CN112341543B - 包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用，该药物组合物包含单域抗体和间充质干细胞外泌体，可用于治疗肺纤维化，可显著改善肺组织系统，修复肺组织损伤，降低炎症反应，产生协同效应。

Description

包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用。
背景技术
纤维化是一种以组织纤维性变为特征的慢性进行性疾病，人体器官由实质和间质两部分构成，其中实质是指器官的主要结构和功能细胞，发挥器官的主要生理功能，而间质由间质细胞和细胞外基质构成，主要起机械支撑和连接作用，当器官组织遭到损伤或其他异常生理信号后，可能导致间质纤维结缔组织大量增生，破坏器官原有正常结构，致使器官纤维化和功能下降，从而诱发多种疾病，如肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、心脏纤维化和皮肤纤维化等等。肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)又被称为弥漫性实质性肺疾病(diffuse parenchymal lung disease，DPLD)，是众多纤维化疾病中较为常见的一种，肺纤维化中又以特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)最具代表性，其以肺间质炎性细胞浸润、成纤维细胞增生和胶原蛋白沉积为特征的慢性炎症性疾病，该疾病的起始阶段表现为肺泡炎，此时大量炎性细胞向肺内浸润、活化，释放多种细胞因子，形成瀑布效应，激活多种细胞，诱导肺成纤维细胞活化、增殖和分泌胞外基质，最终形成肺纤维化。
肺纤维化发病机制尚不十分清楚，可能与自身免疫缺陷、环境污染、不良生活习惯、外部损伤等多种因素相关。目前，临床治疗方法包括抗氧化剂、抗纤维化剂、细胞因子抑制剂等，其中吡非尼酮和尼达尼布可明显减缓肺活量下降速率的能力，已被批准用于肺纤维化，然而这两种药物的治疗效果有限，且可能会引起严重的胃肠道耐受性问题，并且在使用中已发现其可引起肾毒性，也有通过氧气治疗、机械通气、肺部修复或肺移植等方式进行治疗，我国研究人员还开发了多种中医药的治疗方式，如补阳还五汤、养阴清肺汤、麦门冬汤、淫羊藿提取物、甘草酸、黄芪多糖等等。然而，上述治疗方法或药物仍难以有效治疗或缓解肺纤维化，研究表明特发性肺纤维化患者的中位生存期为确诊后的2-4年，5年生存率仅为30%-50%，且预后较差。正因为肺纤维化临床上难以得到有效治疗，且其发病率呈逐年上升趋势，故对于肺纤维化的药物研究成为了当今医学领域的研究热点。
随着现代分子生物学和免疫学的发展，免疫治疗为肺纤维化治疗提供了一种新的解决方案。目前普遍认为，肺部炎症反应在肺纤维化的发生发展中其重要作用，诸如白细胞介素( interleukin，IL) 、肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor，TNF)、前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2) 等炎症因子受到了研究人员的广泛关注。IL-13是一种12kDa的分泌性细胞因子，在体内主要由由CD4+ T 细胞极化的Th2 细胞亚群分泌，它与IL-4被认为是与肺纤维化密切相关的炎症因子，有报道表明，特发性肺纤维化的临床患者肺组织中的Th2 相关细胞因子分泌明显增加，在动物模型中显示出IL-4 和IL-13含量与肺纤维化存在正相关关系，在人为诱导的纤维化模型中IL-13的表达水平上升，而消除IL-13 可以减轻纤维化，尽管IL-4也有类似的作用，但是研究表明IL-4的效果似乎更加短暂，Thomas A Wynn综述了IL-13的生理作用，指出在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，虽然IL-13和IL-4表达水平都有所提高，但是抑制IL-4后对肺纤维化无明显影响，中和IL-13却能显著抑制肺纤维化的发展过程。有研究表明，IL-13参与肺纤维化的作用机制，可能与经典激活巨噬细胞（classically activatedmacrophages，M1）向抗炎性替代激活巨噬细胞（alternativelyactivated macrophages，M2）亚群转化有关，在肺损伤初期M1细胞较多，而后逐渐被M2细胞所替代，，M2 则以抗炎和促纤维化为主，可诱导非纤维化产生，中和IL-13可抑制M2细胞的过度增殖。现有技术中开发出了多种靶向IL-13的单克隆抗体，用于治疗肺纤维化，如CN101039960A，CN105307676A，CN102292351A等，但是靶向IL-13的单域抗体（或称为纳米抗体）却未见报道，单域抗体的结构更加简单，生产、制备和存储也更加方便，故研究开发靶向IL-13的单域抗体具有重要的研究意义和临床应用意义。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是源自中胚层衍生的非造血细胞，其具有低免疫原性，多向分化能力和组织修复能力，并广泛用于治疗多种疾病，MSCs可以从骨髓、脂肪组织、脐带等组织中分离出来，其中，人脐带间充质干细胞更容易获得，具有增殖、免疫抑制作用，并且在临床应用中无伦理问题。继炎症因子后，间充质干细胞也被用于治疗肺纤维化，但是直接使用间充质干细胞治疗，一方面需要培养大量原代细胞，过程繁琐，生产和管理成本较高，另一方面，由于细胞培养过程中所使用的培养基质成分不明，注射外源异体干细胞导致移植抗宿主反应，故其安全性和稳定性也受到一定的质疑，不利于临床应用和推广，因此研究人员试图采用间充质干细胞外泌体治疗肺纤维化，并取得了一定的积极效果，如杨静等（脐带间充质干细胞来源的外泌体通过抑制上皮间质转化缓解肺纤维化，J South Med Univ，2020，40（7）：988-994）采用人脐带间充质干细胞外泌体（hUCMSC-EXOs，通过抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路激活的上皮-间质转化而缓解小鼠肺纤维化程度，张恩国（骨髓间充质干细胞源外泌体抑制二氧化硅诱导的肺纤维化的疗效及其机制研究，济南大学，硕士学位论文，2019）采用骨髓间充质干细胞（bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs）外泌体干预二氧化硅诱导肺纤维化，可改善大鼠肺系数，降低促纤维化因子 TGF-β1 表达水平。但是由于间充质干细胞具有多向分化性，治疗靶向性不高，易引发副反应，故采用间充质干细胞或其外泌体治疗肺纤维化仍难以获得令人满意的疗效，肺纤维化程度改善有限。
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种肺纤维化的新型治疗手段，一方面筛选并获得了靶向IL-13的单域抗体，该抗体具有全新结构，能够高效特异性的结合靶抗原；另一方面，优化了脐带来源间充质干细胞外泌体的制备过程，并将间充质干细胞与肺泡上皮细胞共培养后提取外泌体，然后将上述外泌体和单域抗体共同用于治疗肺纤维化疾病，以期取得协同效应，为肺纤维化的治疗提供了新的手段和方法。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种靶向靶向IL-13的单域抗体及其与间充质干细胞外泌体的联合应用，可产生协同效果，有效抑制肺纤维化的发生发展过程，促进肺泡组织的修复，有助于肺生理机能的恢复，改善治疗效果。
本发明的详细技术方案如下：
提供了一种靶向IL-13的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的互补决定区（CDR区）氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:1所示CDR1，SEQ ID NO:2所示CDR2和SEQ ID NO:3所示CDR3。
进一步的，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
相对于具有完整轻链和重链结构的普通单克隆抗体，单域抗体，又称纳米抗体，仅具有重链结构，使得抗体分子结构更为简单，易于后期的生产制备和分离纯化，且其仍与目标抗原具有较高的亲和力和靶向性，故更适合临床应用和大规模生产。
提供了一种药物组合物，其特征在于包括如前述述的单域抗体和间充质干细胞外泌体。
进一步的，所述单域抗体和间充质干细胞外泌体的质量比为1:2-2:1。
进一步的，所述间充质干细胞来源于脂肪、骨髓、脐带或胎盘。
进一步的，所述间充质干细胞来源于脐带。
进一步的，从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代，待融合度达到80％以上，更换无血清培养基培养24h，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。
进一步的，所述间充质干细胞外泌体为间充质干细胞与肺泡上皮细胞共培养后获得的外泌体。
进一步的，所述间充质干细胞外泌体的制备方法包括：从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代；将所述间充质干细胞接种于Transwell培养小室的下室中，肺泡上皮细胞接种于Transwell培养小室的上室中，进行共培养；共培养一段时间后，更换无血清培养基培养24h，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。
进一步的，所述间充质干细胞与肺泡上皮细胞共培养12-48h。
进一步的，所述间充质干细胞与肺泡上皮细胞共培养24h。
提供了一种上述的药物组合物在制备组织纤维化相关疾病药物中的应用。
进一步的，所述疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化。
进一步的，所述疾病为肺纤维化。
本发明的有益效果包括：
虽然间充质干细胞外泌体已有报道用于治疗肺纤维化，但是其治疗效果仍也有待于强化，且间充质干细胞具有多向分化性，故其治疗的特异性较低，为改善其特异性，本发明中一方面将间充质干细胞的外泌体与靶向IL-13的单域抗体联合使用，另一方面，在间充质干细胞的培养过程中与肺泡上皮细胞共培养一段时间后再收集外泌体，起到一定的诱导分化作用，从而在整体上改善了肺纤维化的治疗效果。
本发明的有益效果包括：
本发明提供了一种靶向IL-13的单域抗体，可高特异性结合目标抗原，治疗肺纤维化，且其具有更简单的生物结构，易于生产和制备；选用人脐带间充质干细胞，来源广泛，易于培养，无伦理性问题；使用干细胞外泌体治疗肺纤维化，避免移植抗宿主效应；将间充质干细胞与肺上皮细胞共培养后收集外泌体，进行初始诱导，有助于提高靶向性，且间充质干细胞外泌体与靶向IL-13单域抗体配合使用，可产生协同效应，进一步提高肺纤维化治疗效果。
附图说明
图1细胞共培养模型示意图；
图2不同治疗组的肺系数图；
图3不同治疗组大鼠肺组织病理切片图；
图4不同治疗组大鼠血清中IL-6表达的影响图；
图5不同治疗组大鼠血清中TGF-β表达的影响图；
图6不同治疗组大鼠血清中TNF-α表达的影响图。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1 靶向IL-13的单域抗体制备
利用人IL-13蛋白免疫羊驼，通过噬菌体展示文库，筛选靶向IL-13的单域抗体，具体方法包括：
（一）羊驼抗原免疫。
将100μg 人IL-13蛋白与100μL弗氏完全佐剂充分混合制成乳化混合物，选取健康成年单峰驼，采用该乳化混合物经背部皮下多点注射方式对羊驼进行免疫，前两次次免疫采用弗氏完全佐剂，后续免疫改用弗氏不完全佐剂与人IL-13蛋白混合而成的乳化混合物进行强化免疫，共免疫8-10次，免疫间隔时间为2周。各次免疫1周后，采集100mL外周血，通过ELISA检测抗血清效价，用人IL-13蛋白包被检测板，每孔加入梯度稀释的抗血清，37℃孵育1.5h，洗涤3-5次，每孔加入104倍稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1h，洗涤3-5次后，加100μL TMB底物，37℃孵育15min，50μL 0.2M的H2SO4中止反应，OD 450nm测定吸光度。当抗血清效价达106以上时，构建抗体噬菌体展示文库。
（二）构建噬菌体展示文库。
采集免疫后的羊驼100mL外周血，使用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），提取PBMC总RNA，使用RT-PCR试剂盒, 经由oligo(dT)反转录为cDNA，通过通用引物进行扩增，随后将羊驼的VHH基因片段经酶切纯化后，克隆至phagemid质粒，转化TG1细菌，经培养富集后，将含VHH基因片段的核酸连接至噬菌体载体上，然后经电击转化构建噬菌体文库。随机挑选55个克隆进行测序鉴定，结果显示，所构建噬菌体文库阳性率为97.5％，序列多样性为98.7％，满足后续实验要求。
（三）目标抗体的筛选
本实验中采用三轮筛选获得靶向IL-13的单域抗体，具体步骤为：
第一轮筛选：在ELISA板上包被天然的人IL-13蛋白，5μg/孔，4℃过夜；用PBST溶解BSA至浓度3％，300μL/孔，37℃封闭2h，洗板3次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板3-5次；加入甘氨酸缓冲液室温下轻摇10min，吸出洗脱液，然后加入的Tris-HCl缓冲液中和反应。将100μL洗脱液加入至5mL对数生长期的TG1菌种，37℃孵育30min，随后加入含抗生素的培养基中，37℃过夜培养。取培养液4℃，4000rpm，离心15min，收集上清液加入5mLPEG/NaCl，冰浴30min，4℃，8000rpm，离心15-20min，弃去上清，用1mL的PBS重悬，4℃，12000rpm，离心10min，所得沉淀即为噬菌体抗体颗粒。
第二轮筛选：在ELISA板上包被天然的人IL-13，1μg/孔，洗板3-5次；用3％的脱脂奶粉，洗板3-5次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板5-8次；其余操作同第一轮筛选。
第三轮筛选：在ELISA板上包被天然的人IL-13，0.1μg/孔，洗板3-5次；用3％的BSA封闭，洗板3-5次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板5-8次；其余操作同第一轮筛选。
筛选完成后，用噬菌体感染TG1细菌，涂布于培养皿中，从培养后的平板上随机挑取65个单克隆，通过酶联免疫反应方法，以可溶解的人IL-13为抗原，筛选阳性克隆，进行测序鉴定。根据测序结果，选取11条序列用于后续实验。
（四）目标抗体的表达与分析
提取阳性克隆质粒并转化至大肠杆菌感受态细胞，以100mM IPTG诱导单域抗体蛋白表达，采用膜分离与树脂分离相互配合的方式纯化目标抗体蛋白。应用Fortebio生物分子相互作用平台检测亲和力，结果表明11个备选抗体中，有5个抗体与目标抗原的亲和力在3.89 E-07至6.74E-09之间，选择其中亲和力最高的单域抗体用于后续实验。
（五）单域抗体序列分析
测定上述IL-13单域抗体的氨基酸序列结构，如SEQID NO:4所示，将该氨基酸序列置于结构数据库中进行同源结构的搜索和抗体序列结构比对分析，确定其互补决定区（CDR区），CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次为SEQ ID NO:1-3所示。
实施例2人脐带MSCs的分离、培养与外泌体获得
2.1 人脐带MSCs的分离与培养
(1)在手术室无菌环境下采集新鲜脐带，取整条脐带快速置于含0.5％青霉素和0.5％硫酸链霉素的无菌PBS溶液中；
(2)在生物安全柜内，取出脐带组织放置于无菌PBS溶液中，反复冲洗脐带，去除残存的血液和其他杂质；
(3)脐带剪成若干段，纵向剖开，并剔除两根脐动脉和一根脐静脉；
(4)用无菌手术剪将脐带剪成约1mm3大小的组织块，将所得组织块用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片；
(5)将上述组织块均匀的平铺于培养皿中，加入含10％胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，置于恒温培养箱中，37℃，5%CO2，进行培养；
(6)培养24小时后，显微镜观察细胞贴壁情况，若贴壁良好，则采用吸管或移液器轻轻吸去培养基，并用无血清培养基轻轻漂洗一次，去除组织残渣和细胞碎片；若贴壁状态不好，继续培养，直至贴壁后再做上述处理；
(7)加入10mL加入含10％FBS培养基，于恒温培养箱内静置培养2-5天，37℃，5%CO2；
(8)待培养皿中贴壁细胞铺满60％以上时，用1mL的0.25％的重组胰蛋白酶消化3分钟，然后加入10mL培养基终止消化，用移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，并用10mL新鲜培养基重悬，所得细胞原代脐带间充质干细胞（记为P0代）；
(9)将步骤(8)所得P0代脐带间充质干细胞进行传代培养，共培养3-5代（记为P3-5代）。
2.2 人脐带MSCs外泌体的获得
(1)待培养的间充质干细胞P3-P5代融合度达到80％以上后，吸出培养基，更换无血清培养基培养24h，收集上清液；
(2) 将所得上清2000rpm离心30min去除细胞碎片，收集上层清液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取得滤液，再经10000rpm离心60min弃上清，将所得沉淀即为人脐带MSCs外泌体，采用适量PBS重悬；
(3)所得外泌体进行NTA、透射电镜观察和流式细胞仪检测，结果表明分离的外泌体能阳性表达CD9、CD63、CD44，阴性表达CD34，具有囊泡状结构，平均直径约为100-120nm，符合实验要求。
实施例3人脐带MSCs与A549细胞共培养与其外泌体的获得
3.1人脐带MSCs与A549细胞共培养
采用Transwell培养小室进行人脐带MSCs与A549细胞共培养，该培养小室底部设有半透膜，可使得营养物质进行交换，而细胞不能通过。
(1) 取液氮中保存的肺泡上皮细胞A549（本实验室保存），于温水中快速复苏，然后加入RPMI1640 培养基混合均匀后，2000 rpm离心5 min收集细胞，采用新鲜培养基洗涤3-5次，然后加入含10% FBS的 RPMI1640 培养基于37℃、5%CO2条件下培养3-5代，以便充分活化A549细胞；
(2)如2.1节中所述，培养人脐带MSCs，并传代至3-5代；
(3)将人脐带MSCs接种于Transwell培养小室的下室中，每孔106个细胞，A549细胞接种于Transwell培养小室的上室中，每孔106个细胞，如图1所示，1为Transwell培养小室，小室底部设有半透膜2，其上室中接种A549细胞3，下室底部接种人脐带MSCs 4；
(4)将(3)中获得的共培养模型中加入完全DMEM/F12培养基，于37℃，5%CO2，培养24h。
3.2人脐带MSCs与A549细胞共培养后外泌体的获得
人脐带MSCs与A549细胞共培养24h后，弃去原培养基，采用PBS 液轻轻洗涤3次，加入无血清培养基，37℃，5%CO2，继续培养24h后，收集外泌体，具体方法同2.2节，所得外泌体进行NTA、透射电镜观察和流式细胞仪检测，结果表明分离的外泌体能阳性表达CD9、CD63、CD44，阴性表达CD34，具有囊泡状结构，平均直径约为100-120nm，符合实验要求。
实施例4肺纤维化大鼠的治疗与评价
4.1肺纤维化大鼠模型的制备
博莱霉素是制备肺纤维化模型的常规药物，其诱导的肺纤维化模型与人类肺纤维化具有相似的生理和病理学特点，被广泛用于肺纤维化的研究和治疗中，且其方法成熟，操作简便，因此本发明中采用博来霉素诱导大鼠肺纤维化，具体步骤如下：
(1)取清洁级 SD（Sprague-Dawley）大鼠，8 -10周龄，体重约180-220g，雌雄各半，在实验室环境下正常饲喂2-3天；
(2)将上述SD大鼠用10%水合氯醛麻醉后，测量并记录大鼠体重，按5mg/kg的博莱霉素实验剂量，计算各个大鼠的给药剂量；
(3)将大鼠固定于实验台上，咽喉部采用碘伏消毒，用手术剪剪开喉部，暴露气管，用医用一次性注射器注射向气管内快速注射计算后剂量的博莱霉素，而后垂直放置大鼠，将其左右旋转 3-4 周，使博莱霉素溶液均匀分布于肺部；
(4)缝合手术伤口，伤口处用碘伏消毒，待大鼠清醒后正常饲养。
4.2肺纤维化大鼠的治疗
为验证本发明中所提供的IL-13抗体、人脐带MSCs及其组合对于肺纤维化的治疗作用，分别采用上述药物治疗博来霉素诱导的肺纤维化大鼠，并观察各种指标，以便综合考察和评价治疗效果。
将肺纤维化大鼠随机分为6组，每组10只，分别为生理盐水组（记为A组），尾静脉注射0.2mL生理盐水；IL-13抗体组（记为B组），尾静脉注射100μg/Kg IL-13抗体；单独培养外泌体组（记为C组），尾静脉注射100μg/Kg单独培养的人脐带MSCs外泌体；共培养外泌体组（记为D组），尾静脉注射100μg/Kg共培养的人脐带MSCs外泌体；IL-13抗体+单独培养外泌体组（记为E组），尾静脉注射100μg/Kg IL-13抗体和100μg/Kg单独培养的人脐带MSCs外泌体；IL-13抗体+共培养外泌体组（记为F组），尾静脉注射100μg/Kg IL-13抗体和100μg/Kg共培养的人脐带MSCs外泌体。在造模1周后，按上述剂量进行给药，给药4周后进行检测。
4.3大鼠肺系数评价
治疗4周后，各实验组大鼠禁食、不禁水饲养12h，将大鼠颈椎脱臼处死，测量各自体重，而后在无菌条件下分离肺脏并称重，按以下公式计算肺系数，肺系数＝肺湿重(mg)/体重(g)。如图2所示，在生理盐水组中，大鼠的肺系数严重降低，说明博来霉素对肺组织造成了严重损伤，各个治疗组中的肺系数具有不同程度的改善，A、B、C三组的治疗效果类似，三组之间的肺系数没有显示出统计学差异，但均明显高于生理盐水组，这说明书采用IL-13抗体或间充质干细胞外泌体均可缓解肺纤维化症状；IL-13抗体与间充质干细胞外泌体联合治疗，展现了较好的治疗效果，其肺系数明显高于抗体或外泌体的单独治疗组，其中IL-13抗体与共培养间充质干细胞外泌体似乎更具有治疗优势，其肺系数改善最大。
4.4大鼠肺组织切片检测
治疗4周后，处死大鼠（处死方法同4.3节），取各个治疗组大鼠肺组织，将其放入10％福尔马林溶液中固定3天，然后取出肺组织经清水冲洗后，对肺组织进行脱水处理，采用石蜡对肺组织进行包埋，再由切片机进行切片，经HE染色后制备为病理切片，在显微镜下观察肺组织的变化。
如图3所示，生理盐水组（A组）中肺泡结构紊乱，不同肺泡之间发生融合，肺泡间隔因炎症细胞大量浸润与成纤维细胞大量增生，伴随细胞外基质沉积；单独培养外泌体组（C组）虽有改善，但仍存在大量炎症细胞和成纤维细胞；IL-13抗体治疗组（B组）肺泡结构开始逐渐恢复，炎症细胞减少，这一趋势也展现在了共培养外泌体组（D组）中，在该组中炎症细胞浸润受到抑制；IL-13抗体+单独培养外泌体组（E组）和IL-13抗体+共培养外泌体组（F组）改善更为明显，炎症细胞大量减少，成纤维细胞增殖减轻，肺泡纤维化程度显著降低。
4.5大鼠血清炎症因子检测
治疗4周后，大鼠尾静脉取血，然后3000rpm，15min离心收集血清，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测IL-6、TGF-β和TNF-α浓度，具体检测步骤按照试剂盒说明书进行，结果如图4-6所示。
IL-6、TGF-β和TNF-α均被认为是与肺纤维化发生发展密切相关的严重因子，可通过等NF-κB、JAK-STAT、BMP等信号通路影响组织纤维化的进程。如图4所示，在IL-6表达水平方面，本发明所提供的IL-13抗体和MSCs外泌体均可以降低其表达水平，且共培养的MSCs外泌体对于IL-6的抑制效果更加明显，在该组中IL-6的表达水平低于IL-13抗体和单独培养MSCs外泌体组；在抗体和MSCs外泌体联合治疗中，IL-6的表达被进一步抑制。
如图5所示，在TGF-β表达水平方面，所有治疗组都有不同程度的改善，但是单独培养MSCs外泌体的改善幅度最低，IL-13抗体组和共培养MSCs外泌体组的治疗效果类似，令人惊奇的是在联合治疗组中，TGF-β表达水平出现了大幅度下降，尤其是在IL-13抗体和共培养MSCs外泌体联合治疗中，TGF-β表达被明显抑制。
如图6所示，在TNF-α表达水平方面，所有治疗组也展现了不同程度的改善，虽然IL-13抗体治疗组略好于单独培养MSCs外泌体和共培养MSCs外泌体组，但其三者整体改善水平类似；令人惊奇的是在联合治疗组中，与TGF-β的表达调控类似，TNF-α表达水平也出现了大幅度下降，尤其是在IL-13抗体和共培养MSCs外泌体联合治疗中，TNF-α表达被明显抑制。
在治疗组中，上述三种炎症因子的表达水平被不同程度的抑制，通过比较可知，联合使用IL-13抗体和间充质干细胞外泌体（尤其是与共培养间充质干细胞外泌体）的治疗效果优于单独治疗，说明二者在治疗肺纤维化中可产生协同效应，在修复肺组织损伤过程中可发挥互补功能，为肺纤维化的临床治疗提供的新的可行性途径。
序列表
<110> 北京欣颂生物科技有限公司
<120> 包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Met Gln Pro Thr Ser Ser Trp
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Tyr Tyr Gln Cys Gly Phe Thr Ala
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Lys Ile Leu Val Pro Glu Ala Cys Tyr Tyr Thr Glu His
1 5 10
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ile Arg Thr Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Trp Asp
1 5 10 15
Asp Met Arg Leu Ser Val Lys Leu Ile His Phe Trp Pro Cys Asn Met
20 25 30
Gln Pro Thr Ser Ser Trp Pro Phe Arg Thr Cys Pro Gly Ser Trp Tyr
35 40 45
Pro Trp Asn Ala Thr Tyr Tyr Gln Cys Gly Phe Thr Ala Val Pro Thr
50 55 60
Ile Ser Met Met Asp Asn Ala Asp Leu Ser Val Ser Val Tyr Thr Met
65 70 75 80
His Phe Ala Gln Gly Val Asp Glu Thr His Asn Val Ile Pro Phe Arg
85 90 95
Lys Ile Leu Val Pro Glu Ala Cys Tyr Tyr Thr Glu His Trp Thr Thr
100 105 110
Asn Pro Ala Cys Asp Gly His Thr Val Thr Thr Ser Ser
115 120 125

Claims (10)

1.一种靶向IL-13的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的互补决定区（CDR区）氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:1所示CDR1，SEQ ID NO:2所示CDR2和SEQ ID NO:3所示CDR3。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
3.一种药物组合物，其特征在于包括如权利要求1或2中所述的单域抗体和间充质干细胞外泌体。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述单域抗体和间充质干细胞外泌体的质量比为1:2-2:1。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的制备方法包括：从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代，待融合度达到80％以上，更换无血清培养基培养24h，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体为间充质干细胞与肺泡上皮细胞共培养后获得的外泌体。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的制备方法包括：从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代；将所述间充质干细胞接种于Transwell培养小室的下室中，肺泡上皮细胞接种于Transwell培养小室的上室中，进行共培养；共培养一段时间后，更换无血清培养基培养24h，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。
8.一种权利要求3-7任一项所述的药物组合物在制备组织纤维化相关疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病为肺纤维化。
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