KR101755066B1 - 폴리감마글루탐산을 포함하는 Ｔｈ17 매개성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 폴리감마글루탐산의 약학적 용도에 관한 것으로, 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 포함하는 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 Th17 세포의 분화를 억제하고 T_reg 세포의 분화를 촉진하는 효과가 있는 바, 다발성경화증, 류마티스관절염, 전신 홍반성 루푸스, 염증성장질환(inflammatory bowel disease), 크론병(Crohn's disease) 등과 같은 Th17 매개성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

폴리감마글루탐산을 포함하는 Ｔｈ17 매개성 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating Th17-mediated diseases comprising poly-gamma-glutamic acid}

본 발명은 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 폴리감마글루탐산의 약학적 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 포함하는 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

인체는 외래물질에 대하여 방어적 면역반응을 일으키는 반면, 자신을 구성하는 물질에 대해서는 반응하지 않는 속성을 지닌다. 상기와 같이 자신을 구성하는 물질에 대하여 면역반응을 일으키지 않은 현상을 '면역적 자가관용(immunological self-tolerance)'이라 하며, 이를 유지하기 위해 중추면역기관에서는 (1)자가항원에 반응적인 T 세포가 제거되는 '클론결손(clonal deletion)' 기전과 (2)말초면역기관에서 자가항원에 반응적인 T 세포의 활성을 억제하는 '조절(regulation)' 기전이 작동된다. 이러한 자가관용 기전이 제대로 작동되지 않는 경우, 자가면역질환을 유발한다.

조절 T(regulatory T, T_{reg )} 세포는 상기 '조절(regulation)' 기전을 매개하는 주된 억제 세포이다. 상기 T_reg 세포는 원래 흉선(thymus)에서 고유의 경로로 발생되어 말초에 분포하는 소수 세포군으로 알려졌으나, 근래에 말초에서도 발생됨이 알려졌다. 즉 말초의 미감작 CD4 양성 T 세포는 TGF-β가 존재하는 환경에서 항원성 자극을 받으면 Foxp3를 발현하며 T_reg 세포로 분화된다. 이러한 T_reg 세포는 자가관용 기작에 중요한 역할을 수행한다.

반면, Th17 세포는 대표적인 친염증성(proinflammatory) 세포이다. 상기 Th17 세포는 Th1, Th2 세포와는 다른 아형으로서, IL-17, IL-17F, IL-21, IL-22를 분비한다. 미감작 CD4 양성 T 세포는 인 비트로(in vitro)에서 TGF-β 및 IL-6가 존재하는 환경에서 항원성 자극을 받으면 Th17 세포로 분화한다. 이 과정에 전사인자인 RORγt, STAT-3, IRF4 등이 관여한다. 말초조직으로 침윤된 Th17 세포는 대식세포, 수지상세포, 섬유모세포, 혈관내피세포, 파골세포 등에 작용하여 여러 염증성 사이토카인(IL-1, TNF, IL-8, IL-6 등), 케모카인, MMP 등을 분비하게 함으로 조직 손상을 일으킨다. 상기 Th17 세포는 염증성 질환을 매개하는 주요 병적세포로 밝혀졌다.

상기와 같이 T_reg 세포와 Th17 세포는 서로 상반된 기능을 갖고 있으나, 말초에서 이들의 발생은 동일 전구세포를 공유하며 상호 연관되어 있다. 즉, CD4 양성 T 세포가 TGF-β와 항원성 자극에 의해 분화될 때, IL-6, IL-23, IL-1, IL-21 등과 같은 다른 염증성 사이토카인의 존재 여부에 따라, T_reg 세포로 분화가 진행될지 아니면 Th17 세포로 분화가 진행될지 결정된다. 따라서, Th17/T_reg 간의 불균형 또는 Th17 세포의 과분화에 의해 초래되는 Th17 매개성 질환에서, Th17 세포의 발생은 억제하고 T_reg의 발생은 유도할 수 있는 물질은 이런 불균형을 해소하고 면역항상성을 회복시켜, 상기 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있을 것이다.

최근, Th17 세포의 발생을 억제하는 치료제를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구의 결과로서, 상기 Th17 세포의 전사인자인 RORγt를 억제하는 SR1001, Th17 활성만 억제하는 할로푸지논(halofuginone), anti-IL-17 단일클론항체 제제 등이 개발되었다. 그러나, 이러한 물질들은 실제적으로 임상 실험을 거쳐 환자에게 적용되기까지 많은 시간이 소요되고, 항체의 경우 단일클론항체를 제작하는 과정에서 비용이 과다하게 소요되는 문제가 있다. 이에, 보다 저렴하고, 인체에 수월하게 적용될 수 있으면서도 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료에 탁월한 효과가 있는 새로운 약제의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 저렴하고, 부작용 없이 인체에 적용되면서도 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 포함하는 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 Th17 세포의 분화를 억제하고 T_reg 세포의 분화를 촉진하는 효과가 있는 바, 다발성경화증, 류마티스관절염, 전신 홍반성 루푸스, 염증성장질환(inflammatory bowel disease), 크론병(Crohn's disease), 경직성 척추염 등과 같은 Th17 매개성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 미분화 CD4 양성 T 세포가 Th0 분화 조건(a) 및 Th17 분화 조건(b)에서 Th17 세포로 분화됨에 있어서, 폴리감마글루탐산이 미치는 영향을 항-IL-17-PE 항체 및 항-IFN-γ-FITC 항체로 유세포분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 미분화 CD4 양성 T 세포가 Th0 분화 조건(a) 및 Th17 분화 조건(b)에서 Th17 세포 및 T_reg 세포로 분화됨에 있어서, 폴리감마글루탐산이 미치는 영향을 항-RORγt-PE 항체 및 항-Foxp3-FITC 항체로 유세포분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 미분화 CD4 양성 T 세포들을 Th0 분화 조건(a) 및 Th17 분화 조건(b)에서 폴리감마글루탐산을 처리 또는 미처리하여 분화시킨 후, 항-IL-17-PE 항체를 이용한 효소결합면역흡착법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 IL-17 사이토카인의 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 미분화 CD4 양성 T 세포들을 Th0 분화 조건 및 Th17 분화 조건에서 폴리감마글루탐산을 처리 또는 미처리하여 분화시킨 후, 분화된 세포에서 생성 또는 발현되는 각종 사이토카인((a): IL-17, (b): IL-17F, (c): IL-21) 및 전사인자((c): RORγt, (d): STAT3, (e): IRF4, (f): Ahr)의 발현량을 정량적 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 미분화 CD4 양성 T 세포들을 Th0 분화 조건에서 폴리감마글루탐산 또는 TGF-β를 처리 또는 미처리하여 분화시킨 후, 항-Foxp3-FITC 항체로 유세포분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 미분화 CD4 양성 T 세포들을 Th0 분화 조건에서 폴리감마글루탐산을 처리 또는 미처리하여 분화시킨 후, 분화된 세포에서 발현되는 Foxp3 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 Th0 분화 조건에서 통상 T 세포(a), 자연 발생한 nT_reg 세포(b), 폴리감마글루탐산을 처리하여 분화 유도된 T_reg 세포(c), 및 TGF-β를 처리하여 분화 유도된 T_reg 세포(d)를 대상으로, 항-CD4-APC 항체, 항-CD25-PE 항체, 항-GITR-PE 항체 및 항-CTLA4-PE 항체로 유세포분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 마우스에서 EAE를 유도하는 과정을 모식적으로 나타낸 흐름도이다.
도 9는 EAE 마우스 모델에서 폴리감마글루탐산의 임상적 증상에 대한 효과를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 EAE 마우스 모델에서 폴리감마글루탐산의 조직병리학적 효과를 관찰한 현미경 사진이다.
도 11은 EAE 마우스 모델에서 폴리감마글루탐산의 염증 반응 억제 효과를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 EAE 마우스모델에서 폴리감마글루탐산의 Th17 세포로의 분화 억제 효과((a) 및 (b)) 및 T_reg 세포로의 분화 촉진 효과((c) 및 (d))를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 류마티스 관절염 모델에서 폴리감마글루탐산이 관절염 위중도(a)및 발병율(b)을 억제하는 효과를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 류마티스 관절염 모델에서 폴리감마글루탐산의 관절염 역제에 관한 조직병리학적 효과를 관찰한 현미경 사진((a) 및 (b))과 점수화한 그래프((c) 및 (d))이다.
도 15는 류마티스 관절염 모델에서 폴리감마글루탐산의 관절연골 보호에 관한 조직병리학적 효과를 관찰한 현미경 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 포함하는 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 폴리감마글루탐산을 포함한다.

상기 폴리감마글루탐산은 글루탐산이 감마-아마이드(γ-amide) 결합으로 연결된 고분자 물질이다. 상기 폴리감마글루탐산은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균에 의하여 콩이 발효되는 과정 중에 생성되며, 콩발효식품인 청국장 또는 낫또의 점액성분의 약 80 %를 차지하는 천연화합물이다. 상기 폴리감마글루탐산은 발효 균주와 발효 조건에 따라서 다양한 분자량으로 생성되나, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분으로서 상기 폴리감마글루탐산은 1 kDa 내지 2000 kDa의 분자량을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 50 kDa의 폴리감마글루탐산을 이용하였다.

상기 폴리감마글루탐산은 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시킨다. 상기 폴리감마글루탐산은 미분화 T 세포에 작용하여, 상기 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화하는데 필요한 전사인자인 RORγt의 발현을 억제함으로써, 상기 미분화된 T 세포가 Th17 세포로 분화되지 못하도록 한다. 특히, 상기 폴리감마글루탐산은 상기 미분화 T 세포가 Th17 분화 조건 하에 있는 경우에도 RORγt의 발현을 억제한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 미분화 T 세포 중 하나인 CD4 양성 T 세포를 Th17 분화 조건에 노출시켜 Th17 세포로의 분화를 유도함과 동시에 폴리감마글루탐산을 처리하여 상기 CD4 양성 T 세포를 배양하였다. 그 결과, 상기 폴리감마글루탐산이 처리된 CD4 양성 T 세포의 경우, 폴리감마글루탐산이 처리되지 않은 경우에 비하여 Th17 세포로 분화되는 비율이 처리된 상기 폴리감마글루탐산의 농도에 따라 최대 1/8 배로 줄어들었다(도 1의 (b) 참조). 상기와 같은 Th17 세포로의 분화 억제는 CD4 양성 T 세포를 Th17 세포로 분화시키는데 필수적인 역할을 하는 전사인자인 RORγt의 발현이 폴리감마글루탐산 처리에 의하여 억제되기 때문인 것으로 판단된다(도 2의 (b) 참조). 또한, 상기와 같은 Th17 세포로의 분화 억제로 인해, Th17 세포의 특이적인 사이토카인인 IL-17의 생성량 또한 감소되었다(도 3의 (b) 참조). 상기와 같은 구체적인 실시예의 결과로부터, 상기 폴리감마글루탐산은 RORγt의 발현을 억제하는 메커니즘으로 미분화된 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 억제하고, 최종적으로 IL-17의 생성을 억제함을 알 수 있다.

또한, 상기 폴리감마글루탐산은 미분화 T 세포가 조절 T(regulatory T, T_{reg )} 세포로 분화되는 것을 증가 또는 촉진시킨다. 특히, 상기 폴리감마글루탐산은 상기 미분화 T 세포가 Th0 분화 조건 하에 있는 경우 뿐만 아니라, Th17 분화 조건 하에 있는 경우에도 상기 미분화된 T 세포로부터 T_reg 세포로의 분화를 촉진시킨다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 미분화 T 세포 중 하나인 CD4 양성 T 세포를 Th0 분화 조건 또는 Th17 분화 조건에 노출시켜 Th17 세포로의 분화를 유도함과 동시에 폴리감마글루탐산을 처리하여 상기 CD4 양성 T 세포를 배양하였다. 그 결과, 상기 폴리감마글루탐산이 처리된 CD4 양성 T 세포에서 Foxp3를 발현하는 세포의 비율이 증가함을 확인하였다. 구체적으로, (1)Th0 분화 조건에 노출된 CD4 양성 T 세포는 폴리감마글루탐산의 처리에 의하여 Foxp3를 발현하는 세포의 비율이 농도에 따라 최대 약 5배 정도까지 증가하였고(도 2의 (a) 및 도 5 참조), (2)Th17분화 조건에 노출된 CD4 양성 T 세포는 40 μM 농도의 폴리감마글루탐산의 처리에 의하여 Foxp3를 발현하는 세포의 비율이 약 1.5배 정도 증가하였다(도 2의 (b) 참조). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 미분화된 T 세포를 T_reg 세포로 분화시키는 효과가 있고, 이러한 폴리감마글루탐산의 효과는 미분화된 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 조건 하에 노출된 환경에서도 여전히 유지됨을 알 수 있다.

즉, 상기 폴리감마글루탐산은 미분화 T 세포가 Th17로 분화되는 조건에 있는 경우에도, 상기 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 억제하면서 상기 미분화 T 세포가 T_reg 세포로 분화되도록 유도한다. 따라서, 상기 폴리감마글루탐산은 Th17 세포의 과분화 또는 과증식에 의하여 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 상기 Th17 세포가 과분화 또는 과증식하는 경우, 상대적으로 T_reg 세포의 수가 감소하게 되어 면역체계의 불균형이 발생하고, 이러한 Th17 세포와 T_reg 세포 간의 불균형은 Th17에 의하여 매개되는 많은 질병을 유발하게 된다. 다시 말하면, 면역체계 내에서 조성되는 Th17 세포로의 분화 촉진 환경은 결과적으로 Th17 매개성 질환의 원인이 된다는 것이다. 상기와 같은 Th17 매개성 질환에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산은 상기 Th17 세포와 T_reg 세포 간의 불균형을 조율함으로써 상기 Th17 매개성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있다.

상기 Th17 매개성 질환은 이에 한정되지 아니하나, 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 특히 상기 상기 Th17 매개성 질환은 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 다발성 경화증이 유발된 마우스 모델에 폴리감마글루탐산을 투여하여 그 치료 효과를 확인하였다. 그 결과, 상기 폴리감마글루탐산의 투여에 의하여 마우스 모델의 중추신경계 내 염증세포가 증가하였고(도 11, 및 도 12의 (a) 및 (b) 참조), 면역계 내 T_reg 세포가 감소하였다(도 12의 (c) 및 (d) 참조). 더욱이, 상기 마우스 모델의 임상적 증상 및 조직병리학적 증상이 크게 완화됨을 확인하였다(도 9 및 도 10). 추가적으로, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 Th17 세포 의존적으로 발병하는 것으로 알려진 류마티스관절염 동물모델에도 폴리감마글루탐산을 투여하여 그 치료 효과를 확인하였다. 그 결과, 상기 폴리감마글루탐산의 투여에 의하여 관절염의 위증도와 발병율이 현저히 감소하였고(도 13 참조), 관절조직의 조직병리학적 증상도 크게 완화되었다(도 14 및 도 15 참조).

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 유효성분인 상기 폴리감마글루탐산을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 조성물은 용도 및 용법에 따라 소화관 내 투여 또는 소화관 외 투여될 수 있다. 상기 소화관 내 투여는 경구 투여, 설하 투여, 직장/질내 투여 등을 포함하며, 상기 소화관 외 투여는 복강, 혈류내, 근육내 및 내부 장기 내로 주사, 흡입, 기관 내 투여, 피부 및 점막에 국소 적용 등을 포함한다.

상기 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 상기 조성물의 일일 투여량은 0.00001 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

폴리감마글루탐산 존재 하에서 Th17 / T _reg 세포로의 분화 유도

<1-1> CD4 양성 T 세포 수득

6 내지 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스(Orient Co., 한국)를 한양대학교 특수 무병원균 장벽 설비(specific pathogen-free barrier facility)에서 동물 관리 및 이용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 규정에 따라 희생시켜 비장(spleen)과 림프절(lymph node)을 수득하였다. 상기 수득된 비장과 림프절을 10 % 우태혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 unit/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 0.05 mM의 2-멀캅토에탄올(mercaptoethnol) 및 2 mM의 L-글루타민이 첨가된 RPMI1640(이하, 'RPMI/10F'이라 한다.) 배지에 넣고 분쇄하여 세포를 추출하고, 적혈구세포와 조직 찌꺼기를 제거한 뒤, 단세포 부유액(single cell suspension)을 수득하였다. 상기 단세포 부유액에서 자성 비드-활성화 세포 분류(magnetic bead-activated cell sorting; MACS) 방법으로 CD4 양성 T 세포를 양성 선별하였다.

<1-2> CD4 양성 T 세포의 Th17 세포로의 분화 유도

1 ㎍/㎖의 항-CD3 항체(145-2C11; eBioscience, 미국) 및 1 ㎍/㎖의 항-CD28 항체(37.51; BD Biosciences, 미국)가 포함된 플레이트의 5개 웰에, 상기 실시예 <1-1>에서 순수 분리된 CD4 양성 T 세포를 각각 2 × 10⁶ 세포/웰의 농도로 분주하였다. 상기 5개의 웰에 50 kDa 크기의 폴리감마글루탐산(Bioleaders, 한국)을 각각 0, 10, 20, 40, 80 μM의 농도로 처리한 다음, 모든 웰에 20 ng/㎖의 마우스 IL-6(R&D Systems, 미국), 5 ng/㎖의 TGF-β(R&D Systems, 미국), 5 ㎍/㎖의 항-IL-4 항체(11b11; BD Biosciences, 미국) 및 5 ㎍/㎖의 항-IFN-γ 항체(XMG1.2; BD Biosciences, 미국)를 첨가(이하, 'Th17 분화 조건'이라 한다.)하고, 1 ㎖/웰 농도의 RPMI/10F 배지로 4일 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양함으로써, Th17 세포로의 분화를 유도하였다.

<1-3> CD4 양성 T 세포의 T _reg 세포로의 분화 유도

1 ㎍/㎖의 항-CD3 항체(145-2C11; eBioscience, 미국) 및 1 ㎍/㎖의 항-CD28 항체(37.51; BD Biosciences, 미국)가 포함된 플레이트의 5개 웰에, 상기 실시예 <1-1>에서 순수 분리된 CD4 양성 T 세포를 각각 2 × 10⁶ 세포/웰의 농도로 분주하였다. 상기 5개의 웰에 50 kDa 크기의 폴리감마글루탐산(Bioleaders, 한국)을 각각 0, 10, 20, 40, 80 μM의 농도로 처리한 다음, 4 ng/㎖의 IL-2(Peprotech, 미국)를 첨가(이하, 'Th0 분화 조건'이라 한다.)하고, 1 ㎖/웰 농도의 RPMI/10F 배지로 4일 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양함으로써, T_reg 세포로의 분화를 유도하였다.

폴리감마글루탐산이 Th17 로의 분화에 미치는 영향 분석

<2-1> 세포 내 사이토카인에 대한 유세포분석

상기 실시예 <1-2> 및 <1-3>에서 분화 유도된 세포들에서 각각 10⁶ 개의 세포를 취하여, 40 ng/㎖의 PMA(Sigma-Aldrich, 미국), 1 ㎍/㎖의 아이오노마이신(ionomycin)(Sigma-Aldrich, 미국) 및 0.6 ㎕/㎖ 골지-스톱(Golgi-stop)(BD Bioscience, 미국)으로 6시간 동안 재자극하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 항-CD4-APC(eBioscience, 미국)로 염색하였다. 상기와 같이 염색된 세포를 BD 사이토픽스/사이토펌 완충액(Cytofix/Cytoperm buffer)(BD Biosciences, 미국)으로 고정시키고, 침투성(permeability)을 증가시켰다.

상기와 같이 고정된 세포를 항-IL-17-PE 항체(eBioscience, 미국)와 항-IFN-γ-FITC 항체(eBioscience, 미국)로 염색시킨 후 유세포분석법으로 형광염색된 세포의 비율을 측정하였다.

먼저, 감마폴리글루탐산을 처리하지 않은 경우, Th0 분화 조건에서 분화시킨 세포들에서는 IFN-γ를 발현하는 세포의 비율이 IL-17을 발현하는 세포의 비율보다 높게 나타나지만, Th17 분화 조건에서 분화시킨 세포들에서는 IL-17을 발현하는 세포의 비율이 IFN-γ를 발현하는 세포의 비율보다 높게 나타났다(도 1). 상기와 같은 결과로부터, Th0 분화 조건과는 달리 Th17 분화 조건에서는 CD4 양성 T 세포가 IL-17을 생성하는 Th17 세포로 분화됨을 알 수 있다.

다음으로, Th0 분화 조건에서 분화 유도된 세포들에서는 폴리감마글루탐산의 농도가 높아질수록, IFN-γ를 발현하는 세포의 비율이 점점 낮아지나, IL-17을 발현하는 세포의 비율에는 눈에 띠는 변화가 없었다. 반면, Th17 분화 조건에서 분화 유도된 세포들에서는 폴리감마글루탐산의 농도가 높아질수록 IL-17을 발현하는 세포의 비율은 점점 낮아지나, IFN-γ를 발현하는 세포의 비율에는 눈에 띠는 변화가 없었다(도 1). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 Th17 분화 조건에서 CD4 양성 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 억제하고, 폴리감마글루탐산의 이러한 효과는 농도에 의존적임을 알 수 있다.

또한, 상기 실시예 <1-2> 및 <1-3>에서 0 및 40 μM의 폴리감마글루탐산을 처리하여 분화 유도된 세포들에서 각각 10⁶ 개의 세포를 취하여, 40 ng/㎖의 PMA, 1 ㎍/㎖의 아이오노마이신(ionomycin) 및 0.6㎕/㎖ 골지-스톱(Golgi-stop)으로 6시간 동안 재자극하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 항-CD4-APC로 염색하였다. 상기와 같이 염색된 세포를 BD 사이토픽스/사이토펌 완충액(Cytofix/Cytoperm buffer)으로 고정시키고, 침투성(permeability)을 증가시켰다. 상기와 같이 고정된 세포를 항-RORγt-PE 항체(eBioscience, 미국) 및 항-Foxp3-FITC 항체(eBioscience, 미국)로 염색시켜 형광염색된 세포의 비율을 측정하였다.

먼저, 감마폴리글루탐산이 처리하지 않은 경우, Th0 분화 조건에서 분화시킨 세포들에서는 Foxp3를 발현하는 세포의 비율이 RORγt를 발현하는 세포의 비율보다 높게 나타나지만, Th17 분화 조건에서 분화시킨 세포들에서는 RORγt를 발현하는 세포의 비율이 Foxp3를 발현하는 세포의 비율보다 높게 나타났다(도 2).

또한, Th0 분화 조건에서 분화시킨 세포들의 경우, 폴리감마글루탐산에 의하여 Foxp3를 발현하는 세포의 비율은 약 2.5배 증가하였으나, RORγt를 발현하는 세포의 비율은 큰 변화가 없었다(도 2의 (a)). 반면, Th17 분화 조건에서 분화시킨 세포들의 경우, 폴리감마글루탐산에 의하여 Foxp3를 발현하는 세포의 비율은 크게 변화하지 않았으나, RORγt를 발현하는 세포의 비율은 0.4배 감소하였다(도 2의 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 Th17 분화 조건에서 CD4 양성 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 억제함을 알 수 있다.

<2-2> 세포 내 사이토카인에 대한 ELISA 분석

상기 실시예 <1-2> 및 <1-3>에서 0 및 40 μM의 폴리감마글루탐산을 처리하여 분화 유도된 세포들의 배양물을 1,400rpm으로 7분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 R&D Duoset ELISA development system(R&D Systems, 미국)로 샌드위치 ELISA 방법에 따라 IL-17 농도를 측정하였다. 상기 ELISA 방법에 따라 IL-17 농도를 측정함에 항-IL-17-PE 항체(eBioscience, 미국)를 이용하였다.

그 결과, Th0 분화 조건에서 분화된 세포들에서는 기본적으로 IL-17의 농도가 낮게 측정되었고, 40 μM 농도의 폴리감마글루탐산을 처리하였음에도 생성되는 IL-17의 농도에는 큰 변화가 없었다(도 3의 (a)). 반면, Th17 분화 조건에서 분화된 세포들에서는 기본적으로 약 25 ng/㎖ 농도의 IL-17가 생성되었고, 40 μM 농도의 폴리감마글루탐산 처리에 의하여 생성되는 IL-17의 농도가 약 5배 이상 감소하였다(도 3의 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 Th17 분화 조건에서 CD4 양성 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 억제함을 알 수 있다.

<2-3> 정량적 RT - PCR 분석

상기 실시예 <1-2> 및 <1-3>에서 0 및 40 μM의 폴리감마글루탐산을 처리하여 분화 유도된 세포에서 각각 8 × 10⁶ 개의 세포를 취하고, TRIZOL 시약(Invitrogen, 미국)을 이용하여 총 RNA(total RNA)를 수득한 다음, 역전사효소 (reverse-transcriptase)로 cDNA를 합성하였다. 상기와 같이 합성된 cDNA에서, 하기 표 1과 같은 프라이머로 정량적 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 폴리감마글루탐산의 처리에 의하여 Th17 세포로의 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 RORγt, STAT3, IRF4, Ahr과 같은 전사인자의 발현이 감소하고(도 4의 (d) 내지 (g)), Th17 세포에서 생성되는 IL-17, IL17-F, IL21과 같은 사이토카인의 발현량 또한 감소한다(도 4의 (a) 내지 (c)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 CD4 양성 T 세포에서 Th17로의 분화에 중요한 역할을 하는 전사인자인 RORγt, STAT3, IRF4, Ahr 등의 발현을 감소시켜 Th17 세포로의 분화를 억제하고, 그 결과 Th17 세포에서 생성되는 IL-17, IL-17F, IL-21 등의 사이토카인의 생성 또한 저하되는 것임을 알 수 있다.

폴리감마글루탐산이 T _reg 로의 분화에 미치는 영향 분석

<3-1> 양성 대조군의 설정

1 ㎍/㎖의 항-CD3 항체(145-2C11; eBioscience, 미국) 및 1 ㎍/㎖의 항-CD28 항체(37.51; BD Biosciences, 미국)가 포함된 플레이트에, 상기 실시예 <1-1>에서 순수 분리된 CD4 양성 T 세포를 2 × 10⁶ 세포/웰의 농도로 분주하였다. 상기 플레이트에 종래 T_reg 분화 유도 물질로 알려진 TGF-β(R&D Systems, 미국)를 5 ng/㎖의 농도로 처리한 다음, 4 ng/㎖의 IL-2(Peprotech, 미국)를 첨가(이하, 'Th0 분화 조건'이라 한다.)하고, 1 ㎖/웰 농도의 RPMI/10F 배지로 4일 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양함으로써, 폴리감마글루탐산이 T_reg로의 분화에 미치는 영향을 분석하기 위한 양성 대조군을 제조하였다.

<3-2> 세포 내 사이토카인에 대한 유세포분석

상기 실시예 <1-3> 및 실시예 <3-1>에서 분화 유도된 세포들에서 각각 10⁶ 개의 세포를 취해 세포를 세척하고, 항-CD4-APC 항체(eBioscience, 미국)와 항-CD25-PE 항체(eBioscience, 미국)로 염색하였다. 상기와 같이 염색된 세포를 eBioscience Fixation/Permeabilization buffer(eBioscience, 미국)로 고정하고 침투성을 증가시킨 다음, 상기 세포에 항-Foxp3-FITC 항체(eBioscience, 미국)를 처리하여 유세포분석기로 형광염색된 세포의 비율을 조사하였다.

그 결과, Th0 분화 조건에서 분화 유도된 세포들에서는 폴리감마글루탐산의 농도가 높아질수록 Foxp3를 발현하는 세포의 비율이 점점 증가하였다(도 5). 특히, 상기 폴리감마글루탐산이 약 40 μM 이상의 농도로 처리되는 경우에는 Foxp3를 발현하는 세포의 비율이 5 ng/㎖ 농도의 TGF-β로 분화를 유도한 경우와 비슷하거나 더 높게 측정되었다. 상기와 같은 결과로부터, Th0 분화 조건은 Foxp3를 발현하는 T_reg 세포의 분화를 촉진하고, 폴리감마글루탐산의 이러한 효과는 농도에 의존적임을 알 수 있다.

또한, Th17 분화 조건에서 분화 유도된 세포들에서도 40 μM 농도의 폴리감마글루탐산 처리에 의하여 Foxp3를 발현하는 세포의 비율이 약 1.5배 정도 증가하였다(도 2의 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산의 T_reg로의 분화 촉진 효과는 Th17 분화 조건에서도 여전히 유지됨을 알 수 있다.

<3-3> 정량적 RT - PCR 분석

상기 실시예 <1-3>에서 0 및 40 μM의 폴리감마글루탐산을 처리하여 분화 유도된 세포에서 각각 8 × 10⁶ 개의 세포를 취하고, TRIZOL 시약(Invitrogen, 미국)을 이용하여 총 RNA(total RNA)를 수득한 다음, 역전사효소 (reverse-transcriptase)로 cDNA를 합성하였다. 상기와 같이 합성된 cDNA에서, 하기 표 2과 같은 프라이머로 정량적 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 폴리감마글루탐산이 처리되지 않은 세포와 비교하였을 때, 40 μM의 폴리감마글루탐산 처리에 의하여 Foxp3 유전자 발현량이 약 8배 정도 증가되었다(도 6). T_reg 세포의 특이적 마커인 전사인자 Foxp3의 발현이 폴리감마글루탐산에 의하여 증가하는 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 Th0 분화 조건하에서 CD4 양성 T 세포의 T_reg 세포로의 분화를 촉진함을 알 수 있다.

<3-4> 세포 표면 표지에 대한 유세포분석

상기 실시예 <1-3>에서 0 및 40 μM의 폴리감마글루탐산을 처리하여 분화 유도된 세포, 상기 실시예 <3-1>에서 TGF-β를 처리하여 분화 유도된 양성 대조군 세포 및 자극하지 않은 비장 세포에서 각각 10⁶ 개의 세포를 취하여 세척한 후, 항-CD4-APC 항체(eBioscience, 미국), 항-Foxp3-FITC 항체(eBioscience, 미국), 항-CD25-PE 항체(eBioscience, 미국), 항-GITR-PE 항체(eBioscience, 미국) 및 항-CTLA4-PE 항체(eBioscience, 미국)로 염색하여 유세포 분석을 수행하였다. T_reg 세포의 표현형 분석을 위해 CD4 양성 및 Foxp3 양성인 세포를 게이팅(gating)하여 분석하였다. 자극 안한 비장 세포에서 CD4 양성 및 Foxp3 양성인 세포는 흉선에서 자연발생된 natural T_reg(이하, 'nT_reg'라 한다.) 세포에 해당되며, 자극 안한 비장 세포에서 CD4 양성 및 Foxp3 음성 세포는 통상의 T 세포에 해당된다.

그 결과, nT_reg 세포의 경우, 통상의 T 세포에 비해 CD25, GITR, CTLA4 유전자의 발현이 높게 나타나는데(도 7의 (a) 및 (b)), 상기 세 유전자의 발현량에 있어서 폴리감마글루탐산에 의해 유도된 T_reg 세포는 (1)nT_reg 세포와 비슷하고(도 7의 (b) 및 (c)), TGF-beta에 의해 유도된 T_reg 세포보다 더 높게 나타났다(도 7의 (c) 및 (d)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산에 의하여 분화 유도된 T_reg 세포는 흉선에서 자연발생된 T_reg 세포와 비슷한 표현형을 가짐을 알 수 있다.

폴리감마글루탐산의 Th17 매개성 질환 치료 효능 : 다발성 경화증

<4-1> 다발성 경과증 동물 모델의 제조

폴리감마글루탐산의 Th17 매개성 질환 치료 효능를 확인하기 위하여 다발성 경화증 동물 모델을 제조하였다. 상기 다발성 경화증 동물 모델은 Nurieva R 등((2007) Nature 448: 480-483)에 기재된 프로토콜에 따라 제조하되, 백일해 독소의 투여 용량 등을 달리하였다. 보다 구체적으로는, 8 내지 10주령의 암컷 C57BL/6 마우스 18 마리를 각각 6마리 씩 세 개의 군(정상대조군, 음성대조군(이하, 'MOG 군'이라 한다.) 및 실험군(이하, 'MOG/γPGA군'이라 한다.))으로 분류하여 SPF(specific pathogen-free) 조건에서 사육하였다. 상기와 같이 사육된 세 군 중 정상대조군의 마우스는 PBS만을 투여하면서 SPF 조건에서 계속 사육하였고, 상기 MOG 군 및 MOG/γPGA군의 마우스에 도 8과 같은 과정으로 EAE(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)를 유발시켜 하기 표 3과 같이 실험을 디자인하였다.

상기 MOG 군 및 MOG/γPGA군의 경우, 모든 마우스에 150 ㎍의 MOG_{35 -55}(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides)(펩프로텍, 한국)와 400 ㎍의 CFA(complete Freund's Adjuvant)(Chondrex, 미국)가 혼합된 혼합액(이하, 'MOG/CFA 혼합액'이라 한다.) 및 500 ng의 백일해독소(Pertussis toxin)(List Biological Laboratories, 미국)를 실험 0일째에 각각 피하주사 및 복강주사하였다. 그런 다음, 실험 2일째에 상기 12 마리의 마우스에 500 ng의 백일해독소를 다시 한번 복강주사하고, 실험 7일째에 상기 12 마리의 마우스에 MOG/CFA 혼합액을 다시 한번 피하주사하였다. 그리고, 마지막으로 실험 8일째에 200 ng의 백일해독소를 복강주사하여 상기 MOG 군 및 MOG/γPGA군의 마우스에 EAE를 유발시켰다.

상기와 같은 EAE 유발 과정동안, 상기 MOG군의 마우스에는 실험 1일째부터 매일 200 ㎕/일의 투여량으로 PBS를 주입하였고, 상기 MOG/γPGA군의 마우스에는 실험 1일째부터 폴리감마글루탐산과 PBS를 매일 각각 12 ㎎/일 및 200 ㎕/일의 투여량으로 복강주사하였다.

<4-2> 폴리감마글루탐산의 임상적 증상에 대한 효과 평가

상기 실시예 <4-1>과 같이 구성된 18 마리의 마우스에 대하여, 각 군의 마우스들의 임상적 증상에 대한 폴리감마글루탐산의 효과를 평가하였다. 상기 임상적 증상은 실험 11일째부터 실험 20일째까지 매일 각 개체의 임상을 육안 관찰하여, 각 상태를 질병 지수로 점수화하고, 각 점수를 각 군별로 평균화하여 표현하였다. 상기 질병지수는 하기 표 4와 같은 기준에 의해 0 내지 5점으로 평가되었다.

그 결과, EAE가 유발되지 않은 정상대조군에서는 모든 개체가 정상으로 나타났고(질병지수 0), MOG군은 실험 20일째에 거의 대부분의 개체가 뒷다리 마비증세를 나타냈다(질병지수 약 3)(도 9). 그러나 MOG/γPGA군의 경우, EAE가 유발되었음에도 불구하고, MOG군과는 달리 실험 20일째에 질병지수가 약 0.7로 측정되어 EAE의 임상적 증상이 현저히 완화되었다(도 9). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산의 투여에 의하여 Th17 매개성 질환의 임상적 증상이 현저히 완화될 수 있음을 알 수 있다.

<4-3> 폴리감마글루탐산의 조직병리학적 효과 평가

상기 실시예 <4-1>과 같이 구성된 18 마리의 마우스를 실험 20일째에 모두 희생시킨 다음, 척수(spinal cord) 조직을 취합하여 4% 포르말린(formalin) 용액으로 고정하였다. 상기 고정된 척수 조직을 파라핀으로 포매(embedding)한 다음, 6 ㎛의 두께로 절편을 만들고 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하고, 현미경으로 척수 조직의 손상 정도와 염증 세포의 침윤 소견을 관찰하였다.

그 결과, MOG군에서는 척수 조직의 조직 손상이 심하고 백색질에 많은 백혈구 세포의 침윤이 관찰되는 반면(도 10의 (b)), 정상대조군 및 MOG/γPGA군에서는 조직 손상과 염증세포의 침윤이 거의 보이지 않았다(도 10의 (a) 및 (c)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산의 투여에 의하여 Th17 매개성 질환의 조직병리학적 증상이 현저히 완화될 수 있음을 알 수 있다.

<4-4> 중추신경계에서의 염증세포 관찰

상기 실시예 <4-1>의 MOG 군 및 MOG/γPGA군의 총 12 마리의 마우스를 실험 20일째에 모두 희생시킨 다음, 뇌와 척수 조직을 취합하였다. 상기와 같이 취합된 뇌와 척수 조직을 잘게 자르고, 500 ㎎/㎖의 Liberase Blendzyme(Roche, 독일)과 100 ㎎/㎖의 DNase I(Sigma-Aldrich, 미국)로 조직을 용해한 다음, Percoll 농도구배 원심분리법으로 단핵구(mononuclear cells)만을 수득하였다. 상기와 같이 수득된 단핵구를 40 ng/㎖의 PMA, 1 ㎍/㎖의 아이오노마이신(ionomycin) 및 0.6 ㎕/㎖ 골지-스톱(Golgi-stop)으로 6시간 동안 자극하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고, 항-CD4-APC(eBioscience, 미국)로 염색하였다. 상기와 같이 염색된 세포를 BD 사이토픽스/사이토펌 완충액(Cytofix/Cytoperm buffer)(BD Biosciences, 미국)으로 고정시키고, 침투성(permeability)을 증가시켰다. 상기와 같이 고정된 세포를 항-IL-17-PE 항체(eBioscience, 미국)와 항-IFN-γ-FITC 항체(eBioscience, 미국)로 염색시켜 형광염색된 세포의 비율을 측정하였다.

그 결과, MOG군에 비하여 MOG/γPGA군에서 단핵구 및 CD4 양성 T 세포의 수가 현저하게 감소하였다(도 11). 상기와 같이 염증세포인 단핵구 및 CD4 양성 T 세포의 수 자체가 감소하는 결과로부터, 폴리감마글루탐산의 처리에 의하여 염증 반응이 억제됨을 알 수 있다.

또한, MOG군에 비하여 MOG/γPGA군에서 IL-17을 생성하는 Th17 세포의 비율이 약 2배 정도 감소하였다(도 12의 (a) 및 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 인 비보(in vivo)에서도 Th17 세포로의 분화를 억제하고, IL-17의 생성을 감소시킴을 알 수 있다. 따라서, 상기 폴리감마글루탐산은 Th17 매개성 질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

<4-5> 면역계에서의 염증세포 관찰

상기 실시예 <4-1>의 MOG 군 및 MOG/γPGA군의 총 12 마리의 마우스를 실험 20일째에 모두 희생시킨 다음, 비장 조직을 적출하였다. 상기와 같이 적출한 비장을 RPMI/10F 배지에 넣고 분쇄하여 세포를 추출하고, 적혈구세포와 조직 찌꺼기를 제거한 뒤, 단세포 부유액(single cell suspension)을 수득하였다. 상기 단세포 부유액을 세척한 후, 항-CD4-APC 항체(eBioscience, 미국)와 항-CD25-PE 항체(eBioscience, 미국)로 염색하였다. 상기와 같이 염색된 세포를 eBioscience Fixation/Permeabilization buffer(eBioscience, 미국)로 고정하고 침투성을 증가시킨 다음, 상기 세포에 항-Foxp3-FITC 항체(eBioscience, 미국)를 처리하여 유세포분석기로 형광염색된 세포의 비율을 조사하였다.

그 결과, MOG군에 비하여 MOG/γPGA군에서 Foxp3와 CD25를 발현하는 T_reg 세포의 비율이 약 1.5배 정도 증가하였다(도 12의 (c) 및 (d)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산은 인 비보(in vivo)에서도 T_reg 세포로의 분화를 촉진함을 알 수 있다. 따라서, 상기 폴리감마글루탐산은 Th17 매개성 질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

류마티스 관절염 동물 모델을 이용한 폴리감마글루탐산의 효능 확인

<5-1> 류마티스 관절염 동물 모델의 제조

폴리감마글루탐산의 Th17 매개성 질환 치료 효능을 확인하기 위하여 류마티스 관절염의 대표적인 동물 모델인 콜라겐 유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 모델을 제조하였다. 상기 CIA 모델은 DBA/1 마우스의 유전자 배경을 필요로 하며, IL-10의 발현이 감소한 경우 더 심하게 더 빨리 유도되므로, 본 실시예에서는 통상적인 CIA보다 질병 위증도와 진행 속도를 더 높이기 위해 IL-10 유전자가 결손(knockout)된 DBA/1 마우스(이하 'IL-10KO DBA/1 마우스'라 한다.)를 사용하여 상기 CIA 모델을 제조하였다. 보다 구체적으로는, 6 내지 8주령의 수컷 IL-10KO DBA/1 마우스 8 마리를 각각 4마리 씩 두 개의 군(음성대조군(이하, 'PBS군'이라 한다.) 및 실험군(이하, 'γPGA군'이라 한다.))으로 분류하여 SPF(specific pathogen-free) 조건에서 사육하였다. 상기와 같이 사육된 마우스에 CIA를 유발시켜 하기 표 5와 같이 실험을 디자인하였다.

상기 모든 마우스에 100 ㎍의 제2형 콜라겐 단백질(Chodrex, 미국)과 동량의 CFA(Chondrex, 미국)가 혼합된 혼합액을 실험 0일째에 진피 내(intradermal) 주사하여 CIA를 유발하였다. 상기와 같은 CIA 유발 과정 동안, 상기 PBS군의 마우스에는 실험 8일째부터 3주 동안 PBS를 200 ㎕/회 용량으로 주 3회 복강주사하였고, 상기 γPGA군의 마우스에는 실험 8일째부터 3주 동안 폴리감마글루탐산과 PBS를 각각 12 ㎎/일 및 200 ㎕/회의 투여량으로 주 3회 복강주사하였다.

<5-2> 폴리감마글루탐산의 임상적 증상에 대한 효과 평가

상기 실시예 <5-1>과 같이 구성된 8 마리의 마우스에 대하여, 각 군의 마우스들의 임상적 증상에 대한 폴리감마글루탐산의 효과를 평가하였다. 상기 임상적 증상은 실험 7일째부터 실험 34일째까지 3 내지 4일마다 각 개체의 임상을 육안 관찰하여, 각 상태를 관절염 지수(arthritic index)로 점수화하고, 각 점수를 각 군별로 평균화하여 표현하였다. 하기 표 6과 같은 기준에 의해 각 다리를 0 내지 4점으로 평가하고 4다리 점수를 합산하여 각 개체의 관절염 지수를 산출하고 각 군의 평균값으로 표현하였다. 각 군의 발병률(incidence)은 전체 다리에서 발병된 다리의 비율을 뜻하며, 각 다리가 2점 이상일 때 발병하였다고 간주된다.

그 결과, PBS군은 실험 20일째에 질병이 개시되어 34일째에 약 70%의 다리에 심한 관절염 증세롤 보였다(관절염 지수 약 9.5점 및 발병률 약 70%)(도 13의 (a) 및 (b)). 그러나 γPGA군의 경우, CIA가 유발되었음에도 불구하고, PBS군과는 달리 실험 31일째에 질병이 시작됨이 관찰되었고 34일째 약 6%의 다리에서 미미한 관절염 증세(관절염 지수 약 1점 및 발병률 약 6%)가 보여, CIA의 임상적 증상이 현저히 완화되었다(도 13의 (a) 및 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산의 투여에 의하여 Th17 매개성 질환 중 하나인 CIA의 임상적 증상이 현저히 완화될 수 있음을 알 수 있다.

<5-3> 폴리감마글루탐산의 조직병리학적 효과 평가 : 염증 억제

상기 실시예 <5-1>과 같이 구성된 8 마리의 마우스를 실험 34일째에 모두 희생시킨 다음, 뒷다리 관절 조직을 취합하여 4% 포르말린(formalin) 용액으로 고정하고 5.5% EDTA 용액으로 탈회하였다. 상기 처리된 관절 조직을 파라핀으로 포매한 다음, 6 ㎛의 두께로 절편을 만들고 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하고, 현미경으로 관절 조직 내 염증 세포의 침윤과 연골 및 뼈의 손상 소견을 관찰하였다. 하기 표 7과 같은 기준에 의해 각 다리를 0 내지 4점으로 평가하고 각 군에 해당하는 마우스의 평균값을 산출하여 조직병리학적 지수로 표현하였다.

그 결과, PBS군에서는 관절 조직에 많은 백혈구 세포의 침윤과 연골 및 뼈의 침범이 매우 극심함이 관찰되는 반면(도 14의 (a) 및 (c)), γPGA군에서는 조직 손상과 염증세포의 침윤이 거의 보이지 않았다(도 14의 (b) 및 (d)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산의 투여에 의하여 Th17 매개성 질환의 조직병리학적 증상이 현저히 완화될 수 있음을 알 수 있다.

<5-4> 폴리감마글루탐산의 조직병리학적 효과 평가: 연골 손상

상기 실시예 <5-2>과 같이 제작된 파라핀 절편을 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 또는 사프라닌 오(Safranin O)로 관절연골 부위를 특수 염색하고, 현미경으로 연골의 손상 소견을 관찰하였다. 연골 조직은 톨루이딘 블루로 염색할 경우 푸른 자주색을 띠고 사프라닌 오로 염색할 경우 빨간색을 띤다.

그 결과, PBS군에서는 연골의 손상이 극심하여 윤활관절뼈 끝부분에서 거의 없어진 상태인 반면(도 15의 (a)), γPGA군에서는 연골 층이 거의 정상적인 소견을 보였다(도 15의 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 폴리감마글루탐산의 투여에 의하여 Th17 매개성 질환인 CIA에서 연골조직 손상 증상이 현저히 완화될 수 있음을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Composition for preventing or treating Th17-mediated diseases comprising poly-gamma-glutamic acid <130> PN130352D <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IL-17 <400> 1 tccagaaggc cctcagacta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IL-17 <400> 2 agcatcttct cgaccctgaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IL-17F <400> 3 gtgttcccaa tgcctcactt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IL-17F <400> 4 ctcctcccat gcattctgat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IL-21 <400> 5 cgcctcctga ttagacttcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IL-21 <400> 6 tgtttctttc ctcccctcct 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for ROR gamma t <400> 7 ccgctgagag ggcttcac 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for ROR gamma t <400> 8 tgcaggagta ggccacatta 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for STAT3 <400> 9 acccaacagc cgccgtag 18 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for STAT3 <400> 10 cagactggtt gtttccattc agat 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for IRF4 <400> 11 caccaaagca cagagtcacc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for IRF4 <400> 12 tcctctggat ggctccagat g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Ahr <400> 13 agcatcatga ggaaccttgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Ahr <400> 14 ggatttcgtc cgttatgtcg 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for Foxp3 <400> 15 cctcatgcat cagctctcca c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for Foxp3 <400> 16 agactccatt tgccagcagt g 21

Claims (6)

1. 폴리감마글루탐산을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산은 분자량이 1 kDa 내지 2000 kDa인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산은 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산은 미분화 T 세포가 조절 T 세포(Regulatory T cell, T_reg)로 분화되는 것을 증가 또는 촉진시키는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 미분화 T 세포는 CD4 양성 T 세포인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 류마티스 관절염은 Th17 세포의 과분화 또는 과증식에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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