASVLGPRR
LDKLGLGADV
AQVTGALRSG
RGKMLLFSGR
RLWRFDVKAQ
MVDPRSASEV
DRMFPGVPLD
THDVFQYREK
AYFCQDRFYW
RVSSRSELNQ
VDQVGYVTYD
ILQCPED (SEQ ID N0:28) где аминокислотная последовательность сигнального пептида представляет собой
MSLWQPLVLV LLVLGCCFAA (SEQ ID NO: 29).
В настоящем описании рассматриваются ММР9-связывающие белки, связывающиеся с любым фрагментом ММР9, например, ММР9 человека, причем ММР9-связывающие белки, преимущественно связывающиеся с ММР9 по сравнению с другими ММР, представляют особый интерес.
Антитела против ММР9 и их функциональные фрагменты можно получить в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Примеры антител против ММР9 приведены ниже.
Моноклональные антитела мыши против ММР9
Моноклональное антитело мыши к ММР9 человека получили, как описано в примере 1. Указанное антитело содержит тяжелую цепь IgG2b мыши и легкую каппа-цепь мыши и обозначается как АВ0041.
- 8 031729
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи АВ0041 выглядит следующим образом:
MAVLVLFLCLVAFPSCVLSQVQLKESGPGLVAPSOSLSITCTVSGFSLLSYGVHW
VRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYY
CARYYYGMOYWGGGYSYYYSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSyTLGCLVKGYFPESVTVT WNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTI NPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKD VLMISL TPKVTCVVVD VSEDDPD VRISWFVN NVE УНТА QTQTHRED YNSTIR WSALPIQHQD WMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGL V RAPQVY1LPPPAEQLSRKDVSLTCLWGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYF1Y SKLDIKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKT1SRSPGK (SEQ ID N0:1)
Сигнальная последовательность выделена подчеркнутым шрифтом, а последовательность константной области IgG2b выделена курсивом.
Аминокислотная последовательность легкой цепи АВ0041 выглядит следующим образом:
MESOIOVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASODVRNTVA
WYQQKTGQSPKLLIYSSSYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQHYIT
RYYYGGGYREEARRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQN
GVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID
N0:2)
Сигнальная последовательность выделена подчеркнутым шрифтом, а последовательность константной области каппа-цепи выделена курсивом.
Следующая аминокислотная последовательность включает каркасные области и гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области тяжелой цепи IgG2b АВ0041 (CDR выделены подчеркиванием):
OVOFKESGPGFVAPSOSFSITCTVSGFSEFSYGVHWVRQPPGKGFEWFGVIWTGGTTNY
NSAFMSRESISKDDSKSOVFFKMNSFQTDDTAIYYCARYYYGMDYWGOGTSVTVSS (SEQ ID N0:3)
Следующая аминокислотная последовательность включает каркасные области и гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области легкой каппа-цепи IgG2b AB0041 (CDR выделены подчеркиванием):
DIVMTOSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRNTVAWYOQKTGOSPKEEIYSSSYRNTGVP DRFTGSGSGTDFTFTISSVOAFDEAVYFCOQHYITPYTFGGGTKEFIK (SEQ ID N0:4)
Варианты тяжелой цепи
Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей АВ0041 модифицировали по отдельности путем изменения последовательностей каркасных областей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи.
Эффект этих изменений последовательности проявлялся в разрушении эпитопов антитела, взаимодействующих с Т-клетками человека, тем самым снижая или устраняя его иммуногенность для человека (Antitope, Бабрагем, Великобритания).
Сконструированы четыре варианта тяжелых цепей на основе тяжелой цепи IgG4 человека, содержащей аминокислотную замену S241P, стабилизирующую шарнирный домен (Angal et al. (1993) Molec. Immunol. 30:105-108), названные VH1, VH2, VH3 и VH4. Аминокислотные последовательности их каркасных областей и CDR выглядят следующим образом:
VH1
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTG
GTTNYNSALMSRLTISKDDSKSTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTSV
TVSS (SEQ ID N0:5)
VH2
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTG GTTNYNSALMSRLTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTLV TVSS (SEQ ID N0:6)
VH3
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTG GTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTLV TVSS (SEQ ID N0:7)
VH4
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTG GTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTLYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTLV TVSS (SEQ ID N0:8)
На фиг. 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей гуманизированных тяжелых цепей и указаны различия в аминокислотных последовательностях каркасных областей четырех указанных вариантов.
- 9 031729
Варианты легкой цепи
Сконструированы четыре варианта легких цепей на основе каппа-цепи человека, названные Vk1, Vk2, Vk3 и Vk4. Аминокислотные последовательности их каркасных областей и CDR выглядят следующим образом:
Vkl
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKTGKAPKLLIYSSSYR NTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID N0:9)
Vk2
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSYRN TGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID N0:10)
Vk3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSYRN TGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID N0:11)
Vk4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSYRN TGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYITPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID N0:12)
На фиг. 2 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей гуманизированных легких цепей и указаны различия в аминокислотных последовательностях каркасных областей четырех указанных вариантов.
Гуманизированные тяжелые и легкие цепи объединяли во все возможные парные комбинации, получая набор функциональных гуманизированных антител против ММР9.
Кроме того, обеспечены дополнительные аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи, обладающие 75% или большей, 80% или большей, 90% или большей, 95% или большей или 99% или большей гомологией с последовательностями вариабельной области тяжелой цепи, описанными в настоящем документе. Кроме того, обеспечены дополнительные аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, обладающие 75% или большей, 80% или большей, 90% или большей, 95% или большей или 99% или большей гомологией с последовательностями вариабельной области легкой цепи, описанными в настоящем документе.
Кроме того, обеспечены дополнительные аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи, обладающие 75% или большей, 80% или большей, 90% или большей, 95% или большей или 99% или большей идентичностью последовательностям вариабельной области тяжелой цепи, описанным в настоящем документе. Кроме того, обеспечены дополнительные аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, обладающие 75% или большей, 80% или большей, 90% или большей, 95% или большей или 99% или большей идентичностью с последовательностями вариабельной области легкой цепи, описанными в настоящем документе.
Гипервариабельные участки (CDR)
CDR тяжелой цепи антитела против ММР9, описанного в настоящем документе, обладают следующими аминокислотными последовательностями:
CDRl: GFSLLSYGVH (SEQ ID N0:13)
CDR2: VIWTGGTTNYNSALMS (SEQ ID N0:14)
CDR3: YYYGMDY (SEQ ID NOT5)
CDR легкой цепи антитела против ММР9, описанного в настоящем документе, обладают следующими аминокислотными последовательностями:
CDRl: KASQDVRNTVA (SEQ ID N0:16)
CDR2: SSSYRNT (SEQ ID N0:17)
CDR3: QQHYITPYT (SEQ ID N0:18)
Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела против ММР9
Настоящее описание обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела против ММР9 и их функциональные фрагменты. Соответственно, настоящее описание обеспечивает выделенный полинуклеотид (нуклеиновую кислоту), кодирующий антитело или антиген-связывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, векторы, содержащие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева и системы экспрессии для транскрипции и трансляции таких полинуклеотидов в полипептиды.
В настоящем описании также рассматриваются конструкции в виде плазмид, векторов, кассет для транскрипции или экспрессии, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, описанный выше.
Настоящее описание также обеспечивает рекомбинантную клетку-хозяина, содержащую один или несколько конструктов, описанных выше, а также способы продукции антитела или его антигенсвязывающих фрагментов, описанные здесь, причем способ включает экспрессию нуклеиновой кислоты,
- 10 031729 кодирующей полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи (в той же или разных клеткаххозяевах, и на основе того же или разных конструктов), в рекомбинантной клетке-хозяине. Экспрессию можно осуществить путем культивирования рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, при соответствующих условиях. После продукции путем экспрессии антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно выделить и/или очистить с помощью любой подходящей методики, а затем использовать по мере необходимости.
Хорошо известны системы для клонирования и экспрессии полипептида в различных клеткаххозяевах. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, клетки млекопитающих, дрожжей и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области техники для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка, клетки меланомы мыши NSO и многие другие. Широко используемый бактериальный хозяин представляет собой E. coli.
Подходящие векторы, которые можно выбрать или сконструировать, содержат соответствующие регуляторные последовательности, в том числе функционально связанные последовательности промоторов, последовательности терминаторов, последовательности полиаденилирования, последовательности энхансеров, маркерные гены и/или другие последовательности по мере необходимости. Векторы могут представлять собой плазмиды, вирусные, например, фаговые векторы или фагмиды, в зависимости от конкретного случая. Для получения дополнительной информации см., например, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные способы и протоколы для работы с нуклеиновыми кислотами, например, изготовления конструктов нуклеиновых кислот, мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов, а также анализа белков подробно описаны в Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Работы Sambrook et al. и Ausubel et al. полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Нуклеиновая кислота, кодирующая представляющий интерес полипептид, интегрирована в геном клетки-хозяина или может поддерживаться в качестве стабильного или временного эписомного элемента.
Любую из широкого спектра последовательностей контроля экспрессии -последовательностей, контролирующих экспрессию последовательности ДНК, функционально связанной с ней - можно использовать в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК. Например, нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес полипептид, можно функционально связать с промотором и включить в конструкт для экспрессии для использования в способах продукции рекомбинантных белков ММР9 или их фрагментов.
Специалистам в данной области известно, что нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи антитела, описанные здесь, можно синтезировать с использованием стандартной информации и процедур в области молекулярной биологии.
Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи, описанных здесь, выглядят следующим образом:
- 11 031729
VHl: CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC
ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG
TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGGAAGG GCCTGGAATG GCTGGGCGTG
ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGCT
GACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGTCCAC CGTGTACCTG AAGATGAACT
CCCTGAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC
GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCTCC GTGACCGTGT CCTCA (SEQ ID N0:19)
VH2: CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC
ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG
TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAG GCCTGGAATG GCTGGGCGTG
ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGCT
GACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CGTGTACCTG AAGATGAACT
CCCTGAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC
GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGT CCTCA (SEQ ID N0:20)
VH3: CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC
ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG
TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAG GCCTGGAATG GCTGGGCGTG
ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGTT
CACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CGTGTACCTG AAGATGAACT
CCCTGAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC
GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGT CCTCA (SEQ ID N0:21)
VH4: CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC
ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG
TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAG GCCTGGAATG GCTGGGCGTG
ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGTT
CACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CCTGTACCTG AAGATGAACT
CCCTGAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC
GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGT CCTCA (SEQ ID N0:22)
Vkl: GACATCGTGA TGACCCAGTC CCCCAGCTTC CTGTCCGCCT CCGTGGGCGA
CAGAGTGACC ATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG
CCTGGTATCA GCAGAAAACC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC
TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTTACCG GCTCTGGCTC
CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG
CCGTGTACTT CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA
GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEQ ID N0:23)
Vk2: GACATCGTGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA
CAGAGTGACC ATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG
CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC
TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTTACCG GCTCTGGCTC
CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG
CCGTGTACTT CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA
GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEQ ID N0:24)
Vk3: GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA
CAGAGTGACC ATCACATGCA AGGCCTCCCA GGACGTGCGG AACACCGTGG
CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC
TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTCTCTG GCTCTGGAAG
CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG
CCGTGTACTT CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA
GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEQ ID N0:25)
Vk4: GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA
CAGAGTGACC ATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG
CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC
TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTCTCTG GCTCTGGAAG
CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG
CCGTGTACTA CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA
GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEQ ID N0:26)
Поскольку структура антител, в том числе расположение CDR и каркасных областей в вариабельной области, структуру каркасных областей и структуру константных областей тяжелой и легкой цепи,
- 12 031729 хорошо известна в данной области техники, специалисты способны получить соответствующие нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела против ММР-9. Соответственно, также обеспечиваются полинуклеотиды, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, обладающие по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% и по меньшей мере 99% гомологией с любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе. Соответственно, также обеспечиваются полинуклеотиды, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, обладающие по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% и по меньшей мере 99% идентичностью любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.
Фармацевтические композиции
ММР9-связывающие белки, а также нуклеиновые кислоты (например, ДНК или РНК), кодирующие ММР9-связывающие белки, можно предоставить в виде фармацевтической композиции, например, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом. Такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для введения субъекту in vivo или ex vivo, а также для диагностики и/или лечения пациента ММР9-связывающими белками.
Фармацевтически приемлемые носители являются физиологически приемлемыми для введения пациенту и сохраняют терапевтические свойства антител или пептидов, с которыми их вводят. Фармацевтически приемлемые носители и их составы в целом описаны, например, в Remington' pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990). Одним из типичных фармацевтических носителей является физиологический раствор. Каждый носитель является фармацевтически приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не наносит существенного вреда пациенту.
Фармацевтические композиции можно составить так, чтобы она была совместима с определенным системным или местным путем введения. Так, фармацевтические композиции включают в себя носители, разбавители или вспомогательные вещества, пригодные для введения различными путями.
Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемые добавки. Примеры добавок включают сахар, например, маннит, сорбит, глюкозу, ксилит, трегалозу, сорбозу, сахарозу, галактозу, декстран, декстрозу, фруктозу, лактозу и их смеси, но не ограничиваются ими. Фармацевтически приемлемые добавки можно объединять с фармацевтически приемлемыми носителями и/или вспомогательными веществами, например, декстрозой. Добавки также включают поверхностно-активные вещества, например, полисорбат 20 или полисорбат 80.
Состав и способы доставки, как правило, адаптируют соответственно области и заболеванию, которое подвергают лечению. Типичные составы включают составы, пригодные для парентерального введения, например, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного или подкожного введения, но не ограничиваются ими.
Фармацевтические композиции для парентеральной доставки включают, например, воду, физиологический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Хэнкса, раствор Рингера, физиологический раствор с декстрозой и растворы глюкозы. Составы могут содержать вспомогательные вещества для приближения к физиологическим условиям, например, буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, увлажнители, детергенты и т. п. Добавки также могут включать дополнительные активные ингредиенты, такие как бактерицидные средства или стабилизаторы. Например, раствор может содержать ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат или триэтаноламинолеат. Дополнительные составы и способы для парентерального введения описаны в Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65 75; Warren (1997) J. Neurol. Sci. 152:31 38 и Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507 515. Препарат для парентерального применения можно поместить в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократного приема из стекла или пластика.
В фармацевтические композиции для внутрикожного или подкожного введения можно включать в стерильный разбавитель, например, воду, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, например, бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту, глутатион или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусную кислоту; буферы, например ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, например хлорид натрия или декстрозу.
Фармацевтические композиции для инъекций включают водные растворы (при растворимости агента в воде) или дисперсии и стерильные порошки для изготовления стерильных растворов для инъекций или дисперсий для немедленного приема. Подходящие носители для внутривенного введения включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor ELTM (BASF, Парсиппани, штат Нью-Джерси, США) или физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS). Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси. Текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытий, например, ле
- 13 031729 цитина, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования ПАВ. Антибактериальные и противогрибковые средства включают, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тимеросал. В композицию можно включать изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, например, маннит, сорбит, и хлорид натрия. Полученные растворы можно упаковать для использования как есть, или в лиофилизированном виде; лиофилизированный препарат в дальнейшем можно объединить со стерильным раствором перед введением.
Фармацевтически приемлемые носители могут содержать соединение, стабилизирующее, увеличивающее или задерживающее всасывание или выведение. Такие соединения включают, например, углеводы, например, глюкозу, сахарозу или декстраны; низкомолекулярные белки; композиции, снижающие выведение или гидролиз пептидов; или вспомогательные вещества или другие стабилизаторы и/или буферы. Агенты, задерживающие всасывание, включают, например, моностеарат алюминия и желатин. Для стабилизации или для увеличения или снижения всасывания фармацевтической композиции можно использовать детергенты, в том числе липосомальные носители. Для защиты от гидролиза соединение можно включить в состав комплекса с композицией, придавая ему устойчивость к кислотному и ферментативному гидролизу, или соединение можно включить в состав комплекса с соответствующим устойчивым носителем, например, липосомой. В данной области техники известны средства защиты соединений от гидролиза (см., например, Fix (1996) Pharm Res. 13:17601764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119135 и патент США № 5391377, описывающий липидные композиции для пероральной доставки терапевтических агентов).
Композиции согласно настоящему изобретению можно объединять с другими терапевтическими веществами или веществами для визуализации/диагностики, как это предусмотрено в настоящем документе. Терапевтическе вещества и/или вещества для визуализации можно предоставить в виде отдельной композиции, или в качестве молекулы, конъюгированной с ММР9-связывающим белком.
Препараты для введения in vivo, как правило, являются стерильными. В одном варианте реализации фармацевтические композиции составлены так, что не содержат пирогенов и являются приемлемыми для введения пациентам-людям.
Различные другие фармацевтические композиции и методики их получения и использования известны специалистам в данной области техники в свете настоящего описания. Подробный список подходящих фармакологических композиций и связанных с ними методик введения приведен среди подробной информации, изложенной в настоящем документе, которую можно дополнить такими текстами, как Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (Lippincott, Williams & Wilkins 2003).
Фармацевтические композиции можно составить на основе физических характеристик пациента/субъекта, нуждающегося в лечении, пути введения и т.п. Такие композиции можно упаковать в подходящую фармацевтическую упаковку с соответствующей этикеткой для распределения в больницы и клиники, причем этикетка содержит указания по лечению расстройства у субъекта, как описано в настоящем документе. Медикаменты можно упаковать в виде одной или нескольких единиц. Инструкция для дозировки и введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению можно включить в фармацевтические упаковки и наборы, описанные ниже.
Способы использования
ММР9 связывающие белки согласно настоящему описанию можно использовать, например, в способах обнаружения ММР9 в образце, в способах лечения (например, в способах ингибирования ангиогенеза), а также в способах диагностики. Примеры способов использования описаны ниже.
Способы лечения
В данном разделе представлены способы лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9. Болезни и расстройства включают опухоли (например, первичные или метастатические), экспрессирующие ММР9 или расположенные в ткани, которая экспрессирует ММР9, но не ограничиваются ими.
В настоящем описании лечить или лечение означает остановку или отсрочку развития симптомов заболевания или расстройства, описанного в настоящем документе. Указанные термины дополнительно включают улучшение существующих неконтролируемых или нежелательных симптомов, предотвращение дополнительных симптомов и облегчение или предотвращение основной метаболической причины симптомов. Таким образом, указанные термины означают достижение положительного результата для субъекта-млекопитающего, страдающего заболеванием или симптомом, или потенциально подверженного развитию такого заболевания или симптома. Реакция достигается, если пациент испытывает частичное или полное облегчение или снижение признаков или симптомов болезни, и, в частности, включает, без ограничения, увеличение срока жизни. Ожидаемый срок жизни без прогрессирования можно измерить в месяцах или годах, в зависимости от прогностических факторов, включающих количество рецидивов, стадию заболевания и другие факторы.
В настоящем описании рассматриваются фармацевтические композиции для использования в связи с такими способами. Композиции могут быть пригодны для местного или системного введения любым подходящим путем.
В целом, ММР9-связывающие белки вводят в терапевтически эффективном количестве, например,
- 14 031729 в количестве, осуществляющем ингибирование опухолевого роста в организме субъекта и/или ингибирование метастазов.
В настоящем описании термин терапевтически эффективное количество или эффективное количество относится к количеству терапевтического агента, который при введении отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом в организм субъекта является эффективным для предотвращения или облегчения болезненного состояния или прогрессирования заболевания. Терапевтически эффективная доза также относится к количеству соединения, достаточному для облегчения симптомов, например, лечения, исцеления, предотвращения или облегчения соответствующего заболевания, или увеличения скорости лечения, исцеления, предотвращения или облегчения таких заболеваний. Применительно к отдельному активному ингредиенту, вводимому в чистом виде, терапевтически эффективная доза относится к этому ингредиенту в чистом виде. Применительно к комбинации терапевтически эффективная доза относится к объединенному количеству активных ингредиентов, приводящему к терапевтическому эффекту, независимо от их введения в комбинации, последовательно или одновременно. Например, при введении антител против ММР9 in vivo, нормальное дозируемое количество может варьироваться от приблизительно 10 нг/кг до 100 мг/кг массы тела млекопитающего или более в сутки, предпочтительно от приблизительно 1 до 50 мг/кг/сут, необязательно от приблизительно 100 до 20 мг/кг/сут, от 500 до 10 мг/кг/сут или от 1 до 10 мг/кг/сут, в зависимости от пути введения.
Выбранная схема дозирования зависит от различных факторов, включая активность ММР9связывающего белка, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретной используемой композицией, возраста, половой принадлежности, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни пациента, подвергаемого лечению, и т.п. факторов, общеизвестных в области медицины.
Врач-специалист может легко определить и назначить необходимое эффективное количество (ED50) фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с дозировок соединения согласно настоящему изобретению, использованных в фармацевтической композиции, на несколько уровней меньших, чем требуется для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желательного эффекта.
В настоящем документе термин субъект означает субъектов-млекопитающих. Типичные субъекты включают людей, обезьян, собак, кошек, мышей, крыс, коров, лошадей, коз и овец, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации субъект страдает от рака и может подвергаться лечению с помощью агента согласно настоящему изобретению, как описано ниже.
При необходимости, способы для лечения рака могут дополнительно включать хирургическое удаление рака и/или введение противоракового агента или лечение в дополнение к ММР9-связывающему белку. Введение такого противоракового агента или лечение могут происходить одновременно с введением композиций, описанных в настоящем документе.
Способы обнаружения ММР9
В настоящем описании также рассматриваются способы обнаружения ММР9 в организме субъекта, например, для обнаружения опухоли или опухолеассоциированной ткани, экспрессирующей ММР9. Таким образом, обеспечиваются способы диагностики, мониторинга, определения стадии или обнаружения опухоли, обладающей активностью ММР9.
Образцы, взятые у лиц, предположительно страдающих опухолью, ассоциированной с экспрессией ММР9, можно собрать и проанализировать путем обнаружения наличия или отсутствия связывания ММР9-связывающего белка. Этот анализ можно выполнить до начала лечения с использованием ММР9связывающего белка, описанного в настоящем документе, или в рамках мониторинга лечения рака. Такой диагностический анализ можно выполнить, используя любой образец, в том числе ткань, клетки, выделенные из таких тканей, и т.п., но не ограничиваясь ими. Образцы тканей включают, например, фиксированные формалином или замороженные срезы тканей.
Можно использовать любой подходящий способ обнаружения и анализа ММР9. Для такой цели можно приспособить различные диагностические методики анализа, известные в данной области техники, например, анализ конкурентного связывания, прямой или непрямой сэндвич-анализ и анализ с применением иммунопреципитации, выполняемые в гетерогенной или гомогенной фазе.
ММР9-связывающие белки для использования в способах обнаружения можно метить обнаруживаемой молекулой. Обнаруживаемая молекула прямо или косвенно создает обнаруживаемый сигнал. Например, обнаруживаемая молекула может представлять собой любую молекулу из описанных здесь, например, радиоактивный изотоп, например, 3H, 14С, 32Р, 35S или 125I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), техасский красный, цианин, фотоциан, родамин или люциферин, или фермент, например, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или пероксидазу хрена.
Обнаружение можно осуществлять путем контактирования образца в условиях, подходящих для связывания ММР9-связывающего белка с ММР9 и оценки присутствия (например, уровня) или отсутствия комплексов ММР9-связывающий белок -ММР9. Уровень ММР9 в образце по сравнению с уровнем в
- 15 031729 эталонном образце может указывать на наличие опухоли или ассоциированных с опухолью тканей, обладающих активностью ММР9. Эталонный образец может представлять собой образец, взятый у субъекта на более ранний момент времени или образец, взятый у другого субъекта.
Примеры
Пример 1. Получение антител к ММР-9 человека.
Для иммунизации мышей использовали полноразмерный белок ММР9 человека без сигнального пептида, представлявший собой SEQ ID NO: 28. Клетки селезенки иммунизированных мышей гибридизовали с клетками миеломы для создания гибридомной библиотеки. Получали моноклональные культуры и выполняли их скрининг с целью идентификации культур, экспрессирующих моноклональное антитело против ММР9.
Антитело (АВ0041) выделяли из одной из культур и выполняли оценку его характеристик. Антитело содержало тяжелую цепь IgG2b и легкую каппа-цепь. Оценка характеристик включала тестирование связывания АВ0041 с другими ММР человека и белками ММР9 других видов, в том числе яванского макака, крысы и мыши. Было установлено, что антитело АВ0041 прочно связывалось с ММР9 человека и яванского макака, менее прочно связывалось с ММР9 крысы, и не связывалось с ММР9 мыши или многими матриксными металлопротеиназами человека, не являвшимися ММР.
Таблица 2. Перекрестная реакционная способность АВ0041 и АВ0045
Протестированная ММР Константа диссоциации (Kd)
АВ0045 АВ0041
ММР1 человека > 100 нМ > 100 нМ
ММР2 человека > 100 нМ > 100 нМ
ММР2 мыши > 100 нМ > 100 нМ
ММРЗ человека > 100 нМ > 100 нМ
ММР7 человека > 100 нМ > 100 нМ
ММР8 человека > 100 нМ > 100 нМ
ММР9 человека 0,168 ± 0,117 нМ 0,133 ± 0,030 нМ
ММР9 яванского макака 0,082 ± 0,022 нМ 0,145 ± 0,16 нМ
ММР9 мыши > 100 нМ > 100 нМ
ММР9 крысы 0,311 ±0,017 нМ 0,332 ± 0,022 нМ
ММР 10 человека > 100 нМ > 100 нМ
ММР 12 человека > 100 нМ > 100 нМ
ММР 13 человека > 100 нМ > 100 нМ
Дополнительная оценка характеристик включала анализ связывания антитела с ММР9 мыши, содержащей некоторые аминокислотные замены для более точного соответствия последовательности ММР9 человека. Кроме того, белок ММР9 человека подвергали мутагенезу, и различные мутанты тестировали на их способность связываться антителом с целью определения аминокислот, важных для связывания антитела и, таким образом, определения терапевтического эпитопа. Этот анализ выявил, что остаток аргинина в положении 162 аминокислотной последовательности ММР9 (R162) важен для связывания антитела. Другие аминокислотные остатки в ММР9, важные для связывания антитела АВ0041, включают E111, D113 и I198. Полученная в последнее время кристаллическая структура ММР9 показала, что E111, D113, R162, и I198 сгруппированы вблизи друг от друга вокруг Са2+-связывающего кармана ММР9. Без привязки к какой-либо конкретной научной теории, АВ0041 может связываться с областью ММР9, в которой расположены указанные остатки. В качестве альтернативы, эти остатки ММР9 могут вступать в прямой контакт с АВ0041.
При ферментативном анализе ММР9 обнаружено, что антитело АВ0041 действовало, как неконкурентный ингибитор.
Пример 2. Гуманизация антител к ММР9 человека
Аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела АВ0041 мыши модифицировали по определенным положениям каркасных участков (т.е., не гипервариабельных участков) их вариабельных областей, получая белки, которые были менее иммуногенными для человека. Эти изменения аминокислотной последовательности показаны на фиг. 1 и 2. Перекрестная реакционная способность гуманизированного антитела (называемого АВ0045) показана в табл. 2 выше.
- 16 031729
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ДЖАЛИД БАЙОЛОДЖИКС, ИНК.
МАККОЛИ, СКОТТ АЛАН
КОВАЛЕНКО, МАРИЯ <120> АНТИТЕЛА К МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЕ 9 <130> 246102008040 <140> PCT/US2011/049448 <141> 26.08.2011 <150> US 61/377886 <151> 27.08.2010 <160> 29 <170> FastSEQ для Windows, версия 4.0 <210> 1 <211> 470 <212> Белок <213> Mus musculus <220>
<221> Цепь <222> (1)...(470) <223> Тяжелая цепь AB0041 <220>
<221> Пептид <222> (1)...(19) <223> Сигнальный пептид <220>
<221> прочее <222> (135)...(470) <223> Константная область IgG2b <400> 1
Met 1 Ala Val Leu Val 5 Leu Phe Leu Cys Leu 10 Val Ala Phe Pro Ser 15 Cys
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Leu Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
- 17 031729
Ser Gly Ser Leu 180 Ser Ser Ser Val His 185 Thr Phe Pro Ala Leu 190 Leu Gln
Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
195 200 205
Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser
210 215 220
Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile
225 230 235 240
Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn
245 250 255
Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp
260 265 270
Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn
290 295 300
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
325 330 335
Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
340 345 350
Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys
370 375 380
Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile
385 390 395 400
Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp
405 410 415
Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Asp Ile Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys
435 440 445
Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile
450 455 460
Ser Arg Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 2 <211> 234 <212> Белок <213> Mus musculus <220>
<221> Цепь <222> (1)...(234) <223> Легкая цепь AB0041 <220>
<221> Пептид <222> (1)...(20) <223> Сигнальный пептид <220>
<221> прочее <222> (128)...(234) <223> Константная область каппа-цепи <400> 2
Met Glu Ser Gln Ile Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser
5 10 15
- 18 031729
Gly Val Asp Gly 20 Asp Ile Val Met Thr 25 Gln Ser His Lys Phe 30 Met Ser
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Arg Asn Thr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 <210> 3 <211> 115 <212> Белок <213> Mus musculus <220>
<221> Цепь <222> (1)...(115) <223> Вариабельная область тяжелой цепи IgG2b AB0041 <220>
<221> прочее <222> (26)...(35) <223> Гипервариабельная область (CDR) <220>
<221> прочее <222> (50)...(65) <223> Гипервариабельная область (CDR) <220>
<221> прочее <222> (98)...(104) <223> Гипервариабельная область (CDR) <400> 3
Gln 1 Val Gln Leu Lys 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Ala Pro Ser Gln 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
- 19 031729
55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115 <210> 4 <211> 107 <212> Белок <213> Mus musculus <220>
<221> Цепь <222> (1)...(107) <223> Вариабельная область легкой каппа-цепи AB0041 <220>
<221> прочее <222> (24)...(34) <223> Гипервариабельная область (CDR) <220>
<221> прочее <222> (50)...(56) <223> Гипервариабельная область (CDR) <220>
<221> прочее <222> (89)...(97) <223> Гипервариабельная область (CDR) <400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> <212> <213> 115 Белок Искусственная последовательность
<220> <223> синтетический конструкт
<220> <221> Вариант
- 20 031729 <222> (1)...(115) <223> Вариант тяжелой цепи VH1 <400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 6 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> Вариант <222> (1)...(115) <223> Вариант тяжелой цепи VH2 <400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 7 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <223> синтетический конструкт <220>
<220>
- 21 031729 <221> Вариант <222> (1)...(115) <223> Вариант тяжелой цепи VH3 <400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> Вариант <222> (1)...(115) <223> Вариант тяжелой цепи VH4 <400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> синтетический конструкт
- 22 031729 <220>
<221> Вариант <222> (1)...(107) <223> Вариант легкой цепи Vk1 <400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10 <211> 107 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> Вариант <222> (1)...(107) <223> Вариант легкой цепи Vk2 <400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический конструкт
<220>
<221> Вариант
<222> (1)...(107)
- 23 031729 <223> Вариант легкой цепи Vk3 <400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12 <211> 107 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> Вариант <222> (1)...(107) <223> Вариант легкой цепи Vk4 <400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(10) <223> гипервариабельная область (CDR1) тяжелой цепи антитела против MMP9
- 24 031729 <400> 13
Gly Phe Ser Leu Leu Ser Tyr Gly Val His
5 10 <210> 14 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(16) <223> гипервариабельная область (CDR2) тяжелой цепи антитела против MMP9 <400> 14
Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser
5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(7) <223> гипервариабельная область (CDR3) тяжелой цепи антитела против MMP9 <400> 15
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr
5 <210> 16 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(11) <223> гипервариабельная область (CDR1) легкой цепи антитела против MMP9 <400> 16
Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Thr Val Ala
5 10 <210> 17
- 25 031729 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(7) <223> гипервариабельная область (CDR2) легкой цепи антитела против MMP9 <400> 17
Ser Ser Ser Tyr Arg Asn Thr
5 <210> 18 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(9) <223> гипервариабельная область (CDR3) легкой цепи антитела против MMP9 <400> 18
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr Thr
5 <210> 19 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(345) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность VH1 тяжелой цепи <400> 19 caggtgcagc tgcaggaatc cggccctggc ctggtcaagc cctccgagac actgtccctg60 acctgcaccg tgtccggctt ctccctgctg tcctacggcg tgcactgggt ccgacagcct120 ccagggaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggaccg gcggcaccac caactacaac180 tccgccctga tgtcccggct gaccatctcc aaggacgact ccaagtccac cgtgtacctg240 aagatgaact ccctgaaaac cgaggacacc gccatctact actgcgcccg gtactactac300 ggcatggact actggggcca gggcacctcc gtgaccgtgt cctca345 <210> 20 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 26 031729 <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(345) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность VH2 тяжелой цепи <400> 20 caggtgcagc tgcaggaatc cggccctggc ctggtcaagc cctccgagac actgtccctg60 acctgcaccg tgtccggctt ctccctgctg tcctacggcg tgcactgggt ccgacagcct120 ccaggcaaag gcctggaatg gctgggcgtg atctggaccg gcggcaccac caactacaac180 tccgccctga tgtcccggct gaccatctcc aaggacgact ccaagaacac cgtgtacctg240 aagatgaact ccctgaaaac cgaggacacc gccatctact actgcgcccg gtactactac300 ggcatggact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtgt cctca345 <210> 21 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(345) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность VH3 тяжелой цепи <400> 21 caggtgcagc tgcaggaatc cggccctggc ctggtcaagc cctccgagac actgtccctg60 acctgcaccg tgtccggctt ctccctgctg tcctacggcg tgcactgggt ccgacagcct120 ccaggcaaag gcctggaatg gctgggcgtg atctggaccg gcggcaccac caactacaac180 tccgccctga tgtcccggtt caccatctcc aaggacgact ccaagaacac cgtgtacctg240 aagatgaact ccctgaaaac cgaggacacc gccatctact actgcgcccg gtactactac300 ggcatggact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtgt cctca345 <210> 22 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(345) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность VH4 тяжелой цепи <400> 22 caggtgcagc tgcaggaatc cggccctggc ctggtcaagc cctccgagac actgtccctg60 acctgcaccg tgtccggctt ctccctgctg tcctacggcg tgcactgggt ccgacagcct120 ccaggcaaag gcctggaatg gctgggcgtg atctggaccg gcggcaccac caactacaac180 tccgccctga tgtcccggtt caccatctcc aaggacgact ccaagaacac cctgtacctg240 aagatgaact ccctgaaaac cgaggacacc gccatctact actgcgcccg gtactactac300 ggcatggact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtgt cctca345 <210> 23
- 27 031729 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(321) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность Vk1 легкой цепи <400> 23 gacatcgtga tgacccagtc ccccagcttc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc60 atcacatgca aggcctctca ggacgtgcgg aacaccgtgg cctggtatca gcagaaaacc120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactcc tcctcctacc ggaacaccgg cgtgcccgac180 cggtttaccg gctctggctc cggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcaggcc240 gaggacgtgg ccgtgtactt ctgccagcag cactacatca ccccctacac cttcggcgga300 ggcaccaagg tggaaataaa a321 <210> 24 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(321) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность Vk2 легкой цепи <400> 24 gacatcgtga tgacccagtc cccctccagc ctgtccgcct ctgtgggcga cagagtgacc60 atcacatgca aggcctctca ggacgtgcgg aacaccgtgg cctggtatca gcagaagccc120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactcc tcctcctacc ggaacaccgg cgtgcccgac180 cggtttaccg gctctggctc cggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcaggcc240 gaggacgtgg ccgtgtactt ctgccagcag cactacatca ccccctacac cttcggcgga300 ggcaccaagg tggaaataaa a321 <210> 25 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(321) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность Vk3 легкой цепи <400> 25 gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtccgcct ctgtgggcga cagagtgacc60 atcacatgca aggcctccca ggacgtgcgg aacaccgtgg cctggtatca gcagaagccc120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactcc tcctcctacc ggaacaccgg cgtgcccgac180 cggttctctg gctctggaag cggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcaggcc240 gaggacgtgg ccgtgtactt ctgccagcag cactacatca ccccctacac cttcggcgga300
- 28 031729 ggcaccaagg tggaaataaa a 321 <210> 26 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетический конструкт <220>
<221> прочее <222> (1)...(321) <223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность Vk4 легкой цепи <400> 26 gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtccgcct ctgtgggcga cagagtgacc60 atcacatgca aggcctctca ggacgtgcgg aacaccgtgg cctggtatca gcagaagccc120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactcc tcctcctacc ggaacaccgg cgtgcccgac180 cggttctctg gctctggaag cggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcaggcc240 gaggacgtgg ccgtgtacta ctgccagcag cactacatca ccccctacac cttcggcgga300 ggcaccaagg tggaaataaa a321 <210> 27 <211> 707 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>
<221> прочее <222> (1)...(707) <223> металлопротеиназа 9 матрикса (MMP9) <220>
<221> Пептид <222> (1)...(19) <223> Сигнальный пептид <220>
<221> Домен <222> (38)...(98) <223> пептидогликан-связывающий домен <220>
<221> Сайт <222> (98)...(99) <223> сайт расщепления пропептида <220>
<221> Домен <222> (112)...(445) <223> домен Zn-зависимой металлопротеиназы <220>
<221> Домен <222> (223)...(271) <223> домен фибронектина II типа (желатин-связывающий домен) <220>
<221> Домен <222> (281)...(329)
- 29 031729 <223> домен фибронектина II типа домен) <220>
<221> Домен <222> (340)...(388) <223> домен фибронектина II типа домен) (желатин-связывающий (желатин-связывающий <220>
<221> прочее <222> (400)...(411) <223> Zn-связывающая область <220>
<221> Домен <222> (521)...(565)
<223> гемопексин-подобный домен
<220>
<221> Домен
<222> (567).. .(608)
<223> гемопексин-подобный домен
<220>
<221> Домен
<222> (613).. .(659)
<223> гемопексин-подобный домен
<220>
<221> Домен
<222> (661).. .(704)
<223> гемопексин-подобный домен
<400> 27
Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys
1 5 10 15
Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro
20 25 30
Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr
35 40 45
Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser
50 55 60
Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr
85 90 95
Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly
100 105 110
Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr
115 120 125
Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala
130 135 140
Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly
165 170 175
Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe
180 185 190
Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu
195 200 205
Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn
- 30 031729
210 215 220
Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys
245 250 255
Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro
260 265 270
Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys
275 280 285
Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr
290 295 300
Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr
305 310 315 320
Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr
325 330 335
Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr
340 345 350
Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp
355 360 365
Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys
370 375 380
Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala
385 390 395 400
His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu
405 410 415
Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His
420 425 430
Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu
435 440 445
Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro
450 455 460
Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg
465 470 475 480
Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro
485 490 495
Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val
500 505 510
Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly
515 520 525
Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu
530 535 540
Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp
545 550 555 560
Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Pro Leu Ser
565 570 575
Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly
580 585 590
Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala
595 600 605
Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met
610 615 620
Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln
625 630 635 640
Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly
645 650 655
Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr
660 665 670
Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu
675 680 685
Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys
690 695 700
Pro Glu Asp
705
- 31 031729 <210> 28 <211> 687 <212> Белок <213> Homo sapiens <220>
<221> прочее <222> (1)...(687) <223> зрелая полноразмерная металлопротеиназа 9 матрикса (MMP9)
<400> 28
Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro Gly Asp Leu Arg
1 5 10 15
Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr Leu Tyr Arg Tyr
20 25 30
Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser Lys Ser Leu Gly
35 40 45
Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu Pro Glu Thr Gly
50 55 60
Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr Pro Arg Cys Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly Asp Leu Lys Trp
85 90 95
His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr Ser Glu Asp Leu
100 105 110
Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala Phe Ala Leu Trp
115 120 125
Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr Ser Arg Asp Ala
130 135 140
Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro
145 150 155 160
Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly Pro
165 170 175
Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu Leu Trp Ser Leu
180 185 190
Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn Ala Asp Gly Ala
195 200 205
Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ala Cys
210 215 220
Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys Ser Thr Thr Ala
225 230 235 240
Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro Ser Glu Arg Leu
245 250 255
Tyr Thr Arg Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys Gln Phe Pro Phe
260 265 270
Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser
275 280 285
Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Arg Asp Lys
290 295 300
Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr Val Met Gly Gly
305 310 315 320
Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr Phe Leu Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp Gly Arg Leu Trp
340 345 350
Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys Trp Gly Phe Cys
355 360 365
Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly
370 375 380
His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu Ala Leu Met Tyr
- 32 031729
385 390 395 400
Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His Lys Asp Asp Val
405 410 415
Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu Pro Glu Pro Arg
420 425 430
Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro Pro Thr Val Cys
435 440 445
Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg Pro Thr Ala Gly
450 455 460
Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Thr Ala Gly
465 470 475 480
Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val Asp Asp Ala Cys
485 490 495
Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly Asn Gln Leu Tyr
500 505 510
Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu Gly Arg Gly Ser
515 520 525
Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp Pro Ala Leu Pro
530 535 540
Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Pro Leu Ser Lys Lys Leu Phe
545 550 555 560
Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly Ala Ser Val Leu
565 570 575
Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala Asp Val Ala Gln
580 585 590
Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met Leu Leu Phe Ser
595 600 605
Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln Met Val Asp Pro
610 615 620
Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly Val Pro Leu Asp
625 630 635 640
Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr Phe Cys Gln Asp
645 650 655
Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu Asn Gln Val Asp
660 665 670
Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys Pro Glu Asp
675 680 685
<210> 29
<211> 20
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220> <221> Пептид
<222> (1)...(20)
<223> сигнальный пептид металлопротеиназы 9 матрикса (MMP9)
<400> 29
Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys
1 5 10 15
Cys Phe Ala Ala
- 33 031729

Claims (44)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. ММР9-связывающий белок, содержащий полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент и полипептид легкой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент, причем указанный ММР9-связывающий белок связывает ММР9 специфичным образом, и причем указанный полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент содержит участки (CDR), определяющие комплементарность, согласно SEQ ID NO: 13-15 и указанный полипептид легкой цепи иммуноглобулина или его функциональный фрагмент содержит CDR согласно SEQ ID NO: 16-18.
  2. 2. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок связывает эпитоп ММР9 человека, содержащий аминокислотные остатки R162, Е111, D113 и I198.
  3. 3. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 или 5-8.
  4. 4. ММР9-связывающий белок по п.3, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 7.
  5. 5. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид вариабельной области легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 или 9-12.
  6. 6. ММР9-связывающий белок по п.5, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид вариабельной области легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 12.
  7. 7. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид тяжелой цепи, содержащий вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 или 5-8, и полипептид легкой цепи, содержащий вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 или 9-12.
  8. 8. ММР9-связывающий белок по п.7, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид вариабельной области тяжелой цепи, содержащий вариабельную область согласно SEQ ID NO: 7, и полипептид легкой цепи, содержащий вариабельную область согласно SEQ ID NO: 12.
  9. 9. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид тяжелой цепи представляет собой IgG.
  10. 10. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что связывание указанного ММР9связывающего белка с ММР9 ингибирует ферментативную активность ММР9.
  11. 11. ММР9-связывающий белок по п.10, отличающийся тем, что указанное ингибирование является неконкурентным.
  12. 12. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид тяжелой цепи, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-22, и полипептид легкой цепи, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23-26.
  13. 13. ММР9-связывающий белок по п.12, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок содержит полипептид тяжелой цепи, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность нуклеотидов согласно SEQ ID NO: 21, и полипептид легкой цепи, кодируемый полинуклеотидом, который имеет последовательность нуклеотидов согласно SEQ ID NO: 26.
  14. 14. ММР9-связывающий белок по п.1, отличающийся тем, что указанный ММР9-связывающий белок представляет собой гуманизированное или химерное антитело.
  15. 15. ММР9-связывающий белок, содержащий антигенсвязывающий фрагмент полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина и антигенсвязывающий фрагмент полипептида легкой цепи иммуноглобулина, при этом указанный ММР9-связывающий белок связывает ММР9 специфичным образом, при этом указанный антигенсвязывающий фрагмент полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина содержит участки (CDR), определяющие комплементарность, согласно SEQ ID NO: 13-15 и указанный антигенсвязывающий фрагмент полипептида легкой цепи иммуноглобулина содержит CDR согласно SEQ ID NO: 16-18, и при этом указанный ММР9-связывающий белок связывает эпитоп ММР9 человека, содержащий остатки аминокислот R162, Е111, D113 и I198.
  16. 16. ММР9-связывающий белок по п.15, отличающийся тем, что полипептид вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 7 и 8.
  17. 17. ММР9-связывающий белок по п.16, отличающийся тем, что полипептид вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 7.
    - 34 031729
  18. 18. ММР9-связывающий белок по п.15, отличающийся тем, что полипептид вариабельной области легкой цепи содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 9, 10, 11 и 12.
  19. 19. ММР9-связывающий белок по п.18, отличающийся тем, что полипептид вариабельной области легкой цепи содержит последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 12.
  20. 20. ММР9-связывающий белок по п.15, отличающийся тем, что связывание указанного ММР9связывающего белка с ММР9 ингибирует ферментативную активность ММР9.
  21. 21. ММР9-связывающий белок по п.20, отличающийся тем, что указанное ингибирование является неконкурентным.
  22. 22. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая ММР9-связывающий белок согласно любому из пп.1-21, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид тяжелой цепи, содержащий участки (CDR), определяющие комплементарность, согласно SEQ ID NO: 13-15 и полипептид легкой цепи, содержащий CDR согласно SEQ ID NO: 16-18.
  23. 23. Выделенная нуклеиновая кислота по п.22, отличающаяся тем, что вариабельная область полипептида тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3 и 5-8.
  24. 24. Выделенная нуклеиновая кислота по п.23, отличающаяся тем, что указанный полипептид тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 7.
  25. 25. Выделенная нуклеиновая кислота по п.22, отличающаяся тем, что вариабельная область полипептида легкой цепи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4 и 9-12.
  26. 26. Выделенная нуклеиновая кислота по п.25, отличающаяся тем, что вариабельная область полипептида легкой цепи содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 12.
  27. 27. Выделенная нуклеиновая кислота по п.22, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-26.
  28. 28. Выделенная нуклеиновая кислота по п.27, содержащая последовательность согласно SEQ ID NO: 21.
  29. 29. Выделенная нуклеиновая кислота по п.27, содержащая последовательность согласно SEQ ID NO: 26.
  30. 30. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид тяжелой цепи ММР9-связывающего белка по любому из пп.1-21 или его функциональный фрагмент, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид тяжелой цепи, содержащий участки (CDR), определяющие комплементарность, согласно SEQ ID NO: 13-15.
  31. 31. Выделенная нуклеиновая кислота по п.30, отличающаяся тем, что вариабельная область полипептида тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3 и 5-8.
  32. 32. Выделенная нуклеиновая кислота по п.30, отличающаяся тем, что указанный полипептид тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 7.
  33. 33. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид легкой цепи иммуноглобулина ММР9-связывающего белка по любому из пп.1-21 или его функциональный фрагмент, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид легкой цепи, содержащий участки (CDR), определяющие комплементарность, согласно SEQ ID NO: 16-18.
  34. 34. Выделенная нуклеиновая кислота по п.33, отличающаяся тем, что вариабельная область полипептида легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4 и 9-12.
  35. 35. Выделенная нуклеиновая кислота по п.34, отличающаяся тем, что указанная вариабельная область полипептида легкой цепи содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 12.
  36. 36. Вектор для получения ММР9-связывающего белка, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по любому из пп.22, 30 или 33.
  37. 37. Клетка для получения ММР9-связывающего белка, содержащая вектор по п.36.
  38. 38. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9, содержащая ММР9-связывающий белок по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
  39. 39. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9, содержащая ММР9-связывающий белок по п.15 и фармацевтически приемлемый носитель.
  40. 40. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9, содержащая вектор по п.36 и фармацевтически приемлемый носитель.
  41. 41. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9, содержащая нуклеиновую кислоту по пп.22, 30 или 33 и фармацевтически приемлемый носитель.
  42. 42. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний и расстройств, связанных с активностью ММР9, содержащая клетку по п.37 и фармацевтически приемлемый носитель.
    - 35 031729
  43. 43. Способ ингибирования активности ММР9 у субъекта, у которого присутствует опухоль или ассоциированная с опухолью ткань, в которой обнаруживается активность ММР9, включающий введение указанному субъекту фармацевтической композиции по любому из пп.38-42 в количестве, эффективном для ингибирования активности ММР9.
  44. 44. Способ обнаружения экспрессии ММР9 в ткани пациента, включающий осуществление контакта образца ткани указанного пациента с ММР9-связывающим белком по любому из пп.1-21 и обнаружение комплекса (ММР9-связывающий белок/ММР9), присутствие которого указывает на экспрессию ММР9 в ткани.
    Тяжелые цепи гуманизированного антитела против ММР9
    AB0041
    VHI
    VH2
    VH3 та 4
    Cwc&kews
    QVQl^ESGPG
    QVQLQESGPG
    QVQI^ESGPG
    OVQLgESGPG
    LVKPSETLSX TCTVSGFSXi LVKPSBTLSl TCTVSSFSDI LVKPSETLSL TCTVSOF&Lb
    FGKGimGi/ PGKGL&KbGV PGKGbEKLGV PGKSiEWLSV PGKSiEifLGV
    ΑΒ3041
    VHI
    VH2
    VH3
    VH4
    TWTGGTTW1W SAEMERLSIS KDDSKSOVFL JffTSGTIWY?? SALMSRLTIS KDDSKSTVYL ТВТЙЗТТЛГЖ 5ALMSRLTIS KDDSKNTVYL -SAIWSRFTIS KODSWTIVYE IWTQGTTMXN ^-AiMSKETIS KDDSKNTTYL
    KMNSDQTi>OT KMHSLKTJSJT KMHSLKTEDT
    KMNSI»KTEDT
    KMNSLKTEpT
    А1УУСАКУУУ AIYYCARITY AIXYCARFIT
    AIMCAR.rrt'
    А1У¥СААП'У
    AB0041
    VHi
    VH2 таз
    VH4
    G®5«GTS VTVSS GM7YW3QGTS VTVSS G№YWSQGTb VTVSS йЖУВЭДСТЬ VTVSS (ЙСЖОСТЬ VTVSS (SEQ (SEQ (SEQ {SEQ {SEQ
    ID
    ID
    ID
    ID
    ID
    N0:3)
    WO: 5)
    N0:6)
    N0:7)
    N0:8)
EA201390146A 2010-08-27 2011-08-26 Антитела к матриксной металлопротеиназе 9 EA031729B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37788610P 2010-08-27 2010-08-27
PCT/US2011/049448 WO2012027721A2 (en) 2010-08-27 2011-08-26 Antibodies to matrix metalloproteinase 9

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390146A1 EA201390146A1 (ru) 2013-12-30
EA031729B1 true EA031729B1 (ru) 2019-02-28

Family

ID=45724100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390146A EA031729B1 (ru) 2010-08-27 2011-08-26 Антитела к матриксной металлопротеиназе 9

Country Status (30)

Country Link
US (7) US8377443B2 (ru)
EP (1) EP2608809B1 (ru)
JP (3) JP5878538B2 (ru)
KR (4) KR101518144B1 (ru)
CN (2) CN103140240B (ru)
AP (2) AP2016009448A0 (ru)
AU (1) AU2011293125B2 (ru)
BR (1) BR112013004579B1 (ru)
CA (1) CA2808418C (ru)
CL (1) CL2013000535A1 (ru)
CO (1) CO6680656A2 (ru)
CR (1) CR20130132A (ru)
EA (1) EA031729B1 (ru)
EC (1) ECSP13012525A (ru)
ES (1) ES2739505T3 (ru)
HK (1) HK1208688A1 (ru)
IL (2) IL224614A (ru)
MA (1) MA34527B1 (ru)
MX (1) MX342413B (ru)
NZ (2) NZ701444A (ru)
PE (1) PE20131376A1 (ru)
PH (1) PH12016501691A1 (ru)
PL (1) PL2608809T3 (ru)
PT (1) PT2608809T (ru)
SG (2) SG10201506703VA (ru)
SI (1) SI2608809T1 (ru)
TR (1) TR201910348T4 (ru)
UA (1) UA109908C2 (ru)
WO (1) WO2012027721A2 (ru)
ZA (2) ZA201301338B (ru)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2608809T3 (pl) * 2010-08-27 2019-10-31 Gilead Biologics Inc Przeciwciała dla metaloproteinazy 9 macierzy
PT2663579T (pt) 2011-01-14 2017-07-28 Univ California Terapêutica de anticorpos contra a proteína r0r-1 e métodos para sua utilização
CN104271156B (zh) * 2012-02-29 2017-06-16 吉利德生物制剂公司 抗基质金属蛋白酶9的抗体
US9550836B2 (en) 2012-02-29 2017-01-24 Gilead Biologics, Inc. Method of detecting human matrix metalloproteinase 9 using antibodies
SG11201508199QA (en) * 2013-04-05 2015-11-27 Claudia Zylberberg Matrix metalloproteinases and uses thereof
WO2015081127A2 (en) 2013-11-26 2015-06-04 Gilead Sciences, Inc. Therapies for treating myeloproliferative disorders
US20160331754A1 (en) 2014-01-20 2016-11-17 Gilead Sciences, Inc. Therapies for treating cancers
EP2985296A1 (en) 2014-08-13 2016-02-17 Calypso Biotech SA Antibodies specific for MMP9
EP2985295A1 (en) * 2014-08-13 2016-02-17 Calypso Biotech SA Antibodies specific for MMP9
TW201639573A (zh) 2015-02-03 2016-11-16 吉李德科學股份有限公司 有關治療癌症之合併治療
SI3321265T1 (sl) 2015-03-04 2020-07-31 Gilead Sciences, Inc. Spojine 4,6-diamino-pirido(3,2-d)pirimidina in njihova uporaba kot modulatorji toličnih receptorjev
CN105037553B (zh) * 2015-08-20 2018-04-17 内蒙古蒙元生物基因科技有限公司 一种能够检测癌症的免疫球蛋白
EP3355875B1 (en) 2015-10-01 2021-09-29 Gilead Sciences, Inc. Combination of a btk inhibitor and a checkpoint inhibitor for treating cancers
PE20181073A1 (es) 2015-12-17 2018-07-04 Gilead Sciences Inc Compuestos inhibidores de la quinasa de union a tank
US20170174788A1 (en) * 2015-12-17 2017-06-22 Gilead Sciences, Inc. Combination of a jak inhibitor and an mmp9 binding protein for treating inflammatory disorders
WO2017152062A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Gilead Sciences, Inc. Compositions and combinations of autotaxin inhibitors
CA3019003A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Gilead Sciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer, inflammatory diseases and autoimmune diseases
WO2017215590A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 I-Mab Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof
EP3493797A1 (en) 2016-08-04 2019-06-12 Gilead Sciences, Inc. Cobicistat for use in cancer treatments
MA46093A (fr) 2016-09-02 2021-05-19 Gilead Sciences Inc Composés modulateurs du recepteur de type toll
US10640499B2 (en) 2016-09-02 2020-05-05 Gilead Sciences, Inc. Toll like receptor modulator compounds
US20180133212A1 (en) 2016-11-03 2018-05-17 Gilead Sciences, Inc. Combination of a bcl-2 inhibitor and a bromodomain inhibitor for treating cancer
WO2018097977A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 Gilead Sciences, Inc. Crystalline forms of a phosphate complex of a bet inhibitor
WO2018109222A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Universite de Bordeaux Mmp9 inhibitors and uses thereof in the prevention or treatment of a depigmenting disorder
ES2908662T3 (es) 2017-01-24 2022-05-03 I Mab Biopharma Us Ltd Anticuerpos anti-CD73 y usos de los mismos
WO2018156901A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Gilead Sciences, Inc. Inhibitors of bruton's tyrosine kinase
CA3054403A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Gilead Sciences, Inc. Inhibitors of bruton's tyrosine kinase
WO2018170488A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Gilead Sciences, Inc. Method of purifying an antibody
JOP20180040A1 (ar) 2017-04-20 2019-01-30 Gilead Sciences Inc مثبطات pd-1/pd-l1
US11926655B2 (en) 2017-07-18 2024-03-12 Daiichi Sankyo Company, Limited Active MMP9-binding peptide
WO2019123340A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3'3' cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the sting adaptor protein
CN111511754B (zh) 2017-12-20 2023-09-12 捷克共和国有机化学与生物化学研究所 活化sting转接蛋白的具有膦酸酯键的2’3’环状二核苷酸
PE20210640A1 (es) 2018-02-13 2021-03-23 Gilead Sciences Inc Inhibidores pd-1/pd-l1
TW202005654A (zh) 2018-04-06 2020-02-01 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 ２，２，─環二核苷酸
TWI818007B (zh) 2018-04-06 2023-10-11 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 2'3'-環二核苷酸
TWI833744B (zh) 2018-04-06 2024-03-01 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 3'3'-環二核苷酸
TWI712412B (zh) 2018-04-19 2020-12-11 美商基利科學股份有限公司 Pd‐1/pd‐l1抑制劑
US20190359645A1 (en) 2018-05-03 2019-11-28 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 2'3'-cyclic dinucleotides comprising carbocyclic nucleotide
JP2021523151A (ja) 2018-05-11 2021-09-02 ホスホレックス、インコーポレイテッド 負の表面電荷を有するマイクロ粒子及びナノ粒子
EP3793565B1 (en) 2018-05-14 2022-01-05 Gilead Sciences, Inc. Mcl-1 inhibitors
ES2962674T3 (es) 2018-07-13 2024-03-20 Gilead Sciences Inc Inhibidores PD-1/PD-L1
US11179397B2 (en) 2018-10-03 2021-11-23 Gilead Sciences, Inc. Imidazopyrimidine derivatives
CN112955435B (zh) 2018-10-24 2024-09-06 吉利德科学公司 Pd-1/pd-l1抑制剂
EP3873608A1 (en) 2018-10-31 2021-09-08 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds having hpk1 inhibitory activity
AU2019372046B2 (en) 2018-10-31 2022-05-26 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds as HPK1 inhibitors
JP7350872B2 (ja) 2019-03-07 2023-09-26 インスティチュート オブ オーガニック ケミストリー アンド バイオケミストリー エーエスシーアール，ヴイ．ヴイ．アイ． ３’３’－環状ジヌクレオチドおよびそのプロドラッグ
EP3935065A1 (en) 2019-03-07 2022-01-12 Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR, V.V.I. 3'3'-cyclic dinucleotide analogue comprising a cyclopentanyl modified nucleotide as sting modulator
AU2020231201A1 (en) 2019-03-07 2021-08-26 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 2'3'-cyclic dinucleotides and prodrugs thereof
TW202212339A (zh) 2019-04-17 2022-04-01 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
TWI751516B (zh) 2019-04-17 2022-01-01 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
US11453681B2 (en) 2019-05-23 2022-09-27 Gilead Sciences, Inc. Substituted eneoxindoles and uses thereof
CA3140708A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Helen Horton Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and pyridopyrimidine derivatives
CA3142513A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
CN114555123B (zh) 2019-10-18 2024-04-02 四十七公司 用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的联合疗法
AU2020374947A1 (en) 2019-10-31 2022-03-31 Forty Seven, Inc. Anti-CD47 and anti-CD20 based treatment of blood cancer
TWI778443B (zh) 2019-11-12 2022-09-21 美商基利科學股份有限公司 Mcl1抑制劑
US11845723B2 (en) 2019-12-24 2023-12-19 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
TWI832035B (zh) 2020-02-14 2024-02-11 美商基利科學股份有限公司 結合ccr8之抗體及融合蛋白及其用途
MX2022013619A (es) 2020-05-01 2022-11-16 Gilead Sciences Inc Compuestos de 2,4-dioxopirimidina que inhiben cd73.
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
TW202313094A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 美商基利科學股份有限公司 使用ＦＬＴ３Ｌ—Ｆｃ融合蛋白之方法
KR20240005901A (ko) 2021-06-23 2024-01-12 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
WO2022271677A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
US11976072B2 (en) 2021-06-23 2024-05-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
WO2022271659A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2023278491A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 Releviate, Llc Mmp-9 antibodies and uses thereof
CN118139858A (zh) 2021-10-28 2024-06-04 吉利德科学公司 吡地嗪-3(2h)-酮衍生物
KR20240097895A (ko) 2021-10-29 2024-06-27 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd73 화합물
US20230220106A1 (en) 2021-12-08 2023-07-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibodies targeting 5t4 and uses thereof
US20230203202A1 (en) 2021-12-08 2023-06-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and 5t4
CA3237577A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
CA3239528A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
AU2023233730A1 (en) 2022-03-17 2024-09-26 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
US20230355796A1 (en) 2022-03-24 2023-11-09 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
TW202345901A (zh) 2022-04-05 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
WO2023205719A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
US20240091351A1 (en) 2022-09-21 2024-03-21 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPa DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
WO2024137852A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040141982A1 (en) * 1998-06-05 2004-07-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Use of genetically engineered antibodies to treat multiple myeloma
US20050287148A1 (en) * 1995-01-17 2005-12-29 Malaya Chatterjee Monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma
US20070172482A1 (en) * 2003-04-04 2007-07-26 Irit Sagi Antibodies and pharmaceutical compositions containing same useful for inhibiting activity of metalloproteins
US20090297449A1 (en) * 2008-03-03 2009-12-03 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 and metalloproteinase 2 binding proteins
US20090311245A1 (en) * 2008-03-03 2009-12-17 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 binding proteins

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
GB9022788D0 (en) 1990-10-19 1990-12-05 Cortecs Ltd Pharmaceutical formulations
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
WO1995015374A1 (fr) 1993-11-30 1995-06-08 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Nouvelle metalloprotease et adn codant pour cette derniere
US7101975B1 (en) 1999-07-13 2006-09-05 University Of Southern California Method and composition for inhibition of angiogenesis using antagonists based on MMP-9 and β1 integrins
ES2327812T3 (es) 1999-07-13 2009-11-04 University Of Southern California Nuevos metodos y composiciones para inhibir la angiogenesis utilizando bases antagonistas de mmp-9 y/o integrinas beta-1.
WO2002066057A2 (en) 2001-02-23 2002-08-29 Biophage Inc. Methods and compositions for preventing and treating neutrophil-mediated diseases
SE0102298D0 (sv) 2001-06-27 2001-06-27 Astrazeneca Ab Crystal structure of enzyme and uses thereof
WO2003006006A1 (en) 2001-07-09 2003-01-23 The Regents Of The University Of California Use of matrix metalloproteinase inhibitors to mitigate nerve damage
WO2003044058A2 (en) 2001-11-23 2003-05-30 Universite Catholique De Louvain Medical use of antibodies directed against human matrix metalloproteinases or related tissue proteinases for the treatment of abnormal uterine bleeding and endometriosis
ES2614274T3 (es) 2002-09-06 2017-05-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Procedimiento de tratamiento de asma usando anticuerpos frente al componente de complemento C5
WO2004076614A2 (de) 2003-02-27 2004-09-10 Bernd Hinzmann Humane nukleinsäuresequenzen aus prostatakarzinomen
WO2006037513A1 (en) 2004-10-09 2006-04-13 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with matrix metalloproteinase 9 (mmp9)
JP2008545139A (ja) 2005-06-29 2008-12-11 ルールズ−ベースド メディスン，インコーポレーテッド 急性冠症候群の診断方法及び診断キット
KR101434682B1 (ko) 2005-12-02 2014-08-27 제넨테크, 인크. 결합 폴리펩티드 및 이들의 용도
WO2007144781A2 (en) 2006-04-21 2007-12-21 Diagnotech Pty. Ltd. Diagnostic methods and kits utilizing antibodies for metalloproteases
WO2008088864A2 (en) 2007-01-18 2008-07-24 The Trustess Of Columbia University In The City Of New York Matrix metalloproteinase-9-related methods
EP2155691B1 (en) * 2007-02-23 2016-01-13 Yeda Research and Development Co. Ltd. Antibodies and pharmaceutical compositions containing same useful for inhibiting activity of metalloproteins
PE20090765A1 (es) 2007-06-08 2009-07-10 Irm Llc Metodos y composiciones para inducir la apoptosis en celulas cancerosas
CA2695969A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Yeda Research & Development Co. Ltd. Regulators of mmp-9 and uses therof
AU2008338421A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Dyax Corp. Compositions and methods for treating osteolytic disorders comprising MMP-14 binding proteins
US20110262396A1 (en) * 2008-10-22 2011-10-27 Dyax Corp. Combination treatments comprising protease binding proteins for inflammatory disorders
US20110286916A1 (en) 2008-11-20 2011-11-24 Jose Miguel Aste-Amezaga Generation and characterization of anti-notch antibodies for therapeutic and diagnostic use
EA201270701A1 (ru) 2010-01-27 2013-01-30 Йеда Рисеч Энд Девелопмент Ко. Лтд. Ингибирующие металлопротеины антитела
US20110261695A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Xiaoming Zhao System and method for network congestion control
PL2608809T3 (pl) * 2010-08-27 2019-10-31 Gilead Biologics Inc Przeciwciała dla metaloproteinazy 9 macierzy
US9550836B2 (en) 2012-02-29 2017-01-24 Gilead Biologics, Inc. Method of detecting human matrix metalloproteinase 9 using antibodies
CN104271156B (zh) 2012-02-29 2017-06-16 吉利德生物制剂公司 抗基质金属蛋白酶9的抗体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050287148A1 (en) * 1995-01-17 2005-12-29 Malaya Chatterjee Monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma
US20040141982A1 (en) * 1998-06-05 2004-07-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Use of genetically engineered antibodies to treat multiple myeloma
US20070172482A1 (en) * 2003-04-04 2007-07-26 Irit Sagi Antibodies and pharmaceutical compositions containing same useful for inhibiting activity of metalloproteins
US20090208510A1 (en) * 2003-04-04 2009-08-20 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies and pharmaceutical compositions containing same useful for inhibiting activity of metalloproteins
US20090297449A1 (en) * 2008-03-03 2009-12-03 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 and metalloproteinase 2 binding proteins
US20090311245A1 (en) * 2008-03-03 2009-12-17 Dyax Corp. Metalloproteinase 9 binding proteins

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomosaics. Anti-Human Active Matrix Metalloproteinase 9 Antibody. 15 July 2009 [Retieved from the Internet 12 February 2012: <http://www.biomosaics.com/pdfs/B2057M.pdf>] *
Hu, et al. Inhibitors of gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 activity comparison of a peptidomimetic and polyhistidine with single-chain derivatives of a neutralizing monoclonal antibody. Biochem Pharmacol. 2004, 67(5):1001-1009 *
Martens et al. A monoclonal antibody inhibits gelatinase B/MMP-9 by selective binding to part of the catalytic domain and not to the fibronectin or zinc binding domains. Biochim Biophys Acta. 2007 Feb; 1770(2): 178-86 *
Nagase et al. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovasc Res. 2006 Feb 15; 69(3): 562-73 *
Tochowicz et al. Crystal structures of MMP-9 complexes with five inhibitors: contribution of the flexible Arg424 side-chain to selectivity. J Mol Biol. 2007, 371(4): 989-1006; Fig 2 *
Vector Laboratories. Product Specifications. Antibody to Matrix Metalloproteinase 9. 2004 [Retieved from the Internet 12 February 2012:<http://www.vectorlabs.com/data/protocols/VPM644.pdf>] *
Visse et al. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res. 2003, 92(8): 827-39 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103140240B (zh) 2015-01-21
MX2013002323A (es) 2013-07-29
SI2608809T1 (sl) 2019-08-30
ZA201507081B (en) 2017-02-22
EP2608809A2 (en) 2013-07-03
CR20130132A (es) 2013-05-29
CN104530238A (zh) 2015-04-22
EA201390146A1 (ru) 2013-12-30
PT2608809T (pt) 2019-08-26
AP2016009448A0 (en) 2016-09-30
KR20170030659A (ko) 2017-03-17
NZ606880A (en) 2015-01-30
JP6198797B2 (ja) 2017-09-20
KR101518144B1 (ko) 2015-05-28
WO2012027721A3 (en) 2012-08-16
JP2016020389A (ja) 2016-02-04
IL255300A0 (en) 2017-12-31
PE20131376A1 (es) 2013-11-25
KR101930179B1 (ko) 2018-12-17
US20130023654A1 (en) 2013-01-24
ES2739505T3 (es) 2020-01-31
KR20150004936A (ko) 2015-01-13
BR112013004579B1 (pt) 2019-03-12
PL2608809T3 (pl) 2019-10-31
EP2608809B1 (en) 2019-05-22
AU2011293125A1 (en) 2013-04-18
AU2011293125B2 (en) 2015-02-05
US20120135004A1 (en) 2012-05-31
KR101827048B1 (ko) 2018-02-07
KR101881724B1 (ko) 2018-07-24
CL2013000535A1 (es) 2014-03-21
CA2808418A1 (en) 2012-03-01
JP2013539365A (ja) 2013-10-24
CN104530238B (zh) 2019-11-26
CN103140240A (zh) 2013-06-05
BR112013004579A2 (pt) 2016-02-10
JP6435381B2 (ja) 2018-12-05
CO6680656A2 (es) 2013-05-31
US20180086845A1 (en) 2018-03-29
MA34527B1 (fr) 2013-09-02
CA2808418C (en) 2019-02-05
US20130281676A1 (en) 2013-10-24
EP2608809A4 (en) 2015-04-01
US9120863B2 (en) 2015-09-01
TR201910348T4 (tr) 2019-08-21
ECSP13012525A (es) 2013-05-31
IL224614A (en) 2017-11-30
WO2012027721A2 (en) 2012-03-01
KR20130063009A (ko) 2013-06-13
US20160122437A1 (en) 2016-05-05
AP3948A (en) 2016-12-21
ZA201301338B (en) 2016-07-27
NZ701444A (en) 2016-06-24
US8501916B2 (en) 2013-08-06
KR20180014245A (ko) 2018-02-07
HK1208688A1 (en) 2016-03-11
US8377443B2 (en) 2013-02-19
US20130281675A1 (en) 2013-10-24
PH12016501691A1 (en) 2017-07-03
SG188224A1 (en) 2013-04-30
MX342413B (es) 2016-09-28
UA109908C2 (xx) 2015-10-26
SG10201506703VA (en) 2015-10-29
US20160159923A1 (en) 2016-06-09
JP5878538B2 (ja) 2016-03-08
US9260532B2 (en) 2016-02-16
JP2017221216A (ja) 2017-12-21
AP2013006743A0 (en) 2013-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11634505B2 (en) Antibodies to matrix metalloproteinase 9
US20180086845A1 (en) Nucleic acids encoding antibodies to matrix metalloproteinase 9
AU2015201367B2 (en) Antibodies to matrix metalloproteinase 9
OA18526A (en) Antibodies to Matrix Metalloproteinase 9

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU