KR102074798B1 - 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커, 진단키트 및 치료용 용도 - Google Patents

자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커, 진단키트 및 치료용 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커, 진단키트 및 치료용 용도를 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 케모카인 수용체인 CXCR3를 포함하는 중간엽줄기세포(MSC)의 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커; 케모카인 CXCL10를 포함하는 자가면역질환의 치료 예후 예측용 바이오마커; 상기 바이오 마커의 발현을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 진단 키트; 및 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량이 증가된 중간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커, 진단키트 및 치료용 용도{BIOMARKER FOR TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES, DIAGNOSTIC KIT AND THE THERAPEUTIC USE THEREOF}
본 발명은 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커, 진단키트 및 치료용 용도에 관한 것이다.
전신홍반루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)는 다발성 기능 부전을 동반한 전신성 자가 면역 질환(systemic autoimmune disease)으로 면역 복합체의 침착과 염증 세포의 침습을 특징으로 한다.
루푸스 신염(lupus nephritis)은 SLE 환자의 60%에서 발생되며 이환율(morbidity)과 사망률(mortality)을 증가시키는 주요 원인이다. 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)는 용해성 인자 및 접촉 의존적 방식(soluble factor- and contact-dependent manners)으로 T 세포, B 세포, 수지상 세포, NK 세포를 억제할 수 있으며 Treg 세포를 증진시키기 때문에 SLE의 유망한 대체 요법으로 연구되어왔다.
생체 내에서 효능을 발휘하기 위하여, MSC는 염증 부위에 효율적으로 침투한다. 염증이 있는 신장(nephritic kidney)에서는 케모카인이 생성되고, MSC는 케모카인 수용체를 발현한다. CCL2, CCL3, CCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13, CX3CL1은 루푸스 모델 동물과 SLE 환자의 염증성 신장(nephritic kidney)에서 발현되며 염증 세포의 신장 침윤을 증가시킨다. 또한 골수 유래 MSC는 CCR2, CCR5, CXCR3 및 CXCR4를 발현하지만 케모카인 반응성과 관련하여 MSC가 염증 조직에 어떻게 침투하는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 몇몇 논문은 MSC가 CXCL12-CXCR4 엑시스(axis)을 사용하여 염증 조직에 침투한다는 것을 보여 주었다. 그러나 지금까지 염증을 일으킨 신장으로의 MSC 침윤에 대한 CXCL10-CXCR3 엑시스(axis)의 역할에 대한 보고는 없다.
Yang D, Sun S, Wang Z, Zhu P, Yang Z and Zhang B. Stromal cell-derived factor-1 receptor CXCR4-overexpressing bone marrow mesenchymal stem cells accelerate wound healing by migrating into skin injury areas. Cellular reprogramming. 2013; 15: 206-15
본 발명은 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커, 진단키트 및 치료용 용도를 제공한다. 더욱 상세하게는 본 발명은 케모카인 수용체인 CXCR3를 포함하는 중간엽줄기세포(MSC)의 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커; 케모카인 CXCL10를 포함하는 자가면역질환의 치료 예후 예측용 바이오마커; 상기 바이오 마커의 발현을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 진단 키트; 및 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량이 증가된 중간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 케모카인 수용체인 CXCR3를 포함하는, 중간엽줄기세포의 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, CXCR3의 발현수준 또는 이의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽줄기세포의 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 키트를 제공한다.
일 구체예에서, CXCR3의 발현수준을 측정하는 제제는 CXCR3에 특이적으로 결합하는 항체이며, CXCR3의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 프라미어, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RP-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 정량적 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트 일 수 있다.
상기 항체, 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드는 본 발명의 속하는 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 작제할 수 있음은 자명하다.
상기 키트에 있어서, CXCR3 또는 이의 mRNA 발현이 없거나, 야생형 중간엽줄기세포보다 낮은 경우, 치료 유효성이 없거나 낮은 것으로 예측할 수 있다. 이와 같이, 바이오마커인 CXCR3 또는 이의 mRNA 발현을 측정함에 의해, 중간엽줄기세포의 자가면역질환 치료에 대한 유효성을 예측할 수 있다.
상기 자가면역질환은 루푸스(전신 홍반성 낭창), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(Progressive systemic sclerosis, Scleroderma), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 염증성 장염, 베체씨병(Behcet's disease), 크론씨병, 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave's disease), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 섬유조직염(Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염(Temporal arteritis)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 특히 전신홍반루푸스 또는 이로 인한 합병증일 수 있다.
상기 합병증은 신장 손상(kidney damage), 두통, 현기증, 행동 변화(behavior changes), 시력 문제(vision problem), 뇌졸중, 발작, 빈혈, 출혈, 혈액 응고, 혈관염(vasculitis), 흉막염(pleurisy), 폐렴, 심낭염(pericarditis), 심혈관 질환, 심장 발작, 관절염, 관절통 및 근육통으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 케모카인 CXCL10를 포함하는 자가면역질환의 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 자가면역질환의 치료는 CXCR3를 포함하는 중간엽줄기세포를 사용한 치료일 수 있다. 또한, CXCL10는 신장에서 발현되는 것이 바람직하다. 상기 CXCL10을 발현하는 신장에서, CXCL10은 CXCR3를 포함하는 중간엽줄기세포가 신장에 침윤되도록 유도할 수 있다.
본 발명은 또한, CXCL10의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 자가면역질환의 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.
일 구체예에서, CXCL10의 발현수준을 측정하는 제제는 CXCR3에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 속하는 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 작제할 수 있음은 자명하다.
본 발명의 일부 구체예에서는, CXCR3 및/또는 CXCL10의 발현수준을 측정하는 것으로만 기재하였으나, 이의 mRNA 발현을 측정함에 의해서 각각의 바이오마커의 발현수준을 측정하는 것이 포함됨은 자명하다.
본 발명은 또한, 중간엽줄기세포(MSC)에서 발현되는 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량 또는 이의 mRNA 발현수준을 측정하여, 자가면역질환 치료에 대한 중간엽줄기세포의 유효성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 바이오마커 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay) 또는 면역형광법(immunofluorescence) 등을 포함한다.
일 구체예에 있어서, 상기 자가면역질환은 특히 전신홍반루푸스 또는 이로 인한 합병증일 수 있다.
본 발명은 또한, 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량 또는 이의 mRNA 발현량을 측정하여, 자가면역질환에 유효한 치료효과를 나타내는 중간엽줄기세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 중간엽줄기세포의 경우, 자가면역질환 예방 또는 치료 활성이 우수하다. 따라서, 상기 방법에 의해 스크리닝된 중간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 1) 중간엽줄기세포의 케모카인 수용체인 CXCR3 자체; 또는 2) CXCR3의 발현량을 증가시키는 제제;를 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, CXCR3의 발현량을 증가시키는 제제는 CXCR3에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 항체의 경우 이의 유도체, 또는 이의 생물학적 등가물이 포함된다고 판단되어야 하며, 항체, 이의 유도체, 또는 이의 생물학적 등가물은 본 발명의 속하는 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 작제할 수 있음은 자명하다. 상기 항체의 유도체 및 이의 생물학적 등가물는 CXCR3의 발현량을 증가시키기 위해 CXCR3에 특이적으로 결합하는 항체의 등가적 활성을 나타내는 것을 말하며, 아미노산 서열의 변경, 결실, 첨부 등에 의한 변이, 또는 각종 치환체를 포함한다.
본 발명은 또한, 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량이 야생형에 비해 증가된 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 CXCR3의 발현량이 야생형에 비해 증가된 중간엽줄기세포는, (i) CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ii) CD34, CD45 및 HLA-DR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 음성의 면역학적 특성을 갖는다.
상기 자가면역질환은 루푸스(전신 홍반성 낭창), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 경피증(Progressive systemic sclerosis, Scleroderma), 아토피 피부염, 원형탈모증(alopecia areata), 건선, 천포창, 천식, 아프타구내염, 만성 갑상선염, 염증성 장염, 베체씨병(Behcet's disease), 크론씨병, 피부근염(dermatomyositis), 다발성 근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave's disease), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 섬유조직염(Fibromyalgia syndrome) 및 측두동맥염(Temporal arteritis)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 특히 전신홍반루푸스 또는 이로 인한 합병증일 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여, 국소(협측, 설하, 피부 또는 안구) 투여, 경피성 투여 또는 비경구(피하, 피내, 근육 내, 혈관 내 또는 관절 내) 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식, 보다 바람직하게는 혈관 내 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 102-1010 세포이다.
본 발명은 또한 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량이 야생형에 비해 증가된 중간엽줄기세포의 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 1) 중간엽줄기세포(MSC)에서 발현되는 케모카인 수용체인 CXCR3 또는 이의 mRNA의 발현량을 측정하는 단계; 및
2) 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량이 야생형에 비해 증가된 중간엽줄기세포를 자가면역질환의 치료가 필요한 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역질환의 치료 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 CXCR3의 발현량이 야생형에 비해 증가된 중간엽줄기세포는, (i) CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ii) CD34, CD45 및 HLA-DR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 음성의 면역학적 특성을 갖는다.
상기 (i) CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ii) CD34, CD45 및 HLA-DR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 음성의 면역학적 특성을 갖는 중간엽줄기세포는 본 출원인인 코아스템의 대한민국출원 제10-2014-0097129호에 상세히 기재되어 있으며, 상기 출원의 내용은 본원의 참조로서 삽입된다.
본 발명에 따르면, 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커, 진단키트 및 치료용 용도를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명은 케모카인 수용체인 CXCR3를 포함하는 중간엽줄기세포(MSC)의 자가면역질환 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커; 케모카인 CXCL10를 포함하는 자가면역질환의 치료 예후 예측용 바이오마커; 상기 바이오 마커의 발현을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 진단 키트; 및 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량이 증가된 중간엽줄기세포를 포함하는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명은 MSC 침윤에 대한 CXCL10-CXCR3 엑시스(axis)의 역할을 명확히 규명할 수 있어, 자가면역질환, 특히 전신홍반루푸스의 예방 또는 치료 효과를 나타내거나 이를 개선할 수 있다.
도 1은 MRL.Faslpr 마우스에 MSCs 또는 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide, CP)를 12주령에 한 번 정맥주사한 후 생존률(도 1a), 체중(도 1b), anti-dsDNA IgG 수준(도 1c) 및 총 IgG 수준 (도 1d)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. WT:wild type, CXCR3-/- :CXCR3가 결핍된 타입 (*p <0.01 versus control).
도 2는 CXCR3를 발현하는 중간엽줄기세포의 신장 침윤을 분석한 것이다. C57BL/6 마우스에서 유래한 MSC (H-2d)를 MRL.Faslpr 마우스 (H-2k)에 정맥 주사하고 24시간 후 비장을 분리하고 항-마우스 MHC-I (H-2d) 항체(anti-mouse MHC-I (H-2d)antibody)를 이용하여 염색한 후 아일렛(islet) 당 H-2d 양성 MSC의 수를 계수한 것을 나타내는 것이다. 도 2b는 8 주 또는 22 주령의 MRL.Faslpr 마우스의 신장으로부터 총 RNA를 분리한 후 CXCL10 및 CXCL12의 유전자 발현 수준을 실시간 PCR로 측정한 결과이다. *p <0.01 versus control. 도 2c는 유동 세포 계측법(flow cytometry)을 이용하여 CMTMR-표지 MSC(CMTMR-labeled MSCs) 및 CMFDA-표지 내피 세포(CMFDA-labeled endothelial cells)의 결합 속도(binding rates)를 분석한 결과를 나타내는 것이다(n = 3). 접합율(conjugation ratio)은 CMFDA/CMTPX 이중 양성 반응(double-positive events)의 포션(portion)으로서 계산되었다. *p <0.01. 도 2d는 MSC를 100 ng/ml의 CXCL10으로 24 시간 동안 처리한 후 MMP-2, MMP-9 및 TIMP-1의 유전자 발현 수준을 실시간 PCR로 측정한 결과를 나타내는 것이다. *p <0.01. 도 2e는 MSC를 100 ng/ml의 CXCL10으로 24 시간 동안 처리한 후 실시간 PCR을 이용하여 α4 인테그린, β1 인테그린 및 CD44의 유전자 발현 정도를 측정한 결과를 나타내는 것이다. *p <0.01.
도 3은 CXCR3-/- MSC는 면역 억제 능력을 분석한 결과이다. 도 3a는 WT 및 CXCR3-/- 마우스로부터 생성된 MSC로부터 총 RNA 및 단백질을 분리하고, CCR5, CCR7, CXCR3 및 CXCR4의 수준을 RT-PCR(real-time PCR) 및 웨스턴 블랏 (WB)에 의해 측정한 결과를 나타내는 것이다. 도 3b는 MSC 이동(MSC migration)을 분석한 결과를 나타내는 것이다. MSC 이동은 8 μm 기공 필터 (Costar, Corning, Cambridge, MA, USA)가 있는 트랜스 웰 플레이트를 사용하여 트랜스 웰 어세이(transwell assay)로 확인하였다. 상부 웰을 37 ℃에서 2 시간 동안 0.1 % 젤라틴 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 코팅한 후, 200 ㎕의 배지에서의 2 × 104 MSC(2 × 104 MSCs in 200 ml of medium)를 상부 웰에 로딩하고, 하부 웰에는 10 % FBS 및 100 ng/ml CXCL10 (R & D 시스템, Minneapolis, MN, USA)을 함유하는 500 ㎕의 배지를 첨가한 다음, 24 시간 후, 필터 상부의 비 이동 세포를 제거하고 막을 10 % 포르말린에 고정시킨 후 필터의 아래쪽으로 이동 한 MSCs를 0.5 % 수정 자색으로 10 분 동안 염색하고 이동된 MSC의 수를 도립 광학 현미경(inverted light microscope)으로 계수하였다. *p <0.01. 도 3c는 96 웰 플레이트(well plate)에 MSC를 0.03 - 0.3 × 105 cells/well로 첨가하고 T 세포를 1 × 105 cells/well로 첨가하고 콘카나발린 A(concanavalin A)를 1 ㎍/ml로 첨가하여 72 시간 동안 배양한 다음 배지에 축적된 IFN-γ의 수준을 ELISA 키트를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 것이다. *p <0.01. 도 3d는 96 웰 플레이트에 MSC를 0.03 - 0.3 × 105 cells/well로 첨가하고, B 세포를 1 x 105 cells/well로 첨가하고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 1 ㎍/ml)로 첨가하고 72 시간 동안 배양한 다음, 배지에 축적된 IgM의 수준을 ELISA 키트를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 것이다. *p <0.01. 도 3e 및 도 3f는 MSC 배양 20일째에 새로운 배지로 교체하고 24 시간 후, 배지에서 가용성 인자의 수준을 측정한 결과를 나타내는 것이다. Griess 시약으로 NO 수준을 측정하였고. ELISA 키트(R & D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 TGF-β와 PGE2의 수준을 측정하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
실시예
재료 및 방법
중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cells)
마우스 MSC는 6-8주된 C57BL/6 마우스 (Orient Bio, 경기도 소재) 또는 CXCR3-/-(B6.129P2-Cxcr3 tm1Dgen /J) 마우스 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)의 경골(tibiae) 및 대퇴골(femurs)의 BM(Bone marrow) 세포에서 수득하였다(CXCR3-/-은 CXCR3가 결핍된 형태를 나타냄). BM 세포는 10 % 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 2 mM L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 포함하는 α-MEM 배지에서 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 비부착성 세포(non-adherent cells)를 1일차에 제거하고 부착 세포를 3일마다 배지를 보충(medium replenishment)하여 배양한 후 17 일에서 20일 사이에 사용하였다. 모든 동물 실험은 충북 대학교 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받아 승인된 지침에 따라 수행되었다.
MRL.Fas lpr 마우스 모델
MRL.Fas lpr마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA)에서 구입하였다. 마우스는 12 시간의 명암주기(12 h light/dark cycle) 하에서 21 ~ 24 ℃ 및 40 ~ 60 % 상대 습도 조건의 특정 병원균이 없는 상태로 보관되었다. MRL.Fas lpr 마우스에 PBS (인산염 완충 생리 식염수, 컨트롤, n=6), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide, 50 mg/kg, n=6), 야생형(wild-type) MSC (1×106 cells/injection, n=6) 및 CXCR3-/-MSCs (1 × 106 cells/injection, n=6)를 12주에 한번 복강 내 주사하였다. 생존율과 체중은 매주 측정하였다. Sigma-Aldrich, Alpha Diagnostic International (San Antonio, TX, USA) 및 eBioscience (San Diego, CA, USA)에서 구입한 ELISA 키트를 사용하여 뇨(urine)에서의 단백질 수준과, 혈청에서의 항-dsDNA IgG 및 총 IgG를 측정하였다. 면역화학염색(immunohistochemistry)을 위하여, 18주령의 MRL.Faslpr 마우스(H-2k)에 MSC(H-2d)를 1 × 106 cells/injection으로 정맥 주사하였다. 24 시간 후, 신장에 침윤한 MSC의 수는 마우스 MHC-1 (H-2d)에 대한 일차 마우스 항체(primary mouse antibody against mouse MHC-1 (H-2Db))와, HRP(horseradish peroxidase; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 접합된 이차 항체 (secondary antibody) 항-마우스(anti-mouse) IgG를 사용하여 결정하였고, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색(counter-staine)하였다.
리얼타임-PCR
트라이졸 시약(TRIZOL Reagent, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 비장 세포로부터 total RNA를 분리하였다. 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량하고 1 mg/ml의 농도로 -80℃에서 보관하였다. cDNA는 RT 키트 (Bioneer, 대전, 한국)를 사용하여 3 ㎍ 총 RNA(total RNA)로부터 합성하였다. CCR5, CCR7, CXCR3, CXCR4, iNOS, TGF-β 및 COX-2에 대한 mRNA의 발현 수준을 PCR로 분석하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: CCR5, 센스, 5'-GCT GAA GAG CGT GAC TGA TA-3'(서열번호 1), 안티센스, 5'-GAG GAC TGC ATG TAT AAT GA-3'(서열번호 2); CCR7, 센스, 5'-ACA GCG GCC TCC AGA AGA ACA GCG G-3'(서열번호 3), 안티센스, 5'-TGA CGT CAT AGG CAA TGT TGA GCT G-3'(서열번호 4); CXCR3, 센스, 5'-GTA CAC GCA GAG CAG TGC G-3'(서열번호 5), 안티센스, 5'-GAA CGT CAA GTG CTA GAT GCC TCG-3'(서열번호 6); CXCR4, 센스, 5'-GGC TGT AGA GCG AGT GTT GC-3'(서열번호 7), 안티센스, 5'-GTA GAG GTT GAC AGT GTA GAT-3'(서열번호 8); iNOS, 센스, 5'-CCT TCC GAA GTT TCT GGC AGC AGC-3'(서열번호 9), 안티센스, 5'-GGC TGT CAG AGC CTC GGG CTT TGG G-3'(서열번호 10); TGF-β, 센스, 5'-TGA CGT CAC TGG AGT TGT AC-3'(서열번호 11), 안티센스, 5'-GGT TCA TGT CAT GGA TGG TG-3'(서열번호 12); COX-2, 센스, 5'-GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT-3'(서열번호 13), 안티센스, 5'-ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA-3'(서열번호 14); β-actin, 센스, 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3'(서열번호 15), 및 안티센스 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3(서열번호 16)'를 포함한다. PCR 산물은 1 % 아가로스 겔에서 분리하였고 5 ㎍/ml 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였다.
SYBR Green Master Mix (Qiagen, Hilden, GER)와 Steponeplus 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하여 정량적 PCR(quantitative PCR) 을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다 : CXCL10, 센스, 5'-GGC TGG TCA CCT TTC AGA AG-3'(서열번호 17), 안티센스, 5'-ATG GAT GGA CAG CAG AGA GC-3'(서열번호 18); CXCL12, 센스, 5'-GAG CCA ACG TCA AGC ATC TG-3'(서열번호 19), 안티센스, 5'-CGG GTC AAT GCA CAC TTG TC-3'(서열번호 20); MMP-2, 센스, 5'-CAA GTT CCC CGG CGA TGT C-3'(서열번호 21), 안티센스, 5'-TTC TGG TCA AGG TCA CCT GTC-3'(서열번호 22); MMP-9, 센스, 5'-CTG GAC AGC CAG ACA CTA AAG-3'(서열번호 23), 안티센스, 5'-CTC GCG GCA AGT CTT CAG AG-3'(서열번호 24); TIMP-1, 센스, 5'-TTA TCC CAT TGG GGC ATT TA-3'(서열번호 25), 안티센스, 5'-TTG CTG CCT TTG ACT GAT TG-3'(서열번호 26); 인테그린 α4, 센스, 5'-CTC CCT CAA GAT GAT AAG TTG TTC AA'(서열번호 27), 안티센스, 5'-TGT GCA AAT GTA CAC TCT CTT CCA-3'(서열번호 28); 인테그린 β1, 센스, 5'-GGC TGA AGA TTA CCC TAT'(서열번호 29), 안티센스, 5'-CAT TCA TCA AAT CCG TTC-3'(서열번호 30); CD44, 센스, 5'-GAC CGG TTA CCA TAA CTA TTG TC'(서열번호 31), 안티센스, 5'-CAT CGA TGT CTT CTT GGT GTG-3'(서열번호 32). 각 샘플의 상대적 mRNA 양은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 β-actin의 Ct(threshold cycle)와 비교한 임계주기(threshold cycle, Ct)를 기준으로 계산되었다.
웨스턴 블랏(Western blot)
세포 용해물(cell lysates)을 준비하고 계면활성제-불용성 물질(detergent-insoluble materials)을 제거한 다음 동량의 단백질을 10 % SDS-PAGE로 분획하고 순수한(pure) 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 5 % 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 함유하는 TBS/Tween 20 (TTBS)로 1 시간 동안 블로킹 한 다음, 5 % BSA를 함유하는 TTBS 내의 1 차 항체의 적절한 희석액과 함께 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
블랏(blot)을 바이오티닐화된 2 차 항체(biotinylated secondary antibody)와 함께 1 시간 동안 배양한 다음, HRP-결합된 스트렙타비딘(HRP-conjugated streptavidin)으로 1 시간 동안 인큐베이션 하였다. 시그널은 ECL(enhanced chemiluminescence; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)에 의해 검출되었다. CCR5, CCR7, CXCR3 및 CXCR4에 대한 항-마우스 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로 부터 구입하였다.
면역조직화학(Immunohistochemistry/migration assay)
20 주령의 MRL.Faslpr 마우스에 MSCs를 정맥 주사하였다(1 x 106 cell/injection). 24 시간 후 신장을 MRL.Faslpr 마우스로부터 분리하여 4 % 포르말린으로 고정시키고 PBS에 담갔다. 에탄올과 자일렌으로 탈수시킨 후, 조직을 파라핀에 삽입하고 4 μm 절편(section)으로 자른 다음, 안티젠 리트리블(antigen retrieval)을 위해 절편을 마이크로웨이브 오븐(650W, 20 분)에서 가열한 후, 3 % 과산화수소(3% hydrogen peroxide)로 내인성 과산화효소 활성(endogenous peroxidase activity)을 차단시켰다. 그 후 절편을 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다(마우스 MHC-1 H-2Db(diluted 1:100; Abcam, Cambridge, UK)에 대한 마우스 항체, 4 ℃에서 밤새 항온 처리). 이후 모든 절편을, HRP (horseradish peroxidase; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 컨쥬케이트된 2차 항체 항-마우스 IgG와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 2-성분(two-component)고감도 DAB(diaminobenzidine) 발색 기질(chromogenic substrate, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 이용하여 10분 동안 시그널을 디벨롭(develop)하고 헤마톡 실린(hematoxylin)으로 카운터-염색하였다.
셀 바인딩 어세이(Cell binding assay)
내피 세포 (endothelial cells, 1 × 106 cells/ml)는 37 ℃에서 10 분 동안 무혈청 배지(serum-free medium)에서 0.5 μM CMFDA (Life Technologies) 및 5 μM CMTPX (Thermo Fisher Scientific)를 포함하는 MSC로 표지하였다. 염색 후, 세포를 10 % FBS를 함유하는 배양 배지에서 2 회 세척하였다. MSCs (1 × 106)와 내피 세포 (1 × 106)를 12 × 75 mm 폴리스티렌 튜브 (BD Biosciences)에서 혼합하고 800 rpm에서 1 분간 원심 분리한 후, 펠릿을 37 ℃에서 10 분간 배양 하였다. 이어서, 세포 혼합물을 부드럽게 현탁시키고 유세포분석기(flow cytometry)로 분석하였다. 접합율(conjugation ratio)은 CMFDA/CMTPX 이중 양성 반응(double-positive events)의 포션(portion)으로 계산되었다.
통계 분석
데이터는 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo, 6마리 마우스)에서 수행된 3회 이상의 독립적인 실험의 평균 ㅁ SEM을 나타낸다. p 값은GraphPad Prism Software (San Diego, CA, USA)의 원-웨이 아노바 (one-way ANOVA)을 사용하여 계산하였다.
실험결과
CXCR3 - / - MSC의 치료 활성(therapeutic activity) 분석
먼저 MRL.Faslpr 마우스 모델에서 CXCR3-/- MSC(CXCR3가 결핍된 MSC)의 치료 활성(therapeutic activity)을 확인하였다. WT MSC(wild type MSC)는 마우스 생존 기간을 현저하게 연장시켰다: WT MSC를 받은 생쥐의 66%는 22주까지 생존했으나 대조군 생쥐는 16%만 생존하였다(도 1a). 한편, CXCR3-/- MSC를 받은 생쥐의 경우 단지 33%만 생존하였다(도 1a). MSC는 체중에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(도 1b). WT MSC는 anti-dsDNA(도 1c)와 총 IgG 항체(도 1d)의 혈청 수준 및 단백뇨 수준 (도 1e)을 감소 시켰지만 CXCR3-/- MSC는 감소시키지 못했다. 양성대조군(positive compound)으로 사용되는 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide) 또한 질병을 완화시켰다. 이러한 데이터는 CXCR3-/- MSC가 MRL.Faslpr 마우스에서 루푸스 증상을 호전시키지 못한다는 것을 보여준다.
MSC의 신장 침윤 분석
도 2는 CXCR3를 발현하는 중간엽줄기세포의 신장 침윤 효과를 분석한 것이다. WT MSCs는 CXCR3-/- MSC 세포보다 염증 있는 신장으로 잘 이동(호밍)하는 것으로 확인되었다(도 2a). 22 주령의 MRL.Faslpr 마우스의 신장은 8 주령에 비해 CXCL10을 높게 발현시켰지만 두 마우스 모두 유사하게 CXCL12를 발현시켰다(도 2b). 이러한 데이터는 염증성 신장이 CXCL10을 높게 발현시킬 수 있고 이는 신장에 대한 MSC 유도를 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다. 다음으로 CXCL10이 MSC 침윤을 어떻게 증가시키는가에 대하여 분석하였다. CXCL10은 WT MSC와 내피 세포의 접합을 증가시켰는데, 이는 신장으로의 MSC 침윤을 위해 중요한 단계이다. 그러나 CXCR3-/- MSC는 내피 세포와의 접합을 증가시키지 못했다(도 2c). CXCL10은 또한 간질 이동(interstitial migration)에 중요한 효소인 MMP-2와 MMP-9의 발현을 증가(도 2d)시켰지만, MSC에 의한 α4/β1 인테그린(integrin)과 CD44의 발현에는 영향을 미치지 않았다(도 2e). 이러한 결과는 CXCL10이 염증성 신장(nephritic kidney)으로의 MSC 침윤을 향상시키는 중요한 케모카인임을 시사한다.
CXCR3 -/- MSC의 면역억제능력 분석
CXCR3-/- MSC의 신장 침윤 능력의 결함에도 불구하고 WT MSC와 유사한 표현형을 보였다. MSC의 마커로 알려진 CD34 및 MHC-II를 발현하지만, CD73 및 Sca-1는 발현하지 않았다. RT-PCR, Real-time PCR과 WB(Western blot)을 사용하여 분석한 결과, WT MSCs는 CCR5, CXCR3, CXCR4를 발현하였으나 CXCR3-/- MSC는 CXCR3을 발현하지 못하고 CCR5와 CXCR4는 발현하는 것으로 확인되었다(도 3a). 또한, CXCR3-/- MSC는 트랜스 웰 분석에서 CXCL10 쪽으로 이동하지 않았다(도 3b). 그러나 CXCR3-/- MSC는 WT MSC와 유사하게 T 세포의 IFN-γ 생산과 B 세포의 IgM 생산을 억제하였다(도 3c, 도 3d). WT MSC와 유사하게, CXCR3-/- MSC는 iNOS, TGF-β및 COX-2 mRNA를 발현(도 3e)하였고, NO, TGF-β 및 PGE2를 생산하였다(도 3f). 이러한 결과는 CXCR3-/- MSCs가 CXCL10으로 이동하지 못하는 것을 제외하고는 WT MSC와 유사한 표현형(phenotypes) 및 면역억제능력(immunosuppressive capacity)을 가지고 있음을 시사한다.
MSC의 신장 침윤은 다단계 과정이다: 첫 번째 단계는 혈관계를 통해 염증 부위로 전달되는 MSC의 전신 투여(systemic administration)이다. 두 번째 단계는 혈액 속 MSC의 포획(capture), 압연(rolling), 내피세포 접착(adhesion to the endothelium), 및 내피세포 투과(transendothelial migration)로 구성된다. 마지막 단계는 간질이동(interstitial migration)이다. 백혈구의 압연(rolling) 및 부착(adhesion)은 L-셀렉틴(L-selectin), VLA-4 및 LFA-1에 의존하지만, MSC의 경우는 그렇지 않을 수도 있다. 염증 조직의 내피세포가 E- 셀렉틴, P- 셀렉틴, VCAM-1 및 ICAM-1을 발현하고 MSC는 CD44 및 α4β1 인테그린을 발현하며 이들의 상호 작용에 의해 MSC가 내피 세포에 견고하게 부착 될 수 있다고 보고된 바 있다. 우리 데이터에 따르면, MSC는 CXCL10 자극이 없는 경우에도 CD44와 VLA-4를 잘 발현하였는데, 이는 내피 세포에 결합하는 MSC가 CXCL10에 독립적으로 작용하는 것임을 의미할 수 있다. 또 다른 CXCL10-비의존적 기전(CXCL10-independent mechanism)으로, 백혈구보다 큰 MSC는 모세혈관(microcapillaries)에서 비특이적으로 억류될 수 있다. CXCL10이 MSC와 내피 세포의 접합을 증가시키는 방법을 명확히 하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
루푸스성 마우스(lupus-prone mice)와 SLE 환자의 염증성 신장(nephritic kidney)은 CCL2, CCL3, CCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 및 CX3CL1을 높게 발현하는데, 이는 염증성 신장으로 염증세포의 이동을 유도 한다. SLE 환자의 경우, 신장에 CXCR3+ T 세포가 많고 혈액에는 적다. CXCL10은 SLE 환자에서 가장 많이 증가하며 신장에서 CXCR3+ 면역 세포와 같은 지역에 분포한다. 염증성 신장(nephritic kidney)에 대한 면역 세포 침윤에 대해서는 잘 알려져 있지만 MSC 침윤에서는 거의 알려지지 않았다. MSC는 CCR2, CCR5, CXCR3 및 CXCR4를 발현하는 것으로 알려져 있다. 그 중 CCR2와 CXCR4는 심장과 피부로의 MSC 침윤에 대한 조절 인자로 잘 알려져 있다. 그러나 MSC가 염증이 있는 신장으로 이동하기 위해 CXCR3이 필요한지는 알려져 있지 않다. 본 실험 데이터에서는 신장염 신장으로의 MSC 침윤에서 CXCR3의 중요한 역할을 보여준다. CXCR3-결핍(CXCR3-deficient) MSC는 WT MSC보다 MRL.Faslpr 마우스에서 내피세포에 대한 결합력이 적고 MMP9 발현이 적으며 염증성 신장으로의 침윤이 적고 결과적으로 루푸스 증상의 개선 효과가 낮은 것으로 확인되었다. 다만 CXCR3-결핍 MSC는 WT MSC와 유사한 증식 및 면역 억제 능력을 보였다.
본 발명은 진단 분류(diagnosis classification) 및 진행성 루푸스 신염(progression lupus nephritis)에 대한 비침습성 바이오 마커(non-invasive biomarkers)의 개발에 영향을 미칠 수 있다. SLE 환자에서 비활성 LN(lupus nephritis)으로 완화(remission)되면서 뇨(urine) CXCL10은 감소되는 바, 이는 치료 후 SLE 환자의 LN 개선을 모니터링하는 데 좋은 바이오 마커일 수 있다는 것을 시사한다. CXCR3에 대한 MSC의 유전자 조작은 SLE 환자의 치료 효능을 향상시키는 유망한 전략일 수 있다. 손상된 부위에 대한 MSC의 침윤 과정을 이해하는 것은 MSC의 치료 효능을 향상시키는 툴(tool)을 제공할 수 있다.
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Claims (18)

  1. 중간엽줄기세포에서 발현되는 케모카인 수용체인 CXCR3를 포함하는, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료에 대한 유효성 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 삭제
  3. CXCR3의 발현수준 또는 이의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽줄기세포의 전신홍반루푸스 치료에 대한 유효성 예측용 키트.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 CXCR3의 발현수준을 측정하는 제제는 CXCR3에 특이적으로 결합하는 항체이며, CXCR3의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인, 유효성 예측용 키트.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 CXCR3 또는 이의 mRNA 발현이 없거나, 야생형 중간엽줄기세포보다 낮은 경우, 치료 유효성이 없거나 낮은 것으로 예측하는, 키트.
  6. 염증성 신장에서 발현되는 케모카인 CXCL10를 포함하는 전신홍반루푸스의 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물로서,
    상기 전신홍반루푸스의 치료는 CXCR3를 포함하는 중간엽줄기세포를 사용한 치료인, 바이오마커 조성물.
  7. 삭제
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 CXCL10을 발현하는 신장에서, CXCL10은 CXCR3를 포함하는 중간엽줄기세포가 신장에 침윤되도록 유도하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  9. 삭제
  10. 중간엽줄기세포(MSC)에서 발현되는 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량을 측정하여, 전신홍반루푸스 치료에 대한 중간엽줄기세포의 유효성을 예측하기 위한 정보제공방법.
  11. 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량을 측정하여, 전신홍반루푸스에 유효한 치료효과를 나타내는 중간엽줄기세포를 스크리닝하는 방법.
  12. 청구항 11에 따라 스크리닝된 중간엽줄기세포를 포함하는 전신홍반루푸스 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 케모카인 수용체인 CXCR3의 발현량이 야생형에 비해 증가된 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 전신홍반루푸스 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 CXCR3의 발현량이 야생형에 비해 증가된 중간엽줄기세포는, (i) CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ii) CD34, CD45 및 HLA-DR로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 음성의 면역학적 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 삭제
  18. 삭제
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