KR20150020113A - mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 - Google Patents

mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 라파마이신이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포에 있어서; CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포 표면인자가 발현되는 간엽줄기세포, 상기 간엽줄기세포를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 및 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 라파마이신(rapamycin)이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포는 면역조절능을 갖는 인자인 IDO, TGF-beta 및 IL-10의 발현이 증가되어 있고, mTOR의 신호전달 인자인 Phospho-mTOR, Rictor 및 Ractor의 발현은 감소되어 있으며, 자가포식 유도인자인 Beclin1, ATG5, ATG7, LC3I 또는 LCII의 발현이 상기 세포 내에서 증가되어 있는 세포로서, 이 세포를 면역질환 개체에 세포치료제로 사용하는 경우, 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있는 효과가 있다.

Description

mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물{Mesenchymal stem cells treated mTOR/STAT3 signaling inhibitor having immuno-modulating activity and cell therapeutic agent for preventing or treating immune disease}
본 발명은 라파마이신이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다.
면역(Immunity)은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호 체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절비장편도 등으로 순환하는 백혈구다. B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성한다. B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. T세포는 흉선에서 만들어져 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.
이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 각종 자가면역질환이 발병하게 된다.
한편, 이러한 자가면역질환을 치료하는 주된 방법은 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 치료에 한계가 있다.
따라서 보다 효과적인 새로운 면역질환 치료제의 개발이 연구 및 개발되고 있는데, 최근 들어 면역질환 치료를 위한 세포치료제가 개발이 되고 있으며, 세포치료제로서 줄기세포를 이용하려는 연구가 점점 증가하고 있다.
특히, 줄기세포 중 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)는 아직까지 면역조절능력에 대한 정확한 작용기전이 밝혀져 있지 않고 우수한 면역질환 치료 효과를 갖는 줄기세포의 제조에 대한 연구도 거의 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 줄기세포를 이용하여 효과적으로 면역치료를 위한 세포치료제를 연구하던 중, 라파마이신을 처리하여 제조한 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)가 우수한 면역질환 치료 효과를 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2005-0038656호
따라서 본 발명의 목적은 라파마이신(rapamycin)이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포에 있어서; CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포 표면인자가 발현되는 간엽줄기세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 라파마이신(rapamycin)이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포에 있어서; CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포 표면인자가 발현되는 간엽줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 라파마이신은 간엽줄기세포 2.5×105 내지 7.5×105 세포수를 기준으로 10~100mM의 농도로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 라파마이신 처리에 의해 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 라파마이신 처리에 의해 mTOR의 신호전달 인자인 Phospho-mTOR, Rictor 및 Ractor의 발현이 상기 세포 내에서 감소되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 라파마이신 처리에 의해; Beclin1, ATG5, ATG7, LC3I 및 LCII로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 자가포식 유도인자의 발현이 상기 간엽줄기세포 내에서 증가되어 있는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 투여개체의 체중 kg당 1×106 내지 5×107 세포수로 투여할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 이식거부질환, 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은, 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 2.5×105~7.5×105 세포수의 간엽줄기세포에 라파마이신을 10~100nM의 농도로 처리하고, 18~27 시간 동안 (28~42℃ 배양)의 조건으로 배양하는 단계를 포함하는, 라파마이신이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포에 있어서; CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포 표면인자가 발현되는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 라파마이신이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포에 있어서; CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포 표면인자가 발현되는 간엽줄기세포, 상기 간엽줄기세포를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 및 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 라파마이신(rapamycin)이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포는 면역조절능을 갖는 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가되어 있고, mTOR의 신호전달 인자인 Phospho-mTOR, Rictor 및 Ractor의 발현은 감소되어 있으며, 상기 간엽줄기세포는 라파마이신 처리에 의해; Beclin1, ATG5, ATG7, LC3I 및 LCII로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 자가포식 유도인자의 발현이 상기 간엽줄기세포 내에서 증가되어 있는 간엽줄기세포로서, 이 세포를 면역질환 개체에 세포치료제로 사용하는 경우,효과적으로 면역질환을 치료할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포에 라파마이신을 처리하여 세포 내에서 발현되는 IL-10, IDO 및 TGF-b의 발현 정도를 분석한 결과(A) 및 라파마이신을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포에서 발현되고 있는 IDO 및 IL-10의 양을 형광현미경을 통해 관찰한 사진이다(B).
도 2는 중간엽줄기세포의 병인 Th17 세포증식억제 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 라파마이신을 처리한 간엽줄기세포의 HMGB-1, IL-6, IL-1beta의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 라파마이신을 처리한 간엽줄기세포 및 라파마이신이 처리되지 않은 간엽줄기세포의 표현형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 라파마이신을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포에서 형성되는 자가포식 소낭의 형성정도를 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 6은 라파마이신을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포에서 자가포식 작용에 관여하는 인자인 ATG5, LC3A 및 LC3B의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR를 수행하여 분석한 결과 및 자가포식 작용에 관여하는 인자들의 발현 정도를 웨스턴블럿을 통해 분석한 사진과 각 인자의 발현양을 수치화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 라파마이신을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포의 세포 표면에서 발현되고 있는 세포 이동에 관여하는 인자들의 발현정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 라파마이신을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포의 세포 이동 정도를 세포 이동 분석키트를 사용하여 분석한 결과를 나타낸 것으로서, 도 8A는 이동된 세포들이 염색된 정도를 현미경으로 관찰한 것을 나타낸 것이고, 도 8B는 이동된 세포수를 카운팅하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 골관절염이 유도된 마우스 모델을 대상으로 라파마이신을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(Rapa-MSC), 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC), 아무것도 처리하지 않은 군(MIA) 및 정상 마우스(Normal)군에서의 통증 분석 결과를 나타낸 것이고(A), 연골의 파괴정도를 인디아 잉크 염색법으로 염색하여 관찰한 사진이다(B).
도 10은 골관절염 유발 동물의 관절염증과 연골의 파괴정도를 분석하기 위해 H&E, Toluidin blue염색, saffranin O 염색을 한 사진이다.
도 11은 염증성 장질환 마우스 모델에서 라파마이신이 처리된 중간엽줄기세포의 질환 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 염증성 장질환 마우스 모델에서 라파마이신이 처리된 중간엽줄기세포에 의한 질병 제어 효과를 조직에서 H&E 및 IHC 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 관절염 마우스 모델에서 라파마이신이 처리된 중간엽줄기세포에 의한 질환 치료 효과로서 serum 내 IgG, IgG1, IgG2a의 농도를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에서, 골관절염이 유발된 동물모델에 중간엽줄기세포를 단독 처리한 경우(MSC) 및 라파마이신을 처리한 중간엽줄기세포의 경우(Rapa-MSC) 각각에 대한 관절염지수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 라파마이신이 처리된 중간엽줄기세포를 이식거부질환 동물 모델에 주입하여 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 라파마이신이 처리된 지방유래 간엽줄기세포에 의한 루푸스 동물 모델 세포에 미치는 면역조절 능력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따라서 본 발명의 라파마이신과 중간엽줄기세포에 의한 Th17 및 Treg 세포 조절 효과를 유세포 분석기(FACs)로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 우수한 면역질환 치료 효과를 갖는, 라파마이신이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포에 있어서; CCR1(C-C chemokine receptor type 1), CCR2(C-C chemokine receptor type 2), CCR3(C-C chemokine receptor type 3), CCR4(C-C chemokine receptor type 4), CCR7(C-C chemokine receptor type 7), CCR9(C-C chemokine receptor type 9) 및 CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포 표면인자가 발현되는 간엽줄기세포를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 라파마이신(rapamycin)을 간엽줄기세포에 처리하는 것을 특징으로 하며, 라파마이신은 IUPAC 명명법으로 (3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-hexadecahydro-9,27-dihydroxy-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylethyl]-10,21-dimethoxy-6,8,12,14,20,26-hexamethyl-23,27-epoxy-3H-pyrido[2,1-c][1,4]-oxaazacyclohentriacontine-1,5,11,28,29 (4H,6H,31H)-pentone 이고, 분자식은 C51H79NO13 이며, 분자량은 914.172이다.
<화학식 1>
Figure pat00001
본 발명자들은 면역질환을 치료할 수 있는 세포치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 라파마이신을 처리하여 제조한 간엽줄기세포가 라파마이신을 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 면역질환의 치료 효과가 현저하게 우수함을 실험을 통해 확인하였다.
따라서, 본 발명은 라파마이신(rapamycin)이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공할 수 있으며, 상기 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
상기 간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막 등에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다.
특히 본 발명에서 사용되는 상기 간엽줄기세포는, 동물의 간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있다. 또한 본 발명의 간엽줄기세포는 골수, 지방조직, 말초혈액, 간, 폐, 양수, 태반의 융모막 또는 제대혈로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 지방조직 또는 말초혈액에서 유래한 것을 사용할 수 있다.
참고로, 간엽줄기세포는 상기와 같이 다양한 소스로부터 수득할 수 있는데, 간엽줄기세포를 얻는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: (1) 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수 또는 지방조직으로부터 간엽줄기세포를 분리하는 단계; (2) 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 (3) 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 간엽줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.
상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.
또한, 분리하여 배양한 간엽줄기세포의 확인은 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 간엽줄기세포는 CD44, CD29 및/또는 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타내므로, 이를 통해 간엽줄기세포를 검증할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 다양한 소스로부터 유래한 간엽줄기세포를 면역질환의 치료 용도로 사용하고자 라파마이신을 처리하여 면역조절능을 갖는 새로운 간엽줄기세포를 제조하였다.
상기 라파마이신(Rapamycin)은 항균제로 잘 알려져 있는 화합물로서 미생물 Streptomyces에서 발견되었고 거대한 석상으로 유명한 ester island에서 발견되었다. 이러한 라파마이신은은 곰팡이의 세포 분열을 억제하는 활성을 갖는다는 사실이 알려져 있으며, 이후에는 면역억제 효과 작용을 갖는다는 사실도 알려져 있다. 또한, 최근에는 항암 작용이 있는 것으로도 밝혀지고 있다.
이에 본 발명자들은 이러한 라파마이신과 간엽줄기세포를 이용한 새로운 면역질환 치료제를 개발하기 위해, 라파마이신에 간엽줄기세포를 처리한 결과, 라파마이신을 처리하여 배양 및 수득한 간엽줄기세포는 세포 내에서 면역조절능과 관련된 TGF-beta, IDO 및 IL-10 유전자의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다(도 1 참조).
면역조절능과 관련성이 있는 상기 TGF-beta, IDO 및 IL-10에 대해 보다 구체적으로 설명하면, TGF-beta(Transforming growth factor beta)는 세포의 성장을 촉진하거나 억제할 수 있으며, 면역조절능이 있다고 알려져 있다. 본 발명의 실험에서는 라파마이신이 처리된 지방조직 유래 간엽줄기세포의 경우, 라파마이신을 처리하지 않은 경우에 비해 TGF-beta의 발현정도가 거의 30배 증가하는 것으로 확인되었다.
또한, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 면역계의 기능 및 활성을 측정하는 인자로 알려져 있으며, 최근 IL-10과 함께 염증을 억제하는 활성이 있는 것으로 밝혀졌다.
뿐만 아니라, 라파마이신을 처리하여 제조한 본 발명의 간엽줄기세포는 자가포식 작용에 관여하는 유전자들의 발현 역시 증가되어 있는 것으로 확인되었고, 이 세포 내에서는 mTOR의 신호전달 작용이 억제되어 있는 것으로 확인되었다(도 6 참조).
자가포식 작용(autophagy)은 세균이 자신의 소기관이나 세포성분을 분해하는 과정으로서, 세포 외에서 고분자를 음작용이나 식작용 등의 세포내 섭취에 의해 받아들이는 헤테로파지와는 구분되는 작용이다. 세포가 영양소 결핍에 반응하여 자신의 단백질을 분해하거나, 세포의 재구축 등의 과정에서 불필요한 세포 성분을 제거하기 위해 작용하며, 세포 성분은 소포체에 유래하는 막에 둘러싸여 자식식포를 형성하고, 또한 리소솜과 융합하여 자식파고리소솜을 형성하여 분해하게 한다.
또한, 이러한 자가포식 작용은 면역과 염증의 유익하거나 해로운 효과를 조절할 수 있고 감염성 질환, 자가면역과 염증질환을 방지할 수 있는 효과가 있기 때문에, 본 발명에서 라파마이신이 처리된 상기 간엽줄기세포는 자가포식작용을 가지고 있어 면역 및 염증질환의 치료에 보다 유용할 수 있다.
나아가 본 발명에서는 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 면역질환 치료 효과가 mTOR 신호전달의 억제와 관련성이 있는지 확인하기 위해, 활성형의 mTOR 인산화 정도를 분석한 결과 라파마이신 처리시 mTOR 인산화 정도가 감소되어 있는 것으로 나타났고, Rictor 및 Ractor의 발현도 감소되어 있는 것으로 나타났다.
참고로, mTOR 신호전달 경로는 단백질 합성을 조절하는데 있어서 매우 중요하며, 다양한 암 세포에서 활성화되어 있는 것으로 알려져 있다. Hsieh 등은 전립선암세포와 생쥐 전립선 암에서 암세포의 침윤에 관여하는 몇몇 유전자들이 mTOR에 의해 조절된다는 사실을 밝혀진 바 있다. 또한, mTOR의 신호억제는 종양세포에 대한 효과 뿐만 아니라 면역세포들에 대한 광범위한 조절 효과도 가지고 있는 것으로 보고되고 있으며, 특히 mTOR의 억제는 면역억제 효과와도 직결되는 것으로 알려져 있다.
따라서 본 발명에서 라파마이신의 처리에 의해 간엽줄기세포 내에서는 mTOR의 신호 전달이 억제되어 있는 것으로 볼 수 있다.
또한, 본 발명자들은 라파마이신을 처리하여 제조한 간엽줄기세포가 세포 이동성을 가지고 있는지 조사하였는데, 그 결과, 라파마이신을 처리한 간엽줄기세포의 경우, 세포 내에서 세포 이동성과 관련된 케모카인들의 발현이 증가되어 있는 것으로 확인되었다(도 7 및 도 8 참조).
이로써 본 발명자들은 본 발명에 따른 간엽줄기세포를 세포 치료제로 사용할 경우, 타겟이 되는 병변부위로 세포가 효율적으로 이동하여 목표지점에서 치료 효과를 도출할 수 있을 것으로 예상할 수 있었다.
본 발명에서 제조한 면역조절능을 갖는 상기 간엽줄기세포는 투여개체의 체중 kg당 간엽줄기세포 1×106 내지 5×107 세포수를 기준으로 10~100nM의 농도의 라파마이신을 처리하여 제조할 수 있으며, 보다 바람직하게는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포 5×105 세포수에 라파마이신을 100nM의 농도로 처리하고, 18~27 시간 동안 28~42℃의 온도 조건으로 배양하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포치료제란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.
본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 체중 kg당 1×106 내지 5×107 세포수의 세포치료제가 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 조성물에 포함되는 세포치료제는 체중 kg당 1×104 내지 1×108 세포수를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내(intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에서 라파마이신 처리에 의해 제조된 간엽줄기세포 및 상기 세포를 포함하는 면역질환 치료용 세포 치료제 조성물이 치료하고자 하는 상기 면역질환은 이에 제한되지는 않으나, 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 이식거부질환, 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)을 포함할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 면역조절능과 관련된 유전자의 발현
변화 분석
<1-1> 말초혈액으로 간엽줄기세포 분리 및 배양
Ficoll-paque를 이용하여 말초 혈액에서 단핵구세포를 분리한 뒤 20% 우태아혈청 (FBS)이 포함된 DMEM 배지에서 6일간 배양한 다음, 위로 뜬 세포를 제거하여 세포 배양 플레이트에 부착된 세포만을 가지고 계대배양을 진행하였으며, 계대배양 조건은 5% CO2 및 37℃의 온도 조건에서 배양하였다. 이후 배양액은 3일 간격으로 교체하면서 배양하여 말초혈액으로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하였다.
<1-2> 지방조직으로부터 간엽줄기세포 분리 및 배양
지방 흡입수술로 얻어진 지방 조직이나, 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2-0.3g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.2% 콜라게나아제 (Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃의 수욕, 100 rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해 되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 가라앉은 MSC로부터 남은 콜라게나아제 용액을 제거하기 위해서 MSCGM [mesenchymal stem cell growth media: MSC 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간엽세포 성장 보조물 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4 mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500㎖)/스트렙토마이신(0.025 mg/500㎖)]를 넣어 다시 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. MSCGM은 우태아혈청을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에 기초한 배지이다. 이어, 상층액을 제거하고, 얻어진 MSC는 배양접시에 접종하여 MSCGM로 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 이틀에 한번 씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.
<1-3> 면역조절능과 관련된 유전자의 발현 정도 분석
상기 <실시예 1>에서 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 라파마이신을 각각 처리한 다음, 면역조절능과 관련된 유전자인 IDO, IL-10 및 TGF-beta의 발현 변화를 분석하였다.
먼저 60mm dish 조건 하에서 지방조직 유래 간엽줄기세포에는 5×105 세포수에 대해 100nM 농도의 라파마이신을 처리하여 37℃ 하에서 배양한 간엽줄기세포를 사용하였다.
이때, 대조군으로는 라파마이신이 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 면역조절능 유전자의 발현 정도는 real time PCR 방법을 사용하여 분석하였다.
분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 간엽줄기세포에 라파마이신을 처리한 경우, 라파마이신을 처리하지 않은 군에 비해 IL-10, IDO, TGF-beta의 발현 정도는 각각 5배 정도 증가한 것으로 나타났다(도 1A 참조). 또한, 현광현미경 분석결과 IL-10 사이토카인 역시 라파마이신의 처리에 의해 그 발현이 의미있게 증가하는 것으로 나타났다(도 1B 참조).
따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 경우, 라파마이신을 처리하지 않은 세포에 비해, IDO, IL-10 및 TGF-beta의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다.
<실시예 2>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 병인 Th17 세포증식억제 효과 분석
본 발명자들은 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에 의한 T 세포 증식 억제능을 조사하기 위하여 싸이미딘을 처리하여 T세포 증식반응을 조사하였다.
먼저, 마우스 CD4+ T 세포(1×105)와 간엽줄기세포(1×104)를 1:10 비율로 넣어 3일간 96well plate에서 37℃ 하에서 공조 배양하였다. 3일 후 싸이미딘을 처리하여 T 세포 증식반응을 조사하여 T 세포 증식 억제능을 분석하였다.
분석 결과, 간엽줄기세포에 의한 T 세포 증식억제능이 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에 의해 더욱 감소되는 것을 확인할 수 있었다.(도 2)
<실시예 3>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 염증인자 및 종양인자 억제 효과 분석
상기 <실시예 1>에서 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 라파마이신을 각각 처리한 다음, 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자인 HMGB-1(High-mobility group protein B1), IL-6, IL-1beta의 발현 변화를 분석하였다.
먼저 60mm dish 조건 하에서 지방조직 유래 간엽줄기세포에는 5×105 세포수에 대해 100nM 농도의 라파마이신을 처리하여 37℃ 하에서 배양한 간엽줄기세포를 사용하였다.
이때, 대조군으로는 라파마이신이 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 면역조절능 유전자의 발현 정도는 real time PCR 방법을 사용하여 분석하였다.
분석결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 간엽줄기세포에 라파마이신을 처리한 경우, 라파마이신을 처리하지 않은 군에 비해 HMGB-1, IL-6, IL-1beta의 발현 정도가 현저하게 감소됨을 확인하였다.
<실시예 4>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 세포 표현형 CD마커 분석
상기 <실시예 1>에서 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 라파마이신을 각각 처리한 다음, 간엽줄기세포의 표현형을 분석하였다.
이때, 대조군으로는 라파마이신이 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 세포 표지자 발현 정도는 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다.
분석결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 간엽줄기세포에 라파마이신을 처리한 군은 라파마이신을 처리하지 않은 군과 같이 양성표지자인 CD105, CD29, CD44가 유사하게 발현되었고, 음성표지자인 CD45, HLA-DR의 발현은 모두 음성으로 관찰되었다.
<실시예 5>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 자가포식 소낭(autophagic vacuoles) 형성 여부 분석
본 발명자들은 하기 실시예 6의 결과를 통해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 자가포식과 관련된 단백질들의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 특히 Beclin-1과 LC3은 자가포식시 발현이 증가되는 단백질로서 Beclin-1은 sutophagosome을 형성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, LC3은 autophagy가 일어나면 LC3의 두 가지 형태 중에서 LC3형태가 LC3 형태로 전환되면서 autophagosome의 막에 결합하기 때문에 autophagosome의 직접적인 지표가 되고 있다.
한편, 자가포식작용은 면역과 염증의 유익하거나 해로운 효과를 조절할 수 있고 감염성 질환, 자가면역과 염증질환을 방지할 수 있는 효과가 있기 때문에, 본 발명에서 라파마이신이 처리된 상기 간엽줄기세포는 자가포식작용을 가지고 있어 면역 및 염증질환의 치료에 보다 유용할 수 있다.
이에 본 발명자들은 간엽줄기세포에 라파마이신을 50uM의 농도로 처리한 후, 1시간 경과한 다음, 전자현미경으로 자가포식 소낭 생성 정도를 관찰하였다.
분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 자가포식 소낭(autophagic vacuoles) 의 숫자가 증가하는 것으로 나타났으며, 도면에서 빨간 화살표가 자가포식 소낭을 나타낸 것이다.
따라서 이러한 결과로부터 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 미토콘드리아 질환의 치료에 유용한 효과를 확인하였다.
<실시예 6>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 자가소화작용(autophagy)과 관련된 유전자들의 발현 변화 분석
<6-1> RT-PCR에 의한 분석
상기 실시예 1에서 분리 및 배양한 지방조직 유래의 간엽줄기세포에 10ng/ml의 라파마이신을 처리하고 12시간 경과 후, 세포들을 수집하고 총 RNA를 수득하였다. 이후 상기 RNA를 기반으로 cDNA 합성키트(Roche, Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)를 제조하였다. 이후 상기 합성된 cDNA를 가지고 자가소화작용 인자 마커인 ATG5, LC3A, LC3B 유전자의 발현 정도를 실시간 PCR을 수행하여 분석하였다. 그리고 이때 PCR을 위해 수행한 각 프라이머 서열은 하기에 기재된 바와 같다.
프라이머명 프라이머 서열(5'-3')
ATG5 F-primer TTTTCACTGTGGTCCCTGGC
ATG5 R-primer ATCCCCAAAATGAACCGACG
LC3 F-primer AGACCTTCAAGCAGCGCCG
LC3 R-primer ACACTGACAATTTCATCCCG
GAPDH F-primer ACCACAGTCCATGCCATCAC
GAPDH R-primer TCCACCACCCTGTTGCTGTA
분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 라파마이신을 처리하지 않은 군에 비해 처리한 군의 경우, ATG5, LC3A, LC3B 유전자의 발현 정도가 유효하게 증가한 것으로 나타났다(도 6A).
<6-2> 웨스턴 블럿 분석
이어 본 발명자들은 <6-1>의 결과에 이어 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 경우, 라파마이신에 의해 mTOR 신호 경로가 조절될 수 있는지 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이를 위해 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 대상으로 10ng/ml의 라파마이신을 처리한 후, 1시간이 경과한 후 세포들을 용해시켜 단백질을 추출하였다. 이후 추출된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동 한 후, nitorcellulose membrane으로 단백질들을 전기적 이동시킨 다음, 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 블록킹 반응시키고, Beclin1, ATG5, ATG7, LC3I,II, Phospho-mTOR, mTOR, Rictor, Ractor에 대한 1차 항체를 붙여 반응시킨 후, 이에 대한 2차 항체를 붙여 다시 반응시킨 다음, Enhanced Chemilunimoecence (ECL) 용액을 사용하여 Kodak X-ray에 감광시켜 이들 유전자의 단백질 발현정도를 분석하였다(도 6C).
분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 라파마이신 처리 시 간엽줄기세포 내에서 mTOR의 활성화(인산화)가 억제되는 것으로 나타났고, 반면, Beclin1, ATG5, ATG7, LC3I,II의 발현은 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 ATG7은 발현 증가 정도가 매우 월등한 것으로 나타났다(도 6B).
따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포는 mTOR의 활성화 및 mTOR 신호전달 인자의 발현이 억제되어 있다는 것을 알 수 있었고, 반면, 자가소화작용과 관련된 유전자들의 발현은 증가되어 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 7>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에서 세포이동에 관여하는 유전자 발현분석
<7-1> 세포이동 표지자의 발현 분석
본 발명자는 라파마이신(50nM로 처리)이 처리된 지방유래 간엽줄기세포가 세포 이동 능력을 가지고 있어 병소부위로 이동이 가능한지 확인하기 위해, 간엽줄기세포의 이동과 관련된 인자인 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4의 발현 정도를 실시간 PCR을 수행하여 분석하였다.
분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 라파마이신을 처리하지 않은 군에 비해 라파마이신을 처리한 간엽줄기세포에서는 CCR1(약 115배), CCR2(약 25배), CCR3(약 70배), CCR4(약 32배), CCR7(약 200배), CCR9(약 150배) 및 CXCR4(약 60배)의 발현이 확연히 증가되어 있는 것으로 나타났다.
<7-2> 세포이동 정도 분석
라파마이신(10ng/ml로 처리)이 처리된 간엽줄기세포의 세포 이동을 확인하기 위해, 세포이동키트(Chemicon, Temecula, CA)를 사용하여 분석하였다. 즉, 아래 챔버에는 CD4+T 세포단독군, CD4+T 세포와 Rapamycin (10ng/ml)이 처리된 군, SDF-1와 CD4+T 세포처리 군을 각각 넣어두었고, 간엽줄기세포를 위의 챔버에 넣어주었다. 이후 위에 넣어준 지방조직 유래 간엽줄기세포가 아래 챔버로 이동하기 위해 polycarbonate membrane을 통과한 세포를 염색하였고, 그 수를 카운팅하여 관찰하였다.
그 결과, CD4+T 세포와 Rapamycin (10ng/ml)으로 처리한 군이 아무것도 처리되지 않은 간엽줄기세포에 비해 통계적으로 더 많이 이동되어 있는 것으로 나타났다.
그러나 autophagy 저해제인 bafilomycin을 처리한 후 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 세포이동능력이 감소됨을 확인하였다(도 8 참조).
<실시예 8>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 골관절염 치료효과
상기 본 발명에 따라 제조된 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포가 실제적으로 면역질환의 치료 효과에 유용한지 확인하기 위해 먼저 골관절염 유발 동물모델을 대상으로 치료 효과를 조사하였다.
먼저, 골관절염 동물모델은 제작하기 위해 200 ~ 250g인 5주령 수컷 Wistar rat(중앙실험동물)을 21 ~ 22℃의 온도에서 명암주기(light-dark cycle)를 12시간 간격으로 사육하였고 살균한 물과 사료를 공급하여 키웠다. 이후 골관절염 유도를 위해 3mg의 monosodium iodoacdtate(Sigma, ST. Louis, MO)를 오른쪽 무릎의 관절내에(intra-articular) 26.5G 주사기를 사용하여 50ul씩 주입하여 골관절염이 유도된 마우스 동물을 제작하였다.
이후, 골관절염이 유도된 마우스에 2×106 세포수의 간엽줄기세포 및 100nM농도로 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 1주일에 한번씩, 총 2회 i.v.로 주입하였다. 이후, 7일 경과한 다음, 골관절염 유발 동물의 행동력에 미치는 영향을 평가하는 지표인 통증정도를 측정하였고, india ink 염색법으로 연골의 파괴정도를 분석하였다.
분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 통증반응정도가 정상 마우스에 거의 근접한 것으로 나타났고, 연골 파괴 정도도 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 처리한 군이 정상과 유사하게 회복되어 있는 것으로 나타났다. 참고로 도 9의 하단 사진은 연골 손상부위를 표시한 것으로서, 왼쪽으로부터, 첫 번째 사진은 골관절염 유도 마우스 군, 두 번째 사진은 골관절염 유도 후 간엽줄기세포를 처리한 군, 세 번째 사진은 골관절염 유도 후 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 처리한 군을 나타낸 것으로서, 세 번째 사진의 경우, 연골손상이 다른 군에 비해 가장 적게 나타나 있는 것으로 확인되었다.
<실시예 9>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 골관절염 통증 및 염증 치료효과
상기 <실시예 8>에서 사용한 골관절염이 유도된 마우스의 골관절염 통증 및 염증 치료효과를 분석하기 위해 H&E, Toluidin blue염색, saffranin O 염색을 하였다.
분석 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 염증세포의 침윤이나 연골 파괴의 정도가 현저하게 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 10).
<실시예 10>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 염증성 장질환 치료효과
염증성 장질환의 마우스 모델을 제조하기 위해, 시험동물은 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하였으며, 상기 마우스에 3.5% 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS) 물을 1주일간 음용하게 하여 염증성 장 질환 유도 동물 모델을 제작하였다. 이후 상기 염증성 장질환 마우스 동물에 지방조직 유래 간엽줄기세포 및 라파마이신이 처리된 지방조직유래 간엽줄기세포를 2×106의 세포수로 i.v.로 일주일에 한 번씩 총 2회 주입하였고, 증상(몸무게, 대장의 길이, DAI(disease activity index))을 확인하였다.
분석 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 지방조직 유래 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 라파마이신을 처리한 간엽줄기세포의 경우, 염증성 장질환으로 감소된 마우스의 몸무게가 더 효과적으로 회복되는 것으로 나타났고(도 11A), IBD 질병 활성도 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며(도 11B), 대장의 두께와 길이도 회복되어 진 것으로 나타났고, 장길이의 단축 현상이 정상과 유사하게 회복되는 것으로 확인되었다(도 11C).
< 실시예 11>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 염증성 장질환 치료효과
본 발명자들은 상기 <실시예 10>에서 사용한 염증성 장질환 마우스 모델에서 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포에 의한 질병 제어 효과를 조직에서 H&E 염색을 통해 확인하였다.
분석 결과, 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 모델에서 장내 염증세포의 침윤 등이 감소되어 있는 것을 관찰하였다(도 12A). 또한, 장에서 염증성 사이토카인인 TNF-a(Tumor necrosis factor alpha)를 IHC(Immunohistochemical) 염색한 결과, 질환 유도군과 비교했을 때 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 모델에서 TNF-a의 양이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(도 12B).
< 실시예 12>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 관절염 치료효과
본 발명자들은 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포가 관절염에도 치료 효과가 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저 자가면역 관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, Y. Iwakura팀이 발표한 방법에 따라 IL-1 수용체 유전자를 결손시킨 마우스(IL-1Ra knockout mouse)를 제작하였는데, 이는 인터루킨1 수용체억제인자(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)가 IL-1수용체에 직접 작용하여, IL-1α, IL-1β가 수용체에 작용하지 못하도록 함으로써 자연적으로 자가면역관절염 질환이 유발되도록 하는 방법이다.
관절염이 유발된 마우스를 대상으로 본 발명에서 제조한 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 상기 질환 마우스에 주입하였는데, 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 2×106의 세포수로 상기 마우스에 i.v.로 일주일에 한 번씩 총 3회 주입하였고, 1주일 후 이들 마우스로부터 혈청을 분리하여 혈청 내 존재하는 IgG, IgG1 및 IgG2a의 양을 분석하였다. 이때 대조군으로는 관절염이 유발된 마우스의 혈청 및 지방조직 유래 간엽줄기세포만이 주입된 관절염 마우스의 혈청을 대상으로 상기 면역글로빈의 양을 측정한 것을 사용하였다.
분석 결과, 간엽줄기세포만을 처리한 군에 비해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 투여한 마우스 군의 경우, 관절염 증상이 개선되는 것으로 나타났고, 면역반응에 작용하는 Th2 타입의 IgG1과 Th1 타입의 IgG2a의 생성이 모두 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(도 13 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 경우, 면역반응을 조절할 수 있는 활성이 있어 면역질환, 특히 자가면역질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 13>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 관절염 치료효과
본 발명자들은 라파마이신을 처리한 간엽줄기세포와 일반 간엽줄기세포의 치료효과를 확인하기 위해 자가항원활성유도를 통한 류마티스 관절염 동물모델에 투여한 후 치료효과를 확인하였다.
관절염 동물을 제작하기 위해, DBA/1J마우스에 type II collagen(CII)과 CFA(adjuvant) 1:1 로 혼합하여, 마우스당 100ug의 CII를 tail base에 50ul 용량으로 주사하고, 2주후 CII와 IFA 1:1로 혼합액을 100ug/50ul로 2차로 주입하였다.
마우스에 관절염을 유도시키고 1주일 후, 1주일에 1회 총3회 정맥을 통해 아무것도 처리되지 않은 간엽줄기세포 또는 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포 1×106~5×107(체중 kg 당)를 투여한 후 관절염 평가를 진행하였다.
관절염 지수의 측정을 위해 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 세 명이 일주일에 세 번씩 관절 염증의 위증도를 평가하여 29일까지 관찰하였다. 이때 관절염의 평가는 Rossoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수에 기준하여 마리당 2차 접종 때 CII/CFA를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.
0점 : 부족이나 종창이 없다.
1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적
이때 마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 쥐 1마리당 최고의 질병지수는 16이다.
분석결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 관절염이 더욱 현저하게 억제되는 것으로 나타났다.
< 실시예 14>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 이식거부질환 치료효과
본 발명자들은 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포가 이식거부질환에도 치료 효과가 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
<14-1> 이식거부질환의 치료 효과 분석
먼저, 이식거부질환 동물 모델을 제조하기 위해, 수여 마우스 Balb/c (H-2k/d)를 전신방사선조사(TBI) 800cGy를 하고 공여마우스 C57BL/6 (H-2k/b)의 대퇴골과 경골에서 조혈모세포와 비장세포를 분리하여 조혈모세포 5x106과 비장세포 1×106 을 수여 마우스 Balb/c(H-2k/d)에 이식하였다.
이식 후, 다음날 아무것도 처리되지 않은 간엽줄기세포 또는 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 복강내 1×106 세포수로 투여한 후 이들에 의한 효력 평가를 진행하였다.
분석 결과, 마우스의 무게, 질병도 측정 및 생존도를 관찰한 결과, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비하여 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 이식거부질환 마우스의 질병도를 개선시키고 마우스의 생존도 또한 30일 간 유지되는 것을 확인하였다(도 15A).
<14-2> 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 모델의 염증세포 침윤 분석
먼저, 이식거부질환 모델 마우스를 대상으로 본 발명에서 제조한 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 상기 질환 마우스에 주입하였다. 이식 후 일주일 후, 마우스의 피부 및 장기(간)를 채취하여, 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후 조직 절편을 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본 염색을 진행하기 전에 자일렌(xylen)을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과 후, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수 시켰다. 염색 과정은 헤마톡실린과 에오진 염색을 진행하였다.
분석 결과, 간엽줄기세포만을 처리한 군에 비해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 투여한 마우스 군의 경우, 염증세포의 침윤이 현저하게 감소된 것을 확인하였다(도 15B).
<14-3> 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 모델의 사이토카인 및 비장세포 내 T 세포 분석
먼저, 이식거부질환 모델 마우스에서 비장을 채취하였다. 채취한 비장으로부터 면역화학염색법을 이용하여 사이토카인(IFN-r, IL-17, IL-4, Foxp)를 염색하여 광학현미경으로 분석하고, 각 마우스의 비장 세포내 T 세포 subset을 분석하였다.
분석 결과, 간엽줄기세포만을 처리한 군에 비해 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포를 투여한 마우스 군의 경우, 병인세포인 Th1(IFN-r), Th17(IL-17) 세포는 현저하게 감소한 반면, Th2(IL-4), Treg(Foxp3+) 세포는 현저하게 증가된 것을 확인하였다(도 15C).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 경우, 면역반응을 조절할 수 있는 활성이 있어 면역질환, 특히 자가면역질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 15>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 루푸스 동물모델의 병인 T 림프구와 공조 배양시에 면역조절 T 림프구( Treg ) 활성의 유도분석
본 발명자들은 라파마이신이 처리된 지방유래 간엽줄기세포에 의한 루푸스 동물모델 세포에 미치는 면역조절능력을 조사하였다.
Roquin 유전자 mutation 마우스는 ICOS(inducible costimulator) 과발현으로 인한 Th세포의 활성 유도와 Germinal center response가 증가되어 자가 항체가 과분비되어 루푸스와 유사한 자가면역질환 마우스 모델이며, 루푸스 동물모델인 Roquin 마우스로부터 세포를 분리하여 간엽줄기세포와 1:10의 비율로 3일간 공조배양한 뒤 면역조절 T 세포(Foxp3+Treg)의 활성을 유세포 분석법을 통해 분석하였다.
분석 결과, 도 16에 나타낸바와 같이 라파마이신을 처리하지 않은 군에 비해 처리한 군의 경우, 배양액 내의 IL-17의 양이 현저하게 감소되어 있었으며, 면역조절 T 세포의 활성은 더욱 증가되는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 라파마이신을 간엽줄기세포에 처리하여 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 활용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 16>
라파마이신이 처리된 간엽줄기세포의 류마티스 관절염 환자의 병인 T 림프구와 공조 배양시에 면역조절 T 림프구( Treg ) 활성의 유도분석
본 발명자들은 라파마이신이 처리된 류마티스관절염 환자 유래 간엽줄기세포의 면역 조절능력을 조사하였다.
마우스 CD4+T 세포(1×105)와 류마티스 관절염 환자 유래 간엽줄기세포(1×104)를 1:10의 비율로 3일간 96 well plate에서 37℃로 공조배양한 뒤 면역조절 T 세포(Foxp3+Treg)의 활성을 유세포 분석법을 통해 분석하였다.
분석 결과, 도 17에 나타낸바와 같이 라파마이신을 처리하지 않은 군에 비해 처리한 군의 경우, 배양액 내의 IL-17의 양이 감소되어 있었으며, 면역조절 T 세포의 활성은 더욱 증가되는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 라파마이신을 간엽줄기세포에 처리하여 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 활용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 라파마이신(rapamycin)이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포에 있어서;
    CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포 표면인자가 발현되는 간엽줄기세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 라파마이신은 간엽줄기세포 2.5×105~7.5×105 세포수를 기준으로 10~100nM의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 라파마이신 처리에 의해 IDO(indole 2,3-dioxygenase), TGF-beta(Transforming growth factor beta) 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 라파마이신 처리에 의해 mTOR의 신호전달 인자인 Phospho-mTOR, Rictor 및 Ractor의 발현이 상기 세포 내에서 감소되어 있는 것을 특징으로 하는 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 간엽줄기세포는 라파마이신 처리에 의해;
    Beclin1, ATG5, ATG7, LC3I 및 LCII로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 자가포식 유도인자의 발현이 상기 간엽줄기세포 내에서 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포.
  7. 제1항의 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 투여개체의 체중 kg당 1×106 내지 5×107 세포수로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 이식거부질환, 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  10. 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 2.5×105~7.5×105 세포수의 간엽줄기세포에 라파마이신을 10~100nM의 농도로 처리하고, 18~27 시간 동안 28~42℃의 조건으로 배양하는 단계를 포함하는, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR7, CCR9 또는 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포표면 인자가 발현되는 간엽줄기세포의 제조방법.
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