CN101952435A

CN101952435A - 启动子、启动子控制元件及其组合和用途

Info

Publication number: CN101952435A
Application number: CN2009801054877A
Authority: CN
Inventors: R·施耐伯格; E·马格勒斯-克拉; T·塔塔瑞诺瓦; Y·方; N·亚历山德罗夫; L·梅德拉诺; R·彭内尔; N·赛西斯; D·格利泽; S·戴维斯; D·罗伯斯; M·保特瑞科
Original assignee: Ceres Inc
Current assignee: Ceres Inc
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2009-01-29
Publication date: 2011-01-19
Also published as: CA2713138A1; US9777285B2; US20200392520A1; BRPI0907501B1; US11560569B2; WO2009099899A2; WO2009099899A3; BRPI0907501A2; US20200392521A1; US20180119159A1; US20150007365A1; US10815490B2; US20120124701A1; US11572567B2

Abstract

本发明涉及启动子序列和启动子控制元件、包含所述启动子和控制元件的多核苷酸构建体以及鉴定所述启动子、控制元件或它们的片段的方法。本发明还涉及本发明的启动子或启动子控制元件调控植物中的转录水平的用途以及含有这类启动子或启动子控制元件的植物。

Description

启动子、启动子控制元件及其组合和用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年2月1日提交的在先美国临时申请系列第61/025,697号的优先权，通过引用将其整体内容并入本文。

序列表或表格的引用并入

所附序列表中的材料通过引用并入本申请中。所附的名称为序列_表_2750-1720WO1.txt的文件创建于2008年12月22日，并且为56KB。该文件可以在使用Windows OS的计算机上使用Microsoft Word获得。

技术领域

本发明涉及可用于调控期望的多核苷酸的转录的启动子和启动子控制元件。这种启动子和启动子控制元件可以包括在多核苷酸构建体中、表达盒中、载体中、或插入到染色体中或作为外源元件来调控多核苷酸的体内和体外转录。使用包含本发明的启动子和启动子元件的多核苷酸的具有期望性状或特征的宿主细胞(包括植物细胞)和有机体(例如自其再生的植物)也是本发明的一部分。

背景技术

本发明涉及用于在宿主细胞或转化的宿主生物体中转录多核苷酸的启动子序列和启动子控制元件序列。

向植物中引入基因导致具有如下新的和可用的表型的植物的开发：如病原体抗性、较高水平的更健康类型的油、健康组分的新颖生产，如稻中的β-胡萝卜素合成。引入的基因一般为由赋予期望的性状的编码区和调节序列构成的嵌合基因。一种调节序列是启动子，其位于编码区的5’端。此序列参与调节其编码区3’的表达模式。启动子序列结合RNA聚合酶复合体以及参与产生编码区的RNA转录物的一个或多个转录因子。

植物转化中所用的基因的启动子区最通常来源于与编码区不同的来源。它可以来自相同植物物种的不同基因、来自不同植物物种、来自植物病毒、藻类物种、真菌物种，或者它可以是不同的天然和/或合成序列的复合物。启动子序列的特性一般决定了与启动子可操作地连接的编码区的表达模式。已经描述了具有不同的表达特征的启动子。在广泛使用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的情况下，启动子可以赋予广泛的表达。在种子特异性菜豆蛋白质启动子的情况下，启动子可以赋予组织特异性表达。启动子可以赋予表达发育改变模式。可以通过施加的化学化合物或通过施加于植物的环境条件来诱导启动子。

用于调节具体的编码区的启动子通过该编码区所期望的表达模式来确定，表达模式本身则通过植物中所期望的最终表型来确定。例如，整个植物期望除草剂抗性，所以35S启动子适于除草剂抗性基因的表达。种子特异性启动子适于改变大豆种子的油含量。胚乳特异性启动子适于改变玉米种子的淀粉组成。根特异性启动子可能对于改善植物中的水或养分的摄取很重要。通过启动子控制引入基因的表达很重要，因为在非靶组织中具有引入基因的表达有时是有害的。例如，诱导细胞死亡的基因可以在与生物限制(bioconfinement)有关的雄性和/或雌性配子细胞中表达。

生物技术的一个主要目标是获得具有特定的期望特征或性状的生物体，如植物、哺乳动物、酵母和原核生物。这些特征或性状的实例很丰富并且可以包括：例如，在植物中，病毒抗性、昆虫抗性、除草剂抗性、增强的稳定性或额外的营养价值。在基因工程中的最近进展使得本领域的研究人员能够将多核苷酸序列加入到宿主细胞中以在所选的生物体中获得期望的品质。这种技术容许来自于与所选的生物体不同来源的一种或多种多核苷酸被所选的生物体转录。如果期望，则可以调控这些新多核苷酸在生物体中的转录和/或翻译以表现期望的特征或性状。可选择地，可以产生生物体内源多核苷酸的转录和/或翻译的新模式。

发明内容

本发明涉及分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列包含来自植物尤其拟南芥(Arabidopsis thaliana)的启动子和启动子控制元件以及在植物中有功能的其他启动子和启动子控制元件。

本发明的一个目的是提供分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸是启动子或启动子控制序列。这些启动子序列包含：例如，

(1)具有根据SEQ.ID.No.1-26任一个的核苷酸序列或SEQ ID NO：26的残基601-1000的多核苷酸；

(2)具有与根据SEQ.ID.No.1-26的序列或SEQ ID NO：26的残基601-1000具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸；以及

(3)具有在确定的Tm-5℃的条件下与根据SEQ.ID.No.1-26的序列或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000杂交的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明的启动子或启动子控制元件序列能够调控优先转录。

A框、聚合酶结合位点、起始位点、转录结合位点、增强子、反向重复、基因座控制区和/或支架/基质附着A框、聚合酶结合位点、起始位点、转录结合位点、增强子、反向重复、基因座控制区和/或支架/基质附着区。

本发明的又一目的是提供包含至少第一和第二启动子控制元件的多核苷酸。所述第一启动子控制元件是如上所讨论的启动子控制元件序列，并且所述第二启动子控制元件与所述第一启动子控制元件是异源的；其中，所述第一控制元件与第二控制元件可操作地连接。这种启动子可以调控转录水平，优选是在特定的组织中或在特定的条件下。

在另一实施方式中，本发明的分离的多核苷酸包含如上所述的启动子或启动子控制元件，其中所述启动子或启动子控制元件与待转录的多核苷酸可操作地连接。

在本发明的另一实施方式中，本发明的启动子和启动子控制元件与是调节序列的异源多核苷酸可操作地连接。

本发明的另一目的是提供包含如上所述的分离的多核苷酸或载体或其片段的宿主细胞。宿主细胞包括：例如，细菌、酵母、昆虫、哺乳动物、真菌、藻类和植物。宿主细胞可以包括对基因组外源的启动子或启动子控制元件。这种启动子能够以顺式和反式调控转录。

在又一实施方式中，宿主细胞是能够再生为植物的植物细胞。

本发明的再一实施方式提供包含上文所述的分离的多核苷酸或载体的植物。

本发明的另一目的是提供在含有无细胞的转录系统或含有宿主细胞的样品中调控转录的方法。此方法包括：提供如上所述的根据本发明的多核苷酸或载体以及使所述多核苷酸或载体的样品接触容许转录的条件。

在本发明方法的另一实施方式中，多核苷酸或载体依据具体启动子的功能优选调控：组成性转录、应激诱导性转录、光诱导性转录、黑暗诱导性转录、叶转录、根转录、茎或枝转录、长角果或果实转录、愈伤组织转录、根茎转录、茎节转录、配子组织转录、花转录、未成熟的芽和花序特异性转录、衰老诱导性转录、发芽转录和/或干旱转录。

本发明的一个实施方式涉及包含选自由以下组成的组的核苷酸序列的具有启动子活性的分离的核酸分子：

a.根据SEQ ID NO.1-26中任一个的核苷酸序列；

b.SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000的核苷酸序列；

c.包含(a)或(b)的功能片段的核苷酸序列，其中所述片段具有启动子活性，

并且其中所述分离的核酸分子不为SEQ ID NO：5。

本发明的另一实施方式涉及包含显示出与SEQ ID NO：1-26的任一个或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000至少80％序列同一性的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含指导可操作地连接的异源多核苷酸转录的调节区，并且其中所述分离的核酸分子不为SEQ ID NO：5。

在本发明的另一实施方式中，分离的核酸分子显示与SEQ ID NO：1-26的任一个或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000至少85％的序列同一性。

在本发明的另一实施方式中，分离的核酸分子具有与SEQ ID NO：1-26的任一个或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000至少90％的序列同一性。

在另一实施方式中，分离的核酸分子包含选自由启动子、增强子和内含子组成的组的至少一个成员。

在本发明的又一实施方式中，分离的核酸分子由SEQ ID NO：1-4、SEQID NO：6-26和SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000的任一个构成。

本发明的另一实施方式涉及载体构建体，其包含：

a.如上所述的第一核酸分子；和

b.可转录的多核苷酸分子，

其中所述第一核酸分子和所述可转录的多核苷酸分子彼此是异源的并且被可操作地连接。

NO：26的核酸残基601-1000构成。

在本发明的另一实施方式中，可转录的多核苷酸分子编码多肽。

NO：NO：26的核酸残基601-1000构成。

在本发明的另一实施方式中，可转录的多核苷酸分子以有义方向与所述第一核酸分子可操作地连接。

在本发明的另一实施方式中，可转录的多核苷酸分子被转录成表达由可转录的多核苷酸分子所编码的多肽的RNA分子。

在本发明的另一实施方式中，可转录的多核苷酸分子以反义方向与所述第一核酸分子可操作地连接。

在本发明的另一实施方式中，可转录的多核苷酸分子被转录成反义RNA分子。

在本发明的另一实施方式中，可转录的多核苷酸分子被转录成针对内源基因的干扰RNA。

在本发明的另一实施方式中，可转录的多核苷酸分子编码农学上重要的多肽。

本发明的另一实施方式涉及植物或植物细胞，其包含：

a.与异源多核苷酸可操作地连接的上述核酸分子，或

b.上述载体构建体。

本发明的另一实施方式涉及被上述载体构建体稳定地转化的植物或植物细胞。

本发明的另一实施方式涉及如上所述的植物的种子。

本发明的另一实施方式涉及在适于转录的环境中，通过组合下列物质来指导转录的方法：

a.如上所述的第一核酸分子；和

b.可转录的多核苷酸分子；其中所述第一核酸分子和所述可转录的多核苷酸分子彼此是异源的并且被可操作地连接。

本发明的另一实施方式涉及在植物中表达外源编码区的方法，所述方法包括：

a.用如上所述的载体转化植物细胞，

b.由步骤(a)的转化的植物细胞再生稳定转化的植物；以及

c.选择含有转化的植物细胞的植物，

其中可转录的多核苷酸分子的表达导致由所述可转录的多核苷酸分子所编码的多肽的产生。

本发明的另一实施方式涉及改变植物中基因表达的方法，所述方法包括：

a.用与异源多核苷酸可操作地连接的如上所述的核酸分子转化植物细胞，以及

b.由所述转化的植物细胞再生稳定转化的植物。

本发明的另一实施方式涉及根据上述方法制备的植物。

本发明的另一实施方式涉及来自上述植物的种子。

本发明的另一实施方式涉及产生转基因植物的方法，所述方法包括：

a.向植物细胞中引入：

(i)分离的多核苷酸，其包含与异源多核苷酸可操作地连接的如上所述的核酸，或

(ii)如上所述的载体；以及

b.由所述植物细胞生长植物。

本发明的其他的和另外的目的将由下列说明而清楚或变得明显。

表格和附图简述

表格由本发明的一些启动子的表达报告组成，提供了各启动子的核苷酸序列和转基因植物中所观察到的由各核酸启动子序列所驱动的表达细节。结果被呈现为空间表达的概述，其提供了关于在多种植物器官和组织中的总表达和/或特异性表达的信息。还呈现了观察到的表达模式，其给出了在不同代或一代内的不同发育阶段期间的表达细节。提供了关于启动子的来源生物体以及用于构建体的载体和标记基因的额外信息。下列符号遍及表格被一致地使用：

-T1：第一代转化体

-T2：第二代转化体

-T3：第三代转化体

-(L)：低表达水平

-(M)：中表达水平

-(H)：高表达水平

表格各行以该部分中所发现的数据的标题开始。接着提供在各部分中所发现的数据的描述：

一些启动子报告描述了另外的实验和特定启动子的结果。

附图说明

图1是可用于将本发明的启动子插入植物中的载体pNewbin4-HAP1-GFP的示意性代表图。载体图谱中所用的缩写定义如下：

Ori-大肠杆菌(E.coli)宿主所用的复制起点

RB-来自pMOG800的T-DNA的右缘的序列

BstXI-用于克隆的限制性酶切割位点

HAP1VP16-HAP1和VP16激活结构域的融合蛋白质的编码序列

NOS-来自胭脂氨酸合酶基因的终止区

HAP1UAS-HAP1的上游激活序列

5ERGFP-被优化以定位在内质网中的绿色荧光蛋白质基因

OCS2-来自章鱼碱合酶2基因的终止序列

OCS-来自章鱼碱合酶基因的终止序列

p28716(又称为28716短)-用于驱动PAT(BAR)基因的表达的启动子

PAT(BAR)-赋予除草剂抗性的标记基因

LB-来自pMOG800的T-DNA的左缘的序列

Spec-赋予大观霉素抗性的标记基因

TrfA-转录阻抑因子基因

RK2-OriV-用于农杆菌(Agrobacterium)的复制起点

具体实施方式

提供了下列定义和方法以更好地定义本发明并在本发明的实践中指导本领域的那些普通技术人员。除非另外指明，否则术语应根据相关领域的那些普通技术人员的常规用法来理解。

本文所公开的发明提供了能够驱动可操作地连接的转基因的表达的启动子。这些启动子的设计、构建和使用是本发明的一个目的。启动子序列SEQ ID NO：1-26和SEQ ID NO：26的残基601-1000能够在特定的植物组织/器官中或在特定的植物生长阶段期间转录可操作地连接的核酸分子，并且因此可以在这些组织/器官中或在植物发育的这些时间选择性地调节转基因的表达。

1.定义

嵌合的：术语“嵌合的”用于描述多核苷酸或基因或构建体，其中所述多核苷酸或基因或构建体的至少两个元件如启动子和待转录的多核苷酸和/或其他调节序列和/或填充序列(filler sequence)和/或它们的互补序列彼此异源的。

广泛表达的启动子：在本文称为“广泛表达的启动子”的启动子有效地促进在大多数但不必是所有的环境条件下和发育或细胞分化状态下的转录。广泛表达的启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区和源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′或2’启动子以及那些技术人员所已知的来自多种植物基因的其他转录起始区，如玉米泛素-1启动子。

结构域：结构域是可用于表征蛋白质家族和/或蛋白质的部分的指纹或标志。这种指纹或标志可以包括保守的(1)一级序列、(2)二级结构和/或(3)三维构象。可将类似的分析应用于多核苷酸。一般地，各结构域与保守的一级序列或序列基序相关。一般地，这些保守的一级序列基序与特异性的体外和/或体内活性相关。结构域可以为任何长度，包括待转录的整个多核苷酸。结构域的实例包括但不限于：AP2、解旋酶、同源框、锌指等。

内源：在本发明内容之内的术语“内源”是指是细胞或由该细胞再生的一个或多个生物体的天然部分的任何多核苷酸、多肽或蛋白质序列。在启动子的上下文中，术语“内源编码区”或“内源cDNA”是指与该启动子天然地可操作连接的编码区。

增强子/阻抑制子：“增强子”是可以增加转录物的稳态水平的DNA调节元件，其通常通过增加转录起始的速率进行。增强子通常发挥其作用而与增强子相对于转录起始位点的距离、上游或下游位置或方向无关。相反，“阻抑制子”是降低转录物的稳态水平的相应DNA调节元件，其通常也是通过响转录起始的速率进行的。强子和阻抑制子元件的基本活性是结合蛋白质因子。这种结合可以通过例如下面所述的方法测定。该结合通常以响细胞中或体外转录提取物中的转录物稳态水平的方式进行。

外源：如其中所提到的“外源”是以通过非有性杂交的任何方法被引入到宿主细胞或由所述宿主细胞再生的生物体的基因组中的任何多核苷酸、多肽或蛋白质序列，无论是嵌合的或非嵌合的。这可被实现所借助的方法的实例在下面描述并且包括农杆菌介导的转化(对于双子叶植物-例如，Salomon等人(1984)EMBO J.3：141；Herrera-Estrella等人(1983)EMBO J.2：987；对于单子叶植物，代表性的论文为Escudero等人(1996)Plant J.10：355)；Ishida等人(1996)Nature Biotech 14：745；May等人(1995)Bio/Technology 13：486)的那些论文；生物射弹法(Armaleo等人(1990)Current Genetics 17：97)；电穿孔；株技术(in planta technique)以及类似方法。这种含有外源核酸的植物的原代转基因植物在此称为T₀，并且第一代称为T₁。本文所用的术语“外源”还旨在涵盖将天然存在的元件插入到非天然存在的位置中。

异源序列：“异源序列”是本质上彼此未被可作地连接或者不是连续的的那些序列。例如，来自玉米的启动子被认为对拟南芥编码区序列是异源的。而且，来自编码玉米的生长因子的基因的启动子被认为对编码生长因子的玉米受体的序列是异源的。本质上不来源于与编码序列相同的基因的调节元件序列(诸如UTR或3′末端序列)被认为对所述编码序列是异源的。彼此本质上可作地连接并且连续的元件对彼此不是异源的。另一方面，这些相同的元件之间如果放入其他填充序列，则它们保持可作地连接但是变为异源的。因此，表达氨基酸运载蛋白的玉米基因的启动子和编码序列对彼此不是异源的，但是以新颖的方式可作地连接的玉米基因的启动子和编码序列是异源的。

同源：在本发明中，“同源”多核苷酸是指与感兴趣的多核苷酸具有序列相似性的多核苷酸。这种相似性可以仅在序列的片段中并且通常代表功能结构域，例如实例包括但不限于DNA结合结构域或具有酪氨酸激酶活性的结构域。同源多核苷酸的功能活性并非必须相同。

诱导型启动子：在本发明上下文中的“诱导型启动子”是指活性受如下的某些条件影响的启动子：如光、温度、化学物质浓度、蛋白质浓度、生物体状态、细胞或细胞器等。可用于本发明的多核苷酸的诱导型启动子的典型实例是PARSK1，它是来自编码丝氨酸-苏氨酸激酶的拟南芥基因的启动子，并且该启动子是通过脱水、脱落酸和氯化钠诱导的(Wang和Goodman(1995)Plant J.8：37)。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括：缺氧条件、升高的温度、养分或其他化合物存在与否或光的存在。

异常表达：术语“异常表达”是指与野生型相比编码区转录成互补RNA序列的增加或减少。该术语还涵盖与野生型和/或来自植物基因组中的非天然位置的基因或编码区相比持续不同时间的基因或编码区的表达和/或翻译或这种转录和/或翻译的抑制，包括来自不同植物物种或来自非植物生物体的基因或编码区。

调控转录水平：如本文所用的短语“调控转录”描述启动子序列或启动子控制元件的生物活性。这种调控包括但不限于：转录起始、转录速率和/或转录水平的上调和下调。

可操作的连接：“可操作的连接”是其中启动子序列或启动子控制元件与一个多核苷酸序列(或多个多核苷酸序列)以将该多核苷酸序列的转录放置在该启动子或启动子控制元件的影响或控制之下的方式相连的连接。两种DNA序列(如待转录的多核苷酸和与待转录的多核苷酸的5’端连接的启动子序列)在下列情况下被说成是可操作地连接的：如果启动子功能的诱导导致编码该多核苷酸的mRNA转录并且如果在这两种DNA序列之间的连接的性质不会(1)导致移码突变的引入；(2)干扰启动子序列指导蛋白质、反义RNA、RNAi或核酶的表达的能力；或(3)干扰DNA模板被转录的能力。因此，如果启动子能够影响多核苷酸序列的转录，则该启动子序列与该多核苷酸序列可操作地连接。

序列同一性百分比如本文所用术语“百分比序列同一性”是指在任何给定的查询序列如SEQ ID NO：1-26与主题序列之间相同的程度。主题序列通常具有查询序列长度的约80％至250％的长度，例如查询序列长度的82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、或120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％或250％。使用计算机程序ClustalW(1.83版，缺省参数)将查询核酸或氨基酸序列与一种或多种主题核酸或氨基酸序列比对，该程序容许核酸或蛋白质序列沿它们的整个长度进行比对(总体比对)。Chenna等人(2003)Nucleic Acids Res.31(13)：3497-500。

ClustalW计算查询序列与一个或多个主题序列之间的最佳匹配，并对它们进行比对以便可以确定同一性、相似性和差异。可以将一个或多个残基的空位(gap)插入到查询序列、主题序列或两者中以将序列比对最大化。对于核酸序列的快速成对比对，使用下列缺省参数：定序列长度(word size)：2；单位比对长度(window size)：4；评分方法：百分比；上对角线数(number of top diagonal)：4；和空位罚分：5。对于多个核酸序列的比对，使用下列参数：空位开放罚分(gap opening penalty)：10.0；空位延伸罚分(gap extension penalty)：5.0；和加权转变(weight transition)：是(yes)。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用下列参数：定序列长度：1；单位比对长度：5；评分方法：百分比；上对角线数：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用下列参数：加权矩阵(weight matrix)：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水空位：开(on)；亲水残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异性空位罚分：开。输出结果为反映序列之间的关系的序列比对。ClustalW可以在万维网上的贝勒医学院检索网站(Baylor College of Medicine Search Launcher website)和欧洲生物信息学研究所网站(European Bioinformatics Institute website)运行。

为了确定主题多肽或核酸序列与查询序列的百分比同一性，使用Clustal W比对序列，将比对中的相同匹配的数目除以查询序列的长度，并将结果乘以100。输出结果为主题序列相对于查询序列的百分比同一性。应注意，百分比同一性值可以四舍五入至最接近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14被四舍至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19被五入至78.2。

植物启动子：“植物启动子”是能够启动植物细胞中的转录并且可以调控多核苷酸的转录的启动子。这种启动子不需要是植物来源的。例如，源自植物病毒的启动子如CaMV35S启动子或如T-DNA启动子的来自根癌农杆菌的启动子可以是植物启动子。植物来源的植物启动子的典型实例为本领域的那些技术人员已知的玉米泛素-1(ubi-1)启动子。

植物组织：术语“植物组织”包括分化的和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、枝、根茎、子叶、上胚轴、下胚轴、叶、花粉、种子、瘿组织和各种形式的培养细胞，如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可以在植物中或者在器官、组织或细胞的培养物中。

优先转录：“优先转录”定义为在特定模式的细胞类型或发育时间或响应于特定的刺激物或它们的组合而发生的转录。优先转录的非限制性实例包括：根组织中期望序列的高转录水平；在胚胎发生期间某些细胞类型中期望序列的可检测的转录水平；以及在干旱条件下期望序列的低转录水平。这种优先转录可以通过测量转录的起始、速率和/或水平来测定。

启动子：“启动子”是指导多核苷酸的转录的DNA序列。通常，启动子位于待转录的多核苷酸的5’区中，接近该多核苷酸的转录起始位点。更通常地，启动子被定义为第一外显子的上游的区域；更通常地，被定义为多个转录起始位点的第一个的上游区域；更通常地，被定义为前面基因的下游且在多个转录起始位点的第一个的上游的区域；更通常地，多聚A信号的下游且在多个转录起始位点的第一个的上游的区域；甚至更通常地，第一外显子的ATG的上游的约3,000个核苷酸；甚至更通常地，多个转录起始位点的第一个的上游的2,000个核苷酸。本发明的启动子包含至少一个如上所定义的核心启动子。通常，启动子能够指导位于该启动子的3’端的各互补DNA链上的基因转录。换言之，许多启动子表现出双方向性，并且能够在以任一方向(即，相对于基因的编码区为5’至3’或3’至5’)存在时指导下游基因的转录。另外，启动子还可以包含至少一个控制元件，如上游元件。这种元件包括UAR和任选的影响多核苷酸转录的其他DNA序列，如合成的上游元件。

启动子控制元件：如本文所用的术语“启动子控制元件”描述影响启动子的活性的元件。启动子控制元件包括转录调节序列决定子，例如但不限于：增强子、支架/基质附着区、TATA框、转录起始基因座控制区、UAR、URR、其他转录因子结合位点和反向重复。

公开序列：如用于本申请上下文中的术语“公开序列”是指在本申请的申请日之前已保藏在可以公开得到的数据库中的任何序列。此术语涵盖了氨基酸序列和核苷酸序列二者。这种序列可以在例如NCBI FTP网站上的BLAST数据库上公开获得(经由因特网获得)。NCBI FTP网站的数据库利用由NCBI指定的“gi”编号作为数据库中每个序列的独特标识，从而提供了来自包括下列数据库的多个数据库的序列的非冗余数据库：GenBank、EMBL、DBBJ(日本的DNA数据库)和PDB(Brookhaven蛋白质数据库)。

调节区：术语“调节区”是指当可操作地连接至序列上时影响所述序列的转录起始或翻译起始或转录终止以及所述过程的速率和/或转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列。如本文所用的术语“可操作地连接”是指能够达成所述影响的调节区和所述序列的定位。调节区包括但不限于：启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导元件、蛋白质结合序列、5′和3′非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多聚腺苷酸化序列和内含子。

SEQ ID NO：1-26中所列的核酸序列是本文所提供的调节区的实例。然而，调节区可以具有衍生自SEQ ID NO：1-26中所列的核苷酸序列同时保留了指导可操作地连接的核酸表达的能力。例如，与SEQ ID NO：1-25或SEQ ID NO：26中所列的核苷酸序列具有80％或更高(例如，85％或更高、90％或更高91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或99％或更高)的序列同一性的调节区可以指导可操作地连接的核酸的表达。

调节区还可以是SEQ ID NO：1-25或SEQ ID NO：26的片段同时保留启动子的活性，即能够指导可操作地连接的核酸的表达。调节区的其他实例在序列表中标出。

调节区可以被分为两类：启动子和其他调节区。

调节序列：如本发明中所用的术语“调节序列”是指影响转录或翻译的起始和速率或者转录物或多肽产物的稳定性和/或移动性的任何核苷酸序列。调节序列包括但不限于：启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导元件、启动子控制元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多聚腺苷酸化序列、内含子、氨基酸编码序列内的某些序列(如分泌信号)、蛋白酶切割位点等。

基因的5′非翻译区(5′UTR)一般定义为在信使RNA或cDNA的转录起始位点(TSS)与编码序列起始位点(ATG密码子)之间的多核苷酸区段。可选择地，5’UTR可以为合成产生的或处理的DNA元件。“植物5’UTR”可以是在植物细胞中有功能的固有的或非固有的5’UTR。5’UTR可以用作5′调节元件来调控可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达。例如，已证明源自热休克蛋白基因的5′UTR增强植物中的基因表达(参见例如，美国专利第5,659,122号和美国专利第5,362,865号，它们全部都通过引用并入本文)。5’UTR的实例包括在SEQ ID NO：1-4、SEQ ID NO：6-10、SEQ IDNO：13-26中显示的那些。

特异性启动子：在本发明的上下文中，“特异性启动子”是指对调控在特定组织、或器官或细胞中和/或在生物体发育期间的特定时间的转录水平具有高度偏好的启动子亚类。所谓“高度偏好”意指与考虑的任何其他参考条件下的转录相比在特定条件下转录水平增加了至少3倍，优选5倍，更优选至少10倍，甚至更优选至少20倍、50倍或100倍。可用于本发明的多核苷酸的植物来源的时序特异性和/或组织特异性或器官特异性启动子的典型实例是：PTA29，能够驱动特别是在绒毡层和仅在花药发育期间的基因转录的启动子(Koltonow等人(1990)Plant Cell 2：1201；RCc2和RCc3，指导稻中的根特异性基因转录的启动子(Xu等人(1995)Plant Mol.Biol.27：237；TobRB27，来自烟草的根特异性启动子(Yamamoto等人(1991)PlantCell 3：371)。受发育控制的组织特异性启动子的实例包括仅在某些组织或器官如根、胚珠、果实、种子或花中启动转录的启动子。其他特异性启动子包括来自编码种子储藏蛋白或脂质体膜蛋白、油质蛋白的基因的那些启动子。几种根特异性启动子在上面提到。还参见“优先转录”。

调节区可以含有保守的调节基序。这种调节区可以是SEQ ID NO：1-26中所列的序列的任一种；或是具有衍生自SEQ ID NO：1-26中所列的任一种的核苷酸序列同时保留指导可操作地连接的核酸表达的能力的调节区。例如，调节区可以含有CAAT框或TATA框。CAAT框是参与转录起始的保守核苷酸序列。CAAT框充当称为转录因子的调节蛋白的识别和结合位点。TATA框是参与转录起始的另一保守核苷酸序列。TATA框似乎对于准确地确定转录起始的位置而言很重要。

其他保守的调节基序可以使用本领域中已知的方法鉴定。例如，调节区可以使用dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html的万维网上的PLACE(PLAnt顺式作用调节DNA元件)网络信号扫描程序(Web Signal Scan program)来分析。参见Higo等人，Nucleic Acids Research，27(1)：297-300(1999)；和Prestridge，CABIOS，7：203-206(1991)。保守的调节基序的实例可以见于dna.affrc.go.jp/PLACE/的万维网上的PLACE数据库中。参见，Higo等人，如上。

诸如SEQ ID NO：1-26的任一个的调节区或具有衍生自SEQ ID NO：1-26中所列的那些序列的核苷酸序列同时保留指导可操作地连接的核酸表达的能力的调节区可以含有一个或多个保守的调节基序，该基序可见于PLACE数据库中。例如，这种调节区可以含有具有共有序列TGTAAAG的-300CORE基序。参见，Forde等人，Nucleic Acids Res 13：7327-7339(1985)；Colot等人，EMBO J 6：3559-3564(1987)；Thomas和Flavell，Plant Cell 2：1171-1180(1990)；Thompson等人，Plant Mol Biol 15：755-764(1990)；Vicente-Carbajosa等人，Proc Natl Acad Sci USA 94：7685-7690(1997)；Mena等人，Plant J 16：53-62(1998)；Shing，Plant Physiol 118：1111-1120(1998)。这种调节区可以含有具有共有序列YACGTGGC的ABREATCONSENSUS基序。参见Choi等人，J Biol Chem 275：1723-1730(2000)；Kang等人，Plant Cell 14：343-357(2002)；Oh等人，Plant Physiology 138：341-351(2005)；Choi等人，Plant Physiol 139：1750-1761(2005)。这种调节区可以含有具有共有序列RYACGTGGYR的ABREATRD22基序。参见Iwasaki等人，Mol Gen Genet 247：391-398(1995)；Bray，Trends in Plant Science 2：48-54(1997)；Busk和Pages，Plant Mol Biol 37：425-435(1998)。调节区可以含有具有共有序列ACGTG的ABRELATERD1基序。参见Simpson等人，Plant J 33：259-270(2003)；Nakashima等人，Plant Mol Biol 60：51-68(2006)。调节区可以含有具有共有序列TACGTGTC的ABREMOTIFAOSOSEM基序。参见Hattori等人，Plant J 7：913-925(1995)；Hobo等人，Proc Natl Acad Sci USA 96：15348-15353(1999)。调节区可以含有具有共有序列MACGYGB的ABRERATCAL基序。参见Kaplan等人，Plant Cell 18：2733-2748(2006)。调节区可以含有具有共有序列GACGTC的ACGTCBOX基序。参见Foster等人，FASEB J 8：192-200(1994)；Izawa等人，Plant Cell 6：1277-1287(1994)；Izawa等人，J Mol Biol 230：1131-1144(1993)。调节区可以含有具有共有序列GTACGTG的ACGTOSGLUB1基序。参见Washida等人，Plant Mol Biol 40：1-12(1999)；Wu等人，Plant J 23：415-421(2000)。调节区可以含有具有共有序列AACGTT的ACGTTBOX基序。参见Foster等人，FASEB J8：192-200(1994)。调节区可以含有具有共有序列CCACCAACCCCC的ACIIPVPAL2基序。参见Patzlaff等人，Plant Mol Biol 53：597-608(2003)；Hatton等人，Plant J 7：859-876(1995)；Gomez-Maldonado等人，Plant J39：513-526(2004)。调节区可以含有具有共有序列NNWNCCAWWWWTRGWWAN的AGL2ATCONSENSUS基序。参见Huang等人，Plant Cell 8：81-94(1996)。调节区可以含有具有共有序列TATCCAT的AMYBOX2基序。参见Huang等人，Plant Mol Biol 14：655-668(1990)；Hwang等人，Plant Mol Biol 36：331-341(1998)。调节区可以含有具有共有序列AAACAAA的ANAERO1CONSENSUS基序。参见Mohanty等人，Ann Bot(Lond).96：669-681(2005)。调节区可以含有具有共有序列RGTGACNNNGC的ARE1基序。参见Rushmore等人，J Biol Chem 266：11632-11639(1991)。调节区可以含有具有共有序列CAATTATTA的ATHB6COREAT基序。参见Himmelbach等人，EMBO J 21：3029-3038(2002)。调节区可以含有具有共有序列TGACGTAA的AUXRETGA1GMGH3基序。参见Liu等人，Plant Cell 6：645-657(1994)；Liu等人，Plant Physiol 115：397-407(1997)；Guilfoyle等人，Plant Physiol 118：341-347(1998)。调节区可以含有具有共有序列ACGTGGC的BOXIIPCCHS基序。参见Block等人，Proc Natl Acad Sci USA 87：5387-5391(1990)；Terzaghi和Cashmore，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 46：445-474(1995)；Nakashima等人，Plant Mol Biol 60：51-68(2006)。调节区可以含有具有共有序列ACCWWCC的BOXLCOREDCPAL基序。参见Meada等人，Plant Mol Biol 59：739-752.(2005)。调节区可以含有具有共有序列CACGCAAT的CACGCAATGMGH3基序。参见Ulmasov等人，Plant Cell 7：1611-1623(1995)。调节区可以含有具有共有序列CCWWWWWWGG的CARGATCONSENSUS基序。参见Hepworth等人，EMBO J 21：4327-4337(2002)；Michaels等人，Plant J 33：867-874(2003)；Hong等人，Plant Cell15：1296-1309(2003)；Folter和Angenent，Trends Plant Sci 11：224-231(2006)。调节区可以含有具有共有序列CWWWWWWWWG的CARGCW8GAT基序。参见Tang和Perry，J Biol Chem 278：28154-28159(2003)；Folter和Angenent，Trends Plant Sci 11：224-231(2006)。调节区可以含有具有共有序列CAANNNNATC的CIACADIANLELHC基序。参见Piechulla等人，Plant Mol Biol 38：655-662(1998)。调节区可以含有具有共有序列ACACNNG的DPBFCOREDCDC3基序。参见Kim等人，Plant J 11：1237-1251(1997)；Finkelstein和Lynch，Plant Cell 12：599-609(2000)；Lopez-Molina和Chua，Plant Cell Physiol 41：541-547(2000)。调节区可以含有具有共有序列ACCGAC的DRE2COREZMRAB17基序。参见Busk等人，Plant J 11：1285-1295(1997)；Dubouzet等人，PlantJ33：751-763(2003)；Kizis和Pages，Plant J 30：679-689(2002)。调节区可以含有具有共有序列WTTSSCSS的E2FCONSENSUS基序。参见Vandepoele等人，Plant Physiol 139：316-328.(2005)。调节区可以含有具有共有序列TGTAAAGT的EMHVCHORD基序。参见Muller和Knudsen，Plant J 4：343-355(1993)。调节区可以含有具有共有序列AAAATATCT的EVENINGAT基序。参见Rawat等人，Plant Mol Biol57：629-643(2005)以及Harmer等人，Science 290：2110-2113(2000)。调节区可以含有具有共有序列RTGASTCAT的GLMHVCHORD基序。参见Albani等人，Plant Cell 9：171-184(1997)；Muller M Plant J 4：343-355(1993)；Onate等人，J Biol Chem 274：9175-9182(1999)。调节区可以含有具有共有序列GRWAAW的GT1共有基序。参见Terzaghi和Cashmore，如上；Villain等人，J Biol Chem 271：32593-32598(1996)；Le Gourrierec等人，Plant J 18：663-668(1999)；Buchel等人，Plant Mol Biol 40：387-396(1999)；Zhou，Trends in Plant Science 4：210-214(1999)。调节区可以含有具有共有序列GAAAAA的GT1GMSCAM4基序。参见Park等人，Plant Physiol 135：2150-2161(2004)。调节区可以含有具有共有序列TAATMATTA的HDZIP2ATATHB2基序。参见Ohgishi等人，Plant J 25：389-398(2001)。调节区可以含有具有共有序列GATAAGR的IBOXCORENT基序。参见Martinez-Hernandez等人，Plant Physiol 128：1223-1233(2002)。调节区可以含有具有共有序列YTCANTYY的INRNTPSADB基序。参见Nakamura等人，Plant J 29：1-10(2002)。调节区可以含有具有共有序列CCAATGT的LEAFYATAG基序。参见Kamiya等人，Plant J 35：429-441(2003)。调节区可以含有具有共有序列ACGTGGCA的LRENPCABE基序。参见Castresana等人，EMBO J 7：1929-1936(1988)。调节区可以含有具有共有序列TTWTWTTWTT的MARTBOX基序。参见Gasser等人，Intnatl Rev Cyto 119：57-96(1989)。调节区可以含有具有共有序列TAACAAA的MYBGAHV基序。参见Gubler等人，Plant Cell 7：1879-1891(1995)；Morita等人，FEBS Lett 423：81-85(1998)；Gubler等人，Plant J 17：1-9(1999)。调节区可以含有具有共有序列MACCWAMC的MYBPLANT基序。参见Sablowski等人，EMBO J 13：128-137(1994)；Tamagnone等人，Plant Cell 10：135-154(1998)。调节区可以含有具有共有序列TAGTGGAT的NRRBNEXTA基序。参见Elliott和Shirsat，Plant Mol Biol 37：675-687(1998)。调节区可以含有具有共有序列TCCACGTACT的O2F3BE2S1基序。参见Vincentz等人，Plant Mol Biol 34：879-889(1997)。调节区可以含有具有共有序列GNATATNC的P1BS基序。参见Rubio等人，Genes Dev.15：2122-2133.(2001)；Shunmann等人，J Exp Bot.55：855-865.(2004)；Shunmann等人，Plant Physiol 136：4205-4214.(2004)。调节区可以含有具有共有序列SCGAYNRNNNNNNNNNNNNNNNHD的PRECONSCRHSP70A基序。参见von Gromoff等人，Nucleic Acids Res 34：4767-4779(2006)。调节区可以含有具有共有序列CAAACACC的PROXBBNNAPA基序。参见Ezcurra等人，Plant Mol Biol 40：699-709(1999)；Busk和Pages，如上；Ezcurra等人，Plant J 24：57-66(2000)。调节区可以含有具有共有序列TTTTTTCC的PYRIMIDINEBOXHVEPB1基序。参见Cercos等人，Plant J 19：107-118(1999)。调节区可以含有具有共有序列AATCCAA的RBCSCONSENSUS基序。参见Manzara和Gruissem，Photosynth Res 16：117-139(1988)；Donald和Cashmore，EMBO J 9：1717-1726(1990)。调节区可以含有具有共有序列ATATT的ROOTMOTIFTAPOX1基序。参见Elmayan和Tepfer，Transgenic Res 4：388-396(1995)。调节区可以含有具有共有序列CATGCATG的RYREPEATVFLEB4基序。参见Curaba等人，Plant Physiol 136：3660-3669.(2004)；Nag等人，Plant Mol Biol 59：821-838(2005)。调节区可以含有具有共有序列ATATTTAWW的SEF1MOTIF基序。参见Allen等人，Plant Cell1：623-631(1989)；Lessard等人，Plant Mol Biol 16：397-413(1991)。调节区可以含有具有共有序列TGTATATAT的SORLREP3AT基序。参见Hudson和Quail，Plant Physiol 133：1605-1616(2003)。调节区可以含有具有共有序列AATACTAAT的SURE2STPAT21基序。参见Grierson等人，Plant J5：815-826(1994)。调节区可以含有具有共有序列GTGGWWHG的SV40COREENHAN基序。参见Weiher等人，Science 219：626-631(1983)；Green等人，EMBO J 6：2543-2549(1987)；Donald和Cashmore，EMBO J9：1717-1726(1990)。调节区可以含有具有共有序列TATAAAT的TATABOX2基序。参见Shirsat等人，Mol Gen Genet 215：326-331(1989)；Grace等人，Biol Chem 279：8102-8110(2004)。调节区可以含有具有共有序列TATTAAT的TATABOX3基序。参见dna.affrc.go.jp/PLCAE/signalscan.html的PLACE(PLAnt顺式作用调节DNA元件)。调节区可以含有具有共有序列TATATAA的TATABOX4基序。参见Grace等人，J Biol Chem 279：8102-8110(2004)。调节区可以含有具有共有序列TTATTT的TATABOX5基序。参见Tjaden等人，Plant Physiol 108：1109-1117(1995)。调节区可以含有具有共有序列TATTTAA的TATABOXOSPAL基序。参见Zhu等人，Plant Cell 14：795-803(2002)。调节区可以含有具有共有序列AAACCCTAA的TELOBOXATEEF1AA1基序。参见Tremousayque等人，Plant J 20：553-561(1999)；Axelos等人，Mol Gen Genet 219：106-112(1989)；Welchen和Gonzalez，Plant Physiol 139：88-100(2005)。调节区可以含有具有共有序列CTGAAGAAGAA的TL1ATSAR基序。参见Wang等人，Science 308：1036-1040(2005)。调节区可以含有具有共有序列AAACCCTA的UP2ATMSD基序。参见Tatematsu等人，Plant Physiology 138：757-766(2005)。调节区可以含有具有共有序列TTTGACY的WBBOXPCWRKY1基序。参见Ishiguro和Nakamura，Mol Gen Genet 244：563-571(1994)；Rushton等人，Plant Mol Biol 29：691-702(1995)；Rushon等人，EMBO J 15：5690-5700(1996)；de Pater等人，Nucleic Acids Res 24：4624-4631(1996)；Eulgem等人，Trends Plant Sci 5：199-206(2000)。调节区可以含有具有共有序列ACAAAGAA的XYLAT基序。参见Ko等人，Mol Genet Genomics 276：517-531(2006)。

严紧性：如本文所用的“严紧性”是核酸分子探针长度、核酸分子探针组成(G+C含量)、盐浓度、有机溶剂浓度和杂交温度和/或洗涤条件的函数。严紧性通常由参数T_m来衡量，以与Tm的温差表示，T_m是在杂交测定中互补核酸分子的50％被杂交的温度。高严紧性条件是提供T_m-5℃至T_m-10℃的条件的那些条件。中度或适度严紧性条件是提供T_m-20℃至T_m-29℃的那些条件。低严紧性条件是提供T_m-40℃至T_m-48℃的条件的那些条件。杂交条件与T_m(℃)之间的关系被表示为数学等式：

T_m＝81.5-16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(％G+C)-(600/N) (I)

其中N是核酸分子探针的核苷酸数。这个等式很好地适用于长度为14至17个核苷酸的与靶序列相同的探针。DNA-DNA杂交的T_m的下列等式可用于具有介于50至大于500个核苷酸范围内的长度的探针，并且用于包含有机溶剂(甲酰胺)的条件：

T_m＝81.5+16.6log{[Na⁺]/(1+0.7[Na⁺])}+0.41(％G+C)-500/L 0.63(％甲酰胺) (II)

其中L表示杂交体的探针中的核苷酸数(21)。等式II的T_m受杂交体的性质影响：对于DNA-RNA杂交体，T_m比计算值高10-15℃；对于RNA-RNA杂交体，T_m高20-25℃。因为使用长探针时，同源性每增加1％，T_m就降低约1℃(Frischauf等人(1983)J Mol Biol，170：827-842)，可以调整严紧性条件以利于相同的基因或相关家族成员的检测。

等式II是在假设反应处于处于平衡的条件下得到的。因此，根据本发明的杂交最优选是在探针过量并且容许足够的时间来达到平衡的条件下进行的。达到平衡所需的时间可以通过使用杂交缓冲液来缩短，该杂交缓冲液含有杂交加速剂，如硫酸葡聚糖或另一高体积聚合物。

严紧性可以在杂交反应期间或在杂交发生后通过改变洗涤溶液的盐和温度条件来控制。上面所显示的公式在用于计算洗涤溶液的严紧性时同样有效。优选的洗涤溶液严紧性处于上述范围内；高严紧性为低于T_m5-8℃，中度或适度的严紧性为低于T_m 26-29℃并且低严紧性为低于T_m45-48℃。

T₀：术语“T₀”是指用转化培养基培植的整个植物、外植体或愈伤组织。

T₁：术语T₁在整个植物转化的情况下是指T₀植物的子代，或者在外植体或愈伤组织转化的情况下是指再生的幼苗。

T₂：术语T₂是指T₁植物的子代。T₂子代是T₁植物自体受精或异花授粉的结果。

T₃：术语T₃是指为转化实验的直接结果的植物的第二代子代。T₃子代是T₂植物自体受精或异花授粉的结果。

TATA至起点：“TATA至起点”应意指一级TATA基序与转录起点之间的以核苷酸数计的距离。

转基因植物：“转基因植物”是具有含通过重组核酸方法引入的至少一个外源多核苷酸的一个或多个植物细胞的植物。

翻译起始位点：在本发明的上下文中，“翻译起始位点”通常是转录物中的ATG或AUG，通常为第一个ATG或AUG。然而，编码单个蛋白质的转录物可以具有多个翻译起始位点。

转录起始位点：“转录起始位点”用在本发明中来描述转录开始的点。该点通常位于距TFIID结合位点(如TATA框)的下游约25个核苷酸。转录可以在基因内的一个或多个位点开始，并且待转录的单个多核苷酸可以具有多个转录起始位点，它们中的一些可能对特定细胞类型或组织或器官中的转录具有特异性。“+1”是相对于转录起始位点而言的并且表示转录物中的第一个核苷酸。

上游激活区(UAR)：“上游激活区”或“UAR”是位置或方向依赖性的核酸元件，其主要指导转录水平的组织、器官、细胞类型或环境调节，通常通过影响转录起始的速率而进行。具有转录抑制作用的对应DNA元件在本文中称为“上游阻抑区”或“URR”。这些元件的基本活性是结合蛋白质因子。这种结合可以通过下面所述的方法测定。该结合通常以影响细胞中或体外转录提取物中的转录物稳态水平的方式进行。

非翻译区(UTR)：“UTR”是被转录但是不被翻译的任何连续核苷酸碱基系列。5′UTR处于转录物的起始位点和翻译起始密码子之间并且包括+1核苷酸。3′UTR处于翻译终止密码子和转录物末端之间。UTR可以具有诸如增加mRNA信息稳定性或翻译弱化的特定功能。3′UTR的实例包括但不限于多聚腺苷酸化信号和转录终止序列。

2.本发明的启动子的用途

本发明的启动子和启动子控制元件能够调控转录。此类启动子和启动子控制元件可以与固有的或异源的启动子片段、控制元件或其他调节序列组合用于调控转录和/或翻译。

具体地，本发明的启动子和控制元件可用于调控期望的多核苷酸的转录，所述期望的多核苷酸包括但不限于：

(i)反义；

(ii)核酶；

(iii)编码序列；或

(iv)它们的片段。

启动子还可以顺式或反式调控宿主基因组中的转录。

在诸如植物的生物体中，本发明的启动子和启动子控制元件可用于产生优先转录，该优先转录会在特定细胞、组织或器官中或者在特定条件下产生期望模式的转录水平。

4.鉴定和分离本发明的启动子序列

本发明的启动子和启动子控制元件被呈现在启动子报告表中并且从拟南芥和稻(Oryza sativa)中被鉴定出来。使用已知的技术从包含本发明的启动子和启动子控制元件的序列的多核苷酸的基因组文库中分离是可能的。例如，聚合酶链式反应(PCR)可以使用自SEQ ID NO：1-26或SEQ IDNO：26的残基601-1000设计的引物来扩增期望的多核苷酸。包含基因组序列的多核苷酸文库可以根据例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版.(1989)Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY)构建。

分离包含本发明的启动子序列的多核苷酸的其他方法包括但不限于热不对称交错PCR(tail-PCR)和cDNA末端的5′快速扩增(RACE)。参见，对于热不对称交错PCR，例如Liu等人(1995)Plant J 8(3)：457-463；Liu等人(1995)Genomics 25：674-681；Liu等人(1993)Nucl.Acids Res.21(14)：3333-3334；以及Zoe等人(1999)Bio Techniques 27(2)：240-248；对于RACE，参见，例如PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法与应用指南)，(1990)Academic Press，Inc。

此外，在启动子报告表中所描述的启动子和启动子控制元件(SEQ.ID.No.1-26)可以根据常用技术化学合成。参见，例如Beaucage等人(1981)Tet.Lett.22：1859和美国专利第4,668,777号。这种化学的寡核苷酸合成可以使用商购获得的装置进行，例如Perkin-Elmer Corp.，Foster City，California，USA的分部Applied Biosystems的Biosearch 4600或8600DNA合成仪；以及Perceptive Biosystems，Framingham，Massachusetts，USA的Expedite。

本发明包括表现出与SEQ.ID.No.1-26或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000的核苷酸序列同一性的启动子，即与SEQ.ID.No.1-26或SEQ ID NO：26的残基601-1000相比表现出至少80％序列同一性、至少85％、至少90％以及至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。这种序列同一性可以通过上述算法和计算机程序计算。

本发明还涵盖所公开的序列的“功能变体”或“功能片段”，尤其是保持启动子活性的SEQ ID NO：1-26和SEQ ID NO：5的残基601-1000的片段。功能变体包括例如具有一个或多个核苷酸取代、缺失或插入的本发明的调节序列并且其中该变体保留启动子活性。功能变体可以通过本领域的技术人员可用的大量方法的任一种来产生，例如通过定点诱变、诱发突变、作为等位基因变体鉴定、通过使用限制性酶切割或类似方法。活性同样可以通过任何种类的技术来测量，包括如美国专利第6,844,484中所述的报道物活性的测量、RNA印迹分析或类似的技术。‘484专利描述了不同启动子的功能变体的鉴定。

功能片段即调节序列片段，可以通过自较大的调节元件的一个或多个缺失来形成。例如，在一些情况下，可以将启动子的5’部分直至转录起始位点附近的TATA框缺失而不损坏启动子活性，如由Opsahl-Sorteberg，H-G.等人，“Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleruone cell specific expression(指导糊粉层细胞特异性表达的HvLTP2启动子的49-bp片段的鉴定)”Gene 341：49-58(2004)中所描述的。这类片段应保留启动子活性，尤其是驱动可操作地连接的核苷酸序列的表达的能力。活性可以通过RNA印迹分析、使用转录融合时的报道物活性测量以及类似方法来测量。参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)(1989)。功能片段可以如下获得：通过使用限制性酶来切割本文所公开的天然存在的调节元件核苷酸序列；通过从天然存在的DNA序列合成核苷酸序列；或可以通过使用PCR技术获得。具体参见，Mullis等人，Methods Enzymol.，155：335-350(1987)和Erlich编辑，PCR Technology(PCR技术)(Stockton Press，New York)，(1989)。

例如，移除部分DNA序列的常规方式是使用核酸外切酶与DNA扩增的组合来产生双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于此目的的商购试剂盒是以商品名Exo-Size^TM(New England Biolabs，Beverly，Mass.)出售的。简言之，此步骤需要将核酸外切酶III与DNA一起孵育从而以3’至5’的方向逐步移除在DNA模板中的5’突出端、平端或切口处的核苷酸。然而，核酸外切酶III不能够移除3’端的4碱基突出端的核苷酸。用这种酶对克隆的同步消化产生了单向嵌套缺失。

5.启动子的测试

通过下列步骤测试本发明的启动子(包括功能片段)的活性：将序列克隆到适当的载体中，用该构建体转化植物并测定标记基因的表达。制备重组DNA构建体，该构建体包含插入到适于转化植物细胞的载体中的本发明的启动子序列。构建体可以使用标准的重组DNA技术(Sambrook等人1989)来制备并且可以通过农杆菌介导的转化或通过下面所提到的其他转化方式被引入到感兴趣的物种中。

载体骨架可以是本领域中典型的那些骨架的任一种，如质粒、病毒、人工染色体、BAC、YAC和PAC以及下面所述类别的载体：

(a)BAC：Shizuya等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8794-8797；Hamilton等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9975-9979；

(b)YAC：Burke等人(1987)Science 236：806-812；

(c)PAC：Sternberg N.等人(1990)Proc Natl Acad Sci U S A.87(1)：103-7；

(d)细菌-酵母穿梭载体：Bradshaw等人(1995)Nucl Acids Res 23：4850-4856；

(e)λ噬菌体载体：置换型载体，例如Frischauf等人(1983)J.Mol Biol 170：827-842；或插入型载体，例如Huynh等人(1985)在：Glover NM(编辑)DNA Cloning：A practical Approach(DNA克隆：一种实用方法)，第1卷，Oxford：IRL Press中；T-DNA基因融合载体：Walden等人(1990)MolCell Biol 1：175-194；以及

(g)质粒载体：Sambrook等人，如下文。

通常，构建体含有包含与任何标记基因可操作地连接的本发明启动子序列的载体。启动子通过标记基因的表达而被鉴定为启动子。尽管可以使用许多标记基因，但绿色荧光蛋白(GFP)是优选的。载体还可以包含赋予植物细胞上可选择的表型的标记基因。标记物可以编码杀生物剂抗性，尤其为抗生素抗性，如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性；或除草剂抗性，如氯磺隆(chlorosulfuron)或草胺磷(phosphinotricin)抗性。载体还可以包括复制起点、支架附着区(SAR)、标记物、同源序列、内含子等。

6.构建具有控制元件的启动子

6.1组合启动子与启动子元件

本发明的启动子和启动子控制元件二者均为天然存在的和合成的，它们可单独或彼此组合使用以产生期望的优先转录。而且，本发明的启动子可以与其他已知序列相组合以获得其他可用的启动子来调控例如对某些条件特异的组织转录或对某些条件特异的转录。这种优先转录可以使用上述技术或测定来确定。

启动子可以含有任何数目的控制元件。例如，启动子可以含有多个转录结合位点或其他控制元件。一种元件可以赋予组织或器官特异性；另一种元件可以限制特定时间段的转录等。通常，启动子将至少含有如上所述的基础启动子或核心启动子。可以根据需要包括任何其他的元件。例如，包含基础启动子或“核心”启动子的片段可以与具有任何数目的其他控制元件的另一片段融合。

下面是在应激条件下诱导的并且可以与本发明的那些启动子相组合的启动子：ldh1(氧应激；番茄；参见Germain和Ricard(1997)Plant Mol Biol 35：949-54)、GPx和CAT(氧应激；小鼠；参见Franco等人(1999)Free Radic Biol Med 27：1122-32)、ci7(冷应激；马铃薯；参见Kirch等人(1997)Plant Mol Biol.33：897-909)、Bz2(重金属；玉米；参见Marrs和Walbot(1997)Plant Physiol 113：93-102)、HSP32(过热；大鼠；参见Raju和Maines(1994)Biochim Biophys Acta 1217：273-80)以及MAPKAPK-2(热休克；果蝇；参见Larochelle和Suter(1995)Gene 163：209-14)。

此外，下列启动子的实例是通过存在或不存在光而诱导的，可以与本发明的那些启动子组合使用：拓扑异构酶II(豌豆；参见Reddy等人(1999)Plant Mol Biol 41：125-37)、查耳酮合酶(大豆；参见Wingender等人(1989)Mol Gen Genet 218：315-22)mdm2基因(人肿瘤；参见Saucedo等人(1998)Cell Growth Differ 9：110-30)、Clock和BMAL1(大鼠；参见Namihira等人(199)Neurosci Lett 271：1-4、PHYA(拟南芥；参见Canton和Quail(1999)Plant Physiol 121：1207-16)、PRB-1b(烟草；参见Sessa等人(1995)Plant Mol Biol 28：537-47)和Ypr10(普通菜豆；参见Walter等人(1996)Eur J Biochem 239：281-93)。

下列基因的启动子和控制元件可以与本发明组合使用以赋予组织特异性：MipB(冰叶日中花(iceplant)；Yamada等人(1995)Plant Cell 7：1129-42)和用于根的SUCS(根瘤；蚕豆；Kuster等人(1993)Mol Plant Microbe Interact 6：507-14)、用于叶的OsSUT1(稻；Hirose等人(1997)Plant Cell Physiol 38：1389-96)、用于长角果的Msg(大豆；Stomvik等人(1999)Plant Mol Biol 41：217-31)、cell(拟南芥；Shani等人(1997)Plant Mol Biol 34(6)：837-42)和用于花序的ACT11(拟南芥；Huang等人(1997)Plant Mol Biol 33：125-39)。

还有其他启动子受激素的影响或参与特定的生理过程，它们可与本发明的那些启动子组合使用。一些实例是被乙烯和油菜素类固醇差异性诱导的ACC合酶基因(绿豆；Yi等人(1999)Plant Mol Biol 41：443-54)、在脱落期间有活性的TAPG1基因(番茄；Kalaitzis等人(1995)Plant Mol Biol 28：647-56)，以及1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因(康乃(carnation)；Jones等人(1995)Plant Mol Biol 28：505-12)和CP-2/组织蛋白质酶L基因(大鼠；Kim和Wright(1997)Biol Reprod 57：1467-77)，两者均在衰老期间为活性的。

可以确定或优化控制元件之间的间距或构型或控制元件以容许发生期望的蛋白质-多核苷酸相互作用或多核苷酸相互作用。

例如，如果两个转录因子同时或时间上相当接近地结合启动子，则将结合位点间隔开以容许每个因子结合而没有空间位阻。这样的两个杂交的控制元件之间的间距可以与结合至控制元件的蛋白质的轮廓一样小。在一些情况下，当在转录过程中在不同时间蛋白质结合时，两个蛋白质结合位点可以彼此邻近。

此外，当两个控制元件杂交时，这两个元件之间的间距将足以容许启动子多核苷酸形成发夹或成环以容许这两个元件结合。这两个杂交的控制元件之间的间距可以为与t-RNA环一样小，至10kb大。

通常，间距不小于5个碱基；更通常，不小于8；更通常，不小于15个碱基；更通常，不小于20个碱基；更通常，不小于25个碱基；甚至更通常，不小于30、35、40或50个碱基。

通常，片段大小不长于5kb碱基；更通常，不长于2kb；更通常，不长于1kb；更通常，不长于800个碱基；更通常，不长于500个碱基；甚至更通常，不多于250、200、150或100个碱基。在一些实施方式中，本发明的核酸包含YP0286(SEQ ID NO：5)的至少一个片段，例如YP2219(SEQ IDNO：4)，前体条件是所述核酸不由YP0286(SEQ ID NO：5)构成。

启动子控制元件之间的这种间隔可以使用上述技术和测定来确定。

6.2用于转化细胞/宿主的载体

可以通过任何植物转化方法将含有本发明的启动子的植物转化构建体引入植物中。用于在本发明的实践中通过将植物表达构建体引入植物基因组来转化植物的方法和材料可以包括任何熟知的和已证明的方法，包括：电穿孔(美国专利第5,384,253号)；微粒轰击(美国专利第5,015,580号；美国专利第5,550,318号；美国专利第5,538,880号；美国专利第6,160,208号；美国专利第6,399,861号；和美国专利第6,403,865号)；农杆菌介导的转化(美国专利第5,824,877号；美国专利第5,591,616号；美国专利第5,981,840号；和美国专利第6,384,301号)；以及原生质体转化(美国专利第5,508,184号)。

可以通过载体将本发明的启动子和/或启动子控制元件递送至系统，如细胞。为了本发明的目的，这种递送的范围可以是从简单地将启动子或启动子控制元件自身随机地引入细胞中到整合含有本发明的启动子或启动子控制元件的克隆载体。因此，载体不必限于具有在宿主细胞中自主复制的能力的DNA分子，如质粒、粘粒或细菌噬菌体。还包括递送本发明的启动子和启动子控制元件的所有其他方式。多种T-DNA载体类型是用于本发明的优选载体。许多有用的载体是商购获得的。

还可能有用的是将标记序列与本发明的启动子和启动子控制元件连接以确定这些序列的活性。标记序列通常包括提供抗生素抗性或提供除草剂抗性的基因，所述抗生素抗性如四环素抗性、潮霉素抗性或氨比西林抗性。具体的选择性标记基因可用于赋予对除草剂诸如草甘膦、草丁膦或溴苯腈(broxynil)的抗性(Comai等人(1985)Nature 317：741-744；Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell 2：603-618；和Stalker等人(1988)Science 242：419-423)。存在提供激素反应性的其他标记基因。

本发明的启动子或启动子控制元件可以可操作地连接至待转录的多核苷酸上。以这种方式，启动子或启动子控制元件在插入基因组中时可以通过调控该多核苷酸的转录水平来修饰转录。

然而，在插入到基因组中之前，启动子或启动子控制元件不是必须与待转录的多核苷酸可操作地或以其他方式连接。例如，启动子或启动子控制元件可以单独插入到已经存在于基因组中的多核苷酸之前的基因组中。以此方式，启动子或启动子控制元件可以调控已经存在于基因组中的多核苷酸的转录。这种多核苷酸可以是基因组所固有的或是在较早的时间插入的。

可选择地，启动子或启动子控制元件可以单独插入到基因组中以调控转录。参见，例如Vaucheret，H等人(1998)Plant J 16：651-659。更确切地，启动子或启动子控制元件可以简单地插入到基因组中或者被保持在染色体外作为将系统的转录资源转向自身的途径。这种方法可用于下调一组多核苷酸的转录水平。

待转录的多核苷酸的性质不受限制。具体地，多核苷酸可以包括具有RNA活性的序列以及产生多肽产物的序列。这些序列可以包括但不限于反义序列、RNAi序列、核酶序列、剪接体、氨基酸编码序列以及它们的片段。具体的编码序列可以包括但不限于内源蛋白质或其片段、或包括标记基因的异源蛋白质或其片段。

本发明的构建体将通常含有与可转录的核酸分子可操作地连接的启动子，该可转录的核酸分子与3’转录终止核酸分子可操作地连接。此外，构建体可以包括但不限于来自植物基因的3’非翻译区(3′UTR)的其他的调节核酸分子(例如，增加mRNA的mRNA稳定性的3′UTR，如马铃薯的PI-II终止区或者章鱼碱合酶或胭脂氨酸合酶的3’终止区)。构建体可以包括但不限于能够在翻译起始中起重要作用并且还可以是植物表达构建体中的遗传组分的mRNA核酸分子的5′非翻译区(5′UTR)。例如，已证明源自热休克蛋白质基因的非翻译的5′前导核酸分子增强植物中的基因表达(参见例如，美国专利第5,659,122号和美国专利第5,362,865号，它们全部都通过引用并入本文)。这些另外的上游和下游调节核酸分子可以源自对于启动子构建体上所存在的其他元件而言为固有的或异源的来源。

因此，本发明的一个实施方式是诸如SEQ ID NO：1-26或SEQ ID NO：26的残基601-1000中所提供的启动子，其与可转录的核酸分子可操作地连接以便在将所述构建体引入植物细胞中之后指导所述可转录的核酸分子以期望的水平或在期望的组织或发育模式中转录。在一些情况下，可转录的核酸分子包含基因的蛋白质编码区并且启动子提供了对被翻译和表达为蛋白质产物的功能性mRNA分子的转录。还可以将构建体构建为用于反义RNA分子或其他类似的抑制性RNA的转录以便抑制靶宿主细胞中感兴趣的特定RNA分子表达。

用于加入到本发明的构建体中的示例性可转录核酸分子包括：例如，来自非靶基因物种的物种的核酸分子或基因、或者甚至是起源于或存在于相同的物种中但是通过基因工程方法而非经典的再生或育种技术加入到受体细胞中的基因。外源基因或遗传元件旨在表示引入受体细胞中的任何基因或核酸分子。外源核酸分子中所包括的核酸分子的类型可以包括：已经存在于植物细胞中的核酸分子、来自另一植物的核酸分子、来自不同生物体的核酸分子、或外部产生的核酸分子(诸如含基因的反义信息的核酸分子)、或编码人工或修饰形式的基因的核酸分子。

可以使用如所述的标记基因将本发明的启动子加入到构建体中并且在瞬时分析中对其进行测试，所述瞬时分析提供在稳定的植物系统中的基因表达的指示。如本文所用的术语“标记基因”是指其表达能够以某种方式被筛选或评分的任何可转录的核酸分子。在瞬时测定中测试标记基因的表达的方法是本领域中的那些技术人员已知的。已报道了使用多种植物、组织、植物细胞和DNA递送系统进行的标记基因的瞬时表达。例如，瞬时分析的类型可以包括但不限于使用任何感兴趣的植物物种在任何瞬时植物测定中经由电穿孔或粒子轰击指导基因递送。这种瞬时系统将包括但不限于来自多种组织来源的原生质体的电穿孔或感兴趣的特定组织的粒子轰击。本发明涵盖了使用任何瞬时表达系统来评价与任何可转录的核酸分子可操作地连接的启动子或启动子片段，所述可转录的核酸分子包括但不限于选择的报道基因、标记基因或农学上重要的基因。预计经由适当的递送系统瞬时测试的植物组织的实例包括但不限于：叶基组织、愈伤组织、子叶、根、胚乳、胚、花组织、花粉和表皮组织。

本发明的启动子和控制元件可用于调控代谢或分解代谢过程。这种过程包括但不限于：次级产物代谢、氨基酸合成、种子蛋白质储存、生物量增加、油形成(oil development)、害虫防御和氮利用。可以被本发明调控的参与这些过程的基因、转录物和肽或多肽的一些实例为：色氨酸脱羧酶(tdc)和异胡豆苷合酶(str1)、二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS)和天冬氨酸激酶(AK)、2S白蛋白和α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、及γ-玉米醇溶蛋白、蓖麻油酸盐和3-酮酯酰-ACP合酶(KAS)、苏芸金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis(Bt))杀虫蛋白、豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)、天冬酰胺合成酶和亚硝酸还原酶。可选择地，可以通过将启动子整合到用于反义使用、共抑制使用或用于产生显性失活突变的构建体中来使用表达构建体抑制这些肽和多肽的表达。

如上面所解释的，存在关于转录调节的几种类型的调节元件。如果期望，可以将这些调节元件的每一个与本发明的载体组合。真核mRNA的翻译通常是在编码第一个蛋氨酸的密码子处开始。因此，当构建用于表达蛋白质产物的根据本发明的重组多核苷酸时，优选确保在启动子的3’部分(优选包括TATA框)与待转录的多核苷酸之间的连接或其功能衍生物不含有能够编码蛋氨酸的任何干扰密码子。

本发明的载体可以含有另外的组分。例如，复制起点容许载体在宿主细胞中复制。另外，在特定序列侧翼的同源序列容许特定序列在靶基因组中的期望位置特异性重组。T-DNA序列还容许特定序列随机插入靶基因组中。

载体还可以具有多个限制性位点以用于插入待转录的多核苷酸以及本发明的启动子和/或启动子控制元件。载体可以另外含有选择性标记基因。载体还可以含有在宿主细胞中具有功能的转录和翻译起始区以及转录和翻译终止区。终止区可以是转录起始区所固有的、可以是待转录的多核苷酸所固有的或可以源自另一来源。方便的终止区可从根癌农杆菌(A.Tumefaciens)的Ti-质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂氨酸合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

适当时可以优化待转录的多核苷酸以使在某些宿主细胞中的表达增加。例如，可以使用用于改善的转录和翻译的优选密码子来合成多核苷酸。参见美国专利第5,380,831号、第5,436,391号；还参见和Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498。

其他的序列修饰包括消除编码假多聚腺苷酸化信号、外显子内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列以及已很好地证明对表达有害的其他此类序列。可以将多核苷酸的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考宿主细胞中表达的已知基因所计算的。可以修饰多核苷酸序列以避免mRNA二级发夹结构。

表达载体和报道基因的一般描述可见于Gruber等人(1993)″Vectors for Plant Transformation(用于植物转化的载体)”在Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology(植物分子生物学与生物技术中的方法)，Glich等人编辑，第89-119页，CRC Press中。此外，GUS表达载体和GUS基因盒可从Clonetech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California获得，而荧光素酶表达载体和荧光素酶基因盒可从Promega Corp.(Madison，Wisconsin)获得。GFP载体可从Aurora Biosciences获得。

6.3多核苷酸插入到宿主细胞中

根据本发明的启动子可以被插入宿主细胞中。宿主细胞包括但不限于：植物、哺乳动物、昆虫、酵母和原核细胞，优选植物细胞。

插入宿主细胞基因组中的方法基于便利来选择。例如，插入到宿主细胞基因组中可以通过整合到宿主细胞基因组中的载体或通过独立于宿主细胞基因组存在的载体来完成。

本发明的启动子可以自主地存在于宿主细胞基因组中或独立于宿主细胞基因组。这些类型的载体是本领域中已知的并且包括：例如，某些类型的非整合病毒载体、自主复制的质粒、人工染色体以及类似物。

另外，在一些情况下可能期望启动子的瞬时表达。

可以将本发明的启动子序列、启动子控制元件或载体转化到宿主细胞中。这些转化可以到原生质体中或完整的组织中或分离的细胞中。优选地，将表达载体引入完整的组织中。培养植物组织的一般方法提供于：例如Maki等人(1993)″Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants(将外来DNA引入植物中的步骤)″在Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology(植物分子生物学与生物技术中的方法)，Glich等人编辑，第67-88页CRC Press中；和Phillips等人(1988)″Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation(细胞-组织培养和体外操作)″在Corn & Corn Improvement(玉米与玉米改良)，第3版Sprague等人编辑，第345-387页，American Society of Agronomy Inc.等。

将多核苷酸引入植物组织中的方法包括直接感染或将植物细胞与根癌农杆菌共培养，Horsch等人(1985)Science，227：1229。农杆菌载体系统和用于农杆菌介导的基因转移的方法的描述由Gruber等人(如上)提供。

可选择地，使用直接基因转移方法将多核苷酸引入植物细胞或其他植物组织中，如微粒介导的递送、DNA注射、电穿孔以及类似方法。更优选地，使用利用基因枪装置的微粒介质递送将多核苷酸引入植物组织中。参见，例如Tomes等人，″Direct DNA transfer into intact plant cells via microprojectile bombardment(经由微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中)″在：Gamborg和Phillips(编辑)Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods(植物细胞、组织和器官培养：基础方法)，Springer Verlag，Berlin(1995)中。

用于特异性转化双子叶植物的方法是本领域的那些技术人员所熟知的。使用这些方法的转化和植物再生已经在大量作物中描述，包括但不限于：棉花(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea)，和芸苔属(Brassica)成员。

用于转化单子叶植物的方法是本领域的那些技术人员所熟知的。使用这些方法的转化和植物再生已经在大量作物中描述，包括但不限于：大麦(Hordeum vulgarae)；玉米(Zea mays)；燕麦(Avena sativa)；鸭茅(Dactylis glomerata)；稻(Oryza sativa，包括籼稻(indica)和粳稻(japonica)品种)；高粱(Sorghum bicolor)；甘蔗(Saccharum sp)；高羊茅(Festuca arundinacea)；草坪物种(例如，物种：匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、金边钝叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(Triticum aestivum)、柳枝稷(Panicum vigatum)和紫苜蓿(Medicago sativa)。对本领域的那些技术人员来说明显的是可以使用大量的转化方法并对其改造以便由任何数目的感兴趣的靶植物产生稳定的转基因植物。

本文所述的多核苷酸和载体可用于转化大量单子叶植物和双子叶植物和植物细胞系统，包括来自下列科之一的物种：爵床科(Acanthaceae)、葱科(Alliaceae)、六出花科(Alstroemeriaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、棕榈科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、小檗科(Berberidaceae)、红木科(Bixaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、秋水仙科(Colchicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、麻黄科(Ephedraceae)、古柯科(Erythroxylaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、亚麻科(Linaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、黑药花科(Melanthiaceae)、芭蕉科(Musaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、蓝果树科(Nyssaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、松科(Pinaceae)、车前科(Plantaginaceae)、禾本科(Poaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、杨柳科(Salicaceae)、无患子科(Sapindaceae)、茄科(Solanaceae)、红豆杉科(Taxaceae)、山茶科(Theaceae)或葡萄科(Vitaceae)。

合适的物种可以包括下列属的成员：秋葵属(Abelmoschus)、冷杉属(Abies)、槭属(Acer)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、六出花属(Alstroemeria)、凤梨属(Ananas)、穿心莲属(Andrographis)、须芒草属(Andropogon)、蒿属(Artemisia)、芦竹属(Arundo)、颠茄属(Atropa)、小檗属(Berberis)、甜菜属(Beta)、红木属(Bixa)、芸苔属、金盏花属(Calendula)、山茶属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、长春花属(Catharanthus)、三尖杉属(Cephalotaxus)、茼蒿属(Chrysanthemum)、金鸡纳属(Cinchona)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、秋水仙属(Colchicum)、鞘蕊花属(Coleus)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、曼陀罗属(Datura)、石竹属(Dianthus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、麻黄属(Ephedra)、蔗茅属(Erianthus)、古柯属(Erythroxylum)、桉属(Eucalyptus)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、雪花莲属(Galanthus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、麻疯树属(Jatropha)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、毒麦属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、石松属(Lycopodium)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、薄荷属(Mentha)、芒属(Miscanthus)、芭蕉属(Musa)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、罂粟属(Papaver)、银胶菊属(Parthenium)、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬茄属(Petunia)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、松属(Pinus)、早熟禾属(Poa)、大戟属(Poinsettia)、杨属(Populus)、萝芙木属(Rauwolfia)、蓖麻属(Ricinus)、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、血根草属(Sanguinaria)、东莨菪属(Scopolia)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、大米草属(Spartina)、菠菜属(Spinacea)、菊蒿属(Tanacetum)、红豆杉属(Taxus)、可可属(Theobroma)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)、北美穗草属(Uniola)、藜芦属(Veratrum)、蔓长春花属(Vinca)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)。

合适的物种包括黍属物种或其杂交种、高粱属物种或其杂交种、双色高粱、芒属物种或其杂交种、甘蔗属物种或其杂交种、蔗茅属物种、杨属物种、大须芒草(Andropogon gerardii，big bluestem)、象草(Pennisetum purpureum，elephant grass)或其杂交种(例如，象草×御谷(Pennisetum typhoidum))、虉草(Phalaris arundinacea，reed canarygrass)、狗牙根(Cynodon dactylon，bermudagrass)、高羊茅(Festuca arundinacea，tall fescue)、草原网茅(Spartina pectinata，prairie cord-grass)、紫苜蓿(alfalfs)、芦竹(Arundo donax，giant reed)或其杂交种、黑麦(Secale cereale，rye)、柳属物种(柳树)、桉属物种(桉树)、小黑麦(小麦属-小麦×黑麦)、东部加马草(Tripsicum dactyloides，Eastern gammagrass)、灰色赖草(Leymus cinereus，盆地野麦)、巨型野生黑麦(Leymus condensatus，giant wildrye)和竹子。

在一些实施方式中，合适的物种可以是野生的、丛生的(weedy)或培养的高粱数物种，例如但不限于杂高梁(Sorghum almum)、阔叶高粱(Sorghum amplum)、狭叶高粱(Sorghum angustum)、Sorghum arundinaceum、高粱(Sorghum bicolor，例如双色族(bicolor)、几内亚族(guinea)、顶尖族(caudatum)、卡佛尔族(kafir)和都拉族(durra))、短柄高粱(Sorghum brachypodum)、球茎高粱(Sorghum bulbosum)、缅甸高粱(Sorghum burmahicum)、Sorghum controversum、Sorghum drummondii、Sorghum ecarinatum、Sorghum exstans、Sorghum grande、假高粱(Sorghumhalepense)、中间高粱(Sorghum interjectum)、Sorghum intrans、Sorghumlaxiflorum、Sorghum leiocladum、Sorghum macrospermum、Sorghummatarankense、Sorghum miliaceum、Sorghum nigrum、光高粱(Sorghum nitidum)、羽高粱(Sorghum plumosum)、拟高梁(Sorghum propinquum)、Sorghum purpureosericeum、Sorghum stipoideum、苏丹草(Sorghum sudanensese)、Sorghum timorense、Sorghum trichocladum、多色高粱(Sorghum versicolor)、Sorghum virgatum、高粱(Sorghum vulgare)、或杂交种，如高粱×杂高粱、高粱×双色高粱或高粱×drummondii。

合适的物种还包括：向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、红花(Carthamus tinctorius，safflower)、麻疯树(Jatropha curcas，jatropha)、蓖麻(Ricinus communis，castor)、油棕(Elaeis guineensis，棕榈)、亚麻(Linum usitatissimum，flax)和芥菜(Brassica juncea)。

合适的物种还包括甜菜(Beta vulgaris，sugarbeet)和木薯(Manihot esculenta，cassava)。

合适的物种还包括：番茄(Lycopersicon esculentum，西红柿)、莴苣(Lactuca sativa，莴苣)、香蕉(Musa paradisiaca，香蕉))、马铃薯(Solanum tuberosum，土豆)、甘蓝(Brassica oleracea，绿花椰菜、花椰菜、抱子甘蓝)、茶(Camellia sinensis，茶)、草莓(Fragaria ananassa，草莓)、可可(Theobroma cacao，可可)、小果咖啡(Coffea arabica，咖啡)、葡萄(Vitis vinifera，葡萄)、凤梨(Ananas comosus，菠萝)、七色椒(Capsicum annum，辣椒&甜椒)、洋葱(Allium cepa，洋葱)、甜瓜(Cucumis melo，甜瓜)、黄瓜(Cucumis sativus，黄瓜)、笋瓜(Cucurbita maxima，南瓜)、南瓜(Cucurbita moschata，南瓜)、菠菜(Spinacea oleracea，菠菜))、西瓜(Citrullus lanatus，西瓜)、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus，秋葵)和茄(Solanum melongena，茄子)。

合适的物种还包括罂粟(Papaver somniferum，罂粟)、东方罂粟(Papaver orientale)、欧洲紫杉(Taxus baccata)、短叶紫杉(Taxus brevifolia)、青蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabis sativa)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、玫瑰红长春花(Vinca rosea)、正鸡纳(Cinchona officinalis)、秋水仙(Colchicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、毛花洋地黄(Digitalis lanata)、紫花洋地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属物种(Berberis spp.)、三尖杉属物种(Cephalotaxus spp.)、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属物种(Ephedra spp.)、东方古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus wornorii)、东莨菪属物种(Scopolia spp.)、千层塔(Lycopodium serratum)(＝蛇足石杉(Huperziaserrata))、石松属物种(Lycopodium spp.)、蛇根萝芙木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属物种(Rauwolfia spp.)、加拿大血根草(Sanguinaria canadensis)、天仙子属物种(Hyoscyamus spp.)、金盏菊(Calendula officinalis)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)和夏白菊(Tanacetum parthenium)。

合适的物种还包括：灰白银胶菊(Parthenium argentatum，银胶菊)、橡胶树属(橡胶)、留兰香(Mentha spicata，薄荷)、辣薄荷(Mentha piperita，薄荷)、红木(Bixa orellana)和六出花属物种(Alstroemeria spp.)。

合适的物种还包括蔷薇属物种(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus，康乃)、碧冬茄属物种(牵牛花)和一品红(Poinsettia pulcherrima，圣诞红)。

合适的物种还包括：烟草(Nicotiana tabacum，烟草)、白羽扇豆(Lupinus albus，羽扇豆)、燕麦(Uniola paniculata，燕麦)、翦股颖(剪股颖属物种)、似欧洲山杨(Populus tremuloides，白杨)、松属物种(松)、冷杉属物种(冷杉)、槭属物种(槭树、大麦(Hordeum vulgare，大麦)、草地早熟禾(早熟禾)、毒麦属(毒麦)和猫尾草(梯牧草)。

因此，方法和组合物可以在大范围的植物物种内使用，包括来自下列的物种：双子叶属，芸苔属、红花属、大豆属、棉属、向日葵属、麻疯树属、银胶菊属、杨属和蓖麻属；和单子叶属，油棕属、羊茅属、大麦属、毒麦属、稻属、黍属、狼尾草、梯牧草属、早熟禾属、甘蔗属、黑麦属、高粱属、小黑麦属、小麦属和玉蜀黍属。在一些实施方式中，植物为下列物种的成员：柳枝稷(Panicum virgatum，柳枝稷)、高粱(高粱属，双色高粱)、奇岗(Miscanthus giganteus，芒)、甘蔗属物种(能源甘蔗(energycane))、大叶钻天杨(Populus balsamifera，白杨)、玉蜀黍(Zea mays，玉米)、大豆(Glycine max，soybean)、甘蓝型油菜(Brassica napus，芸苔)、小麦(Triticum aestivum，wheat)、陆地棉(Gossypium hirsutum，棉花)、稻(Oryza sativa，rice)、向日葵(Helianthus annuus，sunflower)、紫苜蓿(Medicago sativa，alfalfa)、甜菜(Beta vulgaris，sugarbeet)或紫御谷(Pennisetum glaucum，珍珠粟)。

在某些实施方式中，本文所述的多核苷酸和载体可用于转化大量单子叶和双子叶植物和植物细胞系统，其中这种植物是不同物种的杂交种或特定的物种的变种(例如，甘蔗属物种×芒属物种、柳枝稷×矮沙丘草(Panicumamarum)，柳枝稷×Panicum amarulum和象草×御谷)。

在本发明的另一实施方式中，表达构建体可用于愈伤组织培养物中的基因表达以为了表达编码容许鉴定转化的植物的肽或多肽的标记基因。此处，将与待转录的多核苷酸可操作地连接的启动子转化到植物细胞中并且然后将转化的组织置于愈伤组织诱导性培养基上。例如，如果用叶盘进行转化，则愈伤组织将沿切割边缘开始。一旦开始愈伤组织生长，便可以将愈伤组织细胞转移到愈伤组织枝诱导性或愈伤组织根诱导性培养基中。将在适当的培养基上发育着的愈伤组织细胞内发生基因表达：愈伤组织根诱导性启动子将在愈伤组织根诱导性培养基上被激活等。可用作转化标记的这种肽或多肽的实例包括但不限于：barstar、草甘膦、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、卡那霉素、大观霉素、链霉素或其他抗生素抗性酶、绿色荧光蛋白(GFP)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)等。在SEQ ID NO：1-26或SEQ IDNO：26的核酸残基601-1000中提供的一些启动子还能够在再生开始或完成后在一些组织或器官中维持表达。这些组织或器官的实例是体细胞胚、子叶、下胚轴、上胚轴、叶、茎、干、根、花和种子。

整合到宿主细胞基因组中还可以通过本领域中已知的方法完成，例如，通过上面所讨论的同源序列或T-DNA或使用cre-lox系统(A.C.Vergunst等人(1998)Plant Mol.Biol.38：393)。

7.本发明的启动子的用途

7.1使用启动子来研究和筛选表达

本发明的启动子可用于进一步了解发育机制。例如，在愈伤组织形成、体细胞胚形成、枝形成或根形成期间被特异性诱导的启动子可用于探究靶基因的过表达、阻抑或异位表达的作用或用于分离反式作用因子。

本发明的载体可不仅用于表达编码区，还可以用于外显子捕获克隆或启动子捕获步骤以检测不同组织中的差异基因表达(参见Lindsey等人(1993)Transgenic Research 2：3347.Auch和Reth(1990)Nucleic AcidsResearch 18：6743)。

最初被描述用于细菌的捕获载体(Casadaban和Cohen(1979)Proc.Nat.Aca.Sci.U.S.A.76：4530；Casadaban等人(1980)J.Bacteriol.143：971)容许选择位于编码序列内的插入事件。可以将捕获载体引入培养中的多能性ES细胞中，然后经由嵌合体传递到种系中(Gossler等人aaa91989)Science244：463；Skarnes(1990)Biotechnology 8：827)。启动子或基因捕获载体通常含有报道基因，例如LacZ，其缺乏其自身的启动子和/或上游的剪接受体序列。也就是说，启动子基因陷阱含有具有剪接位点但是没有启动子的报道基因。如果载体陷入基因中并被剪接成基因产物，那么会表达报道基因。

最近，基于条件营养缺陷型互补或药物抗性的先进的启动子陷阱(例如，IVET)的使用使得优先诱导的基因的分离成为可能。在一种IVET方法中，将多种细菌基因组片段置于与报道基因偶联的必需的代谢基因之前。将DNA构建体插入到另外缺乏该代谢基因的细菌菌株中，并且将所得细菌用于感染宿主生物体。只有表达该代谢基因的细菌在宿主生物体中存活；所以，可以通过仅收获在宿主细胞中存活某一最短时间的细菌来消除非活性构建体。同时，可以通过在实验室条件下仅筛选不表达报道基因的细菌来消除广泛活性的构建体。通过这种方法选择的细菌含有仅在宿主感染期间被选择性诱导的构建体。可以对IVET方法进行改造以用于在植物中鉴定病原体感染或根定殖之后在细菌或植物细胞中诱导的基因。关于IVET的信息，参见如下论文：Mahan等人(1993)Science 259：686-688；Mahan等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：669-673；Heithoff等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：934-939和Wang等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：10434。

7.2使用启动子转录感兴趣的基因

在本发明的一个实施方式中，将SEQ ID NO：1-26中所显示的核酸分子或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000加入到构建体中以便使本发明的启动子可操作地连接到可转录的核酸分子上，所述可转录的核酸分子为农学上重要的基因。如本文所用术语“农学上重要的基因”是指可转录的核酸分子，其包括但不限于提供与下列方面有关的期望特征的基因：植物形态、生理、生长和发育、产量、营养强化、疾病或害虫抗性或环境或化学耐受。期望表达农学上重要的基因以便赋予农学上重要的性状。为农作物提供有益的农学性状的农学上重要的基因可以是例如包括但不限于包含下列的基因元件：除草剂抗性、增加的产量、增加的生物量、昆虫控制、真菌性疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、淀粉生产、改良的油的生产、高油生产、改良的脂肪酸含量、高蛋白生产、果实成熟、强化的动物和人的营养、生物聚合物、环境胁迫抗性、药用肽、改良的加工性状、改良的可消化性、工业酶生产、改良的香味、固氮作用、杂交种种子生产和生物燃料生产。上面所列专利中所描述的基因元件、方法和转基因通过引用并入本文。

可选择地，可转录的核酸分子可以通过编码引起内源基因表达的靶向抑制的RNA分子来实现上面所提到的表型，例如经由反义、抑制性RNA(RNAi)或共抑制介导的机制。RNA还可以是被工程化以切割期望的内源mRNA产物的催化性的RNA分子(即，核酶)。因此，编码表达感兴趣的表型或形态改变的蛋白或mRNA的任何核酸分子可用于实践本发明。

7.3.应激诱导的优先转录

在氧化、干旱、氧气、创伤和茉莉酸甲酯应激下提供转录调控的启动子和控制元件尤其可用于产生对生物和非生物应激更具抗性的宿主细胞或生物体。在植物中，例如，响应于氧化应激的基因、转录物和/或多肽调控可以保护细胞免受由氧化剂(如过氧化氢和其他自由基)所引起的损伤。

基因、转录物和/或多肽的干旱诱导可用于增加植物的生存力，例如在水是限制性因素时。相比之下，在氧应激期间诱导的基因、转录物和/或多肽可有助于植物的耐涝性。

本发明的启动子和控制元件可以调控与下列应激条件中所描述的那些类似的应激：例如VuPLD1(干旱应激；豇豆；参见Pham-Thi等人(1999)Plant Mol Biol 39：1257-65)、丙酮酸脱羧酶(氧应激；稻；参见Rivosal等人(1997)Plant Physiol 114(3)：1021-29)；色质体特异性类胡萝卜素基因(氧化应激；辣椒；参见Bouvier等人(1998)J Biol Chem 273：30651-59)。

在创伤期间提供优先转录或由茉莉酸甲酯诱导而提供优先转录的启动子和控制元件可以在宿主细胞或生物体中产生防御反应。在植物中，例如，在这种条件下基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于诱导对机械创伤、害虫或病原体的攻击或某些化学物质处理的防御反应。

本发明的启动子和控制元件还可以触发类似于关于下列所描述的那些反应的反应：cf9(病毒性病原体；番茄；参见O’Donnell等人(1998)Plant J 14(1)：137-42)；1型肝细胞生长因子激活物抑制剂(HAI-1)，其增强组织再生(组织损伤；人；Koono等人(1999)J Histochem Cytochem 47：673-82)；酮胺氧化酶(CuAO)，其在个体发生和创伤愈合期间诱导(创伤；鹰嘴豆；Rea等人(1998)FEBS Lett 437：177-82)；蛋白水解酶抑制剂II(创伤；马铃薯；参见Pena-Cortes等人(1988)Planta 174：84-89)；蛋白酶抑制剂II(茉莉酸甲酯；番茄；参见Farmer和Ryan(1990)Proc Natl AcadSci USA 87：7713-7716)；两种营养储藏蛋白基因VspA和VspB(创伤、茉莉酸和水分亏缺；大豆；参见Mason和Mullet(1990)Plant Cell 2：569-579)。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加耐氧化性、耐涝性或耐旱性的基因、转录物和/或多肽可能需要上调转录。

通常，在创伤或茉莉酸甲酯诱导下提供优先转录的启动子或控制元件会产生与在其他条件下的细胞类型、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

对于优先上调的转录，启动子和控制元件产生在测定背景之上的转录水平。

7.4.光诱导的优先转录

在通过光暴诱导时提供优先转录的启动子和控制元件可用于调控生长、代谢和发育；增加耐旱性；并降低宿主细胞或生物体因光应激引起的损伤。在植物中，例如，响应于光的基因、转录物和/或多肽的调控可用于

(1)增加光合速率；

(2)仅增加叶或绿色部分中某些分子的储藏，例如，具有高蛋白或淀粉含量的青贮；

(3)调控绿色组织中外源组分的产生，例如，某些饲用酶；

(4)在延长的光暴期间诱导生长或发育，如果实发育和成熟；

(5)调控保卫细胞以控制叶中气孔的大小从而防止水分损失，或

(6)诱导β-胡萝卜素积累从而有助于农作物抵抗光诱导的应激。

本发明的启动子和控制元件还可以触发类似于下列物质中所描述的那些反应的反应：脱落酸不敏感型蛋白3(ABI3)(黑暗生长的拟南芥幼苗，参见Rohde等人(2000)Plant Cell 12：35-52)、天冬酰胺合成酶(豌豆根瘤，参见Tsai和Coruzzi(1990)EMBO J 9：323-32)、mdm2基因(人肿瘤，参见Saucedo等人(1998)Cell Growth Differ 9：119-30)。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加耐旱性或耐光性的基因、转录物和/或多肽可能需要上调转录。

通常，在暴于光的细胞、组织或器官中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与在降低光暴(强度或时间长度)条件下的细胞、组织或器官相比统计学上显著的转录水平。

7.5.黑暗诱导的优先转录

在由黑暗或降低的光强度或降低的光暴时间诱导时提供优先转录的启动子和控制元件可用于对生长、代谢和发育进行定时以调控宿主细胞或生物体的光合能力。在植物中，例如，响应于黑暗的基因、转录物和/或多肽的调控可用于：例如，

(1)尽管缺乏光也诱导生长或发育，例如果实发育和成熟；

(2)调控在夜晚或在阴天有活性的基因、转录物和/或多肽；或

(3)在黑暗开始时保护存在的质体超微结构。

本发明的启动子和控制元件还可以触发类于上节中所述的那些反应的反应。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加或减少生长和发育的基因、转录物和/或多肽可能需要上调转录。

通常，在暴于黑暗或降低光强度或降低暴时间的条件下提供优先转录的启动子或控制元件产生统计学上显著的转录水平。

7.6.叶优先的转录

在叶中提供优先转录的启动子和控制元件可以调控生长、代谢和发育或者调控宿主细胞或生物体中的能量和养分的利用。在植物中，例如，在叶中的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于：例如

(1)调控叶的大小、形状和发育；

(2)调控叶的数目；或

(3)调控能量或营养物质相对于其他器官和组织的利用。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加生长的基因、转录物和/或多肽可能例如需要上调转录。

通常，在叶的细胞、组织或器官中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他细胞、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

7.7.根的优先转录

在根中提供优先转录的启动子和控制元件可以调控生长、代谢、发育、养分吸收、固氮作用或者调控宿主细胞或生物体中的能量和养分的利用。在植物中，例如，在根中的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于：

(1)调控根的大小、形状和发育；

(2)调控根的数目或根毛；

(3)调控矿物质、肥料或水分的吸收；

(4)调控养分的运输；或

(4)调控能量或营养物质相对于其他细胞、器官和组织的利用。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加或减少生长的基因、转录物和/或多肽可能例如需要上调转录。

通常，在根的细胞、组织或器官中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他细胞、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

7.8.茎/枝的优先转录

在茎或枝中提供优先转录的启动子和控制元件可以调控生长、代谢和发育或调控宿主细胞或生物体中的能量和养分的利用。在植物中，例如，在茎或枝中的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于：例如

(1)调控茎/枝的大小、形状和发育；或

(2)调控能量或营养物质相对于其他器官和组织的利用。

通常，在茎或枝的细胞、组织或器官中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他细胞、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

7.9.果实和种子的优先转录

在长角果或果实中提供优先转录的启动子和控制元件可以对生长、发育或成熟进行定时；或调控受精能力；或调控宿主细胞或生物体中的能量和养分的利用。在植物中，例如，在果实中的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于：

(1)调控果实的大小、形状、发育和成熟；

(2)调控果实或种子的数目；

(3)调控种子落粒；

(4)调控种子的组分，如储存分子、淀粉、蛋白、油、维生素、抗营养组分例如植酸；

(5)调控种子和/或幼苗的活力或生存力；

(6)将外源成分加入到种子中，如富含赖氨酸的蛋白；

(7)容许对于早开花和晚开花的花的类似果实成熟时控；

(8)调控能量或养分相对于其他器官和组织的利用。

通常，在长角果或果实的细胞、组织或器官中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他细胞、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

7.10.愈伤组织的优先转录

在愈伤组织中提供优先转录的启动子和控制元件可用于调控分化的宿主细胞中的转录。在植物转化中，例如，在愈伤组织中基因、转录物的优先调控可用于调控标记基因的转录，该标记基因可促进用外源多核苷酸转化的细胞的选择。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加标记基因可检测性的基因、转录物和/或多肽可能例如需要上调转录。

7.11.花特异性转录

在花中提供优先转录的启动子和控制元件可以调控色素沉着；或者调控宿主细胞或生物体中的受精能力。在植物中，例如，在花中的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于：

(1)调控花瓣颜色；或

(2)调控雌蕊和/或雄蕊的受精能力。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加或减少色素沉着的基因、转录物和/或多肽可能例如需要上调转录。

通常，在花中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他细胞、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

7.12.来成熟的芽和花序的特异性转录

在未成熟的芽或花序中提供优先转录的启动子和控制元件可以对生长、发育或成熟进行定时；或者调控宿主细胞或生物体中的受精能力或生存力。在植物中，例如，在未成熟的芽和/或花序中的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于：

(1)调控胚的发育、大小和成熟；

(2)调控胚乳的发育、大小和组成；

(3)调控种子和果实的数目；或

(4)调控种子的发育和生存力。

通常，在未成熟的芽和花序中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他细胞类型、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

7.13.衰老的优先转录

在衰老期间提供优先转录的启动子和控制元件可用于调控宿主细胞或生物体中的细胞变性、养分迁移和自由基清除。可以调控的其他反应类型包括：例如编码被认为参与细胞变性和养分迁移的酶的衰老相关基因(SAG)(拟南芥；参见Hensel等人(1993)Plant Cell 5：553-64)和CP-2/组织蛋白酶L基因(大鼠；Kim和Wright(1997)Biol Reprod 57：1467-77)，二者均在衰老期间被诱导。

在植物中，例如，在衰老期间的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于调控果实成熟。

上调和转录下调可用于这些应用。例如，增加或减少自由基清除的基因、转录物和/或多肽可能例如需要上调转录。

通常，衰老期间在细胞、组织或器官中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他条件相比统计学上显著的转录水平。

7.14.发芽的优先转录

在发芽的种子中提供优先转录的启动子和控制元件可以对生长、发育或成熟进行定时；或者调控宿主细胞或生物体中的生存力。在植物中，例如，在发芽的种子中的基因、转录物和/或多肽的优先调控可用于：

(1)调控下胚轴、子叶和根(radical)的出现；或

(2)调控枝和初生根的生长和发育；

通常，在发芽的种子中提供优先转录的启动子或控制元件会产生与其他细胞类型、器官或组织相比统计学上显著的转录水平。

8.GFP实验步骤和结果

步骤

使用绿色荧光蛋白(GFP)测定以下列方式来测试本发明的多核苷酸序列的启动子活性。

使用尾接BstXI限制性位点的适当引物分离约1-3kb的基因组序列，该序列紧接着感兴趣的基因的ATG翻译起始位点上游存在。使用这些引物和基因组DNA进行标准PCR反应。分离所得产物、用BstXI切割并将其克隆到诸如pNewBin4-HAP1-GFP(参见图1)的适当载体的BstXI位点中。

农杆菌介导的拟南芥转化

宿主植物和转基因：用Ti质粒转化野生型拟南芥瓦斯莱型(Wassilewskija，WS)植物，所述Ti质粒含有如对应实例中所示的以相对于Ti质粒中35S启动子的有义方向表达的核酸序列。可用于这些构建体的Ti质粒载体CRS 338含有Ceres-构建的植物选择性标记基因草丁膦乙酰基转移酶(PAT)，其赋予转化的植物除草剂抗性。

在T1代中典型地选择了10种独立转化的事件，并评定了它们的质量性状表型。

土混合物的制备：在水泥混合器中将24L 5号日照混合物(Sunshine Mix#5)土(Sun Gro Horticulture，Ltd.，Bellevue，WA)与16L Therm-O-Rock蛭石(Therm-O-Rock West，Inc.，Chandler，AZ)混合以制备60∶40的土混合物。向该土混合物中添加2汤匙Marathon 1％颗粒(Hummert，Earth City，MO)、3汤匙OSMOCOTE14-14-14(Hummert，EarthCity，MO)和1汤匙Peters肥料20-20-20(J.R.Peters，Inc.，Allentown，PA)，首先将它们加入3加仑的水中，然后添加到该土中并彻底混合。通常，用土混合物填充4英寸直径的花盆。然后用8平方英寸的尼龙网覆盖花盆。

种植：使用60mL注射器吸取35mL的种子混合物。添加25滴至各花盆中。将透明的殖拱盖(propagation dome)放置于花盆顶上，然后将花盆置于55％遮阳布下并通过添加1英寸的水进行地下溉。

植物维持：种植后3至4天，移去盖子和遮阳布。根据需要对植物浇水。7-10天后，使用镊子将花盆稀化为每盆20个植物。在2周后，用Peters肥料以1汤匙/加仑水的比率对所有植物进行地下溉。当出芽(bolt)为约5-10cm长时，在第一茎结和茎基之间将它们剪断以诱导次级出芽。剪断后6至7天进行浸入浸渍(Dipping infiltration)。

农杆菌的制备：将羧苄西林、大观霉素和利福平各0.1mL(各自为100mg/ml储备浓度)添加到150mL新鲜的YEB中。获得农杆菌初始板(starter block)(具有生长至OD₆₀₀为约1.0的农杆菌培养物的96孔板)并从初始板的适当孔中转移1mL来按每个培养容器一个构建体接种。然后在27℃振荡孵育培养物。在得到约1.0的OD₆₀₀(约24小时)后离心培养物。添加200mL浸润培养基以重悬农杆菌沉淀。浸润培养基是通过将2.2g MS盐、50g蔗糖和5μL 2mg/ml苯甲酸嘌呤添加至900ml水中来制备。

浸入浸渍：倒置花盆并浸没5分钟以便使植物的地上部分(aerial portion)处在农杆菌悬浮液中。使植物正常生长并收集种子。

T1转基因植物的高通量筛选：将种子均匀地分散到花盆内的水饱和的土中，并将其置于黑暗的4℃冷却器中持续两个晚上以促进均匀的发芽。然后将花盆从冷却器中移出，并用55％的遮阳布覆盖4-5天。在此阶段子叶完全伸展。将FINALE

(Sanofi Aventis，Paris，France)喷洒到植物上(稀释至48盎司水中的3ml FINALE

)并每3-4天重复一次直至仅保留转化体。

GFP测定

通过眼睛或在放大的条件下使用INOX 5级镊子解剖组织，并将其置于具有水的载玻片上并盖上盖玻片。尝试记录在下列组织发育的最早阶段和最晚阶段观察到的表达模式图像。将用高(H)、中(M)、低(L)标号标在特异性组织之前。

T1成熟：这些是由独立的转化事件而得到的T1植物。它们是在6.50-6.90期(即，植物在开花并且植物将开的花的50-90％已发育)筛选的，是4-6周龄。在此阶段，成熟植物具有花、所有发育阶段的长角果和完全伸展的叶。首先在紫外光下用Leica共聚焦显微镜成像以容许在总体水平检测植物。如果存在表达，则使用激光扫描共聚焦显微镜再次成像。

T2幼苗：从给出相同表达模式的T1植物收集子代并且将子代(T2)灭菌并涂布于含有M&S盐的琼脂固化培养基上。在T1植物中没有表达的情况下，由全部的株系种植T2种子。使幼苗在Percival培养箱中在22℃连续光的条件下生长10-12天。筛选个体幼苗的子叶、根、下胚轴、叶柄、叶和枝分生组织区直至观察到两个幼苗具有相同的模式。一般地，相同的表达模式出现在前两个幼苗中。然而，在记录“没有表达模式”之前筛选最多6个幼苗。以T2幼苗筛选所有构建体，即便它们不具有T1代中的表达模式。

T2成熟：以与T1植物类似的方式筛选T2成熟植物。将T2种子种植在温室中，暴于选择条件并筛选至少一个植物以确定T1表达模式。在表达具有任何微小改变的情况下，检测多个植物并将改变记录在表中。

T3幼苗：与T2幼苗类似地进行，不同的是仅种植我们试图确定表达模式的植物。

图像数据：

通过激光扫描共聚焦显微镜收集图像。扫描的图像作为二维光切面或通过堆叠连续收集的2维光切面产生的3维图像来获取。通过成像软件将所有扫描的图像保存为TIFF文件，在Adobe Photoshop中编辑并在Powerpoint中标记指明器官和特异性表达组织。

结果

启动子表达报告表呈现了GFP测定通过它们相应的构建体编号和株系编号所报告的结果。

在序列表中相关SEQ ID的杂项特征部分中鉴定了上述启动子的一个或多个片段。通过与上述相同的步骤测试这些片段的启动子活性，并将结果总结如下。

没有观察到Ceres启动子YP2581的表达。

在序列表中相关SEQ ID的杂项特征部分中鉴定了上述启动子的一个或多个片段。通过与上述相同的步骤测试这些片段的启动子活性，并且将结果总结如下。

没有观察到Ceres启动子PD3457的表达。

在序列表中相关SEQ ID的杂项特征部分中鉴定了上述启动子的一个或多个片段。

通过与上述相同的步骤测试这些片段的启动子活性，并将结果总结如下。

没有观察到Ceres启动子YP2229的诱导。

Ceres启动子PD3464在稻的根部弱表达。

对于Ceres启动子PD3739，没有观察到表达。

Ceres启动子PD3238在稻的根部弱表达。Ceres启动子PD3229和Ceres启动子PD3243没有观察到表达。

对于Ceres启动子PD2926，与全长启动子PD2995相比表达较弱；启动子在除胚外的所有组织中保持活性。

对于Ceres启动子PD3048，与全长启动子PD2995相比表达较弱；启动子在所有组织中保持活性。

对于Ceres启动子PD3182，未观察到表达。

对于Ceres启动子PD3345，表达极弱。

对于Ceres启动子PD3503，没有观察到表达。

对于Ceres启动子PD3676，与全长启动子PD2995相比表达较弱；在营养组织中比在生殖组织中启动子表达水平更高。

对于Ceres启动子PD2929，与全长启动子PD2999相比表达极弱；启动子在所有组织中保持活性。

对于Ceres启动子PD3183，仅在花药和柱头中检测到表达。

对于Ceres启动子PD3240，与全长启动子PD2999相比表达极弱；启动子在所有组织中保持活性。

对于Ceres启动子PD3266，没有在稻中检测到表达。

Ceres启动子PD3584是强的广泛表达的启动子；与全长启动子PD3141相当。

在序列表中相关SEQ ID的杂项特征部分中鉴定了上述启动子的一个或多个片段。通过与上述相同的步骤测试这些片段的启动子活性，并将结果总结如下。Ceres启动子PD3721是强的营养性表达的启动子，与全长启动子PD3147相当。

在序列表中相关SEQ ID的杂项特征部分中鉴定了上述启动子的一个或多个片段。通过与上述相同的步骤测试这些片段的启动子活性，并将结果总结如下。对于Ceres启动子PD3389，在稻幼苗的根中观察到了表达。

这样描述了本发明，但是对于本领域的普通技术人员来说明显的是可以对实践本发明的材料和方法进行各种修改。这些修改必须被考虑在下列权利要求所界定的本发明的范围内。

来自本文所引用的专利和期刊文献的每篇参考文献都通过这种引用整体清楚地并入本文。

Claims

1.一种具有启动子活性的分离的核酸分子，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

a)根据SEQ ID NO.1-26中的任一个的核苷酸序列；

b)SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000的核苷酸序列；

c)包含(a)或(b)的功能片段的核苷酸序列，其中所述片段具有启动子活性，

并且其中所述分离的核酸分子不是SEQ ID NO：5。

2.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含显示出与SEQ ID NO 1-26的任一个或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核酸分子包含指导可操作地连接的异源多核苷酸转录的调节区，并且其中所述分离的核酸分子不是SEQ ID NO：5。

3.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列显示出与SEQ ID NO 1-26的任一个或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000具有至少85％序列同一性。

4.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQID NO 1-26的任一个或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000具有至少90％序列同一性。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述调节区包含选自由启动子、增强子和内含子组成的组的至少一个成员。

6.一种分离的核酸分子，所述核酸分子由根据SEQ ID No.1-4、SEQID NO：6-26和SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000的任一个的核苷酸序列构成。

7.一种载体构建体，所述载体构建体包含：

a)根据权利要求1-6中任一项所述的第一核酸分子；和

b)可转录的多核苷酸分子，

8.根据权利要求7所述的载体构建体，其中所述第一核酸分子由SEQID NO：1-26的任一个或SEQ ID NO：26的核酸残基601-1000中所列的核酸分子构成。

9.根据权利要求7或8所述的载体构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子编码多肽。

10.根据权利要求9所述的载体构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子以有义方向与所述第一核酸分子可操作地连接。

11.根据权利要求10所述的载体构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子被转录成表达由可转录的多核苷酸分子所编码的多肽的RNA分子。

12.根据权利要求7或8所述的载体构建体，其中所述可转录的多核苷酸第二核酸分子以反义方向与所述第一核酸分子可操作地连接。

13.根据权利要求12所述的载体构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子被转录成反义RNA分子。

14.根据权利要求7或8所述的载体构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子被转录成针对内源基因的干扰RNA。

15.根据权利要求9所述的载体构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子编码农学上重要的多肽。

16.一种植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含：

a)根据权利要求1-6中任一项所述的与异源多核苷酸可操作地连接的核酸分子；或

b)根据权利要求7-15中任一项所述的载体构建体。

17.一种植物或植物细胞，所述植物或细胞被根据权利要求7-15中任一项所述的载体构建体稳定地转化。

18.根据权利要求16-17中任一项所述的植物的种子。

19.一种在适于转录的环境中通过组合下列物质来指导转录的方法：

a)根据权利要求1-6中任一项所述的第一核酸分子；和

b)可转录的多核苷酸分子；

20.一种在植物中表达外源编码区的方法，所述方法包括：

a)用权利要求7-10和15中任一项所述的载体转化植物细胞；

b)由步骤(a)的转化的植物细胞再生稳定转化的植物；以及

c)选择含有转化的植物细胞的植物，

其中所述可转录的多核苷酸分子的表达导致了由所述可转录的多核苷酸分子所编码的多肽的产生。

21.一种在植物中改变基因的表达的方法，所述方法包括：

a)用根据权利要求1-6中任一项所述的核酸分子转化植物细胞，所述核酸分子与异源多核苷酸可操作地连接；和

b)由所述转化的植物细胞再生稳定转化的植物。

22.一种植物，所述植物是根据权利要求20或21所述的方法制备的。

23.种子，所述种子来自根据权利要求22所述的植物。

24.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括：

a)向植物细胞中引入：

(i)包含根据权利要求1-6中任一项所述的核酸的分离的多核苷酸，所述核酸与异源多核苷酸可操作地连接；或

(ii)根据权利要求7-15中任一项所述的载体；以及

b)由所述植物细胞生长植物。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含编码多肽的核酸序列。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述异源多核苷酸以反义方向与所述调节区可操作地连接。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述异源多核苷酸被转录成干扰RNA。