ES2399503T3

ES2399503T3 - Uso de reactivos relacionados con citocinas de mamíferos

Info

Publication number: ES2399503T3
Application number: ES10011810T
Authority: ES
Inventors: Rene De Waal Malefyt; Yong-Yun Liu; Marehalli L. Nagalakshmi; Norihiko Watanabe; Vassili Soumelis; Wei Yuan
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-30
Publication date: 2013-04-01
Anticipated expiration: 2023-01-30
Also published as: AU2003208888A1; NZ533987A; CA2474011C; EP2311869B2; JP2014156478A; US20100136003A1; WO2003065985A3; EP2311869B1; EP2311869A1; JP2012184259A; US20070020262A1; MXPA04007426A; US20110229434A1; ES2399503T5; CA2474011A1; EP2077277A1; AU2003208888B2; PT2311869E; JP2009132730A; DK2311869T3

Abstract

Un antagonista de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) o TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3) para su uso en el tratamiento delasma o la dermatitis atópica; en el que el antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo que se uneespecíficamente a TSLP/IL-50 ((SEC ID Nº 1) o TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3) y en el que el antagonista inhibe laproducción de linfocitos T de IL-4, IL-5, IL-13 y TNF-alfa.

Description

Uso de reactivos relacionados con citocinas de mamíferos

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a usos de citocinas de mamíferos. Más específicamente, la invención se refiere a la identificación de citocinas de mamíferos e inhibidores de las mismas que afectan a afecciones médicas tales como alergia e inflamación.

Antecedentes de la invención

Durante algún tiempo se ha sabido que la respuesta inmunitaria de mamíferos se basa en una serie de interacciones celulares complejas denominadas la “red inmunitaria”. Reciente investigación ha proporcionado nuevos conocimientos en los funcionamientos internos de esta red. Aunque sigue estando claro que gran parte de la respuesta gira, de hecho, alrededor de las interacciones de tipo red de los linfocitos, macrófagos, granulocitos y otras células, actualmente los inmunólogos son de la opinión general de que las proteínas solubles, conocidas como citocinas, desempeñan un papel crucial en el control de estas interacciones celulares. Por tanto, existe un considerable interés en el aislamiento, caracterización y mecanismos de acción de los factores moduladores celulares y cuyos conocimientos conducirán a significativos avances en el diagnóstico y terapia de numerosas anomalías médicas, por ejemplo trastornos del sistema inmunitario. Algunos de estos factores son factores de crecimiento y/o diferenciación hematopoyética, por ejemplo el factor de células madre (SCF) y la IL-7. Véase, por ejemplo, Mire-Sluis y Thorpe (1998) Cvtokines, Academic Press, San Diego, CA; Thomson (ed. 1998) The Cytokine Handbook. 3ª ed., Academic Press, San Diego, CA; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic Colonv Stimulating Factors, Cambridge Univ. Press; and Aggarwal and Gutterman (1991) Human Cytokines, Blackwell Publishing, Malden, MA.

Las citocinas median en las actividades celulares de varios modos: Las citocinas soportan la proliferación, el crecimiento y la diferenciación de las células madre hematopoyéticas pluripotenciales en un gran número de progenitores, que comprende diversos linajes celulares formando un complejo sistema inmunitario. Las interacciones adecuadas y equilibradas entre los componentes celulares son necesarias para una respuesta inmunitaria sana. Los diferentes linajes celulares a menudo responden de un modo diferente cuando las citocinas se administran junto con otros agentes.

Las citocinas median la comunicación entre las células del sistema inmunitario, por ejemplo células presentadoras de antígeno (CPA) y los linfocitos T. Las células dendríticas (CD) son las más potentes de las células presentadoras de antígeno. Véase, por ejemplo, Paul (ed.) (1993) Fundamental Immunology. 3ª ed., Raven Press, NY. La presentación del antígeno se refiere a los acontecimientos celulares en los que se capta un antígeno proteináceo, procesado por las células presentadoras de antígeno (CPA) y, después, reconocido para iniciar una respuesta inmunitaria. Las células presentadoras de antígeno más activas se han caracterizado como los macrófagos (que son productos de desarrollo directos de los monocitos), células dendríticas y ciertos linfocitos B. Las CD son muy respondedoras a estímulos inflamatorios tales como lipopolisacáridos bacterianos (LPS) y citocinas tales como el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-alfa). Las citocinas o estímulos, tales como LPS, pueden inducir una serie de cambios fenotípicos y funcionales en las CD que en conjunto se denominan maduración. Véase, por ejemplo Banchereau y Schmitt (eds.) (1995) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Plenum Press, NY.

Las células dendríticas se pueden clasificar como, por ejemplo, células dendríticas intersticiales del corazón, el riñón, los intestinos y los pulmones; las células de Langerhans en la piel y las membranas mucosas; las células dendríticas interdigitantes en la médula mímica y el tejido linfoide secundario; y la sangre y las células dendríticas linfáticas. Aunque las células dendríticas en cada uno de estos compartimentos son leucocitos CD45+ que aparentemente surgen de la médula ósea, pueden exhibir diferencias que se relacionan con el estado de maduración y el microambiente. Los cambios de maduración en las CD incluyen, por ejemplo, silenciación de la captación de antígeno por endocitosis, regulación por incremento de las moléculas de superficie relacionadas con la activación de las células T y producción activa de una serie de citocinas, incluidas TNF-alfa e IL-2. Tras la acumulación local de TNF-alfa, las CD migran a las áreas de los linfocitos T de órganos linfoides secundarios para activar las células T específicas de antígeno.

Las citocinas y las células inmunitarias median los mecanismos o vías fisiológicas específicos, por ejemplo vías que conducen a los diversos trastornos inflamatorios. Aproximadamente el 20 % de la población de los países occidentales sufre trastornos inflamatorios, por ejemplo las enfermedades alérgicas que incluyen asma, rinitis, dermatitis atópica y alergias alimentarias (véase, por ejemplo, A. B. Kay (2001) N. Engl. J. Med. 344:30-37). La inflamación alérgica es el resultado de una compleja cascada inmunológica que hace que los linfocitos T produzcan citocinas derivadas de TH2 con regulación alterada, tales como IL-4, IL-5 e IL-13, de modo que estas citocinas desencadenan hiperreactividad bronquial, producción de IgE, eosinofilia, y producción de moco (véase, por ejemplo, Busse y Lemanske, Jr. (2001) N. Engl. J. Med. 344:350-62; Holgate (2000) Br. Med. J. 320:231-234); y Renauld (2001) J. Clin. Pathol. 54:577-589).

La inflamación y la reconstitución inmunitaria son dos situaciones en las que es deseable usar intervención farmacéutica o terapéutica para modular la actividad o la proliferación de los linfocitos, por ejemplo modulando interacciones entre las CPA y los linfocitos T. Las afecciones inflamatorias dependientes de las interacciones entre las CPA-T incluyen, por ejemplo, psoriasis, las alérgicas y la hipersensibilidad bronquial. La reconstitución inmunitaria, la reposición del sistema inmunitario, es útil en el tratamiento de las infecciones virales, por ejemplo VIH/SIDA, y en el tratamiento de pacientes que sufren citoablación, en la que la citoablación se efectúa con, por ejemplo, radioterapia o quimioterapia.

La psoriasis, una enfermedad inflamatoria de la piel, tiene una prevalencia en los países occidentales de más del 4 % (Granstein (1996) J. Clin. Inv. 98:1695-1696; Christophers (2001) Clin. Exp. Dermatol. 26:314-320). La enfermedad puede producir frecuentes recaídas, en ocasiones es potencialmente mortal y con frecuencia se asocia con artritis, es decir artritis psoriásica. Los linfocitos T y los queratinocitos son necesarios para el desarrollo y la persistencia de la psoriasis (Greaves y Weinstein (1995) New Engl. J. Med. 332:581-588; Robert y Kupper (1999) New Enel. J. Med. 341:1817-1828; Fearon y Veale (2001 Clin. Exp. Dermatol. 26:333-337). Las células dendríticas y los mastocitos, por ejemplo, también contribuyen a la inflamación psoriásica (Mrowietz, y col., (2001) Exp. Dermatol. 10:238-245; Ackermann, y col. (1999) Br. J. Dermatol. 140:624-633).

La hiperreactividad bronquial es la manifestación de enfermedades inflamatorias pulmonares, incluidas asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC; trastorno pulmonar obstructivo crónico), bronquitis crónica, bronquitis eosinófila, bronquiolitis y bronquioilitis viral (Riffo-Vasquez and Spina (2002) Pharmacol. Therapeutics 94:185-211).

El asma es una enfermedad crónica que se caracteriza por un incremento de la capacidad de respuesta bronquial y por obstrucción e inflamación de las vías respiratorias. La enfermedad representa, por ejemplo, más del 15 % de las urgencias pediátricas (Crain y col., (1995) Arch. Pediatr. Adolesc. Med. 149:893-901). Las CPA, los linfocitos T, los linfocitos B, los eosinófilos, los mastocitos y los basófilos contribuyen al mecanismo del asma. Las CPA presentan el antígeno a los linfocitos T que, a su vez, hacen que los linfocitos B produzcan IgE. Los eosinófilos, los basófilos y los mastocitos liberan IL-4 que, a su vez, estimula la diferenciación de los linfocitos T en células TH2 que secretan IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 tras la estimulación con el antígeno. La IL-4 y la IL-13 secretadas por las células TH2 y otras células estimulan la activación de los linfocitos B (Marone (1998) Immunol. Today 19:5-9). Los linfocitos B son estimulados para producir IgE por dos tipos de señales, IL-4 o IL-13, y el contacto directo con los linfocitos T (Barnes y Lemanske (2001) New Engl. J. Med. 344:350-362). La IgE liberada activa los mastocitos que, a su vez, producen la construcción de las vías respiratorias. Los eosinófilos producen la proteína básica principal que directamente produce daños en las vías respiratorias. La IL-5 desempeña un papel crucial en el desarrollo, supervivencia y reclutamiento de eosinófilos (Bames y Lemanske, anteriormente). La prevención de la activación de los linfocitos T, por ejemplo con anticuerpos anti-CO4, o el bloqueo de las citocinas derivadas de THZ, por ejemplo la IL-5, se tratan como nuevos enfoques terapéuticos en el tratamiento del asma alérgica, Stirling y col., British Med. Bull. (2000) 56: 1037-1053).

La EPOC, que implica infiltración linfocitaria de los bronquiolos, es la cuarta causa principal de muerte en Norteamérica (Bames (2000) New Engl. J. Med. 343:269-280). La enfermedad se caracteriza por un engrosamiento del músculo liso de las vías respiratorias e inflamación de las vías respiratorias, es decir con infiltración con monocitos, macrófagos, linfocitos T CD4*, linfocitos T CD8* y neutrófilos en los pulmones (Barnes (2000) Chest 117:10S-14S; Jeffery (1998) Thorax 53:129-136).

La reconstitución inmunitaria es un estado en el que es deseable la modulación de la proliferación de linfocitos. La reconstitución inmunitaria se consigue, por ejemplo, mediante transplante de médula ósea. La potenciación o estimulación de la proliferación de los linfocitos T se desea en el transplante de médula ósea tras quimioterapia y en las enfermedades que producen deficiencia inmunitaria, por ejemplo el SIDA (Panteleo, y col., (1993) New Engl. J. Med. 328:327-335; Kovacs, y col., (1995) New Engl. J. Med. 332:567-575), así como con el uso de linfocitos T terapéuticos, incluidos los linfocitos T alterados genéticamente (Terando y Chang (2002) Surg. Oncol. Clin. N. Am.

11:621 643; Gottschalk, y col., (2002) Adv. Cancer Res. 84:175-201). La reconstitución inmunitaria usando transplantes de médula ósea o transplantes de células madre se usa tras terapia mieloablativa o inmunnosupresora (Paloczi (2000) Immunol. Lett. 74:177-181; Ren-Heidenreich y Lum (2001) Curr. Gene Ther. 1:253-255).

Los receptores de los transplantes de células madre experimentan retrasos en la adquisición de linfocitos completamente funcionales y estos retrasos se pueden extender más allá de un año tras el transplante. Las células no tratadas anteriormente requieren un timo competente para desarrollarse. Por tanto, los recuentos de linfocitos T CD4+ pueden ser inferiores a lo normal con los transplantes de médula ósea, es decir, cuando el timo está dañado por radioterapia (Novitzky y Davison (2001) Cytotherapy 3:211-220). Por tanto, la estimulación de la proliferación de los linfocitos es un objetivo deseable por los retrasos en la proliferación de linfocitos T tras transplante de médula ósea, así como en transplantes en los que el timo está dañado.

La citoablación seguida de transplante de médula ósea o terapia con células madre se usa en el tratamiento de una serie de enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn y esclerosis múltiple (Breedveld (2000) Arthritis Res. 3:268-269; McColl, y col., (1999) Ann. Intern. Med. 131:507-509; Laar (2000) Arthritis Res. 2:270-275), así como en el tratamiento de cánceres tales como linfoma noHodgkin y leucemia (Kay, y col., (2002) Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program) 193-213; Hagemeister (2002) Cancer Chemother. Pharmocol. 49 Suppl. 1:S13-20). Por tanto, existe la necesidad creciente de estimular la proliferación de linfocitos T tras citoablación.

La enfermedad del injerto contra huésped (EICH) es un problema con los transplante de médula ósea. La EICH es una consecuencia de los transplantes alogénicos, en los que la EICH se puede prevenir mediante la depleción ex vivo de los linfocitos T en el injerto (Andre-Schmutz, y col., (2002) Lancet 360:130-137; Aversa, y col., (1998) New Engl. J. Med. 339:1186-1193). Se describe el tratamiento ex vivo del os linfocitos, por ejemplo mediante tratamiento con citocinas o ácidos nucleicos, seguido de la introducción en el sujeto. Véase, por ejemplo, Emerudh, y col. (2002) Curr. Med. Chem. 9:1497-1505; Cavazzana-Calvo y col., (2002) Semin. Hematol. 39:32-40; Gunzer y Grabbe (2001) Crit. Rev. Immuol. 21:133-145; Gokmen, y col., (2001) J. Hematother. Stem Cell Res. 10:53-66. Sin embargo, la depleción ex vivo descrita anteriormente de los linfocitos T exacerba la deficiencia de linfocitos T Por tanto, existe la creciente necesidad de estimular la proliferación de linfocitos T para promover la reconstitución inmunitaria, en la que los linfocitos T estaban deplecionados ex vivo, antes del injerto.

Actualmente existe el interés en el uso de factores de crecimiento hematopoyéticos y citocinas para estimular la proliferación de linfocitos T tras los transplantes de médula ósea (Symann, y col., (1989) Cancer Treat. Rev. 16 Suppl. A:15-19; Lenarsky (1993) Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 15:49-55). Un problema con los métodos actuales es desviar el repertorio de los linfocitos T hacia la oligoclonalidad (Marktel, y col., (2002) Blood, October 3, 2002, publicación electrónica previa a la impresión). Por tanto, existe la necesidad de estimular la proliferación de linfocitos T mediante procedimientos que mantengan la policlonalidad.

La descripción proporciona procedimientos para modular las células dendríticas (CD) para el tratamiento de afecciones inflamatorias dependientes de las interacciones CPA/linfocitos T y para efectuar la reconstitución inmunitaria. Las células dendríticas, las células presentadoras de antígeno profesionales, desempeñan un papel en la estimulación de la activación y proliferación de los linfocitos T. Las CD, las células presentadoras de antígeno profesionales, desempeñan un papel importante en la patogenia de las enfermedades alérgicas. Véase, por ejemplo, Banchereau and Steinman (1998) Nature 392:245-252; Stumbles (1999) Immunol. Cell Biol. 77:428-433; Lambrecht (2001) Clin. Exp. Allergy 31, 206-218; Semper y col., (1995) Adv. Exp. Med. Biol. 378:135-138. No obstante, la señal inicial que ceba las CD para inducir la producción por los linfocitos T de las citocinas TH2 es desconocida (véase, por ejemplo, D. von Bubnoff, y col., (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108:329-339). Aunque se ha demostrado que los queratinocitos y las células epiteliales de la mucosa producen citocinas proinflamatorias, tales como IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF y TNF-alfa tras la activación (S. Nozaki, y col., (1992) Adv. Dermatol. 7:83-100; y el debate 101; T. S. Kupper (1990) J. Invest. Dermatol. 94:146S-150S; P. F. Piguet (1992) Springer Semin. Immunopathol. 13:345-354; e

I. R. Williams y T. S. Kupper (1996) Life Sci. 58:1485-1507), ninguna de estas citocinas puede explicar el mecanismo subyacente a la inducción de la inflamación alérgica (véase, por ejemplo, D. von Bubnoff, anteriormente).

La linfopoyetina estromal tímica (hTSLP/IL-50) (SEC ID Nº 1) es una nueva citocina similar a la IL-7, clonada de una línea de células estromales tímicas (véase, por ejemplo, J. E. Sims y col., (2000) J. Exp. Med. 192:671-680; y el documento USSN 09/963,347, presentado el 24 de septiembre de 2001). La región de codificación madura de la TSLP humana corresponde a los aminoácidos 29-159 (Reche, y col., (2001) J Immunol. 167:336-343). El receptor de TLSP/IL-50 es un heterodímero que consiste en la cadena alfa de IL-7R (SEC ID Nº 2) y una cadena del receptor de tipo gamma (receptor de TSLP, TSLPR) (SEC ID Nº1 3) (véase, por ejemplo, Tonozuka y col. (2001) Cytogenet. Cell Genet. 93:23-25; Pandey y col., (2000) Nat. Immunol. 1:59-64; L. S. Park y col., (2000) J. Exp. Med. 192:659-670; y Reche y col., anteriormente. La cadena del receptor de tipo común humano se identificó inicialmente debido a su homología con la cadena 8 del receptor de IL-2. Su función como la 2ª cadena del receptor de TLLP solo se reconoció más tarde (véase, por ejemplo, el documento WO 01/12672). Aunque TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) soporta los desarrollos de linfocitos B y T precoces murinos (véase, por ejemplo, Levin y col., (1999) J. Immunol. 162:677683; Ray, y col., (1996) Eur. J. Immunol. 26:10-16), hTSLPIIL-50 (SEQ ID NO:1) activa las células dendríticas (CD) CD11c+, pero no tiene ningún efecto biológico directo sobre los linfocitos B, los linfocitos T, las células NK ni los mastocitos (véase, por ejemplo, Reche, y col., anteriormente). In vito, se ha demostrado que las CD tratadas con TSLP estimulan la proliferación de linfocitos T no expuestos previamente (véase, por ejemplo, Reche, y col., anteriormente). Esto está de acuerdo con la coexpresión de ARNm para la subunidad delta 2 del receptor de hTSLP/IL-50 y la cadena alfa del IL-7R en CD CAD 11c+, pero no en otros tipos de células.

Los mecanismos y la patogenia de la inflamación, en concreto la inflamación alérgica, no se entienden del todo y, como tal, hasta ahora se desconocen las diversas terapias. La presente invención proporciona pruebas de que hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) puede participar en varios trastornos inflamatorios mediante su acción sobre determinadas subpoblaciones de células inmunitarias, en concreto las células dendríticas.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento del efecto de hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) sobre la actividad las células presentadoras de antígeno, por ejemplo las células dendríticas (CD), en concreto el cebado por las CD de los linfocitos T que tiene como resultado inflamación, por ejemplo psoriasis o inflamación alérgica.

En el presente documento se describe un procedimiento de modulación del cebado por las células presentadoras de antígeno (CPA) de los linfocitos T, que comprende poner en contacto la CPA con un agonista de TSLP/IL-50 (SEC Nº 1) o del receptor de TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3) o un antagonista de TSLP/IL-50 (SEC Nº 1) o del receptor de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 2, 3). También se describe el procedimiento anterior, en el que el linfocito T es un linfocito T CD4+ no expuesto previamente, un linfocito T de memoria central o un linfocito T de memoria efector; en el que la CPA es una célula dendrítica (CD) CD11c+; en el que el cebado estimula la proliferación del linfocito T; en el que la proliferación es policlonal; o en el que la interacción entre la CPA y el linfocito T es autóloga o alogénica, o en el que la interacción es autóloga y produce un fenotipo de linfocitos T de memoria central.

También se describe el procedimiento anterior en el que el agonista o antagonista comprende un anticuerpo humanizado; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo policlonal; un fragmento Fab; un fragmento F(ab’)2; o un mimético peptídico de un anticuerpo; o en el que el agonista es TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) o un fragmento antigénico del mismo.

En otra realización, la invención abarca el uso del antagonista reivindicado que trata a un sujeto que sufre un trastorno inmunitario, que comprende tratar o administrar una cantidad eficaz de un antagonista de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) o TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3) como se especifica en la reivindicación. También se describe el procedimiento anterior, en el que el trastorno inmunitario es una afección inflamatoria y la administración comprende una cantidad eficaz de un antagonista de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) o TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3), en el que el trastorno inmunitario es psoriasis, artritis psoriásica. También se abarca el uso del antagonista reivindicado en el que el trastorno inmunitario es una respuesta inflamatoria pulmonar; o en el que la enfermedad inflamatoria pulmonar es asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) como se define en las reivindicaciones. También se describe el procedimiento anterior, en el que el trastorno inmunitario es inmunodeficiencia y la administración comprende una cantidad eficaz de un agonista de TSLP/IL50 (SEC ID IL Nº 1); en el que la inmunodeficiencia es un resultado de la citoablación de infección viral que produce inmunosupresión; en el que la administración comprende el tratamiento ex vivo de las células presentadoras de antígeno autólogas o alogénicas (CPA); o en el que la administración comprende el tratamiento ex vivo de las CPA con una cantidad eficaz de un agonista de TSLP/IL50 (SEC ID Nº 1). La invención también contempla el procedimiento anterior en el que el antagonista comprende un anticuerpo humanizado; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo policlonal; un fragmento Fab; un fragmento F(ab’)2;

o un mimético peptídico de un anticuerpo.

También se describe un procedimiento de inducción de la producción de IL-4, IL-5, and IL-13 por un linfocito T que comprende poner en contacto una CPA con un agonista de TSLP/IL-50 o del receptor de TSLP/IL-50 y cebar el linfocito T con CPA.

La invención abarca también el uso del antagonista reivindicado para modular la respuesta TH2 en un sujeto que comprende la administración de un antagonista de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) o de TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3).

La invención también se especifica en las reivindicaciones.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Como se usa en el presente documento, incluidas las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular tales como “uno”, “una” y “el/la" incluyen las correspondientes referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

I. Definiciones.

“Activación", “estimulación” y “tratamiento”, como se aplica a las células o a los receptores, puede tener el mismo significado, por ejemplo activación, estimulación o tratamiento de las células dendríticas (CD) con un ligando, a menos que el contexto indique lo contrario o lo contrario sea explícito.

“Administración” y "tratamiento”, como se aplica al tratamiento de un sujeto humano o un animal, hace referencia al contacto de una composición o agente farmacéutico, terapéutico o diagnóstico con el sujeto o animal. “administración” y “tratamiento” también significa tratamiento ex vivo de, por ejemplo, una célula, tejido órgano, seguido del contacto de la célula, tejido u órgano con el sujeto o animal, incluso cuando el agente o la composición se ha metabolizado, alterado o degradado durante el tratamiento ex vivo.

“Alogénico”, según se aplica a las células o a una reacción entre las células, hace referencia a, por ejemplo, una interacción en la que el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de una primera célula es reconocido como extraño por una segunda célula. “Autólogo”,según se aplica a las células o a una reacción entre las células, hace referencia a, por ejemplo, una interacción en la que el MHC de una primera célula es reconocido como propio por una segunda célula (Abbas, y col., (2000) Cellular and Molecular Immunology. 4ª ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia).

“Cantidad eficaz” significa una cantidad suficiente para mejorar un síntoma o signo de la afección médica.

Expansión o proliferación “policlonal” significa que la proliferación de una célula implica el mantenimiento del fenotipo, mientras que expansión o proliferación “oligoclonal” significa que el fenotipo está alterado (Duarte, y col.,

(2002) Gene Therapy 9:1359-1368).

“Sensibilidad”, por ejemplo sensibilidad del receptor de los linfocitos T (TCR), significa que la unión de un ligando al TCR tiene como resultado un cambio detectable en el TCR o en acontecimientos o moléculas asociadas específicamente con el TCR, por ejemplo un cambio conformacional o fosforilación del TCR, un cambio en las proteínas asociadas con el TCR o un cambio en la expresión génica asociada con el TCR.

II. General.

La hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) (también conocida como linfopoyetina estromal tímica; TSLP) se descubrió originalmente en ratón y se encontró que desempeñaba un papel similar como su IL-7 homóloga como soporte del desarrollo precoz de linfocitos B y T (véase, por ejemplo, Sims, anteriormente; Levin y col., anteriormente; y Ray, y col., anteriormente). La TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) de ratón no activó las CD de ratón aisladas de bazo o generados por monocitos o la médula ósea. La presente invención demuestra que la TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) humana es un nuevo activador de CD. La TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) muestra varias características únicas cuando se compara con otros factores de activación de las CD, por ejemplo el ligando d Ecd40, LPS, o IL-7. Por ejemplo, induce los niveles más altos de CD40 y CD80 sobre las CD; activa las CD para inducir la proliferación y expansión de linfocitos T CD4 no expuestos previamente más potentes; no parece inducir la producción por las CD de varias de las citocinas proinflamatorias conocidas, sino que induce la producción quimiocinas atrayentes TH2 TARC y MDC, y hace que las CD ceben los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente para que produzcan niveles altos de las citocinas TH2 IL4, IL-5, IL-13 y TNF-alfa. Es interesante el hecho de que la producción de la citocina proinflamatorias IL-10 y la citocina de TH1 IFN-gamma está inhibida. Estas características sugieren enérgicamente que la hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) representa un mediador crucial en la inflamación no controlada, en concreto la inflamación alérgica.

La activación de las CD parece ser una etapa crucial en la patogenia de las inflamaciones alérgicas mediadas por TH2, por ejemplo el asma. Las células dendríticas que presentan el alérgeno a las células Th2 activan la liberación por las células Th2 de citocinas, por ejemplo IL-4, IL-5 y IL-13, de modo que estas citocinas contribuyen de modos diferentes a la patología del asma. La IL-4 estimula incrementos en las moléculas de adhesión de las células endoteliales de las vías respiratorias y la producción de quimiocinas, la IL-5 provoca producción de eosinófilos, mientras que la IL-13 estimula la hiperreactividad del músculo liso (Lewis (2002) Curr. Opinion Immunol. 14:644651). Las moléculas de la adhesión celular estimuladas por la IL-4 sirven como receptores de las células inflamatorias (Striz, y col., (1999) Am J. Physiol. 277:L58-L64). La IL-4 y la IL-13 activan los linfocitos B, lo que tiene como resultado proliferación de linfocitos B y síntesis de IgE (Busse y Lemanske (2001 New Engl. J. Med. 344:350362). La IL-4 se sobreexpresa en las vías respiratorias de los asmáticos alérgicos, mientras que la IL-13 se sobreexpresa en las vías respiratorias en el asma alérgico y el asma no alérgico (Wills-Karp, y col., (1998) Science 282:2258 -2260). La IL-4 parece más importante en la sensibilización primaria a alérgenos, mientras que la IL-13 parece más importante durante la exposición secundaria a los alérgenos Kips (2001) Eur. Resp. J. Suppl. 34:24s33s).

Aunque las CD de individuos alérgicos inducen, preferentemente, una respuesta de tipo TH2 con (véase, por ejemplo, Hammad y col., (2001) Blood 98, 1135-41) o son (véase, por ejemplo, P. A. Srumbles, anteriormente; McWilliam y col., (1996) J. Exp. Med. 184:2429-32; N. Novak y col., (1999) Allergy 54:792-803; Tunon-De-Lara y col., (1996) Clin. Exp. Allergy 26:648-655; y Holt (1997) Adv. Exp. Med. Biol. 417:301-306) sensibilización con un alérgeno, el mecanismo molecular subyacente a la señalización de las CD para inducir enfermedades alérgicas de TH2 no se entiende claramente. Los presentes hallazgos de que hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) se expresa considerablemente en los queratinocitos de dermatitis atópica y que las CD activadas por la hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) sensibilizan considerablemente los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente para que produzcan IL-4, IL-5, IL13 y TNF-alfa sugieren que la hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) representa el factor crítico que faltaba para comprender la patogenia de las enfermedades alérgicas.

La hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) producida por las células epiteliales, u otras células estromales en el lugar de entrada del antígeno, activarán las CD y estimularán las CD para que produzcan las quimiocinas atrayentes de TH2 tales como TARC y MDC. Las CD activadas por la hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) migran hacia los ganglios linfáticos drenantes para que induzcan la proliferación de linfocitos T específicos del alérgeno y la diferenciación en células TH2. Estoas células TH2 F específicas de alérgeno pueden migrar de nuevo hacia TARC y MDC en el lugar original de la inflamación para que desencadenen la inflamación alérgica, de modo que se establece una relación funcional directa entre las células epiteliales, las CD y las respuestas inmunitarias mediadas por los linfocitos T.

Al contrario que las células TH2 clásicas, que producen IL-4, IL-5, IL10 e IL-13, los linfocitos T CD4+ humanos activados por CD estimuladas con hTSLP/IL-50 producen IL-4, IL-5 e IL-13, pero no IL-10. Aunque la IL-10 se ha incluido históricamente como una citocina TH2 (véase, por ejemplo, Abbas y col., (1996) Nature 383:787-793), su contribución a la inflamación alérgica mediada por TH2 ha sido controvertida. Mientras que algunos estudios mostraron que los niveles de ARNm de IL-10 en pulmones, intestino y piel aumentaban en pacientes con asma alérgico o dermatitis atópica (véase, por ejemplo, Robinson y col., (1996) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14:113-117), la medición directa de la proteína IL-10 mediante ELISA (Ensato de Inmunosorción Ligado a Enzimas) mostró niveles marcadamente menores de IL-10 en el lavado broncoalveolar o en los sobrenadantes de los cultivos de las células mononucleares de sangre periférica de pacientes atópicos, en comparación con sujetos control normales (véase, por ejemplo, Borish y col., (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 97:1288-96). Los estudios realizados en modelos de ratón confirman un papel de la IL-10 en la supresión de la inflamación de las vías respiratorias y la producción de citocinas (véase, por ejemplo, Akbari, y col., (2001) Nat. Immunol. 2:725-731; y Zuany-Amorim y col., (1995) J. Clin. Invest. 95:2644-2651). Por tanto, niveles elevados de IL-4, IL-.5, IL-13 y TNF-alfa y niveles disminuidos de IL-10 e IFN-gamma producidos por linfocitos T activados por CD estimuladas por hTSLP/IL-50 pueden representar las citocinas inflamatorias alérgicas reales subyacentes en la fisiopatología de la dermatitis atópica o el asma. La IL-10 es una citocina proinflamatoria, pero no un citocina TH2 proalérgica.

También se describe la primera evidencia de que las células epiteliales de la piel y la mucosa interaccionan directamente con las CD durante la inflamación alérgica produciendo TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1). La TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) no solo activa potentemente las CD sino que también proporcionan a las CD la capacidad de polarizar los linfocitos T no expuestos previamente para producir citocinas TH2 proalérgicas. La TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) representa una nueva diana para bloquear las enfermedades inflamatorias y alérgicas.

La presente especificación describe procedimientos y reactivos para potenciar la respuesta mediada por TH2 mediante agonismo de las actividades de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1). La potenciación de esta respuesta es útil en el tratamiento de trastornos producidos por supresión del sistema inmunitario, por ejemplo VIH. El aumento de la actividad de las células dendríticas será útil en el tratamiento de infecciones víricas, bacterianas o fúngicas. La TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) y/o los agonistas de la misma será también útil como adyuvantes de vacuna.

La supresión de la respuesta de las CD es útil para el tratamiento de varios trastornos y afecciones inmunitarias, por ejemplo inflamación alérgica, hiperreactividad bronquial, asma, rinitis, alimentos: alergia, rechazo de transplantes, enfermedad del injerto contra el huésped, enfermedades autoinmunitarias, infecciones víricas que producen inmunosupresión, psoriasis y dermatitis atópica.

III. Antagonistas y agonistas.

El bloqueo de las actividades de hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) se puede conseguir mediante antagonistas de la citocina, por ejemplo anticuerpos frente al ligando, anticuerpos frente al receptor etc. Se ha demostrado que la interferencia con la interacción ligando-receptor es una estrategia eficaz para el desarrollo de antagonistas.

Existen varios medios para antagonizar la actividad mediada por ligandos. Dos medios evidentes son para bloquear el ligando con anticuerpos; un segundo es bloquear el receptor con anticuerpos. En cada uno existen varios epítopos sobre los cuales bloquean su interacción produciendo hidrancia estérica que bloquea la interacción. La correlación de la capacidad para bloquear la señalización no necesariamente se correlacionaría con la afinidad de unión al ligando o a los receptores. Otro medio es usar un ligando luteína que conserva la actividad de unión al receptor, pero no induce la señalización del receptor. La luteína puede ser un inhibidor competitivo de la señalización del ligando.

Como alterativa se puede buscar en pequeñas bibliotecas de moléculas compuestos que pueden bloquear la interacción o señalización mediada por un apareamiento ligando-receptor identificado.

La presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o composición de unión que se une específicamente a un ligando de citocina especificado, preferentemente de mamífero, por ejemplo de primate, ser humano, gato, perro, rata o ratón. Se pueden producir anticuerpos frente a varias proteínas citocinas, incluidas variantes individuales, polimórficas, alélicas, de cepas o de especies, y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas naturales (de longitud completa) como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, se pueden producir anticuerpos frente a las proteínas receptoras tanto en sus formas nativas (o activas) como en sus formas inactivas, por ejemplo desnaturalizadas. También se pueden usar anticuerpos antiidiotípicos.

Se puede seleccionar una serie de inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con proteínas de ligando o receptor. La proteína recombinante es un inmunógeno preferido: para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. La proteína natural, de fuentes adecuadas, por ejemplo de primates, roedores etc., también se puede usar en forma pura o impura. Los péptidos sintéticos, fabricados usando las secuencias proteicas adecuadas, también se pueden usar como inmunógeno para la producción de anticuerpos. La proteína recombinante se puede expresar y purificar en células eucariotas o procariotas como se describe en, por ejemplo, Coligan y col., (eds. 1995 y suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, New York, NY; y Ausubel, y col., (eds. 1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York, NY. Se puede usar material plegado de forma natural o desnaturalizado, según sea adecuado, para producir anticuerpos. Se pueden generar anticuerpos monoclonales o policlonales, por ejemplo para su uso posterior en inmunoensayos para medir la proteína o para procedimientos de inmunopurificación.

Los procedimientos de producción de anticuerpos policlonales son bien conocidos para los expertos en la técnica. Normalmente un inmunógeno, preferentemente una proteína purificada, se mezcla con un adyuvante y se inmuniza a los animales con la mezcla. La respuesta inmunitaria del animal a la preparación inmunogénica se monitoriza realizando análisis de sangre y determinando el título de reactividad a la proteína de interés. Por ejemplo, cuando se obtienen títulos adecuadamente altos de anticuerpos frente al inmunógeno, normalmente tras varias inmunizaciones, se extrae sangre del animal y se prepara el antisuero. Si se desea se puede realizar el posterior fraccionamiento del antisuero para enriquece los anticuerpos reactivos frente a la proteína. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane; o Coligan. La inmunización se puede realizar también mediante otros procedimientos, por ejemplo inmunización con vector de ADN. Véase, por ejemplo, Wang y col. (1997) Virology 228:278-284.

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante diversas técnicas conocidas por los investigadores expertos en la técnica. Normalmente, se inmortalizan los esplenocitos procedentes de un animal inmunizado con un antígeno deseado, normalmente mediante fusión con una célula de mieloma. Véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Procedimientos alternativos de inmortalización incluyen transformación con el virus de Epstein Barr Virus, oncogenes, o retrovirus, u otros procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Doyle y col., (eds. 1994 y suplementos periódicos) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley and Sons, New York, NY. Las colonias que se producen de células únicas inmortalizadas se someten a detección selectiva de la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y el rendimiento de os anticuerpos monoclonales producidos por dichas células se puede potenciar mediante varias técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Como alternativa se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo mediante detección selectiva de una biblioteca de ADN de linfocitos B humanos de acuerdo con, por ejemplo, el protocolo general indicado por Huse y col., (1989) Science 246:1275-1281.

Los anticuerpos o composiciones de unión, incluidos lo fragmentos de unión, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fv, Fab, o F(ab’)2 de anticuerpos, contra fragmentos predeterminados de proteínas ligando o receptor se pueden producir mediante inmunización de los animales con conjugados de los fragmentos de las proteínas ligando

o receptor con proteínas transportadoras. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden someter a detección selectiva de la unión a la proteína normal o defectuosa. Normalmente, estos anticuerpos monoclonales se unirán con al menos una KD de aproximadamente 1 !M, más normalmente de al menos aproximadamente 300 !M, habitualmente de al menos aproximadamente 10 !M, más habitualmente de al menos aproximadamente 30 !M, preferentemente de al menos aproximadamente 10 !M, y más preferentemente de al menos aproximadamente 3 !M, o mejor.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales (mAb) de varios huéspedes de mamífero, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos etc. La descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales se puede encontrar en, por ejemplo, Stites, y col. (eds.) Basic and Clinical Immunology. 4ª ed., Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en el mismo, Harlow y Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2nd ed., Academic Press, New York, NY; y, en particular, en Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497, que tratan un procedimiento de generar anticuerpos monoclonales. En resumen, este procedimiento implica inyectar un animal con un inmunógeno. Después, se sacrifica al animal y se extraen células del bazo, que después se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o “hibridoma” que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas se selecciona después para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una única especie de anticuerpo frente al inmunógeno. De este modo, la especie de anticuerpo individual obtenida son los productos de células B únicas inmortalizadas y clonadas del animal inmune generado en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase, por ejemplo, Huse y col. (1989) Science 246:1275-1281; y Ward, y col,. (1989) Nature 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluidos los anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos se marcan uniéndolos, bien covalente o no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y se han publicado extensamente en la literatura científica y de patentes. Marcadores adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen las patentes de EE.UU. nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y

4.366.241. Asimismo, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly, patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Queen y col., (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; o se fabrican en ratones transgénicos, véase Mendez, y col., (1997) Nature Genetics 15:146-156; véase también Abgenix and Medarex technologies.

Los anticuerpos son simplemente una forma de composiciones de unión específica. Otras composiciones de unión que a menudo tendrán usos similares incluyen moléculas que se unen con especificidad a un ligando o receptor, por ejemplo de un modo pareja de unión-pareja de unión, una interacción anticuerpo-antígeno o en una interacción proteína-proteína natural fisiológicamente relevante, bien covalente o no covalente, por ejemplo proteínas que se asocian específicamente con la proteína deseada. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales o puede ser una molécula estructuralmente no relacionada, por ejemplo que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión adecuados. Los compuestos de unión a anticuerpo, incluidos los fragmentos de unión, como se describe en el presente documento, pueden tener valor diagnóstico o terapéutico significativo. También pueden ser útiles como compuestos de unión no neutralizantes y se pueden acoplar a toxinas o radionúclidos, de modo que cuando el compuesto de unión se une al antígeno una célula que lo expresa, por ejemplo sobre su superficie, muere. Además, estos compuestos de unión se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos, bien directa o indirectamente, por medio de un ligador, y pueden dirigir los fármacos.

Se dispone de anticuerpos frente a TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) (Soumelis, y col., anteriormente). Las regiones de mayor antigenicidad en TSLP/IL-B50 humana (SEC ID Nº 1) incluyen KAAYL (aminoácidos 40-44); KD (49-50); KS (59-60); PHC (73-75); ASLAK (91-95); TKAAL (102-106); KKRRKRKV (125-132); y PLLKQ (154-158) Se dispone de anticuerpos frente a IL-7Ralpha (SEC ID Nº 2) (Pandeyy col., anteriormente). Se dispone de anticuerpos anti-TSLPR (R & D Systems, Minneapolis, MN, nº cat. MAB981; DNAX Research, Inc., Palo Alto, CA). También se preparan anticuerpos contra TSLPR (SEC ID Nº 3) mediante inmunización con, por ejemplo, regiones de mayor antigenicidad determinado mediante el gráfico de Welling de Vector NTI® Suite (Informax., Inc, Bethesda, MD). Las regiones de mayor antigenicidad en el TSLPR incluyen HYR (residuos aminoacídicos 59-61); YYLKP (115-119); KHV (123-125); WHQDAV (129-134); KPKLSK (226-231); y AHLHKM (294-299) de la SEC ID Nº 3, en la que la región N-terminal es citosólica y se ha predicho que la región transmembrana del TSLPR humano está en aproximadamente los residuos 203-207 (Blagoev, y col., (2002) Gene 284:161-168; Park, y col., anteriormente).

Los agonistas incluyen la propia proteína citocina TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1), que se puede usar para inducir la señalización del receptor.

IV. Usos diagnósticos; composiciones terapéuticas, procedimientos

La invención proporciona el uso de los antagonistas reivindicados para el tratamiento de arios trastornos relacionados con la inflamación (según lo reivindicado), por ejemplo inflamación alérgica. La etiología y la patogenia a menudo no se conocen bien, pero producen significativas molestias o morbididad en pacientes. Como se indica más adelante, la administración de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) a las CD CD11 c+ en la sensibilización de los linfocitos T CD4+ para producir IL-4, IL-5, IL-13 y TNF-alfa y, por tanto, los agonistas o antagonistas pueden ofrecer una modalidad terapéutica para potenciar o suprimir el sistema inmunitario.

Los procedimientos diagnósticos incluyen aspectos tales como la predicción del pronóstico; la definición de subpoblaciones que responderán o no responderán a una evolución terapéutica concreta; el diagnóstico de trastornos relacionados con huesos o el sistema inmunitario o subtipos de estos trastornos; o evaluar la respuesta a la terapia. La especificación también contempla un anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que comprende un marcador detectable, por ejemplo un marcador fluorescente, epitópico, enzimáticamente activo o radiactivo.

Los antagonistas o agonistas de la actividad de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) pueden estar implicados de un modo que sugieran efectos terapéuticos significativos, por ejemplo para disminuir o prevenir la aparición de síntomas. Los antagonistas de la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con otro inhibidor o agonista del mismo o vía acompañante; u otros compuestos usados para el tratamiento de los síntomas, por ejemplo antagonistas o esteroides tales como glucocorticoides.

Esto se puede efectuar mediante administración directa del agonista o antagonista o quizá usando una estrategia de terapia génica. El antagonismo se puede efectuar mediante, por ejemplo, tratamiento antisentido, anticuerpos u otra supresión de los efectos de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1).

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyan el anticuerpo, la composición de unión del mismo, el agonista de la citocinas o el antagonista de moléculas pequeñas, La entidad se mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable que es, preferentemente, inerte. La preparación de dichas composiciones farmacéuticas se conoce en la técnica, véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences y U.S. Pharmacopeia National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Normalmente, los anticuerpos, composiciones de unión o citocinas se administran por vía parenteral, preferentemente intravenosa. Dado que estas proteínas o péptidos pueden ser inmunogénicas, se administran preferentemente despacio, bien mediante un conjunto de administración i.v. convencional o a partir de un depósito subcutáneo, por ejemplo como enseñan Tomasi, y col., patente de EE.UU. nº 4,732,863. Se pueden aplicar medios para minimizar las reacciones inmunológicas. Las entidades moleculares pequeñas pueden ser oralmente activas.

Cuando se administran por vía parenteral, los productos biológicos se formularán en forma inyectable monodosis (solución, suspensión, emulsión) en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Normalmente, dichos vehículos son de forma inherente no tóxicos y no terapéuticos. Los terapéuticos se pueden administrar en vehículos acuosos tales como agua, solución salina o vehículos tamponados con o son varios aditivos y/o agentes diluyentes. Como alternativa se puede preparar una suspensión, tal como una suspensión de cinc, para incluir el péptido. Dicha suspensión puede ser útil para inyección subcutánea (SC) o intramuscular (IM). La proporción de sustancia biológica y aditivo puede variar en un amplio intervalo siempre que ambos estén presentes en cantidades eficaces. Preferentemente, el anticuerpo se formula en forma purificada sustancialmente libre de agregados, otras proteínas, endotoxinas y similares, a concentraciones de aproximadamente 5 a 30 mg/ml, preferentemente de 10 a 20 mg/ml. Preferentemente, los niveles de endotoxina son inferiores a 2,5 UE/ml Véase, por ejemplo, Avis y col., (eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications 2ª ed., Dekker, NY; Lieberman, y col., (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets 2ª ed., Dekker, NY; y Lieberman, y col. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY).

La selección de un régimen de administración para una sustancia terapéutica depende de varios factores, incluidos la tasa de recambio sérico o tisular de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad de la entidad y la accesibilidad de las células diana, el momento de la administración etc. Preferentemente, un régimen de administración maximiza la cantidad de sustancia terapéutica liberada en el paciente consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. De acuerdo con esto, la cantidad de sustancia biológica liberada depende, en parte, de la entidad concreta y de la gravedad de la afección que se esté tratando. La guía en la selección de las dosis de anticuerpo adecuadas se encuentra en, por ejemplo, Bach y col., capítulo 22, en Ferrone, y col., (eds.) (1985) Handbook of Monoclonal Antibodies, Noges Publications, Park Ridge, NJ; y Haber, y col., (eds.) (1977) Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Raven Press, New York, NY (Russell, pgs. 303-357, y Smith, y col., pgs. 365-389). Como alternativa, las dosis de citocinas o de moléculas pequeñas se determinan usando metodologías estándar.

La determinación de la dosis adecuada la realiza el clínico usando, por ejemplo, parámetros o factores conocidos o que se sospecha en la técnica que afectan al tratamiento o que se ha predicho que afectan al tratamiento. EN general, la dosis comienza con una cantidad algo inferior a la dosis óptima y después se aumenta en pequeños incrementos hasta conseguir el efecto óptimo o deseado respecto a cualquier efecto secundario negativo. Medidas diagnósticas importantes incluyen las de los síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas. Preferentemente se usará una sustancia biológica derivada de la misma especie que el animal al que está dirigido el tratamiento, de modo que se minimiza una respuesta humoral al reactivo.

Los intervalos de dosis semanales totales para los anticuerpos o fragmentos de los mismos, que se unen específicamente al ligando o al receptor varían generalmente de aproximadamente 10 !g, más generalmente de aproximadamente 100 !g, normalmente de aproximadamente 500 !g, más normalmente de aproximadamente 1.000 !g, preferentemente de aproximadamente 5 mg y más preferentemente de aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal. EN general, el intervalo será inferior a 100 mg, preferentemente inferior a aproximadamente 50 mg y, más preferentemente, inferior a aproximadamente 25 mg por kilogramo de peso corporal. Los agonistas o terapéuticas de moléculas pequeñas se pueden usar a molaridades similares.

Los intervalos de dosis semanales de los antagonistas de la señalización mediada por los receptores de citocinas, por ejemplo anticuerpos o fragmentos de unión, varían de aproximadamente 1 !g, preferentemente de al menos aproximadamente 5 !g, y más preferentemente de al menos aproximadamente 10 !g por kilogramo de peso corporal. En general, el intervalo será inferior a 1.000 !g, preferentemente inferior a aproximadamente 500 !g y, más preferentemente, inferior a aproximadamente 100 !g por kilogramo de peso corporal. Las dosis se administran según un programa que efectúa el tratamiento deseado y puede ser periódico durante un periodo más corto o más largo. En general, los intervalos serán de al menos aproximadamente 10 !g a aproximadamente 50 mg, preferentemente de aproximadamente 100 !g a aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal. Los agonistas de citocinas o sustancias terapéuticas de molécula pequeña normalmente se usarán en cantidades molares similares, pero dado que probablemente tengan pesos moleculares más pequeños, tendrán dosis en peso menores.

La presente invención también proporciona la administración de sustancias biológicas en combinación con terapias conocidas, por ejemplo esteroides, en particular glucocorticoides, que alivian los síntomas, por ejemplo asociados con la inflamación, o antibióticos o antiinfecciosos. Las dosis diarias para los glucocorticoides variarán de al menos aproximadamente 1 mg, generalmente de al menos aproximadamente 2 mg y, preferentemente, de al menos aproximadamente 5 mg al día. En general, la dosis será inferior a aproximadamente 100 mg, normalmente inferior a aproximadamente 50 mg, preferentemente inferior a aproximadamente 20 mg y, más preferentemente, de al menos aproximadamente 10 mg al día. En general, los intervalos serán de al menos aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg, preferentemente de aproximadamente 2 mg a 50 mg al día. También se conocen combinaciones de dosis adecuadas con antibióticos, antiinfecciosos o antiinflamatorios.

Huéspedes mamíferos típicos incluirán ratones, ratas, gatos, perros y primates, incluidos seres humanos. Una cantidad eficaz para un paciente concreto puede variar en función de factores tales como la afección que se esté tratando, la salud general del paciente, el procedimiento, la vía y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios. Cuando se combinan, una cantidad eficaz está en proporción con una combinación de componentes y el efecto no está limitado a los componentes individuales por separado.

Una cantidad eficaz de la sustancia terapéutica disminuirá los síntomas normalmente en al menos aproximadamente un 10 %, normalmente en al menos aproximadamente un 20 %, preferentemente en al menos aproximadamente un 30 % o, más preferentemente, en al menos aproximadamente un 50 %. La presente invención proporciona reactivos que encontrarán uso en aplicaciones terapéuticas como se describe en otro lugar del presente documento, por ejemplo en la descripción general para tratar trastornos asociados con las indicaciones descritas anteriormente. Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Braunwald, y col., (eds.) (2001) Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY; Gilman, y col., (eds.) (1990) Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press; y Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey; y Physician’s Desk Reference (PDR); Cotran, y col., (eds), anteriormente; y Dale y Federman (eds.) (2000) Scientific American Medicine, Healtheon/WebMD, New York, NY.

Ejemplos

I. Procedimientos generales.

Algunos de los procedimientos convencionales se describen o se hace referencia a ellos en, por ejemplo, Maniatis y col. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press; NY; Sambrook, y col., (1989) Molecular Clonine: A Laboratory Manual, (2ª ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, y col., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, y col., (1987 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Los procedimientos para purificación de proteínas incluyen procedimientos tales como precipitación con sulfato amónico, cromatografía de columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros Véase, por ejemplo, Ausubel, y col. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Meth. (Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y bibliografía del fabricante sobre el uso de productos de purificación de proteínas, por ejemplo Pharmacia, Piscataway, N.J., or Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos adecuados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o una equivalente que puede fusionarse mediante una secuencia escindible con proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, y col. (1992) QTAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Se dispone de paquetes de software para determinar, por ejemplo los fragmentos antigénicos, la señal y las secuencias líder, el plegamiento proteico y los dominios funcionales. Véase, por ejemplo, Vector NTI® Suite (Informax, Inc., Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA), y DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, 2000) Bioinformatics 16:741-742. Se usaron también bases de datos de secuencias públicas, de, por ejemplo, GenBank y otros.

II. TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) Activación de CD CD11c+.

Las CD CD11c+ se purificaron de capas leucocíticas de sangre de adultos de donantes de sangre de voluntarios sanos (Stanford Medical School Blood Center, Stanford, CA) tras la separación de PBMC mediante centrifugación e Ficoll y depleción negativa de células que expresan CD3, CD14, CD19, CD56 y glicoforina A usando perlas magnéticas (Dynal, Oslo, Noruega). Las células deplecionadas se tiñeron además con anti-CD4-TC (Caltag, Burlingame, CA), anti-CD11c-PE y anti-CD3, CD14, CD16-FITC (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Los linfocitos T CD11c+ CD4+ se aislaron usando un Vantage FACsorter® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para alcanzar una pureza >99 %.

Las CD CD11c+ se cultivaron inmediatamente después de clasificar en RPMI que contiene 10 % de FCS, 1 % de piruvato, 1 % de HEPES y penicilina/estreptomicina. Las células se sembraron a 0,5 x 106/ml en placas de 96 pocillos de fondo plano en presencia de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) (15 ng/ml), IL-7 (50 ng/ml), LPS (1 mg/ml.), fibroblastos L transfectados con CD40-ligando (2,5 x 104/pocillo) o medio de cultivo solo. Tras 24 horas de cultivo, se recolectaron las CD y se resuspendieron en un medio que contiene EDTA para disociar los grupos. Las CD viables se contaron primero usando exclusión con azul tripán de células muertas.

Las células restantes se tiñeron con diversos anticuerpos monoclonales (mAb) conjugados con FITC anti-humanos de ratón incluidos anti-HLA-DR (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), anti-CD40, CD80 y CD86 (todos de Pharmingen, San Diego, CA) o un control isótopo de IgG1 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), y se analizaron con un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Las células muertas se excluyeron en base a las características de dispersión lateral y hacia delante. Para la detección de apoptosis, las células se tiñeron durante 5-10 minutos con anexina V-FITC (Promega, Madison, WI) y se analizaron en un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) sin exclusión de células muertas. TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1), IL-7, CD40-ligando y LPS todos regularon por aumento los HLA-DR, CD40, CD80, CD86 y CD83 de superficie sobre las CD cuando se compararon con medio solo. La hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) fue al menos dos veces tan potente como la IL-7 en la regulación por aumento de estos marcadores. Es interesante el hecho de que mientras que la TSLP/IL50 (SEC ID Nº 1) inducía los niveles más altos de expresión de CD40 y CD80 en las CD, el CD40-ligando indujo mayores niveles de HLA-DR y CD83. La capacidad de la TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) para regular por aumento el HLA-DR y las moléculas coestimuladoras se bloqueó neutralizando los anticuerpos monoclonales específicos de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1), lo que indica que los efectos observados de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) n las CD CD11c+ eran específicos. Como CD40L, TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) no solo activó las CD sino que también mantuvieron la supervivencia de las CD en cultivos de 24 horas, como se muestra mediante tinción con anexina V y recuentos celulares. Morfológicamente, tanto las CD estimuladas con TSLP/IL-50 como las CD-CD40L muestran largas dendritas y expresan HLA-DR y la glicoproteína de membrana asociada con lisosoma de las células dendríticas (CD-LAMP) cuando se compara con las CD en medio o las CD-IL-7.

CD-LAMP es un marcador de activación de las CD. CD-LAMP se induce rápidamente mediante TNF-alfa, LPS o CD40L y se puede usar para la presentación antigénica (Saint-Vis, y col., (1998) Immunity 9:325-336).

III. Sensibilización de linfocitos T CD4 no expuestas anteriormente.

Las CD CD11c+ se recogieron tras 24 horas de cultivo en diferentes condiciones, se lavaron dos veces para eliminar cualquier citocina y se co-cultivaron con 5x104 linfocitos T CD4+ no expuestas previamente alogénicas recién purificadas en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo. Los co-cultivos se llevaron a cabo por triplicado a proporciones CD/T crecientes. Las CD y los linfocitos T solos se usaron como controles. Tras 5 días, se dieron pulsos a las células con 3H-timidina 1mCi (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ) durante 16 horas antes de recoger y contar la radiactividad.

Más sorprendentemente, las CD estimuladas con TSLP/IL-50 indujeron la proliferación más fuerte de linfocitos T CD4 no expuestos previamente en una reacción linfocitaria mixta alogénica en comparación con CD-CD40L, CD-LPS o CD-IL-7. A una proporción de 1 CD por 150 linfocitos T, las CD activadas por TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) todavía indujeron una muy fuerte proliferación de linfocitos T CD4 no expuestos previamente alogénicos, que fue aproximadamente 10 veces más fuerte que la inducida por las CD-CD40L. Tras 6 días de cultivo, las CD estimuladas con TSLP/IL-50 indujeron un incremento de 2,5 a 10 veces el número total de linfocitos T, más que el inducido por las CD-CD40L, CD-LPS o CD-IL-7. Por tanto, la TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) representa uno de los factores de activación de CD más potentes y las CD estimuladas mediante TSLP/IL-50 inducen la proliferación y expansión más impresionantes de linfocitos T CD4 no expuestos previamente alogénicos.

IV. La expresión de citocinas y quimiocinas en CD sensibilizó linfocitos T no expuestos previamente

Los linfocitos T se recogieron al 6º día del co-cultivo, se lavaron dos veces y se volvieron a estimular con PMA e ionomicina en placas de 48 o de 96 pocillos de fondo plano a una concentración de 1x106/ml. Tras 2,5 horas se añadió Brefeldin A a 10 mg/ml. Tras 5 horas se recogieron las células, se fijaron con 2 % de formaldehído, se permeabilizaron con 10 % de saponina y se tiñeron con mAb conjugados con PE frente a IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 y TNF-alfa y mAb conjugados con FITC frente a IFN-gamma (todos de Pharmingen, San Diego, CA). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

En estudios previos se ha demostrado que la mayoría de las señales de activación de CD, tales como CD40L y LPS, induce la producción por las CD de citocinas proinflamatorias (IL-1 alfa/beta, IL-6 y IL-12) y la sensibilización de la diferenciación de linfocitos T CD4 no expuestos previamente hacia TH1 (Guermonprez, y col., (2002) Annu. Rev. Immunol. 20:621-667; Banchereau, y col., (2000) Annu. Rev. Immunol. 18:767-811). Para investigar los efectos de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) sobre la expresión de citocinas en las CD, los inventores realizaron primero una detección selectiva de ARNm cuantitativa global de 11 citocinas diferentes (IL-1-alfa, IL-1beta, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p35, IL12p40, IL-13, IL-18, IL-23p19 y TNF-alfa) y 12 quimiocinas diferentes (TARC, DCCK1, MDC, MCP1, MCP2, MCP3alfa, MCP4, eotaxina, MIP3, MIG, Rantes e IL-8). Sorprendentemente, al contrario que las CD-CD40L, las CD tratadas con TSLP/IL-50 no produjeron ARNm para todas las citocinas proinflamatorias analizadas pero produjeron niveles altos de ARNm para las quimiocinas TARC y MDC. Los análisis ELISA confirmaron a nivel proteico que las CD activadas por TLSP no producían cantidades detectables de las citocinas proinflamatorias IL-1beta, IL-6, IL12p70 and TNF-alfa, sino niveles elevados de las quimiocinas TARC y MDC (2001) J. Immunol. 167:336-343). TARC y MDC atraen preferentemente las células TH2 que expresan CCR4.

A continuación se comparó la capacidad de las CD estimuladas con hTSLP/IL-50 para polarizar los linfocitos T CD4 no expuestos anteriormente con las CD cultivadas respectivamente con medio, IL-7, CD40L o LPS. Los linfocitos T CD4+CD45RA+ humanos no expuestos previamente purificados de sangre periférica de adulto se co-cultivaron con las CD a una proporción de 1/5 durante 6 días, se lavaron para eliminar todas las citocinas, se volvieron a estimular 24 horas con anti-CD3 y anti-CD28 y se midió la producción de citocinas en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Sorprendentemente, las CD estimuladas con TSLP/IL-50 inducían la producción por los linfocitos T CD4 no expuestos previamente los niveles más altos de citocinas TH2 IL-4, IL-5 e IL-13, junto con la citocina proinflamatoria TNF-alfa. Las CD estimuladas con TSLP/IL-50 inducen la producción por los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente los niveles más bajos de la citocina antiinflamatoria IL-10 y la citocina TH1 IFN-gamma cuando se comparó con las CD cultivadas co medio solo u otros activadores. La capacidad de las CD estimuladas con TSLP/IL50 para inducir la producción por los linfocitos T CD4 no expuestos previamente niveles altos de IL-4, IL-13 y TNFalfa y bajos de IFN-gamma se confirmó mediante tinción de citocinas intracelulares. Por tanto, las CD-TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) indujeron la producción por los linfocitos T CD4 no expuestos previamente de un único grupo de citocinas que es distinto de un perfil TH1 (IFN-gamma) o un perfil TH2 clásico (IL-4, IL-5 e IL-10). Los linfocitos T CD4 activados por las CD estimuladas con TSLP/IL-50 produjeron los niveles más altos de TNF-alfa, una de las citocinas proinflamatorias más potentes cuando se comparó con los linfocitos T CD4 activados respectivamente con CD-medio, IL-7-CD, CD40L-CD o LPS-CD. Por el contrario, las CD estimuladas con TSLP/IL-50 parecían inhibir la producción por los linfocitos T CD4+ de IL-10, una potente citocina antiinflamatoria (véase, por ejemplo, Moore y col., (2001) Annu Rev Immunol 19:683-765) así como IFN-gamma, una citocina TH1 que puede producir inhibición cruzada de la respuesta THD (Abbas, y col., (1996) Nature 383:787-793). Por tanto, las CD estimuladas con TSLP/IL-50 inducen una sólida inflamación alérgica TH2 estimulando los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente para que produzcan IL-4, IL-5 e IL-13, en presencia de una fuerte citocina proinflamatoria TNF-alfa y en ausencia de dos inhibidores fisiológicos de la inflamación Th2, IL-10 e IFN-gamma. Además, las CD estimuladas con TSLP/IL-50 inducen potencian adicionalmente la inflamación mediada por TH2 produciendo quimiocinas tales como TARC y MDC, que, preferentemente, reclutan células TH2 en los tejidos inflamados originales (véase, por ejemplo, Imai y col., (1999) Int. Immunol. 11:81-88; Andrew y col., (1998) J. Immunol. 161:5027-5038; Andrew y col., (2001) J. Immunol. 166:103-111; Vestergaard y col., (2000) J. Invest. Dermatol. 115:640-646; y Vestergaard y col., (1999) J. Clin. Invest. 104:1097-1105).

V. Expresión de TSLP/IL-50.

A. Células estromales.

Para entender más la biología y la patofisiología de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1), la expresión del ARNm de TSLP/IL50 (SEC ID Nº 1) se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real Taqman®) en un panel de bibliotecas de 5 ADNc de diferentes células o líneas celulares primarias y un panel de células primarias clasificadas mediante FACAS (pureza celular más de 99 %). La expresión de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) no se encontró en la mayoría de los tipos de células hematopoyéticas, incluidos los linfocitos T, los linfocitos T, las células NK, los granulocitos, los macrófagos, las subpoblaciones de monocitos y las subpoblaciones de CD. Es interesante el hecho de que los mastocitos activados por anticuerpos monoclonales con reticulación con receptores de IgE de alta afinidad expresan 10 niveles muy altos de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1). Se encontró que la hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) estaba muy expresada por células estromales primarias humanas cultivadas tales como queratinocitos cutáneos, células epiteliales, células de músculo liso y fibroblastos pulmonares. Las células de músculo liso bronquial y los queratinocitos cutáneos activados, respectivamente, por IL-4, IL-13 y TNF-alfa, o TNF-alfa y IL-1beta parecen expresar más TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) cuando se comparó con controles solo con medio. No se encontró

15 expresión de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) en células endoteliales. Por tanto, el ARNm de hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) se expresa principalmente en la mayoría de los tipos de células estromales y mastocitos, pero no en la mayoría de los tipos de células hematopoyéticas y células endoteliales.

Las células primarias que consisten en células de músculo liso bronquial (BSMC), fibroblastos pulmonares humanos normales ((NHLF), queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK) y la línea celular de fibroblastos

20 pulmonares (MRC5) se sembraron a 0,5 X 106 células en placas de cultivo tisular de seis pocillos. Las citocinas o combinaciones de citocinas se añadieron a las concentraciones indicadas seguidas por incubación durante 8 horas a 37 ºC.

La expresión de ARNm de TSLPIIL-50 por las células de músculo liso bronquial humano (BSMC) expuestas a varias citocinas se evaluó mediante Taqman® y ELISA tras el tratamiento de células con varias citocinas, como se describe 25 en Soumelis, y col., (2002) Nature Immunol. 3:673-680; Reche, y col., (2001) J. Immunol. 167:336-343). La expresión de los niveles de ARNm se ajustó como unidades relativas a la expresión de ARN 18s. Las células se trataron con solo medio, IL-1-alfa, IL-1beta, TNF-alfa, o la combinación de IL-1 beta y TNF-alfa, a concentraciones de 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, or 10 ng/ml en distintas mezclas de incubación. Los resultados del ELISA mostraron patrones similares en los que la combinación de IL-1 beta y TNF-alfa produjo la expresión más elevada de TSLP/IL

30 50 en BSMC. Los resultados de los Taqman y ELISA se resumen en la Tabla 1A.

La producción de IL-8 de las células estromales se usó como control (Tabla 1B). Una comparación en las cuatro líneas celulares analizó las diferencias reveladas en tendencias en la expresión de TSLP-IL-50 y la expresión de IL8, lo que indica que los mecanismos que conducen a la expresión de TSLP-IL-50 y de IL-8 no son idénticos.

Tabla 1A. Expresión de ARNm de TSLP-IL-50 y proteína de células estromales. TRATAMIENTO (ND; no 35 determinado)

Células: Técnica IL-1 alfa IL-1 beta TNF-alfa IL-1 beta + TNF-alfa

BSMC: Taqman 321 x 10-7 418 x 10-7 858 x 10-7 927 x 10-7

ELISA (ng/ml): 0,73 0,16 0,13 0,90

NHLF: Taqman 18 x 10-7 ND ND 21 X 10-7

ELISA (ng/ml): 0,06 ND ND 0,10

NHEK: Taqman 12 x 10-7 ND ND 10 x 10-7

ELISA (ng/ml): 0,012 ND ND 0,017

MRC5: Taqman 54 x 10-7 ND ND 130 x 10-7

ELISA (ng/ml): 0,17 ND ND 0,09

Tabla 1B. Expresión de ARNm de IL-8 y proteína de células estromales. TRATAMIENTO (ND; no determinado)

Células: Técnica IL-1 alfa IL-1 beta TNF-alfa IL-1 beta + TNF-alfa

BSMC: Taqman 730 x 10-4 292 x 10-4 118 x 10-4 1331 x 10-4

ELISA (ng/ml): 16 32 14 31

NHLF: Taqman 340 x 10-4 ND ND 345 X 10-4

ELISA (ng/ml): 41 ND ND 36

NHEK: Taqman 2,6 x 10-4 ND ND 5,2 x 10-4

ELISA (ng/ml): 0 ND ND 1,1

MRC5: Taqman 156 x 10-4 ND ND 411 x 10-4

ELISA (ng/ml): 104 ND ND 36

Mediante pruebas distintas se demostró que el tratamiento con IL-13 (25 ng/ml; 8 h) estimulaba los fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF) y los fibroblastos dérmicos humanos normales para que expresaran TSLP/IL-50, mientras que el tratamiento con IL-17 (25 ng/ml; 8 h) provocaba la expresión de TSLP/IL-50 en células

5 SMC y fibroblastos dérmicos humanos normales. La expresión en respuesta a la IL-13 o la IL-17 no se detectó en, por ejemplo, los queratinocitos epidérmicos humanos normales.

B. Amígdalas inflamadas.

Para determinar si los tejidos humanos inflamados, como las amígdalas, expresan la proteína hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) se investigó la inmunohistología. Las muestras se tiñeron usando el mAb 6NE0112F3, que reconoce 10 específicamente TSLP/IL-50. Las amígdalas humanas contienen epitelio de las criptas, que reviste las criptas y que con frecuencia alojan virus y bacterias y representa los puntos de entrada de antígenos e inflamación constitutiva, y epitelio escamoso, que reviste la superficie de las amígdalas. Entre las cinco muestras de amígdalas diferentes se encontró que la hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) se expresaba constitutivamente en las células epiteliales de las criptas, que están en contacto estrecho con los linfocitos CD-LAMP y células dendríticas activadas. Es interesante el hecho

15 de que en todas las muestras de amígdalas, solo se encontraron algunos focos pequeños de expresión de hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) dentro de la parte apical del epitelio escamoso. La expresión de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) se asoció con la infiltración de CD activadas positivas CD-LAMP y la pérdida concurrente de células de Langerhans positivas a langerina dentro del epitelio escamoso. La hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) contribuye a la inflamación constitutiva dentro del epitelio de la cripta y la inflamación esporádica dentro del epitelio escamoso.

20 C. Queratinocitos en la dermatitis atópica.

Para investigar si la expresión de hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) estaba asociada con la inflamación alérgica de tipo TH2 in vivo se analizó la expresión de la proteína hTSLP/IL-50 en lesiones cutáneas, incluida dermatitis atópica (una enfermedad alérgica mediada por TH2), dermatitis de contacto inducida por níquel (una enfermedad alérgica mediada por linfocitos T CD8+ productores de IFN-gamma) y lupus eritematoso diseminado (una enfermedad 25 mediada por TH1). Aunque no se detectó hTSLP/IL-50 en piel normal y en piel no dañada de dermatitis atópica, se encontró una expresión elevada de hTSLP/IL-50 en queratinocitos de dermatitis atópica aguda (4 pacientes) y crónica (6 pacientes). La expresión de hTSLP/IL-50 se encontró principalmente en queratinocitos de las capas apicales de la epidermis, que varía desde focos pequeños a toda el área apical en la dermatitis atópica tanto aguda como crónica. No se encontró hTSLP/IL-50 en lesiones cutáneas de dermatitis de contacto por alergia inducida por

30 níquel y lupus eritematoso diseminado.

VI. Migración y activación de células de Langerhans

Para investigar si la expresión de hTSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) en dermatitis atópica se asocia con la activación de CD, la hTSLP/IL-50 se tiñó junto con langerina (un marcador de células de Langerhans) o C—LAMP (un marcador de la activación de las CD) mediante inmunohistología doble. En piel normal, o piel no dañada de dermatitis atópica, 35 se encontraron muchas células de Langerhans positivas a langerina únicamente dentro de la epidermis pero no en la dermis, y no se encontraron CD CD-LAMP+ ni en la epidermis ni en la dermis. La fuerte expresión de hTSLP/IL-50 en la dermatitis atópica se asoció con la desaparición de las células de Langerhans positivas a langerina dentro de la epidermis y la aparición simultánea de muchas CD CD-LAMP+ en la dermis. Muchas de las CD CD-LAMP+ en la dermis expresan langerina, lo que muestra que las células de Langerhans de la epidermis se activan y migran a la

40 dermis. Por tanto, la expresión de hTSLP/IL-50 por los queratinocitos de la dermatitis atópica contribuye directamente a la activación de las células de Langerhans, que migran a los ganglios linfáticos drenantes y provocan respuestas TH2 específicas de alérgeno.

VII. Expresión de TSLP/IL-50 por células humanas.

La expresión de TSLP/IL-50 se determinó mediante Taqman®, como se ha descrito anteriormente. La expresión relativa de TSLP/IL-50 en las células indicadas fue: Fibroblastos pulmonares cultivados (++++); músculo liso bronquial cultivado (++++); células estromales de la próstata (++); células estromales de mama (+); células

5 epiteliales de mama (+); hepatofibroblastos (+); queratinocitos cutáneos (+).

La expresión de TSLP/IL-50 también se determinó mediante procedimientos histológicos. Las células epiteliales tímicas se tiñeron con anticuerpo anti-TSLP/IL-50 marcado, como se describe en Soumelis, y col., anteriormente. La TSLP/IL-50 no se detectó en queratinocitos de piel normal y en piel no dañada de dermatitis atópica, aunque se encontró una expresión elevada en queratinocitos de dermatitis atópica aguda y crónica En la piel normal, no se

10 encontró expresión en las glándulas sudoríparas, glándulas ecrinas y folículos pilosos. La expresión de TSLP/IL-50 también se observó en células epiteliales tímicas (corpúsculos de Hassal) determinado mediante histología.

VIII. CD tratadas con hTSLP/IL-50 alogénicas y autólogas inducen proliferación de linfocitos T CD4+ no expuestos previamente

Los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente se expusieron a células dendríticas alogénicas preparadas según

15 una de cinco concisiones de prueba diferentes seguidos de la evaluación de la proliferación de los linfocitos T. Las cinco condiciones se describen en la Tabla 2. La proliferación se determinó mediante ensayos de incorporación de3H-timidina. En reacciones alogénicas, las CD tratadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) produjeron el mayor incremento de proliferación de linfocitos T, mientras que las CD tratadas con otros agentes dieron como resultados menos o mucha menos proliferación de linfocitos T.

20 Se analizaron las interacciones celulares autólogas, en las que las células dendríticas CD 11c+ y los linfocitos T CD4+ procedían del mismo donante humano (Tabla 2). De nuevo, el uso de CD tratadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) produjeron el mayor incremento de proliferación de linfocitos T, mientras que otras preparaciones de CD produjeron menores niveles de proliferación de linfocitos T.

Tabla 2

Incremento de la proliferación de los linfocitos T CD4+ con reacciones alogénicas y autólogas.

CONDICIÓN DE LA PRUEBA: Incremento del número de linfocitos T CD4+

ALOGÉNICAS: AUTÓLOGAS

1. Células dendríticas (CD) tratadas con TSLP/50: 8,5 veces 5,5 veces

2. Lipopolisacárido (LPS): 3,6 1,0

3. CD tratadas con CD40L: 3,3 1,8

4. CD tratadas con IL-7: 1,7 1,3

5. CD tratadas con medio: 1,0 1,0

25 IX. Las CD tratadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) estimulan la proliferación de linfocitos T CD4+ no expuestos previamente.

Las CD activadas con TSLP/IL-50 se mezclaron con linfocitos T CD4+ no expuestos previamente autólogos, seguido de una evaluación del perfil de la subespecie del receptor de linfocitos T en el grupo de linfocitos T en proliferación expandidos. Las subespecies de receptor de linfocitos T analizadas fueron TCRV�1, TCRV�2, TCRV�3, TCRV�5, 30 TCRV�8, TCRV�14, TCRV�17, TCRV�22 y TCRV�23. Se usaron tres tipos de incubaciones control: (1) Linfocitos T sin tratar; (2) Linfocitos T tratados con IL-7; y (3) Linfocitos T tratados con CD activadas con la endotoxina B de Streptococcus. La población de linfocitos T control sin tratar contenía subespecies del receptor de células T tal como se indica: TCRV�1 (aproximadamente 3%), TCRV�2 (aproximadamente 8%), TCRV�3 (aproximadamente 6%), TCRV�5 (aproximadamente 2%), TCRV�8 (aproximadamente 4%), TCRV�14 (aproximadamente 2,5%), TCRV�17 35 (aproximadamente 7%), TCRVp22 (aproximadamente 2,5%), and TCRV�23 (aproximadamente 0,2%). Los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente tratados con CD activadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) (Experimental), seguido de incubación para permitir la proliferación de los linfocitos T exhibieron un perfil de subespecie de receptores de linfocitos T que era muy similar a la encontrada con los linfocitos T no cultivados. Los similares perfiles encontrados en los linfocitos T no cultivados y en los linfocitos T tratados con CD activadas con TSLP/IL-50

40 demostraron que se había producido expansión policlonal de los linfocitos T. La incubación control con IL-7 (sin CD) también dio como resultado expansión policlonal de los linfocitos T, mientras que la incubación control con CD tratadas con endotoxina tuvo como resultado la expansión seleccionada de los linfocitos T portadores de TCRV�3 y TCRV�17.

X. La expansión de linfocitos T mediada por TSLP/IL-50 es duradera.

Las CD tratadas con TSLP/IL-50 se incubaron con linfocitos T CD4+ no expuestos previamente autólogos, seguido de la evaluación del número de células a t = 0, 6, 9, 12, 15, 18, y 21 días. Con la exposición a las CD activadas con TSLP/IL-50, el número de linfocitos T se multiplicó por 10 el día 15, seguido de un descenso del número de células a puntos temporales posteriores. Las incubaciones control usaron linfocitos T CD4+ no expuestos previamente expuestos a CD activadas por IL-7, a CD activadas por LPS, a CD activadas por poli I:C, a CD activadas por CD40L y a CD tratadas con medio. Esencialmente todas las incubaciones control tuvieron como resultado poco o ningún incremento del número de linfocitos T, aunque se encontró un incremento por 3 veces del número de linfocitos T el día 6 con CD activadas por LPS.

XI. Alteración del fenotipo de los linfocitos T

Se determinó el fenotipo de los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente antes y después del tratamiento con CD activadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1). El fenotipo se evaluó midiendo los siguientes marcadores en los linfocitos

T: CD45RA; CD45RO; CD25; CD62L; y CCR7.

Los linfocitos T no expuestos previamente tienen el fenotipo CD45RA+, CD45RO-, CD25-, CD62L+, y CCR7+; los linfocitos T de memoria centrales tienen el fenotipo CD45RA-, CD45RO+, CD25+/-, CD62L+, y CCR7+; y los linfocitos T de memoria efectores tienen el fenotipo CD45RA-, CD45RO+, CD25+/-, CD62L+/-, y CCR7-. Los linfocitos T CD4+ activados con CD tratadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) tenían el fenotipo de los linfocitos T de memoria centrales.

Las incubaciones control revelaron que el tratamiento con linfocitos T CD4+ no expuestos previamente con IL-7, pero sin CD, tuvieron como resultado ausencia de cambios en el fenotipo. El tratamiento de linfocitos T CD4+ no expuestos previamente con CD más IL-2 tuvo como resultado linfocitos T del fenotipo CD45RA-, CD45RO+, CD25+, CD62L+, y CCR7+/-.

Los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente fueron expuestos a CD activadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1), seguido de la expansión de los linfocitos T. La población de los linfocitos T expandidos se analizó para determinar la secreción de las siguientes citocinas: IL-2, IFN-gamma, IL-10, IL-4, IL-5, y IL-13. Por tanto, los resultados demostraron una elevada secreción de IL-2, baja secreción de IL-5 e IL-13, y poca o ninguna secreción de IFNgamma, IL-10, e IL-4. Los linfocitos T CD4+ T expandidos carecen de una función efectora inmediata.

Los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente fueron expuestos a CD activadas con TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1), alogénica, seguido de la expansión de los linfocitos T y se evaluó la secreción de las citocinas anteriores. Los resultados demostraron una secreción elevada de IL-2, IL-4, IL-5, and IL-13, y secreción baja de IFN-gamma, lo que indica que los linfocitos T CD4+ expandidos alogénicos tenían un perfil de citocinas de tipo TH2. La expresión de las citocinas identificadas anteriormente se puede usar en la detección de reacciones autólogas o alogénicas o afecciones patológicas que implican a CPA activadas con TSLP/IL-50.

El uso de linfocitos T expandidos mediante reacción autóloga en lugar de reacción alogénica podría ser preferido terapéuticamente cuando no se desea una respuesta efectora inmediata, por ejemplo una respuesta inflamatoria.

Los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente se exponen a CD activadas por TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) autólogas y se tratan con anti- CD3 más anti-CD28, junto con anti-IL-4 más IL-12 (reactivos conocidos que estimulan un perfil de TH1), el resultado es linfocitos T que secretan grandes cantidades de IFN-gamma, pero niveles bajos de IL-2, IL-4, IL-10 e IL-13, es decir células efectoras con un perfil TH1.

Por tanto, los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente expuestos a CD activadas por TSLP/IL-50 autólogas pueden carecer de función efectora inmediata, pero se pueden estimular para diferenciarse en células efectoras mediante estimulación secundaria. Estos resultados indican que las CD activadas por TSLP/IL-50 autólogas pueden montar una respuesta dependiente de antígeno in vivo, por ejemplo en respuesta a un patógeno.

Los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente se trataron durante siete días con CD activadas con TSLP/IL-50 autólogas, seguido de lavado de las células. Después se titularon las células con anti-CD3 con niveles constantes de anti-CD28, con el fin de producir la señalización del TCR. Como control, los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente también se titularon con anti-CD3 con niveles constantes de anti-CD28. Las mezclas de incubación separadas contenían anti-CD3 a 0,0001, 0,0003, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, o 10,0 microgramos/ml, mientras que todas las incubaciones contenían anti-CD28 a un nivel constante de 1,0 microgramos/ml. La proliferación de los linfocitos T se midió mediante incorporación de 3H-timidina. Los resultados demostraron que los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente se estimulaban al máximo para proliferar con anti-CD28 a aproximadamente 3,0 microgramos/ml, con poca o ninguna estimulación con niveles menores de anti-CD28. Por el contrario, los linfocitos T CD4+ no expuestos previamente tratados con CD activadas por TSLP/IL-50 autólogas se estimularon al máximo para proliferar a niveles muy inferiores de anti-CD28, es decir a aproximadamente 0,1 microgramos/ml. Por tanto, los linfocitos T CD4+ expandidos con CD tratadas con TSLP/IL-50 autólogas tienen un umbral de activación reducido.

XII. Las CD activadas por TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) inducen la proliferación de varios linfocitos T CD4+.

CD activadas por TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) se incubaron con:

(1) linfocitos T CD4+ no expuestos previamente autólogos; (2) linfocitos T CD4+ de memoria centrales o (3) linfocitos T CD4+ de memoria efectores autólogos con evaluación de la proliferación de los linfocitos T mediante incorporación de 3H-timidina. Se realizaron incubaciones por separado con CD/linfocitos T a una proporción de 1:1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64. Las incubaciones control incluyeron linfocitos T solo y medio solo. Con la evaluación de la proliferación, se encontró que se producía una proliferación máxima de cada una de las tres poblaciones de linfocitos T con CD/linfocitos T a la proporción de 1:1. La proliferación de los linfocitos T no expuestos previamente fue, en general, de 1,2 a 1,8 veces mayor que la proliferación de los linfocitos T de memoria centrales, mientras que la proliferación de los linfocitos T de memoria centrales fue, en general, aproximadamente 2 veces mayor que la de los linfocitos T efectores.

Los controles incubados con cada uno de los tres tipos de linfocitos T tuvieron como resultado poca o ninguna inducción de la proliferación de linfocitos T.

XIII. Psoriasis y expresión de TSLP/IL-50.

Cada una de las muestras de piel humana normal y piel psoriásica de 10 sujetos diferentes se analizó mediante procedimientos histológicos. La tinción se realizó con anticuerpo anti-TSLP/IL-50 o con anticuerpo IgG2a control (nº cat. M68178; Pharmingen Inc., San Diego, CA), ambos marcados con peroxidasa AEC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Se usaron anticuerpos anti-TSLP/IL-50 de dos clones diferentes, en los que los resultados de ambas fuentes de anti-TSLP/IL 50 fueron consistentes entre sí. La tinción se evaluó en queratinocitos, folículos pilosos y glándulas ecrinas. La tinción de queratinocitos en los diez sujetos normales fue negativa. La tinción de los folículos pilosos y las glándulas ecrinas en diez sujetos normales varió desde negativa a baja. La tinción de los diez sujetos psoriásicos es elevada, en la que la tinción del folículo piloso y de la glándula ecrina fue comparativamente mayor. Los resultados demostraron una asociación significativa entre la expresión de TSLP/IL-50 y la psoriasis.

Identificadores de secuencia

SEC ID Nº 1: es lingopoyetina estromática tímica humana (hTSLP/II,-50).

SEC ID Nº 2: es la cadena alga de IL-7R.

SEC ID Nº 3 : es el receptor de TSLP (TSLPR).

Listado de secuencias

<110> Schering Corporation

<120> Usos de reactivos relacionados con citocinas de mamíferos

<130> DX01477K

<150> 60/353.509

<151>

<160> 3

<170> Patent In versión 3.1

<210> 1

<211> 159

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 371

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un antagonista de TSLP/IL-50 (SEC ID Nº 1) o TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3) para su uso en el tratamiento del asma o la dermatitis atópica; en el que el antagonista es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a TSLP/IL-50 ((SEC ID Nº 1) o TSLP/IL-50R (SEC ID Nº 2, 3) y en el que el antagonista inhibe la producción de linfocitos T de IL-4, IL-5, IL-13 y TNF-alfa.