KR102275822B1

KR102275822B1 - 분리된 미토콘드리아를 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102275822B1
Application number: KR1020190014450A
Authority: KR
Inventors: 최용수; 황정욱; 한규범; 김천형
Original assignee: 주식회사 파이안바이오테크놀로지
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2019-02-07
Publication date: 2021-07-12
Also published as: WO2019151840A1; EP3747449A1; JP2022095884A; US20210052659A1; JP2021512874A; CN111587117A; KR20190094124A; EP3747449A4

Abstract

본 발명은 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 외래 미토콘드리아를 약학 조성물을 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에 투여할 경우, 개체의 부종 및 발적 증상이 호전될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 개체의 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현량을 감소시키고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 류마티스 관절염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

분리된 미토콘드리아를 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING RHEUMATOID ARTHRITIS COMPRISING ISOLATED MITOCHONDRIA}

본 발명은 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

류마티스 관절염은 관절의 활막 증식과 뼈 또는 연골을 파괴하는 만성 염증성 질환이다. 초기에는 관절을 감싸고 있는 활막(synovial membrane)에 염증이 발생하며 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래한다. 또한, 류마티스 관절염은 관절뿐만 아니라 여러 장기에서 염증 반응이 일어날 수 있으며 피하 결절, 폐섬유화증, 혈관염, 피부 궤양, 발진, 체중 감소 등 증상을 나타낼 수 있다. 류마티스 관절염의 원인은 정확하게 밝혀진 바가 없으며, 자가면역반응이 주요 기전으로 알려져 있다.

류마티스 관절염의 치료에는 비스테로이드성 소염제와 스테로이드, 항류마티스제와 종양괴사인자 억제제(tumour necrosis factor inhibitors)를 사용하고 있다. 비스테로이드성 항염제와 스테로이드는 염증을 완화하여 질병의 증상을 완화시킬 수 있지만 질병의 진행을 억제하지는 못한다. 항류마티스제는 비스테로이드성 소염제나 스테로이드에 비해 효과가 나타날 때까지 소정의 시간이 걸리고 직접적인 진통효과는 적지만, 근본적으로 질환을 개선시키기 위해 사용하고 있다. 현재, 류마티스 관절염 치료는 항류마티스제의 효과가 나타날 때까지 비스테로이드성 소염제나 스테로이드와 함께 사용한다.

하지만, 항류마티스제의 효과가 나타나기 전에 비스테로이성 소염제 복용으로 인한 위장 장애와 같은 부작용이 발생할 수 있으며, 스테로이드 복용으로 인한 면역력 감소, 내성 증가, 합병증 발생 등 부작용이 발생할 수 있다. 또한, 항류마티스제는 관절염 치료에 중점을 두고 있지만, 여러 부작용을 유발할 수 있기 때문에 정기적인 혈액검사를 포함한 추척 관찰이 필요하다.

또한, 항류마티스제에 반응하지 않는 류마티스 관절염 환자에 대하여 종양괴사인자 억제제를 처방하고 있다. 종양괴사인자 억제제는 류마티스 관절염을 일으키는 중간물질인 종양괴사인자(tumor necrosis factor)를 차단하여 염증반응을 억제하는 치료제이다. 종양괴사인자 억제제는 기존의 항류마티스제에 반응하지 않는 류마티스 관절염에서 70% 이상 증상이 호전되고 기존 치료제에 비해 효과가 빨리 나타나는 장점이 있다. 하지만, 종양괴사인자 억제제는 짧은 반감기를 가지며 근본적인 원인 치료제가 아니라는 단점이 있다. 또한, 종양괴사인자 억제제는 잠복 결핵의 활성화와 같은 부작용이 보고된 바 있다.

한편, 미토콘드리아는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다. 류마티스 관절염과 관련하여, 관절의 활막 증식이 미토콘드리아의 기능 장애를 유발하고, 미토콘드리아의 기능 장애로 인해 활성산소종이 축적되어 염증반응이 활성화된다는 연구가 보고된 바 있다(Fearon et al., Nat Rev Rheumatoid., 2016,(12):385-397).

Fearon et al., Nat Rev Rheumatoid., 2016,(12):385-397

류마티스 관절염을 치료하기 위한 연구가 진행된 바 있으나, 치료범위가 다소 제한적이거나 부작용이 발생하는 문제가 있는 등 아직은 획기적인 치료법이 개발되지 않은 실정이다. 안전하고 효과적인 류마티스 관절염 치료제에 대한 지속적인 연구개발이 필요한 상황이다.

따라서, 본 발명은 류마티스 관절염을 치료하기 위한 약학 조성물 및 이를 이용한 류마티스 관절염을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 외래 미토콘드리아를 약학 조성물을 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에 투여할 경우, 개체의 부종 및 발적 증상이 호전될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 개체의 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현량을 감소시키고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 류마티스 관절염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 정상군, 대조군 또는 외래 미토콘드리아를 투여한 실험군 마우스 발에서의 부종 및 발적 증상을 육안으로 비교하기 위해 촬영한 사진이다.
도 2는 정상군, 대조군 또는 외래 미토콘드리아를 투여한 실험군 마우스의 병증 정도를 점수화하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 정상군, 대조군 또는 외래 미토콘드리아를 투여한 실험군 마우스의 발등 두께를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 정상군, 대조군 또는 외래 미토콘드리아를 투여한 실험군 마우스의 IL-6 발현량을 비교한 그래프이다.
도 5는 정상군, 대조군 또는 외래 미토콘드리아를 투여한 실험군 마우스의 IL-10 발현량을 비교한 그래프이다.
도 6은 외래 미토콘드리아를 투여한 류마티스 관절염 유발 마우스의 체내에서 외래 미토콘드리아의 분포 상태를 촬영한 사진이다.
도 7은 외래 미토콘드리아 투여에 따른 류마티스 관절염 중증도 평가를 위한 조직학적 상태를 촬영한 사진이다
도 8은 LPS 존재하에서도 외래 미토콘드리아의 투여에 의해 마크로파지의 증식이 이루어짐을 보여주는 그래프이다.
도 9는 LPS 존재하에서도 외래 미토콘드리아의 투여에 의해 TNF-α의 분비량이 감소하였음을 보여주는 그래프이다.
도 10은 LPS 존재하에서도 외래 미토콘드리아의 투여에 의해 IL-6의 분비량이 감소하였음을 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.

본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한,　"유효성분"은　단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다.

상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다.

또한, 상기 미토콘드리아는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic)으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 자가 미토콘드리아는 동일 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 동종 미토콘드리아는 개체와 같은 종에 속하면서 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.

구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포일 수 있다.

또한, 상기 생식세포는 감수분열과 체세포 분열을 하는 세포로서 정자 또는 난자일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.

상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 약학 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.

구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 0 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 3 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 1 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.

아울러, 상기 제1차 원심분리는 100 내지 1,000 ×g, 또는 200 내지 700 ×g, 또는 300 내지 450 ×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 1 내지 2,000 ×g, 또는 25 내지 1,800 ×g, 또는 500 내지 1,600 ×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 100 내지 20,000 ×g, 또는 500 내지 18,000 ×g, 또는 800 내지 15,000 ×g의 속도로 수행될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물에 대하여, 미토콘드리아는 0.1 내지 500 ㎍/㎖, 0.2 내지 450 ㎍/㎖ 또는 0.5 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환자의 류마티스 관절염 병증 개선 정도가 보다 향상될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 0.01 내지 5 ㎎/㎏, 0.1 내지 4 ㎎/㎏ 또는 0.25 내지 2.5 ㎎/㎏ 양의 미토콘드리아를 투여할 수 있다. 즉, 상기 약학 조성물이 류마티스 관절염이 유발된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 1 내지 10회, 3 내지 8회 또는 5 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1 내지 7일 또는 2 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 류마티스 관절염에 걸릴 수 있거나, 그러한 질환 또는 질병을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 정맥 투여될 수 있는 주사제일 수 있고, 바람직하게는 주사용 제제일 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등 일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 수산화나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 약학 조성물을 개체의 투여하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다. 여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

이때, 투여는 정맥 내에 투여되는 것일 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체의 정맥에 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미토콘드리아를 포함하는 조성물 제조

분당 차병원으로부터 제공받은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 10%(v/v) 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 암피실린을 함유하는 Alpha-MEM(Alpha-Minimum Essential Medium) 배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline, Gibco)를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25%(v/v) Trypsin-EDTA(TE, Gibco)를 처리하여 세포를 수득하였다.

수득한 세포는 미토콘드리아를 추출하기 위하여, 혈구계산기를 이용하여 1×10⁷cells/㎖ 농도의 세포를 회수하였다. 상기 세포주를 약 4℃의 온도에서 10분 동안 350 ×g의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였다. 이때 얻어진 펠렛을 회수하여 버퍼 용액에 재현탁 시킨 후, 10 내지 15분 동안 균질화시켰다. 그 후, 상기 펠렛을 포함하는 조성물을 약 4℃의 온도에서 3분 동안 1,100 ×g의 속도로 제2차 원심분리시켜 상청액을 수득하였다. 상기 상청액을 약 4℃의 온도에서 15분 동안 12,000 ×g의 속도로 제3차 원심분리시켜 세포주로 부터 미토콘드리아를 분리하였다. 이렇게 얻어진 미토콘드리아를 5 또는 50 ㎍의 양으로 각각 100 ㎕의 주사용수와 혼합한 뒤 인슐린 주사기에 충진하였다.

제조예 1. 중간엽 줄기세포를 포함하는 조성물 제조

분당 차병원으로부터 제공받은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 10%(v/v) 우태혈청, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 암피실린을 함유하는 Alpha-MEM배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, DPBS를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25%(v/v) Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 다시 DPBS를 이용하여 2회 세척한 뒤, 1×10⁶개의 세포수 양으로 100 ㎕의 주사용수와 혼합한 뒤 인슐린 주사기에 충진하였다.

제조예 2. 종양괴사인자 억제제를 포함하는 조성물 제조

분당 차병원으로부터 제공받은 종양괴사인자 억제제인 엔브렐(Enbrel, etanercept)을 마우스 무게 20 g 기준으로 8.3 ㎍이 투여되도록 희석하여 100 ㎕의 주사용수와 혼합한 뒤 인슐린 주사기에 충진하였다. 상기 투여량은 인간에게 투여하는 양으로 환산하면 인간 몸무게 60 ㎏을 기준으로 25 ㎎이 투여되는 양에 해당한다.

실험예 1. 류마티스 관절염 유발 마우스 제조 및 조성물 투여

오리엔트 바이오(Orient Bio Co., Ltd., Seoul, Korea)로부터 6주 내지 8주령의 암컷 DBA-1/j 마우스를 구입하였다. 구입한 마우스는 차의과학대학교 실험동물센터의 청정구역에서 적응기간을 거친 후 실험을 진행하였다. 적응기간 동안 마우스가 지내는 환경은 12시간 간격으로 낮과 밤이 조성되고, 23±2℃의 실내 온도 및 40 내지 60%의 습도가 유지되었다. 이러한 적응기간을 7일 거친 후 실험에 투입되었다.

적응기간을 거친 마우스에 류마티스 관절염 유발을 위해 4℃ 온도에서 0.05 내지 0.1 M 농도의 아세트산에 닭 유래 제2형 콜라겐을 4 ㎎/㎖ 농도로 용해하고 동등한 양의 완전 프로인트 항원 보강제(CFA, Complete Freund's Adjuvant)와 불완전 프로인트 항원 보강제(IFA, Incomplete Freund's Adjuvant)를 개별적으로 혼합하여 1차 면역유도 현탁물질(CFA)과 2차 면역유도 현탁물질(IFA)을 제조하였다. 상기 제조된 1차 면역유도 현탁물질(CFA)을 마우스 꼬리 기저부 피하에 0.1 ㎖를 투여한 후, 3주 뒤 마우스 꼬리 기저부 피하에 2차 면역유도 현탁물질(IFA)을 0.1 ㎖를 추가로 투여하여 류마티스 관절염 동물모델을 제작하였다.

이때, 류마티스 관절염이 유도된 마우스에 상기 제조예 2.에서 제조한 엔브렐(Enbrel)을 포함하는 조성물 100 ㎕를 3일 간격으로 총 5회 피하주사(SC, Subcutaneous Injection) 방식으로 투여하여 실험군 1을 제작하였다. 또한, 제조예 1.에서 제조한 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 포함하는 조성물과 실시예 1.에서 제조한 미토콘드리아를 포함하는 조성물 100 ㎕를 3일 간격으로 총 5회 정맥주사(IV, Intravenous Injection) 방식으로 투여하여 실험군 2 내지 4를 제작하였다. 또한, 아무런 투여가 되지 않는 정상 마우스를 정상군으로 제작하였다. 또한, 주사용수 100 ㎕를 3일 간격으로 총 5회 정맥주사(IV, Intravenous Injection) 방식으로 투여한 것을 제외하고는 실험군 2와 동일한 방법으로 대조군을 제작하였다(표 1).

	정상군	대조군	실험군 1	실험군 2	실험군 3	실험군 4
투여된 조성물	-	주사용수	제조예 2. (Enbrel)	제조예 1. (MSCs)	실시예 1. (MT-Low)	실시예 1. (MT-High)
투여량	-	100 ㎕	25 mg/ 60 kg	1 x 10⁶cells	5 ㎍	50 ㎍
마리 수	7	7	8	8	8	8

한편, 엔브렐은 성인 기준 1회 25 ㎎을 주 2회 투여하며, 일반적으로 엔브렐을 이용한 동물실험의 경우 용법, 용량에 따라 25 ㎎을 주 2회 투여하여 총 5회 투여한다.

실험예 2. 외래 미토콘드리아 투여에 따른 부종 및 발적 감소 확인

실험예 1.에서 제조한 각 실험군의 30일 후 육안적 증상을 평가하기 위해, 정상군, 대조군 및 실험군 1 내지 4의 발을 촬영하여 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 정상군 마우스의 발에서는 어떠한 부종 및 발적 증상도 나타나지 않았다. 반면, 대조군 마우스의 발에서는 큰 관절 및 작은 관절이 심하게 부어 있었으며, 전체적으로 발적 증상이 나타났다. 엔브럴 또는 중간엽줄기세포를 투여한 실험군 1, 2 마우스의 발에서는 앞발에서는 큰 관절 및 작은 관절이 많이 부어 있었으며, 전체적으로 발적 증상이 나타났다. 실험군 1 및 실험군 2의 뒷발의 붓기는 비교적 양호하였으며, 부분적으로 발적 증상이 나타났다. 미토콘드리아를 투여한 실험군 3 마우스 및 실험군 4 마우스의 발에서는 앞발 및 뒷발의 붓기가 비교적 양호하였으며, 부분적으로 발적 증상이 나타났다. 이를 통해, 미토콘드리아를 포함하는 조성물이 종양괴사인자 억제제인 엔브렐보다 부종 및 발적 감소 효과가 우수한 것을 육안으로 확인하였다.

실험예 3. 외래 미토콘드리아 투여에 따른 류마티스 관절염 병증 개선 효과 확인

실험예 1.에서 제조한 각 실험군의 30일 후 류마티스 관절염 증상의 정도에 따른 점수 기준표(표 2)를 바탕으로 병증 정도에 따라 점수화하여 도 2에 나타내었다.

점수	증상
0	작은관절 또는 큰 관절에 부종 또는 발적이 없음
1	작은 또는 큰 관절에 약간의 부종 및 또는 발적이 발생
2	하나 또는 여러 개의 작은 또는 큰 관절에 보통의 부종 및 또는 발적이 발생
3	큰 관절에 심한 부종과 발적이 있고, 보통의 부종 및 또는 발적이 작은 관절에 발생
4	큰 관절에 매우 심한 부종과 발적이 있고, 심한 부종 및 또는 발적이 작은관절에 발생

도 2에 나타난 바와 같이, 정상군 마우스의 발에서는 어떠한 발적 또는 부종도 나타나지 않았으며, 질환 증상에 따른 점수는 0점으로 측정하였다. 반면, 대조군 마우스의 큰 관절과 작은 관절에 매우 심한 부종과 발적이 발생하였으며, 질환 증상에 대한 점수가 15 내지 16점으로 측정하였다. 또한, 엔브럴 또는 중간엽줄기세포를 투여한 실험군 1 마우스 및 실험군 2 마우스의 발에서는 큰 관절에 심한 부종과 발적이 있고, 작은 관절에 보통의 부종 및 발적이 발생하였으며, 질환 증상에 따른 점수가 11 내지 12점으로 측정되었다.

이와 달리, 미토콘드리아를 투여한 실험군 3 마우스 및 실험군 4 마우스의 큰 관절 또는 작은 관절에 보통의 부종 및 또는 발적이 발생하였으며, 질환 증상에 따른 점수가 8 내지 10점으로 측정되었다. 이를 통해, 미토콘드리아를 포함하는 조성물이 종양괴사인자 억제제인 엔브렐보다 치료 효과가 우수한 것을 확인하였다.

실험예 4. 외래 미토콘드리아 투여에 따른 부종 감소 효과 확인

실험예 1.에서 제조한 각 실험군의 30일 후 발등에 붓기 정도를 수치화하기 위해 버니아 캘리퍼를 이용하여 발등의 두께를 분석하여 도 3에 나타내었다. 이때, 앞발과 뒷발의 발등 두께를 측정하여 평균화하여 그래프로 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 대조군의 마우스 발등 두께는 정상군 마우스의 발등 두께 대비 약 28% 정도 두껍게 측정되었다. 또한, 엔브럴을 투여한 실험군 1의 마우스 발등 두께는 정상군 마우스의 발등 두께 대비 약 23% 정도 두껍게 측정되었다. 중간엽줄기세포를 투여한 실험군 2의 마우스 발등 두께는 정상군 마우스의 발등 두께 대비 약 6.8% 정도 두껍게 측정되었다. 이와 달리, 미토콘드리아를 투여한 실험군 3, 4의 마우스 발등 두께는 약 0.7 내지 6% 정도 두껍께 측정되었다. 따라서, 미토콘드리아를 포함하는 조성물을 투여한 실험군에서는 부종이 감소하는 것을 확인하였다.

실험예 5. 외래 미토콘드리아 투여에 따른 사이토카인 발현량 변화 확인

실험예 1.에서 제조한 정상군, 대조군 및 실험군 1 내지 4 마우스의 혈청 내 존재하는 염증성 사이토카인을 평가하기 위해, 마우스의 심장에서 0.4 ㎖ 체혈한 뒤 실온에서 20 내지 30분 동안 응고시켰다. 응고된 혈액은 2,500 내지 3,000 rpm 조건으로 원심분리하여 상층부의 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 효소 연결 면역 흡수 측정 검사법(ELISA)을 통해 염증성 사이토카인 IL-6와 항염증성 사이토카인 IL-10의 발현양을 분석하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 정상군 마우스의 IL-6 발현량은 약 29 pg/㎖의 양이 측정되었다. 반면, 대조군 마우스의 IL-6 발현량은 약 85 pg/㎖로, 정상군 대비 약 2.9배 정도 높은 발현량을 보였다. 또한, 엔브렐을 투여한 실험군 1 및 중간엽줄기세포를 투여한 실험군 2 마우스의 IL-6 발현량은 각각 약 79 pg/㎖, 약 81 pg/㎖로 측정되었으며, 대조군과 비슷한 IL-6의 발현량을 보였다. 이와 달리, 미토콘드리아를 포함하는 조성물을 투여한 실험군 3, 4 마우스의 IL-6 발현량은 약 42 pg/㎖, 17 pg/㎖로 측정되었으며, 정상군과 유사하거나 대조군보다 약 2배 정도 감소된 IL-6의 발현량을 보였다. 이를 통해, 미토콘드리아를 포함하는 조성물이 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현량을 감소시키는 것을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 정상군 마우스의 IL-10 발현량은 약 19 pg/㎖의 양이 측정되었다. 반면, 대조군 마우스의 IL-6 발현량은 약 21 pg/㎖로 측정되었다. 또한, 엔브렐을 투여한 실험군 1 마우스의 IL-10 발현량은 약 20 pg/㎖로 대조군과 비슷한 IL-10의 발현량을 보였다. 중간엽줄기세포를 투여한 실험군 2 마우스의 IL-10 발현량은 약 26 pg/㎖로 측정되었으며, 정산군 및 대조군보다 높은 IL-10의 발현량을 보였다. 미토콘드리아를 포함하는 조성물을 투여한 실험군 3, 4 마우스의 IL-10 발현량은 약 23 pg/㎖, 30 pg/㎖로 측정되었으며, 정상군 및 대조군보다 높은 IL-10의 발현량을 보였다. 이를 통해, 미토콘드리아를 포함하는 조성물이 항염증성 사이토카인 IL-10의 발현량을 증가시키는 것을 확인하였다.

실험예 6. 미토콘드리아 투여 후 류마티스 관절염 유발 마우스의 체내 분포 확인

류마티스 관절염 유발 마우스에서 투여한 미토콘드리아의 체내 분포를 확인하기 위해, 근적외선 형광시약인 CellVue^TMNIR815 형광염료(Thermo Fisher Scientific, USA)로 미토콘드리아를 표지 시킨 후, 마우스 꼬리 정맥으로 투여하였다. 3시간 후 미토콘드리아의 분포를 확인하기 위해 임펄스(Impulse) 근적외선 장비를 이용하여 미토콘드리아의 체내 분포를 촬영하여 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 마우스의 꼬리 정맥을 통해 투여된 미토콘드리아는 정맥 혈관을 따라 간, 폐, 비장에 분포되는 것을 확인하였으며 특이적으로 마우스의 발에도 존재하는 것을 확인하였다.

실험예 7. 조직학적 평가를 통한 외래 미토콘드리아 투여에 따른 류마티스 관절염 중증도 개선 확인

실험예 1. 에서 제조한 각 실험군의 30일 후 류마티스 관절염 중증도를 분석하기 위해 마우스 발을 적출하여 4% 파라포름알데하이드(4% Paraformaldehyde)에 2일간 고정하였다. 고정한 발 조직을 탈회 용액(Decalcifying solution lite, Sigma)에서 석회질을 제거하고 파라핀 블록을 제작하였다. 제조된 파라핀 블록 발 조직을 10 ㎛의 절편으로 절단하여 고정하였다. 그 후, 헤마토실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 염색한 후 현미경으로 촬영하여 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 정상군 마우스의 발 조직에서는 관절 형태가 유지되어 있으며 염증 반응에 의한 활막섬유모세포(Synovial fibroblast)의 관절 내 침윤이 관찰되지 않았다. 반면, 대조군 마우스의 발 조직에서는 염증 반응에 의한 염증세포 및 활막섬유모세포의 관절 내 침윤이 발생하여 관절의 형태가 손상되었다. 또한, 엔브렐을 투여한 실험군 1 및 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군 2 마우스의 발 조직에서는 대조군과 비슷한 염증 세포 및 활막섬유모세포의 관절 내 침윤이 관찰되었다.

이와 달리, 미토콘드리아를 포함하는 조성물을 투여한 실험군 3, 4 마우스의 발 조직에서는 염증 세포 및 활막섬유모세포의 관절 내 침윤이 감소하였으며 정상군과 유사한 관절 형태를 나타내었다. 이를 통해, 미토콘드리아를 포함하는 조성물이 염증 반응을 통한 염증 세포의 침윤 및 활막섬유모세포의 이상 증식을 억제하는 것을 확인하였다.

실험예 8. 미토콘드리아 전달에 의한 대식세포 증식 확인

Mouse 유래 Raw 264.7(macrophage) 세포에 LPS (2 μg/ml; L4391, Sigma)를 6시간 동안 처리하여 염증반응 유도하였다. 그 후, 인간 유래 탯줄유래줄기세포 (human UC-MSCs)로부터 추출한 건강한 미토콘드리아를 농도별 (0.1, 0.5, 0.75, 1, 5 μg)로 전달한 뒤, 24-well plate에 접종(seeding)시켜 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다. 24 시간에 샘플의 상등액을 수합하여, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상등액만 새 튜브로 옮겼다. 세포의 증식 능력을 비교하기 위해 EZ-cytoX kit(EZ-3000, Dogen)를 사용하였다. 확보한 각각의 샘플에 실험 키트에 포함된 반응 용액을 10:1의 비율(반응 용액 (vol.)= 샘플의 1/10)로 섞어준 뒤, 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 2 시간 동안 반응 시키고, 그 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, 시료의 생존세포수가 증가하면서 미토콘드리아의 탈수소효소의 활성이 증가하였다.

실험예 9. 미토콘드리아 전달에 의한 대식세포의 프로-염증인자(pro-inflammatory) 사이토카인 분비 억제 효능 확인

실험예 8과 동일한 방법으로, mouse 유래 Raw 264.7(macrophage) 세포에 LPS (2 μg/ml)를 6시간 동안 처리하여 염증반응 유도하였다. 그 후, 인간 유래 탯줄유래줄기세포(human UC-MSCs)로부터 추출한 건강한 미토콘드리아를 농도별 (0.1, 0.5, 0.75, 1, 5 μg)로 전달한 뒤, 24-well plate에 접종(seeding)시켜 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다. 24 시간에 샘플의 상등액을 수합하여, 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상등액만 새 튜브로 옮겼다. 대식세포의 프로-염증인자 (pro-inflammatory) 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 발현 양을 확인하기 위해 각각 mouse TNF-α ELISA kit(Sigma, #RAB0477)와 mouse IL-6 ELISA kit (Sigma, #RAB0308)를 사용하여 분석하였다.

각 조건 별 상등액 샘플은 ELISA 분석 키트 내에 포함된 희석 용액을 이용하여 1/10의 비율로 희석하여 준비하였다. 준비된 샘플과 표준(standard)용액을 각각 항체가 미리 코팅되어 있는 96-well 플레이트에 넣어주고, 4℃에서 overnight 시켰다. 실험 다음날, 분석 키트 내에 포함된 워싱 용액을 이용하여 96-well 분석 플레이트에 남아있는 용액을 제거해 주었다. 다음 단계로, 준비된 biotin이 표지된 detection antibody를 각 웰에 추가하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 워싱 용액을 이용하여 96-well 분석 플레이트에 남아있는 용액을 제거해 주었다. 다음 단계로, 준비된 streptavidine 용액을 각 웰에 추가하여 45분 동안 상온에서 교반기를 이용하여 반응시킨 뒤, 워싱 용액을 이용하여 96-well 분석 플레이트에 남아있는 용액을 제거해 주었다. 마지막으로 substrate reagent 용액을 추가하고 30분 동안 상온, 빛을 차단한 조건에서 교반기를 이용하여 반응시켰다. 반응 30분 후, stop 용액을 각 웰에 추가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 9 및 도 10에와 같이, LPS를 처리하였음에도, TNF-α와 IL-6의 발현 양이 미토콘드리아의 처리에 따라 효과적으로 감소하였음을 확인하였다.

Claims

분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 약학 조성물은 주사용 제제인 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것인, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 체세포가 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포로 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 생식세포가 정자, 난자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 줄기세포가 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포가 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것인, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약학 조성물에 대하여, 상기 미토콘드리아는 0.1 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함되는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 주사로 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료 방법.