CN112940119A - 一种单克隆抗体及其与间充质干细胞外泌体的联合应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种单克隆抗体及其与间充质干细胞外泌体的联合应用，该单克隆抗体可高特异性与目标抗原TGF‑β2结合，进而用于治疗肝纤维化；还提供了一种间充质干细胞外泌体，尤其是经过HGF诱导的骨髓间充质干细胞外泌体，可用于治疗肝纤维化，降低炎症反应；还提供了所述单克隆抗体与所述间充质干细胞外泌体的药物组合物，用于联合治疗肝纤维化，可显著改善肝组织生理结构，抑制氧化应激对于肝组织损伤，促进胶原和其他细胞外基质降解，发挥协同效应促进肝组织恢复。

Description

一种单克隆抗体及其与间充质干细胞外泌体的联合应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种单克隆抗体及其与间充质干细胞外泌体的联合应用。

背景技术

肝纤维化是由于各种因素所致慢性肝或损伤，导致的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度沉积或降解减少的病理过程，任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都会伴随有肝纤维化，如果损伤处理不当，将可能导致肝硬化、肝癌、肝衰竭等多种严重肝病，然而肝纤维化也被认为是一个可逆的过程，如果治疗得当将可以逆转肝脏损伤过程，故肝纤维化阶段成为了治疗肝病的重要阶段。肝纤维化的发病机理比较复杂，现有研究表明病毒、细菌、寄生虫、药物、酒精、自身免疫等诸多因素均可以成为肝纤维化的诱因，在肝纤维化的发展过程中，肝星状细胞的活化和ECM的大量沉积具有重要地位，也成为肝纤维化的标志事件之一。目前已经开发出了多种治疗肝纤维化的药物，如乙肝或丙肝病毒抑制剂、转化生长因子-β(Transforming growth factor beta,TGF-β)抑制剂、抗氧化剂、干扰素、前列腺素E、肾上腺皮质激素、马洛替酯、硫辛酸、D-青霉胺以及中药制剂等，然而由于肝纤维化诱因众多，且多与机体自身免疫和调节有关，现有药物或疗法仍难以有效治疗肝纤维化。

细胞外泌体(exosome)为细胞分泌的微小囊泡，最初发现时被认为是一种代谢废物，但后续的研究中发现外泌体中包括多种核酸、多肽和蛋白质等多种生物活性物质，能通过组织液或血液运输至靶细胞，在细胞间信息传递过程中发挥重要作用，临床上已经外泌体用于皮肤损伤、恶性肿瘤、神经损伤、肝损伤、肾损伤和其他疾病。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来自于中胚层的多能干细胞，具有包括高度的自我更新、多向分化及免疫调节能力，来源于间充质干细胞外泌体(exosomesfrommesenchymal stem cells，MSCs-Exo)，即保留了诸多间充质干细胞的生物活性，也能避免细胞治疗过程的操作繁琐、成本高昂、伦理风险等不利因素，故受到了广泛关注，有研究表明MSCs-Exo能够有效修复肝损伤，对肝脏起到一定的保护作用，抑制和逆转肝纤维化过程，如王如岭等[1]发现在小鼠模型中注射骨髓来源的MSCs-Exo能够改善肝纤维化过程；Yan等[2]发现人脐带MSCs-Exo能够通过诱导ERK1/2磷酸化和Bcl2基因表达以及抑制IKKB/NFkB/Caspase9/3信号通路，减少肝细胞氧化损伤和抑制肝细胞凋亡；Chen等[3]将骨髓MSC-Exo用于治疗S100诱导的C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎，表明MSC-Exo可通过miRNA-223调节NLRP3和Caspase-1表达进而发挥肝脏修复和保护作用。近年来，尽管MSC-Exo成为了肝脏疾病治疗领域的研究热点，但是其作用机制仍不明确，其治疗剂量、制备方法和临床应用尚无统一标准，在一定程度上制约了其应用。

转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是最主要的致纤维化因子之一，TGF-β超家族目前已经发现了四十余个成员，在哺乳动物中常见的有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，现有研究中普遍认为TGF-β1与肝纤维化的发生机制密切相关，它在体内一方面可以激活肝星状细胞，诱导其过度活化，另一方面可以抑制肝细胞ECM的降解，降低ECM酶的活性，从而导致或加剧肝纤维化的发生，但是对于TGF-β2在肝纤维化中的作用却关注较少。TGF-β在体内可通过多种信号通路发挥其生理作用，其中最主要的途径是Smads信号转导通路，研究表明目前已知的10多种Smads蛋白均可与TGF-β结合，进而传导生物信号，同时近年来也发现了多种非Smads信号参与TGF-β的生理活性发挥，如MAPK信号通路、PI3kinase/AKT通路、NF-κB通路等等。由于TGF-β在肝纤维化中发挥了重要作用，研究人员开发出了多种基于TGF-β的治疗药物，如TGF-β的化学拮抗剂、单克隆抗体和siRNA等。

尽管已经开发出了多种治疗肝纤维化的药物，但是现有药物或疗法仍存在制备繁琐、副作用大、预后状况不佳、容易复发等缺陷，因此开发新型药物仍是肝病治疗的重点研究方法，尤其是利用自身免疫机制，通过免疫调节方式治疗肝纤维化，提高患者的耐受性和可接受性，降低复发率。本发明中针对现有技术中的不足，提供了一种新型肝纤维化的治疗手段，一方面筛选并获得了靶向TGF-β2的单克隆抗体，该抗体具有全新结构，能够高效特异性的结合靶抗原；另一方面，优化了骨髓来源间充质干细胞外泌体的制备过程，尤其是使用肝细胞生长因子对骨髓来源间充质干细胞进行诱导后收获外泌体，将其与靶向TGF-β2单克隆抗体共同用于治疗肝纤维化，产生协同效应。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种靶向TGF-β2的单克隆抗体及其与间充质干细胞外泌体的联合应用，可产生协同效果，有效抑制肝纤维化的发展过程，促进肝组织修复，及时逆转肝纤维化过程，有利于治疗多种类型肝病。

本发明的详细技术方案如下：

提供了一种靶向TGF-β2的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链互补决定区(CDR区)氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:1所示CDRH1，SEQ ID NO:2所示CDRH2和SEQID NO:3所示CDRH3，轻链互补决定区氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:4所示CDRL1，SEQ IDNO:5所示CDRL2和SEQ ID NO:6所示CDRL3。

进一步的，单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

进一步的，所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

据报道，TGF-β具有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3等多种亚型，现有的靶向TGF-β抗体多基于靶向TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3等混合亚型而开发，如WO2006086469、WO2007076391、WO2012167143等专利文献中均公开了可同时结合TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的单克隆抗体，虽然这类抗体可以结合多种TGF-β亚型，提高了抗体的适用性，但是相对于而言单克隆抗体的靶向性有所削弱，并且TGF-β在生物体内表达相当广泛，尤其是其与肿瘤的发生发展密切相关，如果使用广谱的TGF-β拮抗剂，可能导致难以预料的副反应，甚至诱发癌变风险。并且，目前研究中多关注于阻断TGF-β1，进而抑制肝纤维化的发展或逆转肝纤维化过程，但是对于TGF-β2阻断剂的研究却相对较少，本发明中筛选并获得了靶向TGF-β2的单克隆抗体，惊奇的发现该抗体可有效提高治疗的靶向性，降低毒副作用风险。

提供了一种药物组合物，其特征在于包括如前所述的单克隆抗体和间充质干细胞外泌体。

进一步的，所述间充质干细胞来源于脂肪、骨髓、脐带或胎盘。

进一步的，所述间充质干细胞来源于骨髓。

进一步的，所述间充质干细胞外泌体由间充质干细胞经肝细胞生长因子(HGF)诱导而得

进一步的，从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代，待融合度达到80％以上，更换无血清培养基并加入HGF培养24h，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。

细胞因子对于干细胞的分化和相关治疗作用具有显著影响，不同的细胞因子诱导分化能力也具有差异，本发明中先后采用HGF、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和KGF(角质细胞生长因子)诱导骨髓间充质干细胞分泌外泌体，发现经HGF诱导后的外泌体与靶向TGF-β2抗体联用，对肝纤维化的治疗效果最为显著，而施用bFGF和KGF则协同作用欠佳。

提供了一种上述的药物组合物在制备肝纤维化相关疾病药物中的应用。

本发明的有益效果包括：

筛选并获得了靶向TGF-β2的单克隆抗体，其特异性高，可以有效抑制肝纤维化过程，促进肝脏修复，还可以避免由于靶向性不强而导致的潜在致病风险。此外，本发明还优化和选择了间充质干细胞的制备方法，发现采用经HGF诱导的骨髓间充质干细胞外泌体与本发明所提供的单克隆抗体联合使用，可产生协同作用，能够更加有效的治疗肝纤维化及其相关疾病。

附图说明

图1不同治疗组小鼠肝组织病理切片图；

图2不同治疗组小鼠肝组织SOD水平图；

图3不同治疗组小鼠肝组织MDA水平图；

图4不同治疗组小鼠肝组织TIMP-1mRNA相对表达水平图；

图5不同治疗组小鼠肝组织TIMP-2mRNA相对表达水平图；

图6不同治疗组小鼠血清IFN-γ表达水平图；

图7不同治疗组小鼠血清IL-12表达水平图。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1TGF-β2单克隆抗体的制备

1.1实验动物免疫

以人TGF-β2重组蛋白(本公司实验室保存)为免疫原免疫8-12周龄BALB/c雌性小鼠，具体方法为：向人TGF-β2重组蛋白中加入弗氏完全佐剂，使之与抗原混合均匀并进行乳化，形成稳定油包水的溶液，然后经皮下和腹腔多点注射免疫BALB/c雌性小鼠，剂量为100μg/只；每隔两周以弗氏不完全佐剂作为佐剂，加强免疫一次，共三次，剂量100μg/只；采用间接ELISA法检测小鼠尾血中抗体效价，结果表明效价>1×10⁴，符合实验要求。

1.2杂交瘤细胞融合与筛选

培养骨髓瘤细胞(SP2/0)，用含10％胎牛血清的1640完全培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养，待骨髓瘤细胞生长至对数生长期，消化细胞制备骨髓瘤细胞悬液，以备后续使用。免疫小鼠完成后，脱颈处死小鼠，在超净台无菌环境中取出脾脏，按照常规方法制备脾细胞悬液，并调整细胞悬液浓度至合理范围。取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按照3:1的比例混合，1000rpm，离心10min，弃上清；采用RPMI-1640培养基重悬细胞，1000rpm，离心10min，弃上清；加入37℃预热的PEG1500(Sigma)1mL，在缓慢滴加RPMI-1640培养基至20mL，37℃孵育10min，然后1000rpm，离心10min，弃上清；用含HAT培养基重悬细胞，并分装至96孔细胞培养板，并置于37℃，5％CO₂培养箱内培养。

1.3杂交瘤细胞筛选与保存

使用含有HAT的RPM1640培养液进行培养筛选，使用ELISA法检测阳性克隆细胞，具体方法为：取96孔中每孔收集100μL细胞上清，加入至抗原酶标板，37℃，孵育1h，用PBST洗涤3-5次；每孔中加入稀释后的羊抗鼠-HRP 100μL，37℃，孵育45min，用PBST洗涤3-5次；加入反应底物100μL，避光显色10min，加入2M硫酸50μL/孔终止反应，于酶标仪中测定450nM的吸光值。

筛选能够稳定表达抗TGF-β2单克隆抗体的细胞株，进行扩大培养，待目标细胞生长至对数生长期后，收获细胞，而后加入冻存液(90％胎牛血清+10％DMSO)，放置于冻存管内并用封口膜密封，置于液氮中保存。

1.4单克隆抗体的制备

通过免疫BALB/c小鼠，收集腹水制备抗TGF-β2单克隆抗体，具体方法为：复苏保存好的杂交瘤细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养，待其生长至对数生长期后，收集细胞并调节细胞浓度。取8-12周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只；2周后腹腔接种上述获得的杂交瘤细胞，接种量10⁶/只，约2-3周后可观察见小鼠腹部出现明显膨胀，使用无菌注射器抽取小鼠腹水，采用GE protein G蛋白柱纯化获得抗TGF-β2单克隆抗体。用Lowrry蛋白浓度测定试剂盒测定纯化后，分装后冻干，-20℃低温保存。

1.5单克隆抗体与目标抗原结合力分析

通过间接ELISA法检测上述单克隆抗体与目标抗原人TGF-β2蛋白的结合能力，通过梯度稀释法，建立目标抗原与所述单克隆抗体的结合反应曲线，根据反应曲线计算二者的亲和力常数(Kd值)，结果显示所述单克隆抗体的Kd值为2.5nM。随后采用类似方法，检测本发明单克隆抗体与人TGF-β1、TGF-β3的结合能力，其Kd值分别为1.8μM和3.3μM，说明本发明所述的单克隆抗体对TGF-β2特异性结合，而对于TGF-β1、TGF-β3等亚型结合能力不强，展现了良好的结合特异性。

1.6单克隆抗体序列结构分析

通过分子克隆技术获得所述单克隆抗体，进行测序鉴定，并结合已公布的抗体生物信息学资料，确定所述单克隆抗体的重链互补决定区氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:1所示CDRH1，SEQ ID NO:2所示CDRH2和SEQ ID NO:3所示CDRH3，轻链互补决定区氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:4所示CDRL1，SEQ ID NO:5所示CDRL2和SEQ ID NO:6所示CDRL3；重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例2骨髓MSCs的分离、培养与外泌体获得

2.1骨髓MSCs的分离与培养

本发明中制备大鼠骨髓MSCs，具体方法为：取6-8周龄雄性SD大鼠，脱颈处死大鼠，于无菌条件下分离双侧股骨，用无菌剪刀剪去股骨两侧的干骺端暴露骨髓腔，用无菌注射器抽取PBS反复冲洗骨腔内的红色骨髓3-4次，直至骨髓腔变白；收集冲洗的PBS，1200rpm离心5min，弃去上清，用PBS洗涤2次，弃去上清，采用含10％胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，然后至于37℃，5％CO₂培养箱内培养；48h后观察细胞生长状况，并更换培养基，之后每2天换液1次，至细胞密度80％-90％时，用胰酶消化细胞，按1:3比例进行传代培养，共传代3-5代(记为P3-5代)。

2.2骨髓MSCs外泌体的提取与鉴定

待培养的间充质干细胞P3-P5代融合度达到80％以上后，吸出培养基，使用无菌PBS洗涤3-5次，更换无血清培养基，分别加入HGF(50ng/mL)、bFGF(50ng/mL)和KGF(50ng/mL)以及空白对照，培养24h，收集上清液；将所得上清2000rpm 4℃离心30min去除细胞碎片，收集上层清液；将所得上清液，10000rpm 4℃离心30min，弃去上清，取透明沉淀，用500uL的PBS重悬沉淀；通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取得滤液，再经10000rpm离心60min弃上清，将所得沉淀即为骨髓MSCs外泌体，采用适量PBS重悬。

所得外泌体进行NTA、透射电镜观察，所述外泌体呈圆形或椭圆形，有完整胞膜结构，直径约为80-110nm；经流式细胞仪检测，所述外泌体的CD90、CD29阳性表达，CD45阴性表达，满足后续实验要求。

实施例3肝纤维化小鼠的治疗与评价

3.1肝纤维化小鼠模型的制备

目前存在多种制备肝纤维化模型小鼠的方法，其中四氯化碳法技术路线成熟，该肝纤维化模型与人体肝纤维化病理结构类似度高，因此本发明中采用四氯化碳构建肝纤维化模型小鼠，具体方法为：以橄榄油作为溶剂配置1ml/kg的四氯化碳溶液，取健康8-12周龄昆明小鼠，称量小鼠体重，按0.2mg/kg的注射剂量计算各个小鼠的四氯化碳溶液注射剂量，腹腔注射相应剂量的四氯化碳溶液，每周注射2次，共注射6周。

3.2肝纤维化小鼠的治疗

为验证本发明中所提供的TGF-β2抗体、各种骨髓MSCs外泌体及其组合对于肝纤维化的治疗作用，分别采用上述药物治疗四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠，并观察各种指标，以便综合考察和评价治疗效果。

将肝纤维化小鼠随机分为6组，每组10只，分别为：生理盐水组(记为A组)，尾静脉注射0.1mL生理盐水；TGF-β2抗体组(记为B组)，尾静脉注射1mg/Kg TGF-β2抗体；1mg/KgTGF-β2抗体和1mg/Kg空白培养骨髓MSCs外泌体(记为C组)；1mg/Kg TGF-β2抗体和1mg/KgHGF诱导骨髓MSCs外泌体(记为D组)；1mg/Kg TGF-β2抗体和1mg/Kg bFGF诱导骨髓MSCs外泌体(记为E组)；1mg/Kg TGF-β2抗体和1mg/Kg KGF诱导骨髓MSCs外泌体(记为F组)。

3.3小鼠肝组织病理学检测

治疗28天后脱颈处死小鼠，取小鼠肝脏左叶置于10％福尔马林溶液中固定3天，然后取出肝组织经清水冲洗后，采用乙醇梯度脱水处理，经二甲苯透明后，采用石蜡对肝组织进行包埋，由切片机制作5μm切片经HE染色后制备为病理切片，在显微镜下观察肝组织的变化。

如图1所示，在生理盐水组中，出现大量炎性细胞浸润，胶原沉积明显增加，肝细胞结构出现混乱；各个治疗组中肝脏组织呈现了不同程度的恢复，炎性细胞和纤维化程度降低，其中TGF-β2抗体与HGF诱导骨髓MSCs外泌体联用组改善最为明显，其中炎性细胞大量减少，肝小叶结构基本恢复正常。上述结果表明，本发明中所提供的TGF-β2抗体以及其与骨髓MSCs外泌体可有效治疗肝纤维化，其中TGF-β2抗体与经细胞因子诱导的骨髓MSCs外泌体治疗效果更加明显。

3.4小鼠肝组织抗氧化指标检测

氧化应激反应可导致肝脏组织损伤，诱导肝纤维化、肝硬化或肝脏癌变等多种肝脏疾病，据报道包括牛磺酸、黄芪提取物、法舒地尔在内的多种肝病治疗药物均可通过抑制氧化应激反应而起到保护肝脏，促进肝组织修复作用，还有报道称施用间充质干细胞治疗后，也可以抑制过度的氧化应激反应，保护机体的正常生理功能。而TGF-β可以在体内通过多种信号通路调解氧化应激反应，骨髓MSCs外泌体同样具有一定的氧化应激调解能力，因此可以推测出本发明中的治疗方式可能通过氧化应激途径发挥抗肝纤维化作用，而超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)是机体内参与氧化应激反应的重要代谢酶类和产物，可以较好的反映组织中的氧化能力水平，故本发明中通过检测肝组织中的SOD和MDA水平来表征肝脏中氧化应激情况的变化。

本发明中选用南京建成生物工程研究所的丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测肝脏组织中的SOD和MDA水平，具体方法为：取小鼠肝脏0.5g左右，加入4℃预冷的生理盐水，经组织匀浆机进行匀浆，2000rpm离心10min，去除组织残渣，取上清液，按照试剂盒说明书进行检测。结果如图2所示，生理盐水组中SOD表达水平较低，说明在肝纤维化模型组中SOD水平有所下降，肝组织受到过量氧化损伤的风险较大，而5个治疗组中SOD水平有不同程度的提高，可以对抗氧化损伤，其中单独使用TGF-β2抗体，以及该抗体与单纯骨髓MSCs外泌体、bFGF诱导骨髓MSCs外泌体、KGF诱导骨髓MSCs外泌体，小鼠肝组织中的SOD水平类似，均相对生理盐水组有明显上升，但是各组之间没有显示出统计学差异；然而，当TGF-β2抗体与HGF诱导骨髓MSCs外泌体联用时，却可明显提高肝组织内SOD水平，显著高于其他各治疗组。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，MDA过度积累能够加剧膜的损伤，如图3所示，生理盐水组中MDA含量较高，而经过TGF-β2抗体或MSCs外泌体治疗治疗后，小鼠肝组织中MDA含量下降，其中TGF-β2抗体与HGF诱导骨髓MSCs外泌体联用治疗组的MDA含量最低，TGF-β2抗体与KGF诱导骨髓MSCs外泌体、bFGF诱导骨髓MSCs外泌体联用也可产生一定的协同作用，其MDA水平也显著低于单独使用抗体或抗体与单纯骨髓MSCs外泌体联用。

上述结果，本发明中所提供的TGF-β2抗体能够有效抑制肝纤维化中的过度氧化应激反应，从而保护肝脏组织免受过氧化物的损伤，并且这一作用在联合HGF诱导骨髓MSCs外泌体施用后得到了进一步的增强，说明二者可产生协同抗氧化作用。

3.5小鼠肝组织EMC降解能力检测

金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)是一组胶原酶抑制物,通过与相应的胶原酶结合而抑制其对胶原的分解，其中金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)和金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)是TIMP家族中最为常见的两种抑制因子，它们在肝纤维化组织中高表达，从而抑制胶原的快速降解，引起或加剧肝纤维化进程，本发明中采用RT-PCR方法检测小鼠肝组织中TIMP-1和TIMP-2的表达情况，以便考察TGF-β2抗体和骨髓MSCs外泌体对于胶原降解的影响。

取小鼠肝脏组织约30mg，用无菌剪刀剪碎后，加入液氮进行研磨，加入1mL预冷Trizol裂解液(购自美国Invitrogen公司)充分裂解组织，室温静置5min。加入200μL氯仿。室温静置3min，10000rpm，15min，4℃离心，取上层无色有机相置于洁净EP管中。向管内加入500μL异丙醇，4℃静置10min，10000rpm，10min，4℃离心，弃上清；向管内加入1mL预冷的75％乙醇，涡旋仪震荡洗涤沉淀。5000rpm，5min，4℃离心，吸弃上清。超净台内空气干燥至沉淀透明，加入适量无Rnase dH2O溶解RNA。测定RNA样品的OD260/OD280的比值，约为1.9，说明RNA纯度较好，可用于后续检测。

向RNA样品中加入Oligo dT引物和逆转录酶，利用PrimeScriptTM RT reagentkit(购自TaKaRa公司)进行逆转录反应，逆转录反应条件为42℃，30min；85℃，30s，所获得的产物为cDNA样品，置于-80℃中保存。以制备好的cDNA样品为模板，通过荧光定量PCR检测TIMP-1和TIMP-2的表达水平，采用、SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒(购自TaKaRa公司)，以为β-actin阳性对照，反应条件为：95℃1min；95℃5s；60℃30s；循环40次，反应过程中所用引物如表1所示。

表1 PCR引物序列

如图4所示，施用本发明中所提供的TGF-β2抗体和骨髓MSCs外泌体可以显著降低小鼠肝组织中TIMP-1mRNA表达水平，说明TGF-β2抗体和骨髓MSCs外泌体可通过抑制TIMP-1表达水平，进而抑制肝纤维化过程，虽然各个治疗组中TIMP-1mRNA水平均有所下降，但是各个组间却没有展示出统计学差异，故推测对于TIMP-1的表达抑制作用可能主要来自TGF-β2抗体本身，骨髓MSCs外泌体对TIMP-1的表达相应不明显。但是这一情况却未出现在TIMP-1mRNA表达中，如图5所示，TGF-β2抗体，以及TGF-β2抗体与单纯骨髓MSCs外泌体虽然对TIMP-1mRNA具有一定的降低作用，但是降低幅度较小，当TGF-β2抗体与HGF诱导骨髓MSCs外泌体联用时，却可显著降低TIMP-1表达，此外TGF-β2抗体与bFGF诱导骨髓MSCs外泌体联用也可较大幅度的降低TIMP-1表达。上述结果显示，TGF-β2抗体可显著降低TIMP-1和TIMP-2mRNA水平，并且当该抗体与HGF诱导骨髓MSCs外泌体联用时，对于TIMP-2的抑制作用更强烈。

3.6小鼠血清细胞因子检测

IFN-γ和IL-12都被认为是可以抑制肝纤维化的有益细胞因子，在肝纤维化发生后往往呈现低水平表达，本发明中为考察所述TGF-β2抗体和骨髓MSCs外泌体的治疗作用和治疗机制，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血清中的IFN-γ和IL-12浓度水平。具体方法为：治疗28天后，小鼠眼眶取血，3000rpm，15min离心收集血清，采用ELISA试剂盒(购自TaKaRa公司)检测IFN-γ和IL-12浓度，具体检测步骤按照试剂盒说明书进行。

如图6所示，生理盐水组中IFN-γ的表达水平被明显抑制，而经过治疗后IFN-γ水平均有所提高，其中TGF-β2抗体组、TGF-β2抗体与HGF诱导骨髓MSCs外泌体组、TGF-β2抗体与KGF诱导骨髓MSCs外泌体组中IFN-γ的表达水平较高，而TGF-β2抗体与bFGF诱导骨髓MSCs外泌体组、TGF-β2抗体与单独骨髓MSCs外泌体组中IFN-γ的表达水平改善相对较低，表明并非TGF-β2抗体与所用MSCs外泌体均具有协同效应，而是具有一定的选择性和组织偏好性。类似的情况也出现在IL-12表达中，如图7所示，生理盐水组中IL-12表达水平较低，单独使用TGF-β2抗体或骨髓MSCs外泌体虽然能够明显提供小鼠体内的IL-12水平，但改变幅度仍低于联合治疗组，在联合治疗组中国IL-12水平均比单独治疗组有所提高，其中TGF-β2抗体与HGF诱导骨髓MSCs外泌体组的IL-12表达水平最高。上述结果表明，本发明所提供的抗体能够明显改善小鼠体内IFN-γ、IL-12等细胞因子的表达水平，并且与诱导后的骨髓MSCs外泌体联用似乎改善能力更强，可发挥协同效应。

序列表

<110> 北京欣颂生物科技有限公司

<120> 一种单克隆抗体及其与间充质干细胞外泌体的联合应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ser Leu Tyr Lys Thr Asp Ser

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Glu Asn Gly Pro Pro Ser Val Asp

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Pro Val Ser Val His Asn Gly Asp Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Glu Leu His Asn His Ser Ile

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Thr Leu Tyr His Asn Ala Asn Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Pro Ser Val Glu Gln Arg Gly Cys Glu Gln

1 5 10

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Trp Leu Gln Gln Leu Gly Ser Glu Glu Val Lys Trp Gly Ala

1 5 10 15

Lys Asn Lys Leu Ser Pro Ala Val Gly Lys Thr Phe Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Tyr Lys Thr Asp Ser Trp Val Gln Gln Arg Thr Ile Gly Gln Gly Leu

35 40 45

Trp Ile Gly Arg Ile Trp Glu Asn Gly Pro Pro Ser Val Asp Arg Ala

50 55 60

Thr Pro Pro Asp Val Ser Ser Ile Thr Asp Gln Tyr Ser Gly Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu Thr Trp Glu Gln Gln Val Tyr Tyr Ser His Arg Phe Pro Val

85 90 95

Ser Val His Asn Gly Asp Ser Trp Gly Gln Gln Thr Trp Leu Gly Glu

100 105 110

Ser Ser Ser

115

<210> 8

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Glu Leu Gln Gln Ala Pro Ala Glu Leu Ala Ser Gln Gln Gly

1 5 10 15

Trp Glu Ala Thr Ile Ser Cys Asp Glu Leu His Asn His Ser Ile Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Pro Lys Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr His

35 40 45

Asn Ala Asn Ser Gly Val Pro His Phe Ser Val Gly Ser Gly Ala Glu

50 55 60

Val Ala Phe Thr Val Asn Ile His Lys Val Glu Glu Glu His Gln Thr

65 70 75 80

Ser Tyr Phe Cys Pro Ser Val Glu Gln Arg Gly Cys Glu Gln Phe Gly

85 90 95

Val Lys Gly His Lys Leu Ile Asn Lys

100 105

Claims (10)

1.一种靶向TGF-β2的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链互补决定区(CDR区)氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:1所示CDRH1，SEQ ID NO:2所示CDRH2和SEQ ID NO:3所示CDRH3，轻链互补决定区氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:4所示CDRL1，SEQ ID NO:5所示CDRL2和SEQ ID NO:6所示CDRL3。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.一种药物组合物，其特征在于包括如权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体和间充质干细胞外泌体。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脂肪、骨髓、脐带或胎盘。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞来源于骨髓。

7.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体由间充质干细胞经肝细胞生长因子(HGF)诱导而得。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的制备方法包括：从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代，待融合度达到80％以上，更换无血清培养基并加入HGF培养24h，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。

9.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述单克隆抗体和间充质干细胞外泌体的质量比为1:3-3:1。

10.一种权利要求4-9所述的药物组合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

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